Precisieligatie van de linker anterior descenderende kransslagader met gebruik van anatomische oriëntatiepunten in een muismodel voor myocardinfarct

Samenvatting

Dit protocol induceert een myocardinfarct bij muizen door permanente ligatie van de linker anterior descenderende kransslagader, waarbij de anterior interventriculaire sulcus wordt gebruikt als reproduceerbaar oppervlaktekenmerk voor een nauwkeurige plaatsing van de hechting. Het infarct wordt gevalideerd door middel van elektrocardiografie, echocardiografie, histologische kleuring en analyse van serumbiomarkers.

Samenvatting

Permanente ligatie van de linker anterior descending (LAD) kransslagader is de meest gebruikte methode voor het maken van muismodellen voor myocardinfarct (MI) in preklinisch cardiovasculair onderzoek. In conventionele protocollen wordt de ligatieplaats echter doorgaans 1–2 mm onder het linker atriumoor aangebracht, een anatomisch kenmerk dat tijdens de operatie vaak moeilijk betrouwbaar te identificeren is. In combinatie met aanzienlijke interindividuele variabiliteit in de coronaire anatomie van muizen leidt dit vaak tot een onnauwkeurige lokalisatie van de LAD, inconsistente ligatieplaatsen en een verminderde reproduceerbaarheid tussen operateurs. Om deze beperkingen aan te pakken, introduceert dit protocol de anterior interventriculaire sulcus (AIS) als leidend anatomisch kenmerk voor de LAD-ligatie. De AIS is een ondiepe oppervlakkige groeve die direct zichtbaar is onder de microscoop, waarbij de LAD er onmiddellijk onder loopt. In tegenstelling tot conventionele benaderingen biedt dit een stabiel anatomisch referentiepunt dat een consistentere selectie van de ligatieplaats ondersteunt en gemakkelijker te identificeren is voor onervaren operateurs. Het protocol combineert gestandaardiseerde isofluraan-inhalatieanesthesie met niet-invasieve intratracheale intubatie en valideert het MI met behulp van elektrocardiografie, echocardiografie, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), histopathologische kleuring en driedimensionale beeldvorming van de kransslagaders. Dit protocol biedt een betrouwbare en reproduceerbare experimentele methode voor het induceren van MI bij muizen om de pathofysiologische en immuunveranderingen na een MI te onderzoeken.

Inleiding

Myocardinfarct (MI), een van de belangrijkste oorzaken van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit wereldwijd, vormt een aanzienlijke bedreiging voor de menselijke gezondheid¹. MI wordt gekenmerkt door een abrupt begin, een kritisch klinisch verloop en een hoog sterftecijfer; het wordt primair veroorzaakt door trombotische occlusie van de coronaire arteriën en kan leiden tot ernstige myocardiale ischemie, daaropvolgende cardiomyocyte-necrose en een cascade van complicaties, waaronder aritmieën, hartfalen en plotselinge hartdood². Ondanks aanzienlijke vorderingen in de klinische cardiologie blijft de beperkte toegang tot menselijk myocardweefsel een belemmering vormen voor het onderzoek naar de onderliggende pathofysiologische mechanismen van MI en de ontwikkeling van effectieve therapeutische strategieën³. Bijgevolg blijven betrouwbare, reproduceerbare en klinisch relevante in vivo diermodellen, die de klinische kenmerken en progressie van MI getrouw nabootsen, essentieel voor mechanistische studies en preklinische therapeutische evaluatie.

Sinds Johns en Olson in 1954 voor het eerst een muismodel voor MI establisheerden, zijn de methodologieën voor het induceren van MI bij muizen voortdurend verfijnd⁴. Permanente ligatie van de linker anterior descenderende (LAD) kransslagader onder directe microscopische visualisatie is de meest breed geadopteerde techniek geworden, omdat het belangrijke pathologische kenmerken van humane MI reproduceert, waaronder gelokaliseerde myocardiale ischemie, myocardiale necrose en ventriculaire remodeling na het infarct⁵. Conventionele LAD-ligatie vereist echter aanzienlijke microsurgische expertise die doorgaans alleen via uitgebreide training wordt verworven, wat de procedurele consistentie en reproduceerbaarheid tussen operators en laboratoria beperkt⁶. Bovendien dragen intraoperatieve en postoperatieve complicaties — waaronder hemorragie, longletsel of collaps, onjuiste plaatsing van de ligatuur en mechanische weefselschade als gevolg van inadequate ventilatie — bij aan een relatief hoge perioperatieve mortaliteit, wat de wijdverbreide toepassing van dit model verder beperkt⁷. Als reactie op deze beperkingen introduceerden Gao et al. een gemodificeerde techniek waarbij LAD-ligatie via cardiac eversion plaatsvindt, wat de chirurgische procedure vereenvoudigt en de technische drempel voor het establisheren van het model verlaagt⁸. Aanvullende experimentele benaderingen, waaronder coronaire cryoinjury en farmacologische inductie van myocardiale schade, zijn eveneens ontwikkeld voor specifieke onderzoekstoepassingen^9,10. Desalniettemin blijft permanente LAD-ligatie onder directe visualisatie de voorkeursmethode, omdat het de belangrijkste pathofysiologische kenmerken van humane MI het meest nauwkeurig reproduceert, terwijl het een gecontroleerde inductie van de grootte en locatie van het infarct mogelijk maakt.

Ondanks het wijdverspreide gebruik blijft conventionele LAD-ligatie beperkt door een variabele identificatie van de ligatieplaats, procedurele inconsistentie, een relatief hoge perioperatieve mortaliteit en interlaboratoriumvariabiliteit in reproduceerbaarheid, wat allemaal de betrouwbaarheid en vergelijkbaarheid van experimentele resultaten kan beïnvloeden¹¹. Het algemene doel van het huidige protocol is om een meer gestandaardiseerde en reproduceerbare methode voor permanente LAD-ligatie bij muizen vast te stellen door de sulcus interventricularis anterior (AIS) te gebruiken als extern anatomisch referentiepunt voor de lokalisatie van het vat. In plaats van de ligatieplaats te schatten op een vaste afstand onder het linker atriumoorzakje, identificeert dit protocol de AIS — een ondiepe oppervlakkige groeve die direct zichtbaar is onder microscopische visualisatie en bovenop de LAD ligt — als een stabiel anatomisch referentiepunt voor het begeleiden van de ligatie. In vergelijking met conventionele schattingen op basis van referentiepunten is deze aanpak bedoeld om een consistentere selectie van de ligatieplaats te faciliteren, operatorafhankelijke variabiliteit te verminderen en de toegankelijkheid voor minder ervaren chirurgen te verbeteren, terwijl de compatibiliteit met standaard murine MI-procedures behouden blijft. Dit protocol is daarom geschikt voor onderzoekers die op zoek zijn naar een reproduceerbare chirurgische methode voor het genereren van permanente MI-modellen voor studies naar myocardiale beschadiging, ventriculaire remodellering, inflammatie en gerelateerde mechanismen van cardiovasculaire ziekten.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd met goedkeuring van de Ethiekcommissie van het Dierproefcentrum van de Southwest Medical University (Goedkeuringsnummer SWMU20240146). In deze studie werden mannelijke C57BL/6J muizen gebruikt (specifiek pathogeenvrij [SPF]), in de leeftijd van 8–10 weken en met een gewicht van 20,0 ± 3,0 g. Laat de muizen 1 week acclimatiseren onder standaard laboratoriumomstandigheden (2°C ± 2°C; 12 u licht/12 u donker cyclus) voordat de experimenten worden gestart.

1. Preoperatieve voorbereiding

1. Bereid alle chirurgische instrumenten voor en steriliseer deze op de dag van de operatie, waaronder pincetten, oogheelkundige scharen, een naaldhouder, een micro-mosquito hemostaat, een V-vormige ooglidretractor, 3/8-cirkel 7-0 nylon hechtingen met naald, 6-0 nylon hechtingen en 5-0 nylon hechtingen. Autoclaveer alle metalen instrumenten gedurende 20 min bij 121°C vóór de procedure en steriliseer ze tussen de dieren door met een glaskraalsterilisator (250°C gedurende 15 s), gevolgd door afkoeling op een steriel velje. Gebruik hechtingen uit verzegelde steriele verpakkingen.
2. Richt twee afzonderlijke werkgebieden in om de aseptische techniek te waarborgen. Bereid één gebied voor met pincetten, een tracheale intubatieset voor muizen en een anesthesieapparaat, en bereid een tweede steriel chirurgisch gebied voor met gesteriliseerde instrumenten, wattenstaafjes, povidon-jodium en steriel gaas.
3. Breng ontharingscrème aan op de thoraxregio gedurende 1 min. Verwijder de crème en de haren voorzichtig met steriel gaas bevochtigd met steriel water of fysiologisch zout.
   1. Ontharing alleen vormt geen chirurgische huidvoorbereiding. Voer de definitieve aseptische huiddesinfectie en steriele afdekking pas uit na het anestheseren, intuberen en vastzetten van de muis op het chirurgische platform, direct vóór de huidincisie (Stap 2.6).
4. Dien cefazoline (30 mg/kg) toe via een intraperitoneale injectie 1 u vóór de operatie. Reconstitueer cefazoline-natrium voor injectie in steriel 0.9% fysiologisch zout tot een werkconcentratie van 30 mg/mL, en dien ongeveer 0.2 mL per 20 g lichaamsgewicht toe om de doeldosis te bereiken. Zet de toediening voort éénmaal daags gedurende 5 opeenvolgende dagen na de operatie.
   OPMERKING: Dien in dit protocol geen systemische of topische farmacologische hemostatische middelen toe. Bereik intraoperatieve hemostase door 10–30 s, of totdat de bloeding stopt, een zachte, continue druk uit te oefenen met een steriel wattenstaafje.

2. Inductie van Anesthesie en Tracheale Intubatie

1. Plaats de muis in de inductiekamer (16 × 10 × 1 cm) die is aangesloten op het anesthesieapparaat. Stel de stroomsnelheid van het dragersgas in op 0,5 L/min en induceer anesthesie met 3,5%–4,0% isofluraan.
   OPMERKING: Bevestig adequate anesthesie door de afwezigheid van de pedaalterugtrekkingsreflex. Onder deze instellingen bereikt de muis over het algemeen binnen 2–4 min een chirurgisch vlak van anesthesie.
2. Positioneer de geanestheseerde muis in rugligging op het intubatieplatform voor muizenluchtpijpen. Hang de muis op door de bovenste snijtanden in de elastiekband van het platform te haken, zodat de kop en nek in een hoek van ongeveer 45° zijn gestrekt. Lijn de orale, faryngeale en laryngeale assen uit om de glottis direct in beeld te brengen.
3. Voer orotracheale intubatie uit
   1. Voer orotracheale intubatie uit onder directe laryngoscopie zonder tracheotomie om een gecontroleerde mechanische ventilatie te bewerkstelligen. Gebruik een 20 G intraveneuze catheter (buitendiameter ongeveer 0,9 mm; lengte ongeveer 15 mm) als endotracheale tube.
   2. Open de bek en verschuif de tong voorzichtig naar één zijde met een pincet. Voer het blad van een laryngoscoop voor kleine dieren langs de rugzijde van de tong in en druk de tongbasis naar beneden.
   3. Schuif de laryngoscoop verder tot de epiglottis zichtbaar is. Til de laryngoscoop omhoog en naar voren langs de as van de handgreep om de epiglottis op te tillen en de V-vormige glottisopening en de bleke stembanden bloot te leggen.
   4. Voer de catheter tijdens de inspiratie door de open glottis, terwijl de stembanden direct in beeld blijven. Verwijder de laryngoscoop nadat de catheter door de glottis is gegaan.
   5. Schuif de catheter tot een diepte van ongeveer 5–7 mm. Verwijder de stylet en sluit de catheter aan op de ventilator.
      OPMERKING: Bevestig de correcte plaatsing van de endotracheale tube door symmetrische bilaterale beweging van de borstwand waarnemen die gesynchroniseerd is met de ventilator. Als de beweging van de borstwand minimaal is en er in plaats daarvan ritmische abdominale bewegingen optreden, vergezeld van een progressieve vershaling van de anesthesie, verwijder dan de catheter uit de slokdarm en herhaal de intubatie.
   6. Indien de glottis niet gevisualiseerd kan worden, verwijder dan de laryngoscoop en positioneer de muis opnieuw op het intubatieplatform met de kop en nek gestrekt onder ongeveer 45°. Lijn de orale, faryngeale en laryngeale assen opnieuw uit, verwijder eventuele orofaryngeale secreties met een steriel wattenstaafje en herhaal de laryngoscopie. Als de muis tekenen van ontwaken uit de anesthesie vertoont, breng deze dan terug naar de inductiekamer, verdiep de anesthesie en herhaal daarna de intubatiepoging.
   7. Breek de procedure af als de muis cyanose, laryngeale bloedingen of aanhoudende apneu ontwikkelt. Stop de toediening van isofluraan en plaats de muis op een temperatuurgecontroleerde warmtemat (37°C) tot deze volledig is hersteld.
   8. Ga niet over tot thoracotomie als de tracheale intubatie mislukt is. Plan de procedure voor een latere sessie of sluit het dier uit van de studie en registreer dit als een procedurele fout.
      OPMERKING: Herhaalde intubatiepogingen kunnen laryngeaal oedeem veroorzaken, wat het risico op postoperatieve ademhalingsproblemen verhoogt. In de meeste gevallen wordt een succesvolle intubatie bereikt binnen de eerste twee pogingen na directe visualisatie van de glottis. Vaardigheid in orotracheale intubatie vereist oefening en bekendheid met de techniek.
4. Dien lucht toe als dragersgas met een stroomsnelheid van 0,5 L/min en handhaaf de anesthesie met 1,5%–2,0% isofluraan. Stel de ventilator in op een ademhalingsfrequentie van 130 ademhalingen/min, een tidal volume van 2 mL en een inspiratoire-expiratoire ratio van 5:4.
   OPMERKING: Het tidal volume dat op de ventilator is ingesteld, overschrijdt de theoretische waarde geschat op basis van het lichaamsgewicht, omdat het compenseert voor het samendrukbare volume van het ventilatorcircuit en de dode ruimte van de endotracheale tube. Evalueer de ventilatie gedurende de hele procedure door het dier te monitoren op cyanose en tekenen van barotrauma, inclusief pneumothorax en subcutaan emfyseem.
   1. Monitor de diepte van de anesthesie continu gedurende de hele procedure. Beoordeel het ademhalingspatroon en de pedaalterugtrekkingsreflex elke 2 min. Monitor de hartslag continu met behulp van het elektrocardiogram (ECG) en pas de isofluraanconcentratie aan om een hartslag van 40–50 slagen/min te handhaven; een isofluraanconcentratie van 1,5%–2,0% is over het algemeen voldoende. Let gedurende de procedure op spontane ademhalingsinspanning tegen de ventilator, snorrbewegingen en veranderingen in de kleur van de slijmvliezen.
   2. Verhoog de isofluraanconcentratie in stappen van 0,5%, tot een maximum van 3,0%, als de pedaalterugtrekkingsreflex opnieuw optreedt, snorrbewegingen worden waargenomen of er spontane ademhalingsinspanning tegen de ventilator plaatsvindt. Verlaag de isofluraanconcentratie in stappen van 0,5%, tot een minimum van 1,0%, als de hartslag onder de 350 slagen/min zakt. Pauzeer de chirurgische procedure telkens wanneer deze tekenen worden waargenomen, blijf de hartslag, het ademhalingspatroon, de kleur van de slijmvliezen en de snorrbewegingen monitoren, en hervat de procedure pas nadat de fysiologische parameters zijn gestabiliseerd.
5. Kantel de muis naar de rechterzijde met de linkerzijde boven om de linker thoraxwand bloot te leggen. Bevestig de vier ledematen en de staart aan het platform met hechttape.
6. Desinfecteer de chirurgische plaats met drie opeenvolgende applicaties van povidonjodium. Gebruik voor elke applicatie een nieuw steriel wattenstaafje, beginnend bij de geplande incisielocatie en bewegend naar buiten in een concentrische spiraal tot ongeveer 1 cm voorbij de beoogde incisie in alle richtingen. Gooi het wattenstaafje na elke applicatie weg en breng een gebruikt wattenstaafje niet terug naar het centrum van het chirurgische veld. Laat de laatste applicatie volledig aan de lucht drogen en breng vervolgens een steriel afdekdoek aan, waarbij alleen het chirurgische veld wordt blootgesteld voordat de huidincisie wordt gemaakt.

3. Thoracotomie en blootlegging van het hart

OPMERKING: De algemene chirurgische workflow, inclusief de positionering van het dier, thoracotomie, blootstelling van het hart, ligatie van de LAD-kransslagader, sluiting van de thorax en postoperatieve recovery, is geïllustreerd in Figuur 1 en Figuur 2.

Figuur 1Anatomische lokalisatie van de ligatieplaats van de linker anterior descending coronaire arterie met behulp van de sulcus interventricularis anterior. (A) Ventraal aanzicht van het blootgelegde muizenhart vóór ligatie, met weergave van de anterieure interventriculaire sulcus (AIS). (B) Aanzicht van hetzelfde gebied na ligatie van de linker anterieure descenderende (LAD) kransslagader; het omcirkelde gebied geeft de ligatieplaats aan. (C) Schema dat de ruimtelijke relatie tussen de AIS en de kransslagaders toont. De LAD loopt langs de AIS, en het ligatiepunt bevindt zich in het bovenste derde deel van de sulcus. RCA, rechter kransslagader; LCA, linker kransslagader; LCX, linker circumflex kransslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2Chirurgische procedure voor ligatie van de linker voorste dalende kransslagader bij muizen, geleid door de anterior interventriculaire sulcus. (A) Positioneer en fixeer de geanestheseerde muis waarbij de linker thoraxregio is gedepileerd. (B) Maak een huidincisie over de linker thoraxwand. (C) Scheid de pectoraalspieren en identificeer de geschikte intercostale ruimte voor de thoracotomie. (D,E) Plaats en positioneer de borstretractor om de intercostale ruimte te verbreden en het operatieveld bloot te leggen. (F) Visualiseer het blootgelegde hart en identificeer de sulcus interventricularis anterior (SIA). (G) Haal een 7-0 nylon hechtdraad door de SIA en onder de linker anterieure descenderende (LAD) coronaire arterie. (H) Knoop de hechtdraad vast om een permanente LAD-ligatie te bewerkstelligen. (I) Verwijder de borstretractor en sluit de thoraxwand. (J,K) Sluit de spier- en huidlagen opeenvolgend. (L) Laat de muis na de operatie herstellen onder een warmtebron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Maak met een oogheenschaar een longitudinale huidincisie van 1 cm op de linker thoraxwand, parallel aan de lange as van het sternum en ongeveer 2 mm lateraal van de linker sternumrand. Leg de onderliggende pectorale spieren bloot.
2. Scheid de musculus pectoralis major en musculus pectoralis minor met fijne pincetten botstomp in de richting van hun vezels. Retraheer de spieren lateraal om de ribben en intercostale ruimtes bloot te leggen; vermijd het doorsnijden van de spieren om bloedverlies te minimaliseren.
3. Identificeer de juiste intercostale ruimte voordat de thoraxholte wordt geopend. Lokaliseer de arteria intercostalis anterior, een zijtak van de arteria thoracica interna die in een intercostale ruimte parallel aan de ribben loopt, en identificeer de derde intercostale ruimte onmiddellijk craniaal aan de meest consistent zichtbare arterie in de vierde intercostale ruimte.
4. Indien de arteria intercostalis anterior niet duidelijk zichtbaar is, palpeer dan de eerste rib en tel caudaal om de ruimte tussen de derde en vierde rib te identificeren. Bevestig voordat u verdergaat dat de geselecteerde intercostale ruimte een direct, ongehinderd zicht biedt op de linker atriumoor en de anterieure vrije wand van de linker ventrikel.
   OPMERKING: Nauwkeurige identificatie van de derde intercostale ruimte is essentieel, omdat een onjuiste locatie voor de thoracotomie de visualisatie van het hart kan beperken en de procedure kan compromitteren.
5. Voer een thoracotomie uit via de linker derde intercostale ruimte. Spreid de intercostale ruimte voorzichtig met een V-vormige ooglidretractor totdat de linker atriumoor en het bovenste derde deel van de linker ventrikel duidelijk zichtbaar zijn binnen het operatieve veld.
   OPMERKING: In dit stadium blijft het hart bedekt door het pericard; daarom kan de AIS niet betrouwbaar worden geïdentificeerd. Identificeer de AIS pas na het openen van het pericard (Stap 3.6), zoals beschreven in Stappen 4.2–4.3.
6. Pak het pericard voorzichtig vast met één paar fijne pincetten en til het weg van het myocard. Gebruik een tweede paar fijne pincetten om het pericard langzaam open te scheuren en het hart volledig bloot te leggen.

4. Landmerk-geleide ligatie van de linker anterior descenderende kransslagader

1. Haal een 6-0 nylonhechting door de borstwand en oefen voorzichtig tractie uit om het operatieveld te verbreden. Leg de AIS volledig bloot voordat de ligatieplaats wordt geïdentificeerd (Figuur 1A).
2. Identificeer de AIS als de ondiepe groef die schuin loopt van de hartbasis naar de apex en de oppervlakkige grens tussen de linker- en rechterventrikels markeert (Figuur 1C). Identificeer deze onder de microscoop als een quasi-circulaire depressie die zich ongeveer 1–2 mm onder de inferieure rand van het linker atriumoor bevindt.
3. Als de AIS moeilijk te identificeren is, dep dan voorzichtig het epicardiale oppervlak met een wattenstaafje bevochtigd met warme zoutoplossing. Onderzoek het operatieveld opnieuw onder de microscoop om de groef duidelijker te identificeren.
   OPMERKING: Onder de dissectiemicroscoop is de AIS een gemakkelijk identificeerbare ondiepe groef die anatomisch de interventriculaire grens afbakent, waarbij de LAD-kransslagader er direct onder loopt. Als de AIS na het afdeppen onduidelijk blijft, bevestig dan eerst of de thoracotomie voor voldoende blootstelling zorgt. Identificeer vervolgens de LAD direct volgens eerder beschreven methoden: ten opzichte van de begeleidende hartader is de slagader rozer van kleur, kleiner van kaliber en duidelijk pulserend¹².
   1. Indien de AIS of de LAD-kransslagader niet kan worden geïdentificeerd, controleer dan eerst of de thoracotomie via de linker derde intercostale ruimte is uitgevoerd. Repositioneer indien nodig de thoracotomie zoals beschreven in stappen 3.3–3.5, en herhaal vervolgens de identificatie van de AIS en de LAD zoals beschreven in stappen 4.1–4.3.
   2. Beëindig de procedure als de AIS of de LAD na 10 min zorgvuldige inspectie niet kan worden geïdentificeerd, als er ongecontroleerde bloedingen optreden, als de totale open-borstprocedure 20 min overschrijdt, of als de hartslag onder 30 beats/min blijft ondanks aanpassing van de anesthesiediepte. Anestheseer de muis diep met 5% isofluraan, euthanaseer deze door cervicale dislocatie en registreer het dier als een procedurele mislukking voor opname in de analyse van de chirurgische uitkomsten.
4. Haal een 7-0 nylonhechting door de groef bij het superieure derde deel van de AIS (Figuur 1B). Steek de naald loodrecht op het epicardiale oppervlak tot een diepte van ongeveer 0,5–1 mm, waarbij de in- en uitgangspunten zich aan weerszijden van de groef bevinden en ongeveer de maximale breedte ervan overspannen.
5. Bevestig de ligatuur met een chirurgische knoop. Stel de ligatuur zo af dat er direct na de eerste worp bleking van het myocard distaal van de ligatieplaats optreedt, zonder noemenswaardige lokale weefselindrukking.
   OPMERKING: Trek de hechting slechts zo strak aan dat de coronaire bloedstroom wordt afgesloten. Overmatige spanning kan het aangrenzende myocard beschadigen of ervoor zorgen dat de hechting door het vat en het omliggende weefsel snijdt.
6. Bevestig de succesvolle coronaire occlusie binnen 1 min na ligatie door patchy ischemische bleking van het myocard distaal van de ligatieplaats waarneemt¹². Bevestig de occlusie verder door ST-segmentelevatie op het ECG vast te stellen.
7. Als het ischemische gebied overmatig klein is of als bleking ontbreekt, maak dan de ligatuur los en herhaal de ligatieprocedure.

5. Sluiting en postoperatieve herstel

1. Verwijder voorzichtig de V-vormige ooglidretractor. Sluit de thoracotomie met een enkele onderbroken 5-0 nylonhechting door de naald rond de aangrenzende derde en vierde ribben te voeren om de derde intercostale ruimte opnieuw te benaderen. Houd de naald dicht bij het riboppervlak om beschadiging van het intercostale neurovasculaire bundel te voorkomen. Comprimeer de thorax voorzichtig aan het einde van de uitademing om resterende intrathoracale lucht te evacueren voordat de hechting wordt vastgezet, en behoud deze compressie terwijl de hechting met een chirurgische knoop wordt vastgezet.
2. Sluit de huidincisie in lagen met 5-0 nylonhechtingen. Zorg voor een volledige appositie van de wondranden voordat u verder gaat.
3. Plaats de muis op een temperatuurgecontroleerd verwarmingskussen (37°C), staak de toediening van isofluraan en zet de mechanische ventilatie voort tot de spontane ademhaling is hervat. Observeer het dier tijdens het herstel van de anesthesie, inclusief beweging van de staart of snorharen en het herstel van een regulier ademhalingspatroon van ongeveer 150 ademhalingen/min.
4. Bevestig dat de muis klaar is voor extubatie door te controleren op een regelmatige spontane ademhaling, zichtbare beweging van de borstwand gesynchroniseerd met de ventilatiecyclus en doelgerichte beweging van de ledematen of snorharen. Verwijder de endotracheale tube langzaam tijdens de expiratiefase en blijf de muis gedurende 3–5 min op het verwarmingskussen monitoren om de afwezigheid van respiratoire distress te bevestigen.
   OPMERKING: Respiratoire distress na extubatie wordt meestal veroorzaakt door een pneumothorax als gevolg van onvolledige sluiting van de intercostale ruimte. Als er respiratoire distress optreedt, moet de muis tijdelijk opnieuw worden geanestheseerd en geventileerd, de huidhechtingen worden geopend, de intercostale sluiting worden geïnspecteerd en aanvullende hechtingen worden geplaatst op elke plek waar lucht lekt, alvorens de extubatieprocedure te herhalen.
5. Plaats de muis na herstel van de anesthesie terug in de thuiskooi. Dien buprenorfine (0,1 mg/kg, subcutaan) toe direct na de operatie en elke 4–6 u gedurende de eerste 48 u.
6. Monitor elke muis minstens tweemaal daags gedurende de eerste 3 postoperatieve dagen en daarna eenmaal daags. Beoordeel het lichaamsgewicht, de houding, de activiteit, het ademhalingspatroon en de operatiewond, en eutanaseer elk dier dat voldoet aan de vooraf gedefinieerde humane eindpunten, waaronder aanhoudende bemoeilijkte ademhaling, onvermogen om voedsel of water te bereiken, of een gebogen, immobiele houding die niet reageert op stimulatie.

6. Electrocardiografische (ECG) beoordeling

1. Registreer elektrocardiografische signalen met een fysiologisch registratiesysteem met meerdere kanalen, uitgerust met een ECG-versterker. Plaats drie subcutane ledematen-elektroden bij de muis, waarbij de positieve ingang (VIN+) wordt verbonden met het linkerachterpootje, de negatieve ingang (VIN−) met het rechtervoorpootje en de aarde (GND) met het rechterachterpootje.
2. Sluit de ECG-versterkermodule aan op de data-acquisitie-eenheid. Stel het notch-filter in op 50 Hz (of 60 Hz, afhankelijk van de lokale netfrequentie), open vervolgens de acquisitiesoftware en voeg een nieuwe ECG-versterkermodule toe onder de analoge kanaalinstellingen.
   1. Configureer de versterker met de volgende parameters: gain = 20, mode = normal, laagdoorlaatfilter = 150 Hz en hoogdoorlaatfilter = 0.05 Hz. Open de acquisitie-instellingen, stel de bemonsteringssnelheid in op 1 kHz en sluit het instellingsvenster.
   2. Klik na het plaatsen van de elektroden op Start om te beginnen met registreren. Stel de tijdbasis van het display in op 0,5 s per hoofdschaalverdeling en de verticale schaal op 0,25 mV per hoofdschaalverdeling, en registreer vervolgens het ECG continu gedurende ten minste 30 s. Selecteer een stabiel, artefactvrij segment voor analyse en representatieve presentatie.
3. Registreer het ECG onmiddellijk na de ligatie terwijl de muis onder 1,5% isofluraan-anesthesie en normothermie op een warmtemat wordt gehouden. Registreer ECG's van zowel de MI- als de normale controlegroep (NC) op hetzelfde tijdstip onder vergelijkbare anesthetische omstandigheden.

7. Echocardiografie

1. Verwijder het haar van de anterieure thoracale regio met ontharingscrème 1 dag vóór de beeldvorming. Anestheseer de muis gedurende het gehele onderzoek met 1,5% isofluraan.
2. Plaats de muis in rugligging op een verwarmd platform, bevestig de vier ledematen aan de ECG-elektroden en breng echogel aan op het precordium. Pas de isofluraanconcentratie naar behoefte aan om een hartslag van meer dan 40 beats/min te handhaven.
3. Positioneer de echoprobe in de derde tot vierde intercostaalruimte langs de linker sternumrand. Richt de probemarkering naar de rechter voorpoot onder een hoek van ongeveer 30° en richt de probe uit langs de lange as van het hart.
4. Voer alle beeldvorming uit met een linear-array transducer met een centrale zendfrequentie van 30 MHz, een bandbreedte van 20–46 MHz en een axiale resolutie van 50 μm. Stel het zendvermogen in op 10%, de beelddiepte op 13 mm, de beeldbreedte op 1 mm, het dynamisch bereik op 60 dB en de tweedimensionale gain op 40 dB. Neem B-mode cine loops op met een framerate van 210 frames/s.
5. Sla deze acquisitieparameters op als een systeempreset. Gebruik dezelfde transducer, preset, zendvermogen, dynamisch bereik, beelddiepte en beeldbreedte voor alle dieren en alle beeldvormingssessies, en wijzig de beelddiepte niet tussen de NC- en MI-groepen.
6. Positioneer binnen hetzelfde long-axis view de M-mode samplinglijn op mid-ventriculair niveau, loodrecht op het interventriculair septum en de posterieure wand van het linker ventrikel, waarbij de sampling gate de volledige anteroposterieure diameter van het linker ventrikel beslaat. Registreer de M-mode tracing voor nadere analyse.
7. Neem B-mode beelden op waarin het linker ventrikel, het linker atrium en de aortawortel duidelijk zichtbaar zijn, en registreer cine loops voor nadere analyse. Neem overeenkomstige M-mode beelden op in hetzelfde beeldvlak.
8. Meet de end-diastolische interne diameter van het linker ventrikel (D_d), de end-systolische interne diameter van het linker ventrikel (Ds) en de dikte van het interventriculair septum op basis van de verkregen beelden. Neem vijf opeenvolgende hartcycli op en rapporteer de gemiddelde waarden.
   OPMERKING: Bereken het end-diastolisch volume van het linker ventrikel (LVEDV) en het end-systolisch volume van het linker ventrikel (LVESV) automatisch met behulp van de beeldvormingssoftware. Bereken de fractionele verkorting (FS) als FS = (D_d − D_s) / D_d × 10% en de ejectiefractie (EF) als EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 10%.

8. Oogsten van weefsel, histologische kleuring en ELISA

1. Weefselwinning
   1. Voer op dag 7 na MI-inductie bij elke muis een echocardiografie uit. Anestheseer de muis met 4% isofluraan, neem ongeveer 1,5 mL bloed af via retro-orbitale bloedname, euthanaseer de muis door cervicale dislocatie en exciseer het hart.
   2. Laat de bloedmonsters overnight stollen bij 4°C. Centrifugeer de monsters 10 min bij 20 × g bij 4°C, verzamel het serum en bewaar dit bij −80°C tot aan de analyse.
2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
   1. Kwantificeer serum B-type natriuretisch peptide (BNP), interleukine-1β (IL-1β), tumornecrosefactor-α (TNF-α) en nucleaire factor-κB p65 (NF-κB p65) met behulp van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits.
      1. Breng alle reagentia en serummonsters naar kamertemperatuur en bereid de werkingsoplossingen voor volgens de instructies van de kit. Verdun de serummonsters 1:5 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), oftewel één volume serum plus vier volumes PBS.
      2. Voeg 50 μL standaarden, PBS en verdunde serummonsters toe aan respectievelijk de standaard-, nul- en monsterputjes, waarbij het blanco putje leeg blijft. Voeg 10 μL mieriksorganismeperoxidase (HRP)-geconjugeerd detectie-antilichaam toe aan alle putjes behalve de blanco, seal de plaat en incubeer deze 60 min bij 37°C in het donker.
      3. Gooi de inhoud van elk putje weg en was de plaat vijf keer met wasbuffer, waarbij de buffer tijdens elke wascyclus 20 s in elk putje blijft staan. Dep de plaat droog op pluisvrij papier.
      4. Voeg 10 μL vers bereid substraat (Oplossingen A en B gemengd in een volumeverhouding van 1:1) toe aan elk putje. Incubeer de gesealde plaat 15 min bij 37°C in het donker, voeg 50 μL stopoplossing toe en meet de optische dichtheid bij 450 nm.
   2. Trek de optische dichtheid van de blanco af van elke meting en stel een standaardcurve op met behulp van een four-parameter logistic (4PL) regressiemodel. Bereken de concentratie van elk monster aan de hand van de gefitte curve, vermenigvuldig de waarde met de verdunningsfactor van 5 en rapporteer de gemiddelde waarde van de dubbele putjes.
3. Weefselbewerking, inbedding en doorsneden
   1. Spoel elk geexcideerd hart kort af in ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing om resterend bloed te verwijderen. Fixeer het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 24 u bij kamertemperatuur.
   2. Trim elk hart om een vlak kort-as oppervlak bloot te leggen en plaats het in een gelabelde weefselcassette. Dehydrateer het weefsel via een oplopende ethanolserie (75% ethanol gedurende 4 u, 85% ethanol gedurende 2 u, 90% ethanol gedurende 2 u, 95% ethanol gedurende 1 u en twee wissels absolute ethanol van elk 30 min). Breng het weefsel over via een mengsel van ethanol–xyleen gedurende 5–10 min, clear het in twee wissels xyleen van elk 10 min en infiltreer het met drie wissels gesmolten paraffine van elk 1 u.
   3. Bed elk hart in zodat de korte as naar het blokoppervlak is gericht. Snijd seriële coupes van 3 μm op mid-papillair niveau, laat de coupes drijven op een waterbad van 40°C, monteer ze op glasplaatjes en droog ze bij 60°C.
   4. Deparaffineer de coupes in twee wissels xyleen (elk 15 min), gevolgd door drie wissels absolute ethanol (elk 5 min), 75% ethanol (5 min) en omgekeerd osmose- (RO) water (5 min).
      WAARSCHUWING: Paraformaldehyde is een waarschijnlijk carcinogeen en een irritant voor de luchtwegen en huid, en xyleen is ontvlambaar en neurotoxisch. Hanteer deze reagentia in een chemische zuigkast terwijl u aseptische medische handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming draagt, en voer afval af volgens de institutionele procedures voor gevaarlijk afval. Ethanol en n-butanol zijn ontvlambaar; houd ze uit de buurt van ontstekingsbronnen.
4. Histologische kleuring
   1. Hematoxyline en eosine kleuring
      1. Dompel de gedeparaffineerde en regehydrateerde coupes 3–5 min onder in hematoxyline. Spoel de coupes met water.
      2. Differentieer de coupes in 1% zuur alcohol en spoel ze met water. Kleur de coupes blauw in 0,5% waterige ammoniak en spoel ze opnieuw.
      3. Breng de coupes opeenvolgend over via 85% ethanol, 95% ethanol en absolute ethanol gedurende elk 5 min. Kleur de coupes tegen met eosine gedurende 3–5 min.
      4. Dehydrateer de coupes via drie wissels absolute ethanol van elk 5 min en vervolgens in n-butanol gedurende 5 min. Clear de coupes via drie wissels xyleen van elk 5 min en monteer ze met neutrale hars.
         OPMERKING: Kernen verschijnen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix rood verschijnen.
   2. Masson's trichroomkleuring
      1. Beit de gedeparaffineerde en regehydrateerde coupes overnight gedurende ongeveer 15 u bij kamertemperatuur in een 2,5% kaliumdichromaatoplossing. Spoel de coupes ongeveer 30 s onder stromend water tot de gele tint verdwijnt.
      2. Kleur de coupes 6 min in Ponceau–zuurfuchsine-oplossing tot het weefsel helderrood verschijnt. Verleng de kleuringstijd als de kleur zwak blijft en spoel de coupes onder stromend water tot het afspoelwater kleurloos is.
      3. Laat overtollig water weglopen zonder de coupes te laten uitdrogen. Differentieer de coupes 1–2 min in waterige fosfomolybdeenzuur totdat het collageen bleek verschijnt en de spiervezels rood blijven.
      4. Breng de coupes direct over in anilineblauw-oplossing zonder te spoelen. Incubeer de coupes 6–30 s.
      5. Differentieer de coupes via drie tot vijf wissels 1% azijnzuur gedurende ongeveer 8 s per wissel. Dehydrateer ze snel via drie wissels absolute ethanol gedurende respectievelijk ongeveer 3, 5 en 5 s.
      6. Clear de coupes 5 min in n-butanol en vervolgens 5 min in xyleen. Monteer de coupes met neutrale hars.
         OPMERKING: Collageenvezels verschijnen blauw, terwijl spiervezels, fibrine en erytrocyten rood verschijnen.
   3. Sirius Red kleuring
      1. Incubeer de gedeparaffineerde en regehydrateerde coupes 30 min in Sirius Red oplossing A in een oven van 65°C. Was de coupes onder stromend water tot de gele tint verdwijnt.
      2. Dep overtollig vloeistof weg en dompel de coupes 2 min onder in Sirius Red oplossing B. Was de coupes kort en dep overtollig vloeistof weg.
      3. Dompel de coupes 30 min onder in Sirius Red oplossing C. Spoel ze kort gedurende 1–2 s.
      4. Dehydrateer de coupes via drie wissels absolute ethanol van ongeveer 3 s per wissel. Clear ze via drie wissels xyleen van elk 5 min en monteer ze met neutrale hars.
         OPMERKING: Onder brightfield-verlichting verschijnen collageenvezels rood tegen een gele achtergrond.
5. Beeldacquisitie en kwantificering
   1. Verwerven alle histologische beelden met een digitale slide-scanner. Gebruik identieke instellingen voor belichting, witbalans, belichtingstijd en vergroting voor alle coupes van alle groepen, en voeg een kalibratieschaalbalk toe aan elk beeld.
   2. Kalibreer de ruimtelijke schaal vóór de beeldanalyse. Laad een referentiebeeld met de schaalbalk die is verkregen met dezelfde resolutie en pixelafmetingen als de studiebeelden. Maak onder Measure > Calibration > Set System een nieuwe ruimtelijke kalibratie aan, stel de eenheid in op μm, definieer de pixel-naar-micrometer conversie door de kalibratiepunten uit te lijnen met de schaalbalk, sla de kalibratie op en pas deze toe op alle beelden.
   3. Laad een met Masson's trichroom gekleurde coupe en omtrek de linkerventrikel met de irregular area-of-interest (AOI) tool. Sluit de ventriculaire holte, de rechterventrikel en artefacten door weefselbewerking uit, en noteer vervolgens de totale oppervlakte van de linkerventrikel.
   4. Open Measure > Count/Size en selecteer Select Colors om het segmentatiediaalog te openen. Kies Color Cube Based segmentatie en stel de parameters als volgt in: sensitivity = 4, expand selection door 1 kleurindex, minimum color size = 1 pixel en kernel size = 3 × 3. Pas dezelfde segmentatie-instellingen toe op alle coupes.
   5. Selecteer blauwe collageen-positieve pixels met de pipettool als startpunten. Bemonster alleen duidelijk collageen-positieve regio's, genereer een voorbeeldbeeld en bevestig dat het masker de collageen-positieve gebieden bevat terwijl het roodgekleurde myocard, de ventriculaire holte en de achtergrond worden uitgesloten. Pas de startpunten indien nodig aan voordat u het masker toepast.
      OPMERKING: Selecteer voor elke coupe opnieuw startpixels om rekening te houden met kleine verschillen in kleurintensiteit tussen coupes. Houd voor alle beelden identieke segmentatieparameters aan (gevoeligheid, uitbreidingsgraad, minimale kleurgegrootte en kernel-grootte), en accepteer de segmentatie alleen wanneer het voorbeeld een volledige dekking van de collageen-positieve gebieden aantoont met uitsluiting van niet-collageenstructuren.
   6. Pas het segmentatiemasker toe en sluit het dialoogvenster. Selecteer onder Measure > Select Measurements de optie Area, klik op Count, open View > Statistics en noteer de totale collageen-positieve oppervlakte.
   7. Bereken de collageenvolumefractie (CVF) door de collageen-positieve oppervlakte te delen door de totale oppervlakte van de linkerventrikel en druk het resultaat uit als een percentage.

9. Weefselklaring en driedimensionale beeldvorming van de kransslagaders

1. Fluorescentiemarkering van de coronaire vasculatuur
   1. Injecteer 200 µL van een 2% Evans Blue-oplossing in de laterale staartader om de coronaire vasculatuur te markeren. Plaats de muis 60 min terug in de kooi om de systemische circulatie van de kleurstof mogelijk te maken.
   2. Plaats de muis in de inductiekamer (16 × 10 × 11 cm) die is verbonden met het anesthesieapparaat en induceer anesthesie met 4% isofluraan. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie, open de borstholte, verwijder het intacte hart, spoel het in PBS en fixeer het gedurende 24 u bij 4°C in 4% paraformaldehyde (PFA).
      WAARSCHUWING: PFA is een waarschijnlijk carcinogeen en een irritant voor de luchtwegen en de huid. Hanteer PFA in een chemische zuurkast terwijl u aseptische medische handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming draagt, en voer het afval af volgens de institutionele procedures voor gevaarlijk afval.
   3. Bereid een 3% agarose-oplossing in RO-water voor en bedel het gefixeerde hart zodanig dat de ligatieplaats correct georiënteerd is voor beeldvorming. Injecteer met een microliter-spuit 1 µL DAPI-oplossing in elk van de acht locaties rondom het ligatiegebied en incubeer het monster 2 dagen bij kamertemperatuur.
2. Tissue clearing
   1. Voer tissue clearing uit met een FDISCO (driedimensionale beeldvorming van solvent-geclearde organen met superieure fluorescentiebewarende capaciteit) tissue-clearing kit volgens de instructies van de fabrikant. De kit bestaat uit zes reagentia (A–F): Reagentia A, B, C, D en E bevatten respectievelijk 50%, 70%, 80%, 10% en 10% tetrahydrofuran (THF) in water, en Reagens F is dibenzelether.
      WAARSCHUWING: THF is zeer brandbaar, vormt explosieve peroxiden tijdens opslag en is een irritant voor de luchtwegen en de huid. Dibenzelether is een huid- en oogirritant. Hanteer alle reagentia in een chemische zuurkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder aseptische medische handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming. Voer het afval af volgens de institutionele procedures voor gevaarlijk afval.
   2. Incubeer elk hart opeenvolgend in Reagentia A, B, C, D en E gedurende 6 u per reagens. Gebruik 10 mL van elk reagens per hart, wat overeenkomt met een minimale monster-reagensvolumeratio van 1:5.
   3. Breng het monster over naar Reagens F en zet de incubatie voort totdat het weefsel optisch transparant wordt, gewoonlijk gedurende ongeveer 1 u.
   4. Voer alle clearingstappen uit bij 6°C–8°C met zachte agitatie. Plaats het monster in een glazen container gewikkeld in aluminiumfolie en bescherm het gedurende de gehele procedure tegen licht om de fluorescentie te behouden.
3. Light-sheet fluorescentiebeeldvorming
   1. Monteer het geclearde monster op de monsterhouder. Gebruik een light-sheet fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 4× objectieflens (numerische apertuur = 0,28; werkafstand = 20,0 mm).
   2. Dompel het gemonteerde monster in dibenzelether binnen de beeldvormingskamer. Belicht het preparaat van beide zijden en exciteer opeenvolgend DAPI bij 405 nm en Evans Blue bij 647 nm.
   3. Stel de acquisitieparameters als volgt in: voor het 405 nm-kanaal, gebruik een laserintensiteit van 3.0 arbitraire eenheden en een belichtingstijd van 30 ms; voor het 647 nm-kanaal, gebruik een laserintensiteit van 4.00 arbitraire eenheden en een belichtingstijd van 30 ms. Neem alle beelden op met een z-stapgrootte van 6 μm en een beeldresolutie van 1.024 × 1.024 pixels.
   4. Stel de acquisitiemodus van de camera in op XYCZT, waarbij eerst laterale (XY) beelden worden opgenomen, gevolgd door opeenvolgende kanaalacquisitie (C), axiale stapzetting (Z) en tijdspuntacquisitie (T), zoals geconfigureerd door de beeldvormingssoftware.
4. Beeldbewerking en driedimensionale reconstructie
   1. Stik de ruwe TIFF-beeldbestanden met de beeldverwerkingssoftware die bij de microscoop is geleverd. Converteer de gestikte beeldbestanden naar het IMS-formaat door te selecteren File > Convert to Imaris.
   2. Importeer de geconverteerde IMS-bestanden in de driedimensionale analyse-software. Genereer volume-rendered reconstructies met de standaard renderinginstellingen en exporteer representatieve beelden met de Snapshot-module.
      OPMERKING: Driedimensionale reconstructies worden gegenereerd met de standaard renderingpipeline van de software zonder modificatie. Er is geen beeldsegmentatie, thresholding, denoising, achtergrondsubtractie of andere voorbewerking toegepast. De gereconstrueerde beelden worden gebruikt voor kwalitatieve visualisatie van de coronaire vasculatuur en zijn niet bedoeld voor kwantitatieve analyse.

10. Statistische analyse

1. Druk alle gegevens uit als het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Voer statistische analyses uit met GraphPad Prism-software (versie 5.0).
2. Definieer de experimentele eenheid als het individuele dier. Analyseer n = 8 muizen per groep voor alle functionele, biomarker- en histomorfometrische eindpunten.
3. Voer gegevensverzameling en analyse uit met gecodeerde monsteridentificatie, waarbij de onderzoeker geblindeerd blijft voor de groepsindeling. Onthul de groepsindelingen pas na voltooiing van alle kwantitatieve analyses.
4. Beoordeel de normaliteit van de gegevens met de Shapiro–Wilk-toets en de homogeniteit van de variantie met de toets van Levene in GraphPad Prism (versie 5.0) voordat de passende statistische toets wordt gekozen.
5. Vergelijk twee groepen met een tweezijdige ongepaarde Student's t-toets wanneer voldaan is aan de aannames van normaliteit en gelijke variantie. Voer anders een Mann–Whitney U-toets uit.
6. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant. Geef statistische significantie aan als P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001.

Resultaten

De AIS diende als anatomisch oriëntatiepunt voor de lokalisatie van de LAD-kransslagader en de identificatie van de ligatieplaats (Figuur 1A–C). Na identificatie van de AIS werd de sequentiële chirurgische workflow voor de inductie van een MI, bestaande uit thoracotomie, blootlegging van het hart, LAD-ligatie, sluiting van de thorax en postoperatief herstel, uitgevoerd zoals geïllustreerd in Figuur 2A–L. Het vereenvoudigde protocol maakte een snelle en reproduceerbare inductie van MI bij muizen mogelijk. Dit protocol vereist een uitgebreide periode van praktische training voordat het betrouwbaar kan worden uitgevoerd; tracheale intubatie en AIS-gestuurde ligatie zijn de twee stappen met de steilste leercurve. Tijdens de vroege training kan de perioperatieve mortaliteit gedurende de eerste 7 postoperatieve dagen oplopen tot 50% of hoger, en kan het succespercentage van de modelinductie dalen tot 30% of lager. Zodra deze technieken beheerst zijn, overschrijdt het chirurgische succespercentage consistent de 90%. In de huidige studie traden er geen perioperatieve sterfgevallen op gedurende de eerste 7 postoperatieve dagen. Alle trainingsprocedures werden uitgevoerd onder hetzelfde goedgekeurde institutionele protocol voor diergebruik.

Na de ligatie van de LAD werden karakteristieke elektrocardiografische afwijkingen waargenomen, waaronder een uitgesproken verdieping van de Q-golf, ST-segmentelevatie met een naar boven convexe morfologie, hyperacute T-golfpieken (die gewoonlijk evolueren naar T-golfinversie tijdens de subacute fase), een verhoogde amplitude van het QRS-complex met een verbreding, en uitgesproken tachycardie (Figuur 3A). Macroscopisch onderzoek toonde lokale myocardiale bleking en ventriculaire dilatatie distaal van de ligatieplaats in de MI-groep vergeleken met de NC-groep (Figuur 3B). Histopathologisch onderzoek toonde gedesorganiseerde myocardiale vezels, verbreedde intercellulaire ruimtes, infiltratie van ontstekingscellen, collageendepositie en myocardiale structurele disruptie in de MI-groep, aangetoond door hematoxyline en eosine (H&E), Masson's trichroom- en Sirius Red-kleuringen (Figuur 3C). Kwantitatieve analyse van met Masson's trichroom gekleurde coupes toonde een significant grotere CVF in de MI-groep dan in de NC-groep (18,24% ± 1,67% vs. 0,05% ± 0,01%; P < 0,01; Figuur 3D).

Figuur 3Elektrocardiografische, macro-anatomische en histopathologische veranderingen na ligatie van de linker anterior descenderende kransslagader bij muizen. (A) Representatieve elektrocardiogrammen (ECG's) opgenomen direct na de chirurgische ingreep in de normale controlegroep (NC) en de myocardinfarctgroep (MI). (B) Representatieve macrofoto's van harten uit de NC- en MI-groepen. Schaalbalken = 1 mm. (C) Representatieve transversale hartsecties van de NC- en MI-groepen, gekleurd met hematoxiline en eosine (H&E; links), Masson-trichroom (midden) en Sirius Red (rechts). In met Masson-trichroom gekleurde coupes verschijnt collageen blauw en myocardium rood; in met Sirius Red gekleurde coupes verschijnt collageen rood tegen een gele achtergrond. Schaalbalken = 1,000 µm(D) Collageenvolumefractie (CVF), berekend als de collageen-positieve oppervlakte gedeeld door de totale oppervlakte van de linker ventrikel en uitgedrukt als percentage, in de NC- en MI-groepen. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM); n = 8 muizen per groep. Statistische significantie ten opzichte van de NC-groep is aangegeven als **P < 0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cardiale functionele beperking werd bevestigd via echocardiografie. Representatieve M-mode beelden toonden een verminderde contractiliteit van de linker ventrikel in de MI-groep (Figuur 4A). Kwantitatieve analyse toonde een significant verminderde EF en FS van de linker ventrikel aan in de MI-groep vergeleken met de NC-groep (Figuur 4B,C). ELISA toonde significant verhoogde serumconcentraties van BNP, TNF-α, NF-κB p65 en IL-1β aan in de MI-groep (Figuur 4D–G), wat consistent is met een verminderde cardiale functie en een inflammatoire respons.

Figuur 4Cardiale functionele veranderingen en serum biomarkerspiegels na ligatie van de linker anterior descenderende kransslagader. (A) Representatieve M-mode echocardiografische beelden van de normale controlegroep (NC) en de myocardinfarctgroep (MI). (B) Linkerventrikelejectiefractie (EF). (C) Linkerventrikel fractionele verkorting (FS). (D–G) Serumconcentraties van (D) B-type natriuretisch peptide (BNP), (E) tumornecrosefactor-α (TNF-α), (F) nucleaire factor-κB p65 (NF-κB p65) en (G) interleukine-1β (IL-1β), gemeten via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). EF en FS zijn uitgedrukt in percentages; BNP, TNF-α en IL-1β zijn uitgedrukt in pg/mL; en NF-κB p65 is uitgedrukt in ng/mL. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM); n = 8 muizen per groep. Statistische significantie ten opzichte van de NC-groep wordt aangegeven met *P < 0,01 en **P < 0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Driedimensionale fluorescentiebeeldvorming van weefselgeklaarde harten demonstreerde het verloop van de LAD onder de AIS en toonde aan dat ligatie op de anatomisch gedefinieerde locatie leidde tot coronaire occlusie (Figuur 5A–F). Samen tonen deze bevindingen de succesvolle inductie van een MI-fenotype aan in deze initiële serie van acht dieren per groep, gekenmerkt door linkerventrikelfunctiestoornissen, myocardiale fibrose en systemische ontsteking. De huidige studie was erop gericht de haalbaarheid van het AIS-gestuurde MI-model vast te stellen en aan te tonen, in plaats van een uitgebreide validatie van de steekproefomvang, de stabiliteit van het model op lange termijn of de anatomische concordantie tussen de AIS en de LAD te bieden. Bijgevolg worden deze aspecten erkend als beperkingen van de huidige studie en worden ze in de sectie Discussie besproken. Specifiek waren de functionele en biochemische beoordelingen beperkt tot de acute fase na het MI, en de relatie tussen de AIS en de LAD werd kwalitatief aangetoond, maar is nog niet gekwantificeerd in een voldoende grote cohort.

Figuur 5Driedimensionale fluorescentie-imaging van de geklaarde coronaire vaten van muizen. Geklaarde gehele harten werden gelabeld met Evans Blue om de coronaire vasculatuur te visualiseren en met 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om celkernen te visualiseren, gevolgd door light-sheet fluorescentie-imaging en driedimensionale reconstructie. (A–C) Reconstructies van het gehele hart waarop het (A) DAPI-kanaal, (B) Evans Blue-kanaal en (C) samengevoegde kanalen te zien zijn. Schaalbalken = 1,000 µm(D–F) Vergrotingen van de coronaire vasculaire regio met weergave van het (D) DAPI-kanaal, (E) Evans Blue-kanaal en (F) samengevoegde kanalen. Schaalbalken = 400 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Niet elke procedure levert een optimaal model op, en het herkennen van suboptimale resultaten is belangrijk voor het oplossen van problemen. Ligatie die te proximaal is geplaatst of een naald die te diep is ingevoerd, kan een overmatig groot infarct veroorzaken dat gepaard gaat met ernstig hartfalen, aritmie of ventriculaire ruptuur, wat leidt tot vroege mortaliteit. Omgekeerd kan ligatie die te distaal of te oppervlakkig is geplaatst, slechts een klein infarct veroorzaken of erin resulteren dat er geen infarct wordt geïnduceerd. De succesvolle inductie van het model moet daarom aan meerdere criteria worden getoetst. Tijdens de chirurgische ingreep biedt bleking van het myocard distaal van de ligatieplaats een directe indicatie van coronaire occlusie, hoewel dit bevinding niet altijd direct zichtbaar is. Postoperatieve echocardiografie en histopathologisch onderzoek bieden aanvullende bevestiging van een succesvolle totstandkoming van het model. Aanvullende figuur 1 toont een representatief ongeslaagd model waarin histopathologisch onderzoek geen evidente infiltratie van ontstekingscellen of fibrose aantoont.

Aanvullende figuur 1. Representatieve histologische bevindingen van een mislukt myocardinfarctmodel. Representatieve transversale hartdoorsneden van een muis bij wie de inductie van een myocardinfarct niet succesvol was, gekleurd met (A) hematoxyline en eosine (H&E), (B) Masson-trichroom en (C) Sirius Red. Vergeleken met de succesvolle inductie van een myocardinfarct vertonen deze coupes geen evidente infiltratie van ontstekingscellen of fibrotische remodellering in het myocard van de linker ventrikel, wat consistent is met een mislukte occlusie van de kransslagader. Schaalbalken = 1,000 µm.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In recente jaren zijn klinische en experimentele modellen van MI steeds belangrijker geworden in cardiovasculair onderzoek, maar veel vragen over de pathogenese van MI en strategieën voor de behandeling ervan blijven onbeantwoord. Dit artikel beschrijft een verfijnde methode voor het opzetten van een murine MI-model, waarbij verschillende kritieke procedurele stappen bijzondere aandacht vereisen. De eerste kritieke stap is de endotracheale intubatie. Sommige eerdere protocollen brengen de luchtweg vrij via een tracheotomie, wat vereist dat de cervicale huid wordt ingesneden en de weefsels worden gedisseceerd om de trachea voor intubatie bloot te leggen¹³; andere behouden orotracheale intubatie, maar bevelen een midline cervicale incisie aan om de visualisatie tijdens de procedure te verbeteren¹⁴. In tegenstelling tot beide benaderingen maakt het huidige protocol gebruik van een laryngoscoop om de orofarynx te verlichten en wordt orotracheale intubatie uitgevoerd onder directe visualisatie van de glottis zonder cervicale incisie. Hoewel deze benadering een groter beroep doet op de technische vaardigheid van de operator, voorkomt het trauma aan het cervicale weefsel, vermindert het het risico op infectie en postoperatieve pijn, en verkort het de operatietijd. De meest voorkomende fout tijdens intubatie is onbedoelde plaatsing in de slokdarm. Als de thorax niet oploopt tijdens ventilatie en de endotracheale tube geen condensatie vertoont tijdens expiratie, trek de tube dan onmiddellijk terug en herhaal de intubatie. Sluit de ventilator pas aan nadat symmetrische bilaterale beweging van de borstwand is bevestigd.

De tweede, en meest kritische, stap is de identificatie van de LAD-kransslagader en de nauwkeurige plaatsing van de ligatuur. Conventionele methoden staan in deze fase voor verschillende uitdagingen. De rusthartslag van de muis is ongeveer 500–600 beats/min, en de LAD ligt naast verschillende begeleidende kransslagaders, wat real-time intraoperatieve identificatie van de arterie inherent moeilijk maakt. Bovendien kan, zelfs onder optimale omstandigheden, een aanzienlijk deel van de LAD's niet duidelijk worden gevisualiseerd onder een dissectiemicroscoop¹⁵. Tegen deze achtergrond zijn eerdere protocollen, waarbij de ligatieplaats wordt geschat als een punt 1–2 mm onder de linker atriumoor, beperkt door de inconsistente intraoperatieve identificatie van dit anatomische referentiepunt^12,14, terwijl het complexe vertakkingspatroon van de linker kransslagader de reproduceerbaarheid verder kan belemmeren¹⁶. Om deze uitdagingen aan te pakken, gebruikt het huidige protocol de AIS als anatomisch kenmerk voor het positioneren van de ligatuur. Onder de dissectiemicroscoop verschijnt de AIS als een ondiepe groef op het ventrale oppervlak van het hart, waarbij de LAD er direct onder loopt. Het biedt daarom een relatief stabiel anatomisch referentiepunt dat minder afhankelijk is van de ervaring van de operator. Het positioneren van de ligatuur bij het bovenste derde deel van de AIS biedt een consistent anatomisch doel voor coronaire occlusie. De representatieve resultaten tonen aan dat deze benadering met succes het verwachte acute MI-fenotype produceerde in de onderzochte dieren.

Het AIS-referentiepunt is niet onder alle omstandigheden betrouwbaar. Wanneer de thoraxexpositie beperkt is of wanneer epicardiale bloedingen het hartoppervlak onduidelijk maken waardoor het AIS moeilijk te identificeren is, veeg het operatieveld dan voorzichtig schoon met een met zoutoplossing bevochtigde wattenstaaf en beoordeel de groeve opnieuw vóór de ligatie. Indien het AIS nog steeds niet met zekerheid kan worden geïdentificeerd, identificeer dan de LAD rechtstreeks zoals beschreven in het protocol en voer de ligatie uit onder directe visualisatie in plaats van te vertrouwen op het AIS. Bevestig indien nodig de juiste intercostaalruimte door caudaal te tellen vanaf de eerste rib om een adequate expositie van het linker atriumoor en de voorwand van de linker ventrikel te waarborgen.

Van de postoperatieve complicaties is pneumothorax de meest voorkomende en manifesteert zich doorgaans als respiratoire insufficiëntie na extubatie. De sleutel tot het voorkomen van een pneumothorax is de volledige evacuatie van resterende lucht uit de borstholte vóór het sluiten van de intercostale ruimte. Indien een pneumothorax wordt vermoed, dient de muis kortstondig opnieuw te worden genarceerd en geventileerd, waarna de huidhechtingen worden geopend en de intercostale sluiting wordt geïnspecteerd. Als één of meer plaatsen van onvolledige sluiting worden geïdentificeerd, moeten er aanvullende hechtingen worden geplaatst op de plek van het luchtlekkage voordat de extubatieprocedure opnieuw wordt uitgevoerd. Een andere potentiële complicatie is intraoperatieve bloedingen, die meestal optreden wanneer de naald een klein epicardiaal vat of een bijbehorende coronaire vene doorprikt tijdens de ligatie. Bloedingen zijn over het algemeen beperkt en kunnen meestal worden beheerst door gedurende enkele seconden zachte druk uit te oefenen met een met saline bevochtigd wattenstaafje. Bevestig vóór het sluiten van de borstholte dat er geen actieve bloedingen meer aanwezig zijn in het operatieveld om postoperatieve complicaties te minimaliseren. Daarnaast kunnen muizen tijdens of direct na de procedure ritmestoornissen ontwikkelen, waaronder premature ventriculaire contracties of voorbijgaande ventriculaire fibrillatie. Deze aritmieën worden vaak verlicht door de lichaamstemperatuur op peil te houden, de diepte van de anesthesie te stabiliseren en de procedure tijdelijk te pauzeren om spontaan herstel van het hartritme mogelijk te maken. Tot slot zijn anesthesiecomplicaties meestal het gevolg van het niet tijdig verlagen van de isofluraanconcentratie na een succesvolle tracheale intubatie. Verlaag de isofluraanconcentratie naar het onderhoudsniveau onmiddellijk nadat de endotracheale tube is aangesloten op de ventilator, en monitor de ademhaling en hartslag continu gedurende de gehele procedure.

Over het algemeen vereist deze methode aanzienlijke microsurgische vaardigheid en blijft deze, net als andere permanente LAD-coronaire arterieligatie-modellen, onderhevig aan variabiliteit als gevolg van anatomische verschillen in de kransslagaders en de ervaring van de operateur. Desalniettemin kunnen onderzoekers met een adequate training en een consistente chirurgische techniek het MI-model met een redelijke consistentie vestigen, terwijl de reproduceerbaarheid van de procedure en de postoperatieve overleving worden verbeterd.

Verschillende beperkingen van deze methode moeten worden erkend. Ten eerste werden de functionele en biochemische beoordelingen voltooid binnen één week na de inductie van het MI en weerspiegelen zij daarom alleen de acute fase van het MI, zonder systematische evaluatie van langetermijnuitkomsten zoals ventriculaire remodellering 4–8 weken na de operatie. Ten tweede kan dit protocol, net als andere modellen van permanent-ligatie MI die niet-absorbeerbare hechtingen gebruiken, leiden tot chronische pericardiale adhesies. Dit is een inherente eigenschap van het ligatiemodel en geen beperking die specifiek is voor de AIS-geleide benadering. De ernst van deze adhesies en hun effecten op de cardiale functie op lange termijn zijn echter in de huidige studie niet gekwantificeerd. Toekomstige studies zouden het gebruik van absorbeerbare hechtingen kunnen onderzoeken en hun effecten op adhesievorming en modelprestaties kunnen evalueren. Ten derde toonde driedimensionale coronaire beeldvorming kwalitatief aan dat de LAD onder de AIS loopt, maar de anatomische concordantie tussen deze structuren is nog niet gekwantificeerd in een voldoende grote cohorte. Ten vierde omvatte deze studie alleen mannelijke C57BL/6J muizen. Hoewel wordt verwacht dat de AIS een consistent anatomisch referentiepunt vormt, vereist de toepasbaarheid ervan bij vrouwelijke muizen, andere muizenstammen en andere soorten verdere validatie. Ten slotte zijn de potentiële voordelen van dit protocol met betrekking tot de consistentie van de ligatieplaats en de reproduceerbaarheid van de procedure gebaseerd op ervaringen binnen één enkel laboratorium en zijn ze niet geëvalueerd in een directe vergelijking met conventionele LAD-ligatiemethoden of over meerdere operateurs en instellingen heen. Aanvullende validatiestudies zullen daarom nodig zijn om de bredere generaliseerbaarheid van de methode vast te stellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,9% steriele zoutoplossing	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	–	Reconstitutie van cefazoline
3% agarose	Sigma-Aldrich	A0169	Inbedding van monsters
4% paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Fixatie van weefsel
Absolute ethanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0170A	Dehydratatie van weefsel; brandbaar
Zure fuchsine	Aladdin	A104916-100g	Bereiding van Ponceau–zure fuchsine-oplossing voor Masson-trichroomkleuring
AcqKnowledge-software	BIOPAC Systems	AcqKnowledge 4.0	Acquisitie en analyse van elektrocardiogrammen
Ammoniakoplossing, 0,5% waterig	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.2528A	Blauwen tijdens hematoxyline- en eosinekleuring
Anilineblauw, zuuroplosbaar	Aladdin	A111200-100g	Bereiding van anilineblauwe oplossing voor Masson-trichroomkleuring
Aseptische medische handschoenen	Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.	–	Chemische en biologische bescherming
Buprenorfine	Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.	H10940181	Postoperatieve analgesie
Cefazoline-natrium voor injectie	CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.	–	Perioperatieve antibiotische profylaxe
Wattenstaafjes	Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.	–	Epicardiale reiniging en aseptische voorbereiding
DAPI-kleuroplossing	Thermo Fisher	D1306	Nucleaire markering
Ontharingscrème	Veet	–	Ontharing van de thorax
Digitale coupescanner	3DHISTECH	Pannoramic MIDI II	Whole-slide imaging
ECG-versterker	BIOPAC Systems	ECG100C	Versterking van elektrocardiogrammen
Elektrocardiogram-registratiesysteem	BIOPAC Systems	MP160	Registratie van elektrocardiogrammen
ELISA-kit, muis B-type natriuretisch peptide	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RXW202726M	Kwantificatie van BNP in serum
ELISA-kit, muis interleukine-1β	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX203063M	Kwantificatie van IL-1β in serum
ELISA-kit, muis nucleaire factor-κB p65	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX201879M	Kwantificatie van NF-κB p65 in serum
ELISA-kit, muis tumornecrosefactor-α	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX202412M	Kwantificatie van TNF-α in serum
Inbedcassettes	Jiangsu Shitai	22022	Inbedding van weefsel
Endotracheale katheter, 20 G	Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.	B11103	Orale intubatie; buitendiameter ongeveer 0,9–1,0 mm; voor gebruik afgeknipt tot ongeveer 15 mm
Eosine Y, alcoholoplosbaar	Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.	Y0310-100G	Cytoplasmatische tegenkleuring tijdens hematoxyline- en eosinekleuring
Evans Blue	Jarvisbio	A312001	Markering van de coronaire vasculatuur
Fijne pincet	RWD Life Science	F12011-10	Weefselhantering en opening van het pericard
Fijne pincet, microsurgisch	RWD Life Science	FC12002T-08	Microsurgische weefselhantering
Fijne schaar	RWD Life Science	S12000-09	Oftalmologische schaar voor huidincisie en dissectie
glacial azijnzuur	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	–	Bereiding van 1% azijnzuur voor Masson-trichroomdifferentiatie
Glasplaatjes	Jiangsu Shitai	80312/80302	Montage van coupes
Glaskraalsterilisator	RWD Life Science	RS3002	Sterilisatie van instrumenten tussen dieren
GraphPad Prism-software	GraphPad Software	Version 5.0	Statistische analyse
Warmtemat	RWD Life Science	69020	Postoperatieve thermoregulatie
Hematoxyline-kleuroplossing	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Nucleaire kleuring tijdens hematoxyline- en eosinekleuring
Met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd detectie-antilichaam	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Inbegrepen bij ELISA-kits	ELISA-detectie
Zoutzuur	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.1337A	Bereiding van zuuralcohol voor hematoxylinedifferentiatie
Image-Pro Plus-software	Media Cybernetics	Version 6.0	Kwantificatie van het collagenvolumefractie
Imaris-software	Bitplane	Version 7.2.3	Driedimensionale reconstructie en analyse
Isofluraan	RWD Life Science	R510-22-10	Inhalatieanesthesie
Isofluraan-anesthesiesysteem	RWD Life Science	TAIJI-IE	Toediening van isofluraan
Laryngoscoop, voor kleine dieren	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.	SR310-MR	Directe visualisatie tijdens intubatie
Light-sheet fluorescentiemicroscoop	Light Innovation Technology	LiToneXL	Driedimensionale fluorescentie-imaging
LitScan-software	Light Innovation Technology	Version 3.31	Afbeeldingstitching en conversie
Mechanische ventilator	Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.	HX-101E	Mechanische ventilatie; 130 ademhalingen/min; tidal volume 2 mL
Micro-muggenhemostaat	RWD Life Science	FC21001R-12	Naaldhouder tijdens ligatie en sluiting
Microliter-spuit	Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.	–	Gelokaliseerde DAPI-injectie
Microplate-reader	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax iD5	Meting van de optische dichtheid bij 450 nm
Microscoop, dissectie	Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.	MSD204	Intraoperatieve visualisatie
Microscoop, rechtopstaand licht	Leica	DM500	Histologische imaging
Microtoombladen	Epredia	MX35 ULTRA	Paraffine-coupesnijden
Gemodificeerde Sirius Red-kleurkit	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1078	Collageenkleuring; bevat oplossingen A, B en C
n-Butanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0886A	Histologische dehydratatie en klaring; brandbaar
Neutrale montagehars	Shanghai Yiyang	YSQN41-91	Montage op glasplaatjes
Nylonhechting, 3/8-cirkel 7-0 met naald	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	–	Ligatie van de linker anterior descending coronaire arterie
Nylonhechting, 5-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	–	Sluiting van thorax en huid
Nylonhechting, 6-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	–	Expositie en tractie van de borstwand
Paraffine-inbedstation	Wuhan Junjie Electronics	JB-L5	Inbedding van weefsel
Paraffine-was	NA	NA	Infiltratie en inbedding van weefsel
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	P3813	Wassen van weefsel en verdunning van reagentia
Fosfomolybdeenzuur	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.	–	Masson-trichroomdifferentiatie
Ponceau 2R	Aladdin	P104989-25g	Bereiding van Ponceau–zure fuchsine-oplossing voor Masson-trichroomkleuring
Kaliumdichromaat	Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory	7778-50-9	Masson-trichroombeits
Povidoon–jodium	SingleLady	GB26368-2010	Huiddesinfectie
Omgekeerd osmosewater	Laboratoriumgezuiverd	Niet van toepassing	Bereiding van oplossingen
Rotatiemicrotoom	Leica Instruments (Shanghai)	RM2016	Paraffine-coupesnijden
Monsterhouder-adapter	Light Innovation Technology	Geleverd bij LiToneXL	Montage van geklaarde monsters voor light-sheet imaging
Huidplakband	Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.	–	Fixeren van ledematen en staart
Dekglasjes	Jiangsu Shitai	80340-1630	Dekken van coupes
Glasplaatjesdroger	Shaoxing Luyue	101-3B	Drogen van glasplaatjes
Stopoplossing	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Inbegrepen bij ELISA-kits	Beëindiging van de ELISA-reactie
Substraatoplossingen A en B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Inbegrepen bij ELISA-kits	ELISA-kleurentwikkeling
Weefseldrijfbad	Wuhan Junjie Electronics	JK-5/6	Drijven van coupes
Weefselprocessor	Wuhan Junjie Electronics	JT-12S	Geautomatiseerde weefselverwerking
Weefselklaringskit, reagentia A–F	Jarvisbio	JA11012	Oplosmiddelgebaseerde weefselklaring
Tracheale intubatieplatform	RWD Life Science	Re20-M	Positionering voor orale intubatie
Ultrasone analyse-software	Fujifilm VisualSonics	VevoLAB 3.2.6	Analyse van echocardiografische gegevens
Ultrasone gel	Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.	TM-100	Echocardiografische koppeling
Ultrasone imaging-systeem	Fujifilm VisualSonics	Vevo 3100	Echocardiografie
V-vormige ooglidretractor	Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.	SS5009G	Intercostale en ribretractie
Wasbuffer	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Inbegrepen bij ELISA-kits	Wassen van ELISA-plaatjes
Waterzuiveringssysteem	Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.	UPT-II-20T	Productie van omgekeerd osmosewater
Xyleen	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0586A	Weefselklaring en deparaffinering; brandbaar en neurotoxisch