Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
miR-488-3p kan dienen als een nieuwe niet-invasieve diagnostische marker voor RA. miR-488-3p moduleert de biologische functie van synoviocyten via ROCK1. Er werd een significante negatieve correlatie aangetoond met de ernst van de ziekte bij RA-patiënten.
De diagnose van reumatoïde artritis (RA) blijft uitdagend vanwege de beperkingen van bestaande biomarkers. Het doel van de studie was om het potentieel van miR-488-3p in serum als biomarker voor RA te onderzoeken en het potentiële werkingsmechanisme ervan te onthullen. De studie omvatte 135 RA-patiënten, 130 patiënten met artrose (OA) en 125 gezonde controles. De expressieniveaus van miR-488-3p werden onderzocht middels RT-qPCR. Het werkingsmechanisme werd geanalyseerd via functionele tests (CCK-8, flowcytometrie, ELISA) en target-validatie-experimenten (luciferase reportergen, RIP). De serumexpressieniveaus van miR-488-3p waren significant lager bij RA-patiënten dan bij patiënten met artrose (OA) en gezonde controles (p < 0,001). ROC-curve-analyse toonde aan dat miR-488-3p een hoge diagnostische nauwkeurigheid had bij het onderscheiden van RA van gezonde controles en OA-patiënten. miR-488-3p correleerde negatief met de erytrocytbezinkingssnelheid (ESR), C-reactief proteïne (CRP), reumafactor (RF) en DAS28-scores. Functionele validatie onthulde dat overexpressie van miR-488-3p de proliferatie en inflammatoire respons van synoviocyten remde, terwijl het apoptose induceerde. Mechanistische studies toonden aan dat miR-488-3p direct kon targeten op Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1), wat de beschermende effecten medieert. Serum miR-488-3p is veelbelovend als een nieuwe niet-invasieve diagnostische marker voor RA en beschermt synoviocyten tegen beschadiging.
Reumatoïde artritis (RA) is een veelvoorkomende auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door synoviale ontsteking, gewrichtserosie en destructie1,2. De wereldwijde prevalentie van RA is ongeveer 0,5%–1%3, wat de levenskwaliteit en het vermogen om te werken van patiënten ernstig beïnvloedt. De ziekte heeft een sluipend begin, en vroege symptomen zijn vaak atypisch en worden gemakkelijk verkeerd gediagnosticeerd of over het hoofd gezien4. Naarmate de ziekte vordert, kan dit leiden tot gewrichtsdeformiteit, functieverlies en zelfs een verhoogd risico op complicaties zoals hart- en vaatziekten5, wat een aanzienlijke last vormt voor patiënten, hun families en de gezondheidszorgsystemen.
Op dit moment is een combinatie van klinische symptomen, tekenen, laboratoriumtesten en beeldvormende evaluatie vereist voor de diagnose van RA6. Veelgebruikte laboratoriumindicatoren zijn de bezinkingssnelheid (ESR) en C-reactief proteïne (CRP), welke aspecifieke markers zijn voor systemische inflammatie, evenals reumafactor (RF) en anti-cyclisch gecitrullineerd peptide (anti-CCP) antilichamen, die belangrijke serologische biomarkers zijn voor RA7,8. Deze traditionele biomarkers hebben echter beperkingen: RF kan positief zijn bij sommige gezonde personen en patiënten met andere auto-immuunziekten (vals-positief percentage van ongeveer 5%); anti-CCP is zeer specifiek (>95%), maar heeft een beperkte sensitiviteit in de vroege stadia van de ziekte (ongeveer 60–70%)4,9, en sommige patiënten met RA blijven seronegatief10. Daarom is het belangrijk om sensitievere en specifiekere biomarkers te vinden voor de vroege diagnose, ziektemonitoring en prognosebeoordeling van RA11.
MicroRNA's (miRNA's) zijn een groep endogene, niet-coderende regulerende RNA-moleculen met een lengte van ongeveer 22–25 basen12,13. Er is vastgesteld dat miRNA's fungeren als sleutelregulatoren bij de ontwikkeling van diverse ziekten, en dat hun aberrante expressie nauw verbonden is met de pathogenese van ziekten13,14,15, waardoor miRNA's veelbelovende biomarkers zijn voor ziektevroegdiagnostiek en therapeutische monitoring. In de afgelopen jaren is de rol van miRNA's bij RA in toenemende mate in aandacht gekomen16. Studies hebben aangetoond dat meerdere miRNA's geassocieerd zijn met een ontregelde expressie (bijv. miR-146a, miR-155, etc.) in serum, synoviale weefsels en perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) van RA-patiënten17,18,19. Deze miRNA's dragen bij aan de pathogenese van RA door de productie van inflammatoire cytokinen te reguleren, de proliferatie en invasie van synoviale cellen te bevorderen en de differentiatie van osteoclasten te beïnvloeden20. Hiervan is miR-488 gelokaliseerd in de regio 1q25.2 van het menselijk chromosoom21, en eerdere studies hebben de neuroprotectieve effecten ervan bevestigd: het speelt een regulerende rol bij de progressie van gliomen22 en neuroblastomen23, en opmerkelijk is dat miR-488-3p apoptose van osteoarthritische chondrocyten bij artrose (OA) bevordert24. Hoewel OA en RA verschillende gewrichtsaandoeningen zijn, delen ze gemeenschappelijke mechanismen in de pathologische processen van synoviale ontsteking en kraakbeendestructie25. Wij stelden de hypothese op dat miR-488-3p een rol kan spelen bij RA door soortgelijke target-pathways te reguleren. De specifieke rol en potentiële mechanismen van miR-488-3p bij RA zijn echter nog niet opgehelderd.
De studie onderzocht de veranderingen in de expressieniveaus van serum miR-488-3p bij RA-patiënten en de relatie hiervan met ziekteactiviteit en klinische indicatoren, met als doel de potentiële waarde ervan als niet-invasieve diagnostische marker voor RA te evalueren. Deze studie biedt een nieuw inzicht in de vroege screening en de voorspelling van ziekteprogressie bij RA, waardoor de prognose van RA-patiënten wordt verbeterd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Hefei BOE Hospital (goedkeuringsnummer 2021–1), en van alle deelnemers werd voorafgaand aan de inclusie schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.
Patiënten en monsters
Voor deze studie werden 135 patiënten met RA (gediagnosticeerd volgens de 2010 ACR/EULAR-classificatiecriteria) geworven vanuit de afdeling Reumatologie en Immunologie van het Hefei BOE-ziekenhuis, 130 patiënten met OA vanuit de afdeling Orthopedie (gediagnosticeerd volgens de 2018 OA-diagnostische criteria van de Chinese Medical Association), en 125 op leeftijd en geslacht afgestemde gezonde controles uit het medisch onderzoekscentrum van hetzelfde ziekenhuis. De deelnemers waren tussen de 30 en 80 jaar oud. Bij de gezonde controles werd door middel van een uitgebreide anamnese, lichamelijk onderzoek en laboratoriumtests bevestigd dat er geen sprake was van auto-immuunziekten, gewrichtsaandoeningen of acute infecties. Deelnemers werden uitgesloten indien zij leden aan comorbide auto-immuunziekten, een voorgeschiedenis van infectie of trauma in de afgelopen 3 maanden hadden, een maligniteit hadden, of zwanger waren of borstvoeding gaven.
Bemonstering en preparatie
Er werd nuchter veneus bloed afgenomen bij alle studieonderwerpen. Na stolling bij kamertemperatuur gedurende 30 min werden serummonsters geïsoleerd door centrifugatie bij 1500 × g gedurende 15 min. Het serum werd bewaard bij -80°C tot aan verdere analyse.
Detectie van klinische en serologische markers
Om de ziektestatus en inflammatoire activiteit uitgebreid te evalueren, werden klinische en serologische biomarkers gemeten met gestandaardiseerde klinische laboratoriummethoden. De BSE werd gemeten met de Westergren-methode om aspecifieke systemische inflammatie te beoordelen. CRP werd gekwantificeerd met een immunoturbidimetrische assay (normale referentiewaarde: <10 mg/L) om de acute-fase-inflammatoire respons te evalueren. RF werd gemeten met een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met een normale referentiewaarde van ≤20 IU/mL. Anti-CCP-antilichamen werden gemeten met een ELISA van de tweede generatie om serologisch bewijs te leveren voor de diagnose van RA.
Cellijnen en kweek
Menselijke fibroblast-achtige synoviocyten beïnvloed door RA (HFLS-RA) cellen werden gekweekt in Dulbecco's Modified Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. De cellen werden bewaard in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂, en cellen tussen de derde en zesde passage werden gebruikt voor alle experimenten.
RNA-extractie en kwantitatieve real-time RT-PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit serummonsters met behulp van een RNA-extractiereagens. Reverse transcriptie werd uitgevoerd met een miRNA first-strand synthesekit voor miRNA's en een reverse transcriptiekit voor messenger RNA (mRNA) doelgenen volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (RT-qPCR) werd uitgevoerd met een real-time PCR-systeem met een op SYBR Green gebaseerde PCR-mastermix. Het thermocycle-programma werd ingesteld op 95 °C pre-denaturatie gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van amplificatie (95 °C denaturatie gedurende 5 s en 60 °C annealing/extensie gedurende 30 s). Elk monster werd in triplo geanalyseerd. U6 small nuclear RNA (U6 snRNA) en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) dienden respectievelijk als endogene referentiegenen voor de normalisatie van miRNA en mRNA. De primersequenties zijn samengevat in Supplementary Table 1. De relatieve expressieniveaus van miR-488-3p en de bijbehorende doelgenen werden berekend met de 2−ΔΔCt methode. De veranderingen in de mRNA-niveaus van doelgenen na overexpressie of inhibitie van miR-488-3p werden eveneens geanalyseerd om hun regulatoire relaties te verifiëren.
Celtransfectie
HFLS-RA-cellen werden gezaaid in 6-wells platen met een dichtheid van 5 × 105 cellen/well. De cellen werden getransfecteerd met een liposoom-gebaseerd transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. De transfectiegroepen bestonden uit groepen met enkelvoudige transfectie en co-transfectie. De enkelvoudige transfectiegroepen waren: 1) controle—niet-getransfecteerde cellen; 2) mimic negatieve controle (NC)—cellen getransfecteerd met de negatieve controle van de miR-488-3p mimic; 3) miR-488-3p mimic—cellen getransfecteerd met de miR-488-3p mimic; 4) inhibitor NC—cellen getransfecteerd met de negatieve controle van de miR-488-3p inhibitor; 5) miR-488-3p inhibitor—cellen getransfecteerd met de miR-488-3p inhibitor. De co-transfectiegroepen waren: 1) miR-488-3p mimic + overexpressie-NC (oe-NC)—cellen co-getransfecteerd met de miR-488-3p mimic en de negatieve controle van de ROCK1-overexpressievectoren; 2) miR-488-3p mimic + oe-ROCK1—cellen co-getransfecteerd met de miR-488-3p mimic en ROCK1-overexpressievectoren. Alle transfectiesequenties zijn samengevat in Aanvullende Tabel 1. De overexpressievector van ROCK1 werd gemaakt door de coderende sequentie (CDS) regio te kloneren in het pcDNA 3.1-plasmide. De getransfecteerde cellen waren 48 u na de celtransfectie beschikbaar voor de volgende experimenten.
Celfunctieanalyse
Celproliferatie-assay (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Getransfecteerde HFLS-RA-cellen werden geënt in 96-wells platen met 5 × 103 cellen/well, met drie replicate wells per groep. Op 0, 24, 48 en 72 u na transfectie werd 10 µL CCK-8-oplossing aan elke well toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 2 u. De absorbentie werd gemeten bij 450 nm (detectiegolflengte) en 630 nm (referentiegolflengte) met een microplate reader. De relatieve proliferatiesnelheid werd berekend met 0 u als baseline.
Detectie van apoptose (flowcytometrie): Apoptose werd beoordeeld door analyse met een Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)/propidiumjodide (PI) apoptose-assay. Cellen werden getransfecteerd met de juiste plasmiden en vervolgens verzameld na trypsinisatie. De apoptosegraad werd bepaald via flowcytometrie.
Bepaling van ontstekingsfactoren (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]): HFLS-RA-cellen werden gezaaid in 24-wells platen en gedurende 48 u getransfecteerd met de aangegeven miR-488-3p-mimic, miR-488-3p-inhibitor of de overeenkomstige negatieve controles. De concentraties van interleukine-6 (IL-6), tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-1β (IL-1β) in de supernatanten van de celculturen werden gekwantificeerd met behulp van ELISA-kits.
Targetvalidatie
Voorspelling van het doelwit: Met behulp van de TargetScan-database26 werd voorspeld dat ROCK1 een downstream doelwit is van miR-488-3p. De voorspelde bindingsplaatsen tussen miR-488-3p en de 3′-niet-vertaalde regio (3′UTR) van ROCK1 werden eveneens geïdentificeerd.
Dual-Luciferase Reporter Gene Assay: Het wild-type of gemuteerde 3′UTR van ROCK1 werd gekloond in het pGL3-plasmide. De voorspelde bindings- en mutatieplaatsen worden weergegeven in Figuur 4. HEK-293T-cellen werden co-getransfecteerd met miR-488-3p mimic of inhibitor samen met de geconstrueerde vectoren27. De luciferase-activiteit werd gemeten 48 u na transfectie met miR-488-3p mimic of inhibitor.
RNA-immunoprecipitatie (RIP): HFLS-RA-cellen werden geïncubeerd met een anti-Argonaute 2 (Ago2) antilichaam (RRID: AB_2882071, verdunning 1:200) of een immunoglobuline G (IgG) controle-antilichaam (RRID: AB_2819160, verdunning 1:5000), gevolgd door RNA-extractie en kwantitatieve PCR (qPCR) voor de verrijking van ROCK1 mRNA zoals hierboven beschreven.
Statistische analyse
De studie werd statistisch geanalyseerd met SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) en GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Meetgegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Alle experimenten werden uitgevoerd met drie biologische replica's, waarbij elke biologische replica in triplo werd geanalyseerd. De ruwe gegevens zijn toegevoegd in het aanvullende materiaal. De gegevens werden geëvalueerd met een normale waarschijnlijkheidsplot (P-P plot) voorafgaand aan de parametrische statistische toetsen. De t-toets voor onafhankelijke steekproeven werd gebruikt om continue basisvariabelen (bijv. leeftijd, body mass index [BMI], etc.) te vergelijken en de chi-kwadraattoets werd gebruikt voor categorische variabelen (bijv. geslacht, etc.). Genexpressieniveaus werden vergeleken met een t-toets voor onafhankelijke steekproeven. Veranderingen in celproliferatie op verschillende tijdstippen werden geanalyseerd met een variantieanalyse (ANOVA) met herhaalde metingen, terwijl een eenweg-ANOVA werd gebruikt om apoptosepercentages bepaald via flowcytometrie te vergelijken. Correlatieanalyse werd uitgevoerd met Spearman (voor variabelen die niet aan de normale verdeling voldeden) en Pearson (voor variabelen die aan de normale verdeling voldeden). De diagnostische prestaties werden geëvalueerd met een receiver operating characteristic (ROC) curve-analyse. De optimale afkapwaarde, sensitiviteit en specificiteit werden bepaald met de maximale Youden-index. Alle statistische toetsen waren tweezijdig en p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Basiskenmerken van de studedeelnemers
Deze studie omvatte 125 gezonde controles, 130 patiënten met OA en 135 patiënten met RA voor systematische analyse (Tabel 1). Er waren geen significante verschillen in de baselinekenmerken van de drie groepen met betrekking tot leeftijd (p = 0,191), geslachtsverhouding (p = 0,203) en BMI (p = 0,562), wat de vergelijkbaarheid van de studiepopulatie waarborgde. Wat betreft de ziektekenmerken waren ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Zoals benadrukt door Smolen et al1 in de nieuwste richtlijnen voor de diagnose en behandeling van RA, heeft de ontwikkeling van nieuwe biomarkers een aanzienlijke klinische waarde. In deze studie hebben we bevestigd dat serum miR-488-3p significant verlaagd was bij patiënten met RA en een veelbelovende diagnostische prestatie vertoonde, met een relatief bevredigende sensitiviteit en specificiteit. Vroege diagnose van RA is altijd een klinische uitdaging geweest, en bestaande biomarkers zijn onvold...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengelingen zijn.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC apoptosedetectiekit | BD Bioscience | 556547 | celapoptose |
| anti-Ago2-antilichaam | Proteintech | 66720-1-Ig | RNA-immunoprecipitatie |
| CCK-8-oplossing | Dojindo | CK04 | celproliferatie |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 121000146 | celkweek |
| Foetaal runderserum | Thermo Fisher | 10437028 | celcultuur |
| Flowcytometer | BD Bioscience | FACSCalibur | celapoptose |
| Human anti-CCP antilichaam ELISA-kit | Cusabio | CSB-E09077h | anti-CCP-detectie |
| Human RF-IgA ELISA-kit | Feien Biotechnology | EH4270 | RF-detectie |
| Fibroblast-achtige synoviocyten van mensen met reumatoïde artritis (HFLS-RA) | Celtoepassingen | HFLS-RA-200 | in vitro validatie van de functie van miR-488-3p |
| IgG-controleantilichaam | Abcam | ab205718 | RNA-immunoprecipitatie |
| Interleukine-1β (IL-1βELISA-kit | R&D Systems | DY201-05 | cellulair IL-1β concentratie |
| Interleukine-6 (IL-6) ELISA-kit | R&D Systemen | D6050B | cellulaire IL-6-concentratie |
| Liposoomtransfectiereagens 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | celtransfectie |
| Microplaatlezer | BioTek | ELx808 | ELISA-assay |
| Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | omgekeerde transcriptie |
| Opti-MEM-medium | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | celtransfectie |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | overexpressie van ROCK1 |
| Penicilline-streptomycine | Thermo Fisher | 15140122 | celkweek |
| Phadia 250 laboratoriumsysteem | Thermo Fisher | Phadia 250 | bloedanalyse |
| PrimeScriptTM Reverse Transcription Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | omgekeerde transcriptie |
| Propidiumjodide (PI)/ribonuclease (RNase) | BD Bioscience | 550825 | celapoptose |
| QuantStudio 5-systeem | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | PCR-assay |
| RNAiso Plus-reagens | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | RNA-isolatie |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | PCR-amplificatie |
| TargetScan-database | TargetScan | Het is niet mogelijk om een vertaling uit te voeren omdat er geen brontekst is verstrekt. Voeg aub de tekst toe die vertaald moet worden. | voorspelling van bindingsplaatsen, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-reactief proteïne IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | CRP-detectie |
| Tumornecrosefactor-α (TNF-α) ELISA-kit | R&D Systems | DY210-05 | cellulair TNF-α concentratie |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.