Onderzoeksartikel

Serumexpressie van Mir-488-3p dient als niet-invasieve diagnostische biomarker bij patiënten met reumatoïde artritis

27 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72346

⸱

28 augustus 2026

 , 
1Department of Medical Laboratory, Hefei BOE Hospital

In dit artikel

Samenvatting

miR-488-3p kan dienen als een nieuwe niet-invasieve diagnostische marker voor RA. miR-488-3p moduleert de biologische functie van synoviocyten via ROCK1. Er werd een significante negatieve correlatie aangetoond met de ernst van de ziekte bij RA-patiënten.

Samenvatting

De diagnose van reumatoïde artritis (RA) blijft uitdagend vanwege de beperkingen van bestaande biomarkers. Het doel van de studie was om het potentieel van miR-488-3p in serum als biomarker voor RA te onderzoeken en het potentiële werkingsmechanisme ervan te onthullen. De studie omvatte 135 RA-patiënten, 130 patiënten met artrose (OA) en 125 gezonde controles. De expressieniveaus van miR-488-3p werden onderzocht middels RT-qPCR. Het werkingsmechanisme werd geanalyseerd via functionele tests (CCK-8, flowcytometrie, ELISA) en target-validatie-experimenten (luciferase reportergen, RIP). De serumexpressieniveaus van miR-488-3p waren significant lager bij RA-patiënten dan bij patiënten met artrose (OA) en gezonde controles (p < 0,001). ROC-curve-analyse toonde aan dat miR-488-3p een hoge diagnostische nauwkeurigheid had bij het onderscheiden van RA van gezonde controles en OA-patiënten. miR-488-3p correleerde negatief met de erytrocytbezinkingssnelheid (ESR), C-reactief proteïne (CRP), reumafactor (RF) en DAS28-scores. Functionele validatie onthulde dat overexpressie van miR-488-3p de proliferatie en inflammatoire respons van synoviocyten remde, terwijl het apoptose induceerde. Mechanistische studies toonden aan dat miR-488-3p direct kon targeten op Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1), wat de beschermende effecten medieert. Serum miR-488-3p is veelbelovend als een nieuwe niet-invasieve diagnostische marker voor RA en beschermt synoviocyten tegen beschadiging.

Inleiding

Reumatoïde artritis (RA) is een veelvoorkomende auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door synoviale ontsteking, gewrichtserosie en destructie1,2. De wereldwijde prevalentie van RA is ongeveer 0,5%–1%3, wat de levenskwaliteit en het vermogen om te werken van patiënten ernstig beïnvloedt. De ziekte heeft een sluipend begin, en vroege symptomen zijn vaak atypisch en worden gemakkelijk verkeerd gediagnosticeerd of over het hoofd gezien4. Naarmate de ziekte vordert, kan dit leiden tot gewrichtsdeformiteit, functieverlies en zelfs een verhoogd risico op complicaties zoals hart- en vaatziekten5, wat een aanzienlijke last vormt voor patiënten, hun families en de gezondheidszorgsystemen.

Op dit moment is een combinatie van klinische symptomen, tekenen, laboratoriumtesten en beeldvormende evaluatie vereist voor de diagnose van RA6. Veelgebruikte laboratoriumindicatoren zijn de bezinkingssnelheid (ESR) en C-reactief proteïne (CRP), welke aspecifieke markers zijn voor systemische inflammatie, evenals reumafactor (RF) en anti-cyclisch gecitrullineerd peptide (anti-CCP) antilichamen, die belangrijke serologische biomarkers zijn voor RA7,8. Deze traditionele biomarkers hebben echter beperkingen: RF kan positief zijn bij sommige gezonde personen en patiënten met andere auto-immuunziekten (vals-positief percentage van ongeveer 5%); anti-CCP is zeer specifiek (>95%), maar heeft een beperkte sensitiviteit in de vroege stadia van de ziekte (ongeveer 60–70%)4,9, en sommige patiënten met RA blijven seronegatief10. Daarom is het belangrijk om sensitievere en specifiekere biomarkers te vinden voor de vroege diagnose, ziektemonitoring en prognosebeoordeling van RA11.

MicroRNA's (miRNA's) zijn een groep endogene, niet-coderende regulerende RNA-moleculen met een lengte van ongeveer 22–25 basen12,13. Er is vastgesteld dat miRNA's fungeren als sleutelregulatoren bij de ontwikkeling van diverse ziekten, en dat hun aberrante expressie nauw verbonden is met de pathogenese van ziekten13,14,15, waardoor miRNA's veelbelovende biomarkers zijn voor ziektevroegdiagnostiek en therapeutische monitoring. In de afgelopen jaren is de rol van miRNA's bij RA in toenemende mate in aandacht gekomen16. Studies hebben aangetoond dat meerdere miRNA's geassocieerd zijn met een ontregelde expressie (bijv. miR-146a, miR-155, etc.) in serum, synoviale weefsels en perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) van RA-patiënten17,18,19. Deze miRNA's dragen bij aan de pathogenese van RA door de productie van inflammatoire cytokinen te reguleren, de proliferatie en invasie van synoviale cellen te bevorderen en de differentiatie van osteoclasten te beïnvloeden20. Hiervan is miR-488 gelokaliseerd in de regio 1q25.2 van het menselijk chromosoom21, en eerdere studies hebben de neuroprotectieve effecten ervan bevestigd: het speelt een regulerende rol bij de progressie van gliomen22 en neuroblastomen23, en opmerkelijk is dat miR-488-3p apoptose van osteoarthritische chondrocyten bij artrose (OA) bevordert24. Hoewel OA en RA verschillende gewrichtsaandoeningen zijn, delen ze gemeenschappelijke mechanismen in de pathologische processen van synoviale ontsteking en kraakbeendestructie25. Wij stelden de hypothese op dat miR-488-3p een rol kan spelen bij RA door soortgelijke target-pathways te reguleren. De specifieke rol en potentiële mechanismen van miR-488-3p bij RA zijn echter nog niet opgehelderd.

De studie onderzocht de veranderingen in de expressieniveaus van serum miR-488-3p bij RA-patiënten en de relatie hiervan met ziekteactiviteit en klinische indicatoren, met als doel de potentiële waarde ervan als niet-invasieve diagnostische marker voor RA te evalueren. Deze studie biedt een nieuw inzicht in de vroege screening en de voorspelling van ziekteprogressie bij RA, waardoor de prognose van RA-patiënten wordt verbeterd.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Hefei BOE Hospital (goedkeuringsnummer 2021–1), en van alle deelnemers werd voorafgaand aan de inclusie schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.

Patiënten en monsters

Voor deze studie werden 135 patiënten met RA (gediagnosticeerd volgens de 2010 ACR/EULAR-classificatiecriteria) geworven vanuit de afdeling Reumatologie en Immunologie van het Hefei BOE-ziekenhuis, 130 patiënten met OA vanuit de afdeling Orthopedie (gediagnosticeerd volgens de 2018 OA-diagnostische criteria van de Chinese Medical Association), en 125 op leeftijd en geslacht afgestemde gezonde controles uit het medisch onderzoekscentrum van hetzelfde ziekenhuis. De deelnemers waren tussen de 30 en 80 jaar oud. Bij de gezonde controles werd door middel van een uitgebreide anamnese, lichamelijk onderzoek en laboratoriumtests bevestigd dat er geen sprake was van auto-immuunziekten, gewrichtsaandoeningen of acute infecties. Deelnemers werden uitgesloten indien zij leden aan comorbide auto-immuunziekten, een voorgeschiedenis van infectie of trauma in de afgelopen 3 maanden hadden, een maligniteit hadden, of zwanger waren of borstvoeding gaven.

Bemonstering en preparatie

Er werd nuchter veneus bloed afgenomen bij alle studieonderwerpen. Na stolling bij kamertemperatuur gedurende 30 min werden serummonsters geïsoleerd door centrifugatie bij 1500 × g gedurende 15 min. Het serum werd bewaard bij -80°C tot aan verdere analyse.

Detectie van klinische en serologische markers

Om de ziektestatus en inflammatoire activiteit uitgebreid te evalueren, werden klinische en serologische biomarkers gemeten met gestandaardiseerde klinische laboratoriummethoden. De BSE werd gemeten met de Westergren-methode om aspecifieke systemische inflammatie te beoordelen. CRP werd gekwantificeerd met een immunoturbidimetrische assay (normale referentiewaarde: <10 mg/L) om de acute-fase-inflammatoire respons te evalueren. RF werd gemeten met een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met een normale referentiewaarde van ≤20 IU/mL. Anti-CCP-antilichamen werden gemeten met een ELISA van de tweede generatie om serologisch bewijs te leveren voor de diagnose van RA.

Cellijnen en kweek

Menselijke fibroblast-achtige synoviocyten beïnvloed door RA (HFLS-RA) cellen werden gekweekt in Dulbecco's Modified Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. De cellen werden bewaard in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂, en cellen tussen de derde en zesde passage werden gebruikt voor alle experimenten.

RNA-extractie en kwantitatieve real-time RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit serummonsters met behulp van een RNA-extractiereagens. Reverse transcriptie werd uitgevoerd met een miRNA first-strand synthesekit voor miRNA's en een reverse transcriptiekit voor messenger RNA (mRNA) doelgenen volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (RT-qPCR) werd uitgevoerd met een real-time PCR-systeem met een op SYBR Green gebaseerde PCR-mastermix. Het thermocycle-programma werd ingesteld op 95 °C pre-denaturatie gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van amplificatie (95 °C denaturatie gedurende 5 s en 60 °C annealing/extensie gedurende 30 s). Elk monster werd in triplo geanalyseerd. U6 small nuclear RNA (U6 snRNA) en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) dienden respectievelijk als endogene referentiegenen voor de normalisatie van miRNA en mRNA. De primersequenties zijn samengevat in Supplementary Table 1. De relatieve expressieniveaus van miR-488-3p en de bijbehorende doelgenen werden berekend met de 2−ΔΔCt methode. De veranderingen in de mRNA-niveaus van doelgenen na overexpressie of inhibitie van miR-488-3p werden eveneens geanalyseerd om hun regulatoire relaties te verifiëren.

Celtransfectie

HFLS-RA-cellen werden gezaaid in 6-wells platen met een dichtheid van 5 × 105 cellen/well. De cellen werden getransfecteerd met een liposoom-gebaseerd transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. De transfectiegroepen bestonden uit groepen met enkelvoudige transfectie en co-transfectie. De enkelvoudige transfectiegroepen waren: 1) controle—niet-getransfecteerde cellen; 2) mimic negatieve controle (NC)—cellen getransfecteerd met de negatieve controle van de miR-488-3p mimic; 3) miR-488-3p mimic—cellen getransfecteerd met de miR-488-3p mimic; 4) inhibitor NC—cellen getransfecteerd met de negatieve controle van de miR-488-3p inhibitor; 5) miR-488-3p inhibitor—cellen getransfecteerd met de miR-488-3p inhibitor. De co-transfectiegroepen waren: 1) miR-488-3p mimic + overexpressie-NC (oe-NC)—cellen co-getransfecteerd met de miR-488-3p mimic en de negatieve controle van de ROCK1-overexpressievectoren; 2) miR-488-3p mimic + oe-ROCK1—cellen co-getransfecteerd met de miR-488-3p mimic en ROCK1-overexpressievectoren. Alle transfectiesequenties zijn samengevat in Aanvullende Tabel 1. De overexpressievector van ROCK1 werd gemaakt door de coderende sequentie (CDS) regio te kloneren in het pcDNA 3.1-plasmide. De getransfecteerde cellen waren 48 u na de celtransfectie beschikbaar voor de volgende experimenten.

Celfunctieanalyse

Celproliferatie-assay (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Getransfecteerde HFLS-RA-cellen werden geënt in 96-wells platen met 5 × 103 cellen/well, met drie replicate wells per groep. Op 0, 24, 48 en 72 u na transfectie werd 10 µL CCK-8-oplossing aan elke well toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 2 u. De absorbentie werd gemeten bij 450 nm (detectiegolflengte) en 630 nm (referentiegolflengte) met een microplate reader. De relatieve proliferatiesnelheid werd berekend met 0 u als baseline.

Detectie van apoptose (flowcytometrie): Apoptose werd beoordeeld door analyse met een Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)/propidiumjodide (PI) apoptose-assay. Cellen werden getransfecteerd met de juiste plasmiden en vervolgens verzameld na trypsinisatie. De apoptosegraad werd bepaald via flowcytometrie.

Bepaling van ontstekingsfactoren (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA]): HFLS-RA-cellen werden gezaaid in 24-wells platen en gedurende 48 u getransfecteerd met de aangegeven miR-488-3p-mimic, miR-488-3p-inhibitor of de overeenkomstige negatieve controles. De concentraties van interleukine-6 (IL-6), tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-1β (IL-1β) in de supernatanten van de celculturen werden gekwantificeerd met behulp van ELISA-kits.

Targetvalidatie

Voorspelling van het doelwit: Met behulp van de TargetScan-database26 werd voorspeld dat ROCK1 een downstream doelwit is van miR-488-3p. De voorspelde bindingsplaatsen tussen miR-488-3p en de 3′-niet-vertaalde regio (3′UTR) van ROCK1 werden eveneens geïdentificeerd.

Dual-Luciferase Reporter Gene Assay: Het wild-type of gemuteerde 3′UTR van ROCK1 werd gekloond in het pGL3-plasmide. De voorspelde bindings- en mutatieplaatsen worden weergegeven in Figuur 4. HEK-293T-cellen werden co-getransfecteerd met miR-488-3p mimic of inhibitor samen met de geconstrueerde vectoren27. De luciferase-activiteit werd gemeten 48 u na transfectie met miR-488-3p mimic of inhibitor.

RNA-immunoprecipitatie (RIP): HFLS-RA-cellen werden geïncubeerd met een anti-Argonaute 2 (Ago2) antilichaam (RRID: AB_2882071, verdunning 1:200) of een immunoglobuline G (IgG) controle-antilichaam (RRID: AB_2819160, verdunning 1:5000), gevolgd door RNA-extractie en kwantitatieve PCR (qPCR) voor de verrijking van ROCK1 mRNA zoals hierboven beschreven.

Statistische analyse

De studie werd statistisch geanalyseerd met SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) en GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Meetgegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Alle experimenten werden uitgevoerd met drie biologische replica's, waarbij elke biologische replica in triplo werd geanalyseerd. De ruwe gegevens zijn toegevoegd in het aanvullende materiaal. De gegevens werden geëvalueerd met een normale waarschijnlijkheidsplot (P-P plot) voorafgaand aan de parametrische statistische toetsen. De t-toets voor onafhankelijke steekproeven werd gebruikt om continue basisvariabelen (bijv. leeftijd, body mass index [BMI], etc.) te vergelijken en de chi-kwadraattoets werd gebruikt voor categorische variabelen (bijv. geslacht, etc.). Genexpressieniveaus werden vergeleken met een t-toets voor onafhankelijke steekproeven. Veranderingen in celproliferatie op verschillende tijdstippen werden geanalyseerd met een variantieanalyse (ANOVA) met herhaalde metingen, terwijl een eenweg-ANOVA werd gebruikt om apoptosepercentages bepaald via flowcytometrie te vergelijken. Correlatieanalyse werd uitgevoerd met Spearman (voor variabelen die niet aan de normale verdeling voldeden) en Pearson (voor variabelen die aan de normale verdeling voldeden). De diagnostische prestaties werden geëvalueerd met een receiver operating characteristic (ROC) curve-analyse. De optimale afkapwaarde, sensitiviteit en specificiteit werden bepaald met de maximale Youden-index. Alle statistische toetsen waren tweezijdig en p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Basiskenmerken van de studedeelnemers

Deze studie omvatte 125 gezonde controles, 130 patiënten met OA en 135 patiënten met RA voor systematische analyse (Tabel 1). Er waren geen significante verschillen in de baselinekenmerken van de drie groepen met betrekking tot leeftijd (p = 0,191), geslachtsverhouding (p = 0,203) en BMI (p = 0,562), wat de vergelijkbaarheid van de studiepopulatie waarborgde. Wat betreft de ziektekenmerken waren de bezinking (ESR) (82,63 ± 40,32 vs. 18,39 ± 6,38 mm/h, p < 0,001) en CRP-spiegels (56,33 ± 38,07 vs. 10,54 ± 4,98 mg/L, p < 0,001) in de RA-groep significant hoger dan die in de OA-groep, wat het niveau van systemische inflammatie weerspiegelt. Ondertussen was RF, een serologische marker geassocieerd met RA, positief bij 70,37% (95/135), met een significant hogere serumconcentratie (144,13 ± 81,05 vs. 5,10 ± 1,37 IU/mL, p < 0,001); en de anti-CCP-positiviteitsgraad bij RA-patiënten was 56,30% (76/135), met een DAS28-score van 4,12 ± 1,36.

Expressiekenmerken en diagnostische waarde van miR-488-3p bij RA-patiënten

Serumexpressieniveaus van miR-488-3p waren significant verlaagd bij RA-patiënten vergeleken met OA-patiënten en gezonde controles (p < 0.0001, Figure 1A). ROC-curve-analyse toonde aan dat miR-488-3p een hoge diagnostische accuratesse had bij het onderscheiden van RA van OA en gezonde controles: bij het onderscheiden van RA van gezonde controles was de AUC-waarde 0,931 (95% CI: 0,896–0,967), met een sensitiviteit van 96,15% (95% CI: 91,31%–98,35%) en een specificiteit van 80,95% (95% CI: 73,22%–86,85%, p < 0,001, Figure 1B); en bij het onderscheiden van RA van OA-patiënten was de AUC-waarde 0,800 (95% CI: 0,747–0,854), met een sensitiviteit van 85,93% (95% CI: 79,06%–90,80%) en een specificiteit van 66,15% (95% CI: 57,66%–73,72%, p < 0,001, Figure 1C). Multivariabele logistische regressieanalyse identificeerde miR-488-3p als een onafhankelijke factor die geassocieerd is met het risico op RA (OR = 0,166, 95% CI: 0,097–0,284; Table 2).

Correlatieanalyse van miR-488-3p met klinische indicatoren van RA

De expressieniveaus van serum miR-488-3p waren significant negatief gecorreleerd met belangrijke klinische indicatoren van RA, waaronder ESR, CRP, RF en DAS28 (allemaal p < 0,001; Tabel 3). Specifiek was miR-488-3p negatief gecorreleerd met ESR (r = −0,718), CRP (r = −0,726), RF (r = −0,805) en de DAS28-score (r = −0,836) (Tabel 3).

Overexpressie van miR-488-3p remt celproliferatie en ontstekingsreacties en induceert apoptose in HFLS-RA-cellen

Om het effect van miR-488-3p op de functie van HFLS-RA te onderzoeken, hebben we de expressie ervan gemoduleerd door transfectie met mimics en inhibitoren. De RT-qPCR analyse bevestigde dat het expressieniveau van miR-488-3p significant hoger was in de miR-488-3p mimic-groep vergeleken met de controlegroep (p = 0,0001), terwijl het expressieniveau in de miR-488-3p inhibitor-groep significant lager was (p = 0,0003, Figuur 2A). De CCK-8 assay toonde aan dat overexpressie van miR-488-3p de celproliferatie remde, welke significant lager was dan in de controlegroep na 24 u, 48 u en 72 u (p = 0,0208, p < 0,0001, p = 0,0036), en remming van de miR-488-3p expressie verhoogde de celproliferatie significant (Figuur 2B). Flowcytometrie toonde aan dat overexpressie van miR-488-3p apoptose significant bevorderde (p = 0,0033, Figuur 2C).

Vervolgens voerden we een ELISA uit om het effect van de upregulatie van de miR-488-3p-expressie op de spiegels van inflammatoire cytokinen te onderzoeken. De resultaten lieten zien dat wanneer miR-488-3p overexpressie vertoonde, de spiegels van inflammatoire cytokinen (IL-6, TNF-α en IL-1β) significant afnamen (p < 0,0001, Figuur 3A-C), terwijl remming van de miR-488-3p-expressie het tegenovergestelde effect produceerde. Deze significante regulerende effecten werden geverifieerd in alle drie de onafhankelijke biologische replica-experimenten en negatieve controles vertoonden geen significante veranderingen (p > 0,05).

MiR-488-3p reguleert de expressie van ROCK1-moleculen

Om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan de rol van miR-488-3p bij de progressie van RA, hebben we de downstream-doelen van miR-488-3p onderzocht. Bio-informatische analyses lieten zien dat miR-488-3p voorspeld werd te binden aan de 3'UTR-regio van ROCK1 (Figuur 4A). Een duale luciferase reporter-assay bevestigde dat de luciferase-activiteit significant was verminderd wanneer wild-type ROCK1 3'UTR werd gecotransfecteerd met miR-488-3p mimics (p < 0.0001), en dat de luciferase-activiteit significant was toegenomen wanneer de expressie van miR-488-3p werd geremd (p < 0.0001); terwijl er geen significante verandering in dit regulerende effect was na mutatie van de bindingsplaats (Figuur 4B). RIP-experimenten bevestigden deze regulerende relatie verder, waarbij bleek dat het expressieniveau van ROCK1 mRNA significant verhoogd was in Ago2-antilichaam-verrijkte complexen vergeleken met IgG-controles (p < 0.0001, Figuur 4C).

Daarnaast vertoonde ROCK1 in klinische monsters een expressiepatroon dat tegenovergesteld was aan dat van miR-488-3p, waarbij een significante upregulatie van ROCK1 werd waargenomen ten opzichte van zowel OA-patiënten als gezonde controles (Figuur 4D). In HFLS-RA-cellen onthulde RT-qPCR dat overexpressie van miR-488-3p leidde tot een significante afname van de ROCK1-expressie (p = 0,0093), terwijl inhibitie van miR-488-3p de ROCK1-expressie significant verhoogde (p = 0,0003, Figuur 4E).

ROCK1 medieert de regulatoire effecten van miR-488-3p op HFLS-RA-cellen

In HFLS-RA-cellen werd de onderdrukking van de ROCK1-expressie door miR-488-3p-overexpressie omgekeerd door transfectie met ROCK1-overexpressievectoren (Figuur 5A). Op soortgelijke wijze werd het remmende effect van miR-488-3p-overexpressie op de celproliferatie afgezwakt door ROCK1-overexpressie (Figuur 5B). Bovendien keerde ROCK1-overexpressie ook de verhoogde apoptose om die werd geïnduceerd door miR-488-3p (Figuur 5C) en herstelde het de spiegels van inflammatoire cytokinen die waren onderdrukt door miR-488-3p-overexpressie (Figuur 5D).

Violin-plots en ROC-curves die de expressieanalyse en sensitiviteit-specificiteit in de RA-studie tonen.
Figuur 1. Expressieniveaus en diagnostische prestaties van miR-488-3p bij patiënten met reumatoïde artritis (RA), artrose (OA) en gezonde controles. (A) Vergelijking van de relatieve expressieniveaus van miR-488-3p bij RA-patiënten, OA-patiënten en gezonde controles. (B) Receiver operating characteristic (ROC)-curve-analyse van miR-488-3p voor het onderscheiden van RA van gezonde controles. (C) ROC-curve-analyse van miR-488-3p voor het onderscheiden van RA van OA-patiënten. AUC, oppervlakte onder de curve; CI, betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genexpressieanalyse; staafdiagrammen en lijngrafiek; cellevensvatbaarheid, apoptose, effecten van miR-488-3p.
Figuur 2. Functionele effecten van miR-488-3p in HFLS-RA-cellen. (A) Relatieve expressie van miR-488-3p in getransfecteerde HFLS-RA-cellen, bepaald via kwantitatieve reverse transcriptie polymerase ketenreactie (RT-qPCR). (B) Effecten van miR-488-3p overexpressie en inhibitie op celproliferatie. (C) Effecten van miR-488-3p overexpressie en inhibitie op apoptose. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD. Alle metingen werden uitgevoerd met drie biologische replica's, elk met drie technische replica's. p < 0,05 duidt op een statistisch significant verschil tussen de aangegeven groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagrammen van cytokoneconcentraties; panelen A-C; IL-6, TNF-α, IL-1β; statistische vergelijking.
Figuur 3. Effect van miR-488-3p op de secretie van inflammatoire cytokinen. (A) Interleukine-6 (IL-6). (B) Tumornecrosefactor-α (TNF-α). (C) Interleukine-1β (IL-1β). Cytokineconcentraties werden gemeten met een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. Alle metingen werden uitgevoerd met drie biologische replica's, elk met drie technische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Luciferase-assay diagram: miRNA-interactie met ROCK1, staafdiagrammen en data-analyseresultaten.
Figuur 4. Validatie van het moleculaire mechanisme ten grondslag aan de gerichte regulatie van ROCK1 door miR-488-3p. (A) Voorspelde bindingsplaats van miR-488-3p binnen de 3′-niet-vertaalde regio (3′UTR) van ROCK1. (B) Duale luciferase-reporterassay die de interactie tussen miR-488-3p en de wild-type of gemuteerde ROCK1 3′UTR aantoont. (C) RNA-immunoprecipitatie (RIP)-assay die de verrijking van ROCK1-messenger-RNA (mRNA) in complexen verrijkt met Argonaute 2 (Ago2)-antilichamen laat zien. (D) Relatieve ROCK1-expressieniveaus bij patiënten met RA, patiënten met OA en gezonde controles. (E) Relatieve ROCK1-expressie in getransfecteerde HFLS-RA-cellen bepaald door kwantitatieve reverse transcriptie-polymeraseketingreactie (RT-qPCR). Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD. Alle metingen zijn uitgevoerd met drie biologische replica's, elk met drie technische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Grafieken van genexpressie waarin ROCK1-niveaus en inflammatoire markers worden vergeleken met gebruik van de miR-488-3p mimic-methode.
Figuur 5. Betrokkenheid van ROCK1 bij de regulatie van HFLS-RA-cellen door miR-488-3p. (A) Regulatie van de ROCK1-expressie in HFLS-RA-cellen na celtransfectie. (B) Effecten van ROCK1-overexpressie op de celproliferatie onder miR-488-3p-overexpressie. (C) Effecten van ROCK1-overexpressie op apoptose onder miR-488-3p-overexpressie. (D) Effecten van ROCK1-overexpressie op de productie van inflammatoire cytokinen onder miR-488-3p-overexpressie. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. Alle metingen zijn uitgevoerd met drie biologische replica's, elk met drie technische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VariabeleControle (n = 125)OA (n = 130)RA (n = 135)p-waarde
Leeftijd (jaar)55.10 ± 9.3057.21 ± 10.2755.22 ± 11.610.191
Geslacht (man/vrouw)74/5163/6769/660.203
BMI (kg/m2)22.79 ± 1.7322.98 ± 1.9823.04 ± 2.050.562
Ziekteduur (jaar)-7.96 ± 4.008.03 ± 3.830.882
Anti-CCP positief (n/%)--76 (56.30)-
BSZ (mm/h)18.39 ± 6.3882.63 ± 40.32<0.001
CRP (mg/L)10.54 ± 4.9856.33 ± 38.07<0.001
RF positief--95 (70.37)
RF (IU/mL)-5.10 ± 1.37144.13 ± 81.05<0.001
DAS28--4.12 ± 1.36-

Tabel 1: Basiskenmerken van de studiedeelnamemers. De drie studiegroepen waren vergelijkbaar wat betreft de demografische kenmerken. RA-patiënten vertoonden verhoogde ontstekingsmarkers en RF-spiegels.

VariabeleOF95% BIpp-waarde
Leeftijd (jaren)1.4110.822–2.4220.211
Geslacht (mannelijk/vrouwelijk)1.2090.707–2.0670.489
BMI (kg/m²).2)1.3360.778–2.2950.293
Ziekteperiode (jaren)1.130.663–1.9290.653
MiR-483-3p0.1660.097–0.284<0.001

Tabel 2: Onafhankelijke factoren afgeleid uit multivariabele logistische regressie die geassocieerd zijn met de progressie van artrose naar reumatoïde artritis. MiR-488-3p werd geïdentificeerd als zijnde geassocieerd met het risico op de ontwikkeling van RA bij OA-patiënten.

ItemsMiR-488-3p (Reumatoïde artritis)pp-waarde
Correlatie(r)
bezinkingssnelheid (mm/u)-0.718<0.001
CRP (mg/L)-0.726<0.001
RF (IE/ml)-0.805<0.001
DAS28 -0.836<0.001

Tabel 3: Correlaties tussen miR-488-3p en clinicopathologische kenmerken van RA-patiënten. miR-488-3p vertoonde een significante negatieve correlatie met BSE, CRP, RF en de DAS28-score bij patiënten met RA.

Aanvullende Tabel 1. Sequentie-informatie van celtransfectie en PCR-assay. De primersequenties en transfectiereagentia die in de studie zijn gebruikt, worden hier samengevat.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Zoals benadrukt door Smolen et al1 in de nieuwste richtlijnen voor de diagnose en behandeling van RA, heeft de ontwikkeling van nieuwe biomarkers een aanzienlijke klinische waarde. In deze studie hebben we bevestigd dat serum miR-488-3p significant verlaagd was bij patiënten met RA en een veelbelovende diagnostische prestatie vertoonde, met een relatief bevredigende sensitiviteit en specificiteit. Vroege diagnose van RA is altijd een klinische uitdaging geweest, en bestaande biomarkers zijn onvoldoende sensitief voor de diagnose van RA, terwijl het aanzienlijke diagnostische potentieel van miR-488-3p dit gat zou kunnen vullen, vooral voor de identificatie van seronegatieve RA-patiënten. In vergelijking met gezonde individuen vertoonden RA-patiënten een meer uitgesproken systemische ontsteking. Hoewel OA-patiënten voornamelijk een lokale degeneratieve gewrichtsaandoening hebben, wordt er frequent laaggradige systemische ontsteking waargenomen. Daarom is de onderscheidende efficiëntie van miR-488-3p veel hoger bij vergelijking met gezonde individuen dan bij vergelijking met OA-patiënten. De diagnostische prestatie van miR-488-3p is niet direct vergeleken met die van gevestigde klinische biomarkers. De patiënten in deze studie werden gediagnosticeerd volgens de huidige klinische gouden standaard voor RA, waarin gevestigde biomarkers zoals anti-CCP-antilichamen, RF, ESR en CRP zijn opgenomen. Significante verschillen in deze markers werden waargenomen tussen patiënten met OA en RA (Tabel 1). Daarom was deze cohort niet geschikt voor het direct vergelijken van de diagnostische prestatie van miR-488-3p met deze gevestigde biomarkers. Dergelijke vergelijkingen vereisen een onafhankelijke validatiecohort.

Daarnaast bleek dat de expressieniveaus van miR-488-3p significant negatief gecorreleerd waren met diverse klinische indicatoren van RA, waaronder systemische ontstekingsmarkers (ESR, CRP)28 en auto-antilichamen (RF)6. Van bijzonder klinisch belang is dat miR-488-3p een sterke negatieve correlatie vertoonde met de Disease Activity Score (DAS28). DAS28 is een samengestelde index die de ziekteactiviteit weerspiegelt op basis van gewrichtszwelling, gevoeligheid, ontsteking en de klinische status van de patiënten. Deze bevindingen suggereren daarom dat miR-488-3p kan dienen als een potentiële biomarker voor ziekteactiviteit bij RA. Het ondersteunt tevens de regulerende rol ervan in de pathogenese van RA en kan de ziekteprogressie beïnvloeden door ontstekingssignaleringsroutes of auto-immuunresponsen te remmen29.

In functionele experimenten stelden we vast dat miR-488-3p de proliferatie onderdrukte en apoptose bevorderde in HFLS-RA-cellen van RA-patiënten, en de productie van inflammatoire cytokinen (IL-6, TNF-α en IL-1β) significant verminderde. HFLS-RA-cellen spelen een sleutelrol in het pathologische proces van RA30; de aberrante proliferatie en invasieve groei ervan kunnen leiden tot synoviale hyperplasie en gewrichtsdestructie, terwijl de overproductie van inflammatoire factoren de lokale en systemische ontstekingsreacties verder verergert31. Daarom kan de regulatie van de HFLS-RA-functie door miR-488-3p de synoviale invasie en boterosie bij RA direct remmen, wat een theoretische basis biedt voor de ontwikkeling van nieuwe gerichte therapeutische strategieën. Eerdere studies hebben aangetoond dat andere miRNA's, zoals miR-155, de progressie van RA kunnen beïnvloeden door de functie van synoviocyten te reguleren19, wat onze bevindingen verder ondersteunt.

Mechanistische studies hebben aangetoond dat miR-488-3p ROCK1 direct kan targeten en de expressie ervan kan remmen door te binden aan de 3'UTR. ROCK1 is een belangrijk effectormolecuul van de Rho/ROCK-signaleringsroute, die betrokken is bij cytoskeletale reorganisatie, ontstekingsreacties en fibrose32. Eerdere studies hebben aangetoond dat ROCK1 sterk tot expressie komt in RA-synoviocyten en hun migratie en invasie bevordert33. Zoals verwacht keerde overexpressie van ROCK1 de effecten van miR-488-3p op HFLS-RA-cellen significant om, wat wijst op de betrokkenheid ervan bij de regulerende rol van miR-488-3p bij de progressie van RA.

Er moet echter nog veel werk worden verricht in toekomstig onderzoek. De expressie van miR-488-3p in de klinische monsters werd geëvalueerd met RT-qPCR, waarbij U6 als interne referentie werd gebruikt. Eerdere studies hebben tegenstrijdige bevindingen gerapporteerd over de stabiliteit van U6, vooral in circulerende monsters, zoals serum. Hoewel er in de huidige studie voorlopige experimenten zijn uitgevoerd om de stabiliteit van U6 te waarborgen, blijft de potentiële volatiliteit van U6 een beperking, waardoor het risico op een verkeerde diagnose toeneemt. Verdere validatie met gebruik van stabielere interne referentiegenen is gerechtvaardigd. Aan de andere kant was de klinische evaluatie van miR-488-3p gebaseerd op een cohort uit één centrum zonder externe validatie. De steekproefomvang was relatief klein en beperkt tot de schaal van het ziekenhuis. Bovendien ontbrak er een longitudinale follow-up om de prognostische waarde van miR-488-3p te beoordelen. Deze beperkingen moeten in toekomstige studies worden aangepakt. Daarnaast laten sommige studies zien dat in vivo toediening van miRNA's een grote uitdaging blijft voor klinische translatie34. Toekomstige studies zouden het therapeutische potentieel van miR-488-3p in vivo kunnen valideren door conditionele knockout-muizen te creëren of door gebruik te maken van gerichte toedieningssystemen zoals nanodragers35.

Concluderend heeft deze studie de potentiële waarde van miR-488-3p onthuld voor de diagnose en potentiële therapeutische targeting van RA. MiR-488-3p vertoonde een hoge diagnostische prestatie en remde de proliferatie en inflammatoire responsen van HFLS-RA-cellen, terwijl het apoptose bevorderde. Dit suggereert dat het een veelbelovend doelwit kan vormen voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor RA. Toekomstig onderzoek zou zich moeten richten op 1) het valideren van de diagnostische stabiliteit van miR-488-3p in grote multicenter cohorten, 2) het verkennen van de synergistische effecten met bestaande therapeutische middelen, zoals JAK-remmers of biologica28, en 3) het optimaliseren van de miRNA-afgiftesystemen om de klinische translationele haalbaarheid te verbeteren36.

DATAbeschikbaarheid:

De ruwe gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn beschikbaar in de aanvullende materialen die samen met dit manuscript zijn ingediend.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengelingen zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Annexin V-FITC apoptosedetectiekitBD Bioscience556547celapoptose
anti-Ago2-antilichaamProteintech66720-1-IgRNA-immunoprecipitatie
CCK-8-oplossingDojindoCK04celproliferatie
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher121000146celkweek
Foetaal runderserumThermo Fisher10437028celcultuur
FlowcytometerBD Bioscience FACSCaliburcelapoptose
Human anti-CCP antilichaam ELISA-kitCusabioCSB-E09077h anti-CCP-detectie
Human RF-IgA ELISA-kitFeien BiotechnologyEH4270RF-detectie
Fibroblast-achtige synoviocyten van mensen met reumatoïde artritis (HFLS-RA)CeltoepassingenHFLS-RA-200in vitro validatie van de functie van miR-488-3p
IgG-controleantilichaamAbcamab205718RNA-immunoprecipitatie
Interleukine-1β (IL-1βELISA-kitR&D SystemsDY201-05cellulair IL-1β concentratie
Interleukine-6 (IL-6) ELISA-kitR&D SystemenD6050Bcellulaire IL-6-concentratie
Liposoomtransfectiereagens 3000Ingenuity Life TechnologiesL3000015celtransfectie
MicroplaatlezerBioTek ELx808ELISA-assay
Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis KitNihonbao Bioengineering Co., Ltd.638313omgekeerde transcriptie
Opti-MEM-mediumIngenuity Life Technologies, Inc31985070celtransfectie
pcDNA 3.1InvitrogenV790-20overexpressie van ROCK1
Penicilline-streptomycineThermo Fisher15140122celkweek
Phadia 250 laboratoriumsysteemThermo Fisher Phadia 250bloedanalyse
PrimeScriptTM Reverse Transcription KitNihonbao Bioengineering Co., Ltd.RR037Aomgekeerde transcriptie
Propidiumjodide (PI)/ribonuclease (RNase)BD Bioscience550825celapoptose
QuantStudio 5-systeemApplied Biosystems, Inc.A28138PCR-assay
RNAiso Plus-reagensNihonbao Bioengineering Co., Ltd.9108RNA-isolatie
SYBR Green Premix Ex TaqNippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd.RR420APCR-amplificatie
TargetScan-databaseTargetScanHet is niet mogelijk om een vertaling uit te voeren omdat er geen brontekst is verstrekt. Voeg aub de tekst toe die vertaald moet worden.voorspelling van bindingsplaatsen, (https://www.targetscan.org/) 
Tina-quant C-reactief proteïne IVRoche Diagnostics7876033190CRP-detectie
Tumornecrosefactor-α (TNF-α) ELISA-kitR&D SystemsDY210-05cellulair TNF-α concentratie

Referenties

  1. Smolen JS, et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18001.
  2. Kook HY, et al. Serum miR-214 as a novel biomarker for ankylosing spondylitis. Int J Rheum Dis. 2019;22(7):1196-201.
  3. Alamanos Y, Voulgari PV, Drosos AA. Incidence and prevalence of rheumatoid arthritis, based on the 1987 American College of Rheumatology criteria: a systematic review. Semin Arthritis Rheum. 2006;36(3):182-8.
  4. van der Linden MPM, et al. Long-term impact of delay in assessment of patients with early arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(12):3537-46.
  5. Anderson J, et al. Rheumatoid arthritis disease activity measures: American College of Rheumatology recommendations for use in clinical practice. Arthritis Care Res (Hoboken). 2012;64(5):640-7.
  6. Aletaha D, et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2569-81.
  7. Yang J, et al. MicroRNA-488: a miRNA with diverse roles and clinical applications in cancer and other human diseases. Biomed Pharmacother. 2023;165:115115.
  8. Molendijk M, Hazes JMW, Lubberts E. From patients with arthralgia, pre-RA and recently diagnosed RA: what is the current status of understanding RA pathogenesis? RMD Open. 2018;4(1):e000256.
  9. van Venrooij WJ, van Beers JJBC, Pruijn GJM. Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(7):391-8.
  10. Szodoray P, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 2010;9(3):140-3.
  11. Filer A, et al. Utility of ultrasound joint counts in the prediction of rheumatoid arthritis in patients with very early synovitis. Ann Rheum Dis. 2011;70(3):500-7.
  12. Zuo C, Fan P, Yang Y, Hu C. MiR-488-3p facilitates wound healing through CYP1B1-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting MeCP2. J Diabetes Investig. 2024;15(2):145-58.
  13. Mendell JT, Olson EN. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 2012;148(6):1172-87.
  14. Cai Z, Poulos RC, Liu J, Zhong Q. Machine learning for multi-omics data integration in cancer. iScience. 2022;25(2):103798.
  15. Fabian MR, Sonenberg N. The mechanics of miRNA-mediated gene silencing: a look under the hood of miRISC. Nat Struct Mol Biol. 2012;19(6):586-93.
  16. Duroux-Richard I, et al. Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2014;2014:342524.
  17. Zakeri Z, et al. MicroRNA and exosome: key players in rheumatoid arthritis. J Cell Biochem. 2019;120(7):10930-44.
  18. Pauley KM, et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. Arthritis Res Ther. 2008;10(4):R101.
  19. Kurowska-Stolarska M, et al. MicroRNA-155 as a proinflammatory regulator in clinical and experimental arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11193-8.
  20. Pers YM, et al. miR-155 contributes to the immunoregulatory function of human mesenchymal stem cells. Front Immunol. 2021;12:624024.
  21. Fu Q, et al. miR-488-3p alleviates neuropathic pain by regulating target gene ROCK1. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2023;83(3):271-9.
  22. Xue W, et al. PVT1 regulates the malignant behaviors of human glioma cells by targeting miR-190a-5p and miR-488-3p. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018;1864(5 Pt A):1783-94.
  23. Muiños-Gimeno M, et al. Human microRNAs miR-22, miR-138-2, miR-148a, and miR-488 are associated with panic disorder and regulate several anxiety candidate genes and related pathways. Biol Psychiatry. 2011;69(6):526-33.
  24. Le TD, Zhang J, Liu L, Li J. Computational methods for identifying miRNA sponge interactions. Brief Bioinform. 2017;18(4):577-90.
  25. Scanzello CR, Goldring SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-57.
  26. McGeary SE, et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 2019;366(6472):eaav1741.
  27. Liu X, et al. Impaired AGO2/miR-185-3p/NRP1 axis promotes colorectal cancer metastasis. Cell Death Dis. 2021;12(4):390.
  28. Smolen JS, Aletaha D, McInnes IB. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2016;388(10055):2023-38.
  29. O'Connell RM, Rao DS, Baltimore D. microRNA regulation of inflammatory responses. Annu Rev Immunol. 2012;30:295-312.
  30. Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(1):24-33.
  31. Firestein GS, McInnes IB. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 2017;46(2):183-96.
  32. Amano M, Nakayama M, Kaibuchi K. Rho-kinase/ROCK: a key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(9):545-54.
  33. Peng H, et al. ROCK1 induces endothelial-to-mesenchymal transition in glomeruli to aggravate albuminuria in diabetic nephropathy. Sci Rep. 2016;6:20304.
  34. van der Meel R, et al. Smart cancer nanomedicine. Nat Nanotechnol. 2019;14(11):1007-17.
  35. Yin H, et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-55.
  36. Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(6):421-46.

Herprints en machtigingen

Tags

Serum biomarkerRT-qPCRsynoviocytenapoptoseinflammatoire responsROC-curveROCK1-doelwitflowcytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.