Deze studie toonde aan dat LUS en serum miR-486-3p verhoogd waren bij neonaten met acute respiratoire distress syndroom (ARDS). Hun gecombineerde beoordeling verbeterde de voorspelling van de ernst van de ziekte en de prognose, en miR-486-3p bleek de celfunctie in een ARDS-model te reguleren door Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 als doelwit te hebben.
Onderzoeksartikel
Prognostische waarde van de longechoscore en serum miR-486-3p bij neonataal acuut respiratoir distressesyndroom
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie had tot doel de prognostische waarde van de longechoscore (LUS) en serum miR-486-3p bij neonataal acute respiratory distress syndrome (ARDS) te beoordelen en het onderliggende mechanisme te onderzoeken. In totaal werden 112 neonaten met ARDS en 100 gezonde zuigelingen, geboren in dezelfde periode, respectievelijk opgenomen in de studiegroep en de gezonde controlegroep. Elke neonaat onderging een longechografie binnen 6 u na opname op de intensive care en werd geëvalueerd op de LUS. Real-time kwantitatieve PCR werd gebruikt om de genexpressie te kwantificeren, terwijl receiver operating characteristic (ROC)-curve- en Pearson-correlatieanalyses werden uitgevoerd om de prognostische prestaties en correlaties te evalueren. Verder werd een in vitro ARDS-model opgezet met HPMECs om het onderliggende mechanisme van miR-486-3p te onderzoeken. Een dual-luciferase reporter assay werd uitgevoerd om de targetrelatie tussen miR-486-3p en Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 (DLL4) te verifiëren. De resultaten onthulden dat LUS en serum miR-486-3p significant verhoogd waren bij neonaten met ARDS. ROC-curve-analyse toonde aan dat zowel miR-486-3p als LUS de neonatale prognose van ARDS konden voorspellen (AUC = 0,883 en 0,873, sensitiviteit: 96,4% en 89,3%, specificiteit: 77,4% en 73,8%, respectievelijk), en miR-486-3p in combinatie met LUS een beter voorspellend effect had (AUC = 0,929, sensitiviteit: 92,9%, specificiteit: 84,5%). Mechanistisch gezien targette miR-486-3p DLL4 om de biologische functies van ARDS-modelcellen te reguleren. Samenvattend kan de gecombineerde beoordeling van LUS en serum miR-486-3p dienen als een veelbelovende benadering voor het evalueren van de ernst van de ziekte en het voorspellen van de prognose bij neonaten met ARDS. Verdere multicentrische validatie is nog nodig om de algemene toepasbaarheid te bevestigen.
Inleiding
Neonaat acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een levensbedreigende, kritieke respiratoire aandoening die primair wordt gekenmerkt door een verslechterde functie van het alveolaire surfactant, wat grote risico's vormt voor de overleving van neonaten1,2. Ondanks de ontwikkeling van diverse behandelmodaliteiten blijft de algehele prognose voor aangedane neonaten onvoldoende3. Vroege identificatie van de ernst van de ziekte en een nauwkeurige prognostische beoordeling zijn daarom essentieel om klinische interventies te optimaliseren en de uitkomsten voor de patiënt te verbeteren. Zodra ARDS zich ontwikkelt, is de pulmonale functie van de neonaat ernstig aangetast, vergezeld van een verstoorde ventilatie en gasuitwisseling4. Longechografie kan worden beschouwd als de primaire beeldvormingsmethode voor het monitoren van de ventilatie bij ARDS5. Het is een geprefereerd bedside-beeldvormingsinstrument geworden voor het monitoren van pulmonale laesies bij ARDS, en de lung ultrasound score (LUS) wordt op grote schaal toegepast om acute respiratoire aandoeningen bij neonaten te diagnosticeren en de ernst van de ziekte en de prognose in intensive care-omgevingen te evalueren6. Echter, enkelvoudige beeldvorming of laboratoriumtesten hebben inherente gebreken en kunnen niet volledig voldoen aan de klinische beoordelingsvraag7. Daarom is het verkennen van nieuwe biomarkers voor het opzetten van een gecombineerd evaluatiesysteem van groot klinisch belang.
MicroRNA (miRNA) vormt een nieuwe klasse van genregulerende factoren die een cruciale rol spelen in de pathogenese van ARDS8. Zo is een verlaagde expressie van miR-141-3p nauw geassocieerd met de ernst van de ziekte bij longfibrose en longschade9. miR-124-3p is een beschermende factor bij ARDS door p65 te targeten10. Eerdere high-throughput sequencing-studies hebben bevestigd dat miR-486-3p significant is verhoogd bij patiënten met ARD11. Recent onderzoek heeft de hsa_circ_0006892/miR-486-3p-as aangewezen als een potentieel moleculair mechanisme dat betrokken is bij de ontwikkeling van ARDS12. Deze bevindingen suggereren dat miR-486-3p nauw verbonden is met ARDS. Desondanks moet de prognostische en voorspellende waarde van miR-486-3p met betrekking tot de ernst en de uitkomst van neonatale ARDS nog volledig worden opgehelderd.
Momenteel zijn thoraxradiografie, bloedgasanalyse en de detectie van een enkele biomarker de gangbare methoden voor de evaluatie van ARDS bij pasgeborenen. Beeldvorming van de thorax gaat gepaard met blootstelling aan straling en maakt geen real-time, herhaalde monitoring mogelijk. Bloedgasanalyse weerspiegelt enkel de acute respiratoire functie en beschikt niet over voorspellende waarde voor de prognose op lange termijn. De detectie van een enkel microRNA levert objectieve kwantitatieve resultaten, maar kan geen real-time morfologische veranderingen van het longweefsel weerspiegelen. In vergelijking met deze conventionele benaderingen integreert de combinatie van LUS en serum miR-486-3p de voordelen van bedside-beeldvorming en moleculaire detectie.
Deze studie richtte zich op neonaten die voldeden aan de ARDS-criteria in plaats van op het klassieke RDS door surfactantdeficiëntie. Daarom beoogt deze studie vast te stellen of baseline LUS en serum miR-486-3p de kortetermijnmortaliteit bij neonatale ARDS kunnen voorspellen. Dit onderzoek is erop gericht om waardevolle gegevens te verschaffen ter verbetering van de klinische beoordeling van ziektecondities en kortetermijnprognoses bij neonatale ARDS.
Protocol
Deze studie heeft ethische goedkeuring ontvangen van de Medisch Ethische Commissie van The First People's Hospital of Yongkang, in strikte naleving van de Verklaring van Helsinki.
Proefpersonen
Deze observationele cohortstudie in één centrum, met een in vitro experimenteel component, werd uitgevoerd tussen januari 2022 en december 2023. In totaal werden 112 opeenvolgende pasgeborenen met de diagnose ARDS ingeschreven in The First People's Hospital of Yongkang. Ten behoeve van vergelijking werden gezonde zuigelingen die in dezelfde periode waren geboren en geen voorgeschiedenis van asfyxie of intra-uteriene nood hadden, geworven als controlesubjecten.
Inclusiecriteria:
Alle deelnemers voldeden aan de diagnostische criteria voor neonataal acuut respiratoir distressyndroom, zoals beschreven in de Montreux-richtlijnen (editie 2017). De diagnose werd onderbouwd door beeldvorming en klinische beoordelingen: röntgenonderzoeken toonden diffuse opaciteiten in beide longen die consistent waren met longoedeem, en echocardiografie toonde geen bewijs van hypertensie in het linkeratrium, waardoor cardiogeen longoedeem werd uitgesloten. Aanvullende criteria omvatten een acute onset van symptomen en de noodzaak van mechanische ventilatie gedurende meer dan 3 dagen, zonder ernstige extrapulmonale infecties. Geïnformeerde toestemming is tegenwoordig verkregen van de families van de neonaten.
Uitsluitingscriteria:
Pasgeborenen met een primaire alveolaire surfactantdeficiëntie, aangeboren hartafwijkingen, metabole stoornissen of andere significante onderliggende aandoeningen werden uitgesloten. Bovendien werden zuigelingen met malformaties van de longen of de borstkaswand of andere grote aangeboren afwijkingen uitgesloten. Neonatale RDS werd uitgesloten.
Klinische gegevens
De zwangerschapsduur, het geslacht, het geboortegewicht bij opname en de moederlijke kenmerken werden voor alle deelnemers gedocumenteerd. Elke neonaat onderging binnen 6 h na opname op de intensive care een longechografie en werd geëvalueerd op LUS. De LUS werd gescoord op een schaal met een maximum van 36 punten, waarbij een hogere score wees op een grotere ernst van de pulmonale symptomen. Bloedmonsters werden direct bij opname verzameld als onderdeel van de initiële klinische beoordeling en voorafgaand aan elke belangrijke therapeutische interventie (bijv. surfactant-herdosering, escalatie van de ventilatiemodus of initiatie van vasoactieve middelen). Bloedmonsters van gezonde neonaten werden verkregen op het moment van hun inschrijving. Voor de isolatie van serum werd volbloed in serumscheidingsbuizen geplaatst en 30 min stationair op kamertemperatuur bewaard om volledige stolling mogelijk te maken. De monsters werden vervolgens gecentrifugeerd bij 1500 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Het bovenste heldere serumsupernatans werd voorzichtig geaspireerd, verdeeld in steriele cryogene vials en onmiddellijk bewaard in een ultralage-temperatuurvriezer bij -80 °C voor daaropvolgende experimenten. Alleen heldere, niet-gehemolyseerde serummonsters werden gebruikt voor daaropvolgende experimenten. Gebruikte bloedafnamebuizen en residu bloed werden afgevoerd als medisch biologisch afval conform de institutionele regelgeving.
Groepering
Alle pasgeborenen werden ingedeeld in twee aparte groepen: de milde groep (graden I–II) en de ernstige groep (graden III–IV), op basis van de initiële röntgenfoto's van de borstkas en de ernst van de aandoening beoordeeld 24 u na opname. De interpretaties van de röntgenfoto's van de borstkas onthulden graad I, gekenmerkt door een verminderde longtransparantie bilateraal, met kleine partikels en reticulaire schaduwen binnen het longparenchym. Graad II gaf aan dat de laesies zich uitstrekten tot in de middelste en buitenste longzones, met bewijs van het air bronchogram-teken. Bij graad III was er sprake van een significante afname van de transparantie in beide longen, wat resulteerde in vervaagde contouren van het hart en het diafragma. Graad IV werd gekenmerkt door uitgesproken air bronchogram-tekens, culminerend in een bijna volledige opacificatie die leek op een white lung-aspect.
Pasgeborenen met de diagnose ARDS kregen na opname op de neonatale intensive care unit een uitgebreid behandelregime. Dit regime omvatte mechanische ventilatie, sedatie, toediening van pulmonale surfactant, ontstekingsremmende therapieën, nutritionele ondersteuning, hulp bij het ophoesten van slijm en maatregelen voor vochtvervanging. De neonatale diagnose van ARDS diende als startpunt voor de studie. De eindpunten werden gedefinieerd als respectievelijk succesvol herstel en ontslag van de patiënt, of het overlijden van de patiënt als gevolg van een ineffectieve behandeling. Op basis van de klinische uitkomsten werden de deelnemers ingedeeld in twee groepen: de overlevingsgroep en de sterftegroep.
Celcultuur en behandeling
Humaan pulmonale microvasculaire endotheelcellen (HPMECs) werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. De cellen werden in stand gehouden bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Om een ARDS-celmodel te vestigen, werden de cellen behandeld met lipopolysaccharide (LPS) in een concentratie van 1 mg/L13,14. De succesvolle vestiging van het model werd bevestigd door lichte celkrimp waar te nemen onder een omgekeerde microscoop na de LPS-behandeling. Na voltooiing van de experimenten werden het gebruikte kweekmedium, dode cellen en wegwerpkweekmaterialen afgevoerd als biologisch gevaarlijk afval.
Celtransfectie en groepering
HPMEC's werden in kweekplaten gezaaid en geïncubeerd tot 70% confluentie vóór transfectie. Transfectiecomplexen werden bereid volgens de instructies van de fabrikant. De cellen werden verdeeld in groepen: blanco controle, miR-486-3p mimic, mimic negatieve controle, miR-486-3p inhibitor, inhibitor negatieve controle, miR-486-3p mimic + DLL4 overexpressieplasmid (OE-DLL4), en miR-486-3p mimic + leeg overexpressieplasmid (OE-NC). De transfectiecomplexen werden aan de overeenkomstige wells toegevoegd en gedurende 4–6 h geïncubeerd. Het medium werd vervangen door vers compleet medium, waarna de kweek gedurende 24–48 h werd voortgezet voor daaropvolgende experimenten. Een succesvolle transfectie werd aangetoond door een stabiele celconfluentie zonder overmatige celdood.
Real-time kwantitatieve PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit serummonsters en gekweekte cellen met behulp van een RNA-extractiereagens. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden gemeten met een spectrophotometer, waarbij monsters met een A260/A280-ratio van 1,8–2,1 als geschikt werden beschouwd voor verdere analyse. Complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van een reverse transcriptie-kit. Vervolgens werd kwantitatieve PCR uitgevoerd met een real-time PCR-systeem volgens de volgende cycluscondities: een initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 min, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s. Voor de detectie van microRNA werd de relatieve expressie van miR-486-3p berekend met de 2-ΔΔCt-methode, waarbij U6 snRNA diende als interne referentie. Voor de mRNA-kwantificering werd de DLL4-expressie genormaliseerd ten opzichte van GAPDH mRNA met hetzelfde 2-ΔΔCt-algoritme. De primersequenties waren als volgt: miR-486-3p forward: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' en miR-486-3p reverse: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 forward: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' en U6 reverse: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 forward: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' en DLL4 reverse: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH forward: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' en GAPDH reverse: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
CCK-8 celproliferatie-assay
Getransfecteerde cellen werden uitgezaaid in 96-wellplaten met een dichtheid van 1 × 103 cellen per well en geïncubeerd gedurende 24, 48 en 72 u. Het kweekmedium werd vervolgens afgezogen en de cellen werden tweemaal gewassen met 1× PBS. Daarna werden 100 µL verse 1× PBS en 10 µL CCK-8-oplossing aan elke well toegevoegd, waarna de platen 2 u bij 37 °C werden geïncubeerd. De absorbantie werd gemeten bij 450 nm met een microplaatlezer, en de celproliferatie werd geëvalueerd op basis van de absorbantiewaarden. Een succesvolle uitvoering van de assay werd aangetoond door tijdgefaseerde veranderingen in de absorbantie tussen de experimentele groepen.
Apoptose-assay met flowcytometrie
Cellen werden gedigesteerd met 0,25% trypsine, waarna de resulterende celsuspensie werd verzameld en 5 min gecentrifugeerd bij 1500 × g bij 4 °C. Het supernatant werd weggegooid en de celpellets werden drie keer gewassen met vooraf gekoelde 1× PBS. De cellen werden vervolgens geresuspendeerd in 500 µL 1x Binding Buffer, gevolgd door de toevoeging van 5 µL Annexine V-FITC en 5 µL propidiumjodide (PI). Na voorzichtig mengen werden de monsters 40 min geïncubeerd bij kamertemperatuur in het donker. Celapoptose werd gemeten via flowcytometrie en de gegevens werden geanalyseerd met de geschikte software voor flowcytometrie-analyse. Een succesvolle uitvoering van de assay werd aangetoond door een lage apoptosegraad in de normale controlegroep en een duidelijke toename van apoptose in de ARDS-modelgroep.
Luciferase reporter assay
Potentiële doelgenen van miR-486-3p werden geïdentificeerd met behulp van de online TargetScan-database (http://www.targetscan.org/vert_72/). Na identificatie van de voorspelde bindingsplaatsen werden wild-type (DLL4-WT) en mutante (DLL4-MUT) luciferase-reporterplasmiden geconstrueerd die de overeenkomstige bindingssequenties bevatten. De DLL4-WT- en DLL4-MUT-vectoren werden samen met respectievelijk miR-486-3p-mimics of -remmers gecotransfecteerd in HPMECs. De relatieve luciferase-activiteit werd vervolgens gemeten met een dual-luciferase reporter assay kit. Bioluminescentiesignalen werden gedetecteerd met een luminometer volgens de instructies van de fabrikant. Een succesvolle validatie van het doelgen werd aangetoond door een significante afname van de luciferase-activiteit in de DLL4-WT-groep na overexpressie van miR-486-3p.
Gedetailleerde informatie over alle reagentia, verbruiksartikelen en laboratoriumapparatuur die in deze studie zijn gebruikt, is opgenomen in de bijbehorende Tabel met Materialen.
Statistische methoden
Statistische analyses en datavisualisaties werden uitgevoerd met SPSS versie 26.0 en GraphPad Prism versie 9.0. Meetgegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie, waarbij vergelijkingen tussen de gemiddelden van twee onafhankelijke steekproeven werden beoordeeld met een onafhankelijke t-toets. Voor vergelijkingen tussen drie of meer groepen werden eenweg-variantieanalyse (ANOVA) en herhaalde-metingen ANOVA toegepast, gevolgd door de post-hoc meervoudige vergelijkingstoets van Tukey om intergroepsverschillen te identificeren. Categorische gegevens werden uitgedrukt als aantallen (percentages), en intergroepsvergelijkingen werden geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraattoets. De Wilcoxon Mann-Whitney-toets werd toegepast voor non-parametrische gegevens. Daarnaast werd de ROC-curve opgesteld om de voorspellende waarde van de expressieniveaus van serum miR-486-3p en LUS te evalueren bij het bepalen van de mortaliteit bij pediatrische patiënten met ARDS. De correlatieanalyse van Pearson werd gebruikt om correlaties te onderzoeken. Alle experimentele groepen hadden drie onafhankelijke biologische replica's en technische replica's. De statistische eenheid werd gedefinieerd als een onafhankelijk experiment, waarbij elke biologische replica een aparte celkweekbatch vertegenwoordigde afgeleid van verschillende passages, en technische replica's werden gebruikt om intra-experimentele variatie te verminderen. Gegevens van technische replica's werden eerst gemiddeld, waarna de statistische analyse werd uitgevoerd op basis van de gemiddelde waarden van de biologische replica's. Statistische significantie werd vastgesteld op p < 0,05.
Resultaten
Vergelijkbare baseline-gegevens tussen groepen
De algemene kenmerken van de zuigelingen die aan de studie deelnamen, worden gepresenteerd in Tabel 1. Er waren geen significante verschillen in de demografische basiskenmerken tussen de twee groepen: zwangerschapsduur (36,07 ± 2,71 vs. 35,72 ± 2,64 weken, p = 0,347), aandeel mannelijk geslacht (59,0% vs. 66,1%, p = 0,290), geboortegewicht (3,39 ± 0,57 vs. 3,33 ± 0,55 kg, p = 0,437), moederleeftijd (29,18 ± 4,00 vs. 29,66 ± 4,05 jaar, p = 0,387) en bevallingsmethode (vaginaal: 54,0% vs. 58,0%; keizersnee: 46,0% vs. 42,0%, p = 0,554), wat aangeeft dat deze groepen vergelijkbaar waren. Op basis van de evaluatie van de thoraxfoto werden in de ARDS-groep 72 gevallen (64,3%) geclassificeerd als mild (graad I-II), terwijl 40 gevallen (35,7%) werden geclassificeerd als ernstig (graad III-IV).
De ernst van ARDS correleert met de prognose van de patiënt
De vergelijkende analyse van de overleving tussen de groep kinderen met ARDS die overleefden en degenen die bezweken is weergegeven in Tabel 2. Van de 112 neonaten met de diagnose ARDS overleefden 84 gevallen (75%), terwijl er in 28 gevallen (25%) sprake was van mortaliteit. Opmerkelijk genoeg waren er geen statistisch significante verschillen in leeftijd van de zuigeling, geslacht, geboortegewicht, moederlijke leeftijd, bevallingswijze, kenmerken van het vruchtwater, etiologie of andere variabelen tussen de twee groepen (p > 0.05). Er werd echter wel een significant verschil in de ernst van de ARDS waargenomen (p < 0.01), wat wijst op een kritieke prognostische factor.
miR-486-3p en LUS zijn verhoogd bij ARDS. RT-qPCR-analyse toonde aan dat de serumspiegels van miR-486-3p significant verhoogd waren bij neonaten met ARDS in vergelijking met gezonde controles. Bovendien waren de spiegels binnen de ARDS-cohort in de ernstige groep opvallend hoger dan in de milde groep (P < 0,001) (Figuur 1A). Daarnaast was de LUS hoger in de ernstige ARDS-groep dan in de milde ARDS-groep (p < 0,001) (Figuur 1B). Bij onderverdeling van ARDS-patiënten op basis van de klinische uitkomst vertoonde de sterftegroep aanzienlijk hogere LUS- en miR-486-3p-spiegels dan de overlevingsgroep (Figuur 1C,D). Er werd een sterke positieve correlatie gevonden tussen LUS en serum miR-486-3p bij patiënten die niet overleefden (r = 0,832, p <0,001) (Figuur 1E).
Gecombineerde detectie verbetert de prognostische voorspelling
Op basis van het ROC-analyseprotocol hebben we de prognostische prestaties van enkelvoudige en gecombineerde indicatoren geëvalueerd. De AUC-waarden van LUS en miR-486-3p voor het voorspellen van mortaliteit op korte termijn waren respectievelijk 0,873 (95% BI: 0,809-0,936) en 0,883 (95% BI: 0,822-0,944). De sensititeitswaarden waren 89,3% en 96,4%, terwijl de specificiteitswaarden respectievelijk 73,8% en 77,4% waren. De optimale afkapwaarden voor LUS en miR-486-3p waren respectievelijk 15,500 en 1,465. Bovendien was de AUC voor het gecombineerde voorspellende model 0,929 (95% BI: 0,883-0,975), met een sensitiviteit van 92,9% en een specificiteit van 84,5% bij de optimale afkapwaarde van 1,659 (Figuur 1F).
Upregulatie van miR-486-3p belemmert de celfunctie
Volgens het protocol voor celkweek en LPS-interventie hebben we een in vitro ARDS-celmodel geconstrueerd met behulp van HPMEC's. qPCR-resultaten toonden aan dat de expressie van miR-486-3p geleidelijk toenam in de loop van de tijd na LPS-stimulatie (Figuur 2A). miR-486-3p werd overgeëxpresseerd of uitgeschakeld (knockdown) om de effecten ervan op ARDS-modelcellen te onderzoeken (Figuur 2B). In overeenstemming met de protocollen voor de CCK-8- en flowcytometrie-assays werden celproliferatie en apoptose gedetecteerd. Overexpressie van miR-486-3p onderdrukte de celproliferatie significant en bevorderde celapoptose. Omgekeerd verzachtte de knockdown van miR-486-3p de door LPS geïnduceerde celschade (Figuur 2C,D).
miR-486-3p reguleert de expressie van DLL4 naar beneden
Volgens het protocol voor plasmidconstructie en de dual-luciferase reporterassay hebben we de interactie tussen miR-486-3p en DLL4 geverifieerd. Bio-informatische voorspellingen bevestigden een geconserveerde bindingsplaats tussen miR-486-3p en de 3’UTR van DLL4 (Figuur 3A). De luciferase-activiteit van de DLL4 wild-type groep was significant verminderd na overexpressie van miR-486-3p, terwijl er geen duidelijke verandering werd waargenomen in de mutante groep (Figuur 3B), wat bewijst dat DLL4 een direct doelgen is van miR-486-3p. In celmodellen nam de expressie van DLL4 tijdsonafhankelijk af na LPS-behandeling (Figuur 3C). Het manipuleren van de expressie van miR-486-3p reguleerde de DLL4-niveaus eveneens negatief (Figuur 3D).
In klinische monsters was de expressie van DLL4 lager bij neonaten met ARDS dan bij gezonde controles, en verder verlaagd in de overlijdensgroep (Figuur 3E–F). Een negatieve correlatie tussen miR-486-3p en DLL4 werd waargenomen bij patiënten die niet overleefden (r = -0,795, P < 0,001) (Figuur 3G). Alle qPCR-tests voor DLL4 werden uitgevoerd met drie technische replica's, en de resultaten waren stabiel.
DLL4 keren de door miR-486-3p gemedieerde celbeschadiging om
Na het co-transfectieprotocol met het miR-486-3p mimic en het DLL4-overexpressieplasmid hebben we rescue-experimenten uitgevoerd. qPCR bevestigde dat de expressie van DLL4 effectief werd hersteld na OE-DLL4-transfectie (Figuur 4A). Functionele tests lieten zien dat overexpressie van DLL4 het remmende effect van miR-486-3p op de celproliferatie en het pro-apoptotische effect gedeeltelijk terugdraaide (Figuur 4B,C). Deze resultaten gaven aan dat miR-486-3p de celactiviteit gedeeltelijk moduleert door DLL4 te targeten.
Beschikbaarheid van gegevens:
Alle gegevens die tijdens deze studie zijn gegenereerd of geanalyseerd, worden verstrekt als Aanvullend bestand 1.
Figuur 1: Vergelijking van LUS en serum miR-486-3p gehaltes tussen groepen. (A) Serum miR-486-3p gehaltes bij gezonde neonaten en neonaten met ARDS. (B) LUS-waarden bij gezonde neonaten en neonaten met ARDS. (C) Serum miR-486-3p gehaltes in de overlevingsgroep en de sterftegroep. (D) LUS-waarden in de overlevingsgroep en de sterftegroep. (E) Correlatieanalyse tussen serum miR-486-3p en LUS bij niet-overlevende neonaten met ARDS. (F) ROC-curves van enkelvoudige LUS, enkelvoudige miR-486-3p en gecombineerde detectie voor het voorspellen van de prognose van neonatale ARDS. Alle kwantitatieve gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie; foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. *** = p <0.001, vergeleken met de gezonde groep; ### = p <0.001, vergeleken met de groep met milde ARDS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effect van miR-486-3p op cellen in een ARDS-model. (A) Tijdsafhankelijke veranderingen in de expressie van miR-486-3p in HPMECs na LPS-behandeling. (B) Relatieve expressie van miR-486-3p na overexpressie- en knockdown-interventie. (C) Celproliferatieactiviteit bepaald met een CCK-8-assay na wijziging van de miR-486-3p expressie. (D) Celapoptoserate bepaald met flowcytometrie na wijziging van de miR-486-3p expressie. Alle gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie; foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Statistische markeringen: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verificatie van de targetrelatie tussen miR-486-3p en DLL4. (A) Schematisch diagram van de voorspelde bindingsplaats tussen miR-486-3p en de 3’UTR van DLL4. (B) Duale luciferase reporter-genassay bevestigde de targetrelatie tussen miR-486-3p en DLL4. (C) Dynamische veranderingen in DLL4-expressie in HPMEC's na LPS-behandeling. (D) DLL4-expressie na overexpressie of knockdown van miR-486-3p. (E) Serum DLL4-spiegels bij gezonde neonaten en neonaten met ARDS. (F) DLL4-spiegels in de overlevingsgroep en de sterftegroep van neonaten met ARDS. (G) Correlatieanalyse tussen serum miR-486-3p en DLL4 bij niet-overlevende neonaten met ARDS. Alle kwantitatieve gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie; foutbalken stellen de standaarddeviatie voor. Statistische markeringen: * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001 ten opzichte van de gezonde groep, ### = p <0,001 ten opzichte van de groep met milde ARDS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effect van miR-486-3p targeting van DLL4 op ARDS-modelcellen. (A) Detectie van DLL4-expressie na co-transfectie van miR-486-3p mimic en DLL4 overexpressie-plasmide. (B) Veranderingen in de celproliferatieactiviteit na DLL4 rescue. (C) Veranderingen in de apoptosesnelheid van cellen na DLL4 rescue. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie; foutenbalken representeren de standaarddeviatie. Statistische markers:* = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Variabele | Gezond (n=100) | Neonatale ARDS (n=112) | p-waarde |
| Zwangerschapsduur (weken) | 36.07 ± 2.71 | 35.72 ± 2.64 | 0.347 |
| Geslacht (mannelijk, %) | 59 (59.0 %) | 74 (66.1 %) | 0.29 |
| Geboortegewicht (kg) | 3.39 ± 0.57 | 3.33 ± 0.55 | 0.437 |
| Moederleeftijd (jaren) | 29.18 ± 4.00 | 29.66 ± 4.05 | 0.387 |
| Toedieningsmethode | 0.439 | ||
| Vaginaal | 54 (54.0 %) | 65 (58.0 %) | |
| Keizersnedede | 46 (46.0 %) | 47 (42.0 %) | |
| ARDS-gradaties | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64.3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35.7 %) |
Tabel 1: Baselinekenmerken van de geïncludeerde zuigelingen. Deze tabel vat de baseline demografische informatie van gezonde pasgeborenen en pasgeborenen met ARDS samen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie voor continue variabelen, en aantal (percentage) voor categorische variabelen. P-waarden geven statistische verschillen tussen de groepen aan. Afkortingen: ARDS = acute respiratory distress syndrome.
| Variabele | Overleving (n=84) | Overlijden (n=28) | p-waarde |
| Zwangerschapsduur (weken) | 35.95 ± 2.58 | 35.04 ± 2.76 | 0.112 |
| Geslacht (mannelijk, %) | 53 (63.1 %) | 21 (75.0%) | 0.253 |
| Geboortegewicht (kg) | 3.37 ± 0.58 | 3.23 ± 0.42 | 0.248 |
| Leeftijd moeder (jaren) | 29.49 ± 3.82 | 30.18 ± 4.74 | 0.438 |
| Bevallingsmethode | 0.444 | ||
| Vaginaal | 47 (56.0 %) | 18 (64.3 %) | |
| Keizersneden | 37 (44.0 %) | 10 (35.7 %) | |
| Afwijkend vruchtwater | 6 (9.5 %) | 4 (14.3 %) | 0.485 |
| ARDS-gradaties | 0.001** | ||
| I-II | 61 (72.6 %) | 11 (39.3 %) | |
| III-IV | 23 (27.4 %) | 17 (60.7%) | |
| Etiologie | 0.827 | ||
| Verslikken | 33 (39.3 %) | 12 (42.9 %) | |
| Longontsteking | 17 (20.2 %) | 6 (21.4 %) | |
| Sepsis | 12 (14.3 %) | 2 (7.1 %) | |
| Mekoniumaspiratiesyndroom | 22 (26.2 %) | 8 (28.6 %) |
Tabel 2: Vergelijking van klinische gegevens tussen de overlevingsgroep en de overlijdensgroep bij neonaten met ARDS. Deze tabel vergelijkt klinische indicatoren tussen overlevende en niet-overlevende neonaten met ARDS. Continue gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, en categorische gegevens worden uitgedrukt als aantal (percentage). p-waarden geven de statistische significantie tussen de twee groepen aan. ** = p<0,01. Afkortingen: ARDS = acute respiratory distress syndrome.
Aanvullend bestand 1: Ruwe klinische en experimentele datasets ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie, inclusief individuele metingen voor de longechoscore (LUS), serum miR-486-3p expressie, DLL4 expressie en resultaten van celgebaseerde assays.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Neonatale ARDS is een belangrijke oorzaak van respiratoir falen en vroege mortaliteit bij kritiek zieke neonaten15. Een vroege en nauwkeurige evaluatie van de ernst van de ziekte en de prognose is de voorwaarde voor geïndividualiseerde interventie en het verminderen van de mortaliteit. Een groeiende hoeveelheid bewijs bevestigt dat microRNA's deelnemen aan de pathologische progressie van ARDS en dienen als veelbelovende circulerende biomarkers16. Onderzoek wijst uit dat miR-155 sterk verhoogd is bij septische patiënten die lijden aan acute longschade/ARDS17. Daarnaast hebben studies een toename in serum miR-629-5p-spiegels onthuld bij kinderen met de diagnose ARDS18. Serum miR-34a is nauw gerelateerd aan de ernst en prognose van neonataal RDS19. Nieuwe studies tonen miR-375 aan als een diagnostische en prognostische biomarker voor neonatale ARDS20. Vergelijkbaar met deze gerapporteerde moleculen kan serum miR-486-3p stabiel worden gedetecteerd in perifeer bloed via kwantitatieve PCR en is het geschikt voor snelle screening op neonatale intensive care-afdelingen (NICU's). Vergeleken met miR-375 en miR-34a, die voornamelijk het vroege begin van de ziekte weerspiegelen, correleert de expressie van miR-486-3p nauwer met de ernst van de pulmonale laesies en verandert deze dynamisch mee met de progressie van de longschade. In combinatie met LUS wordt een hogere prognostische nauwkeurigheid voor kortetermijnmortaliteit bereikt. Desondanks vertoont miR-486-3p een relatief lage ziektespecificiteit, en het relevante klinische onderzoeksbewijs blijft beperkt in vergelijking met dat van goed gevestigde miRNA-biomarkers. In samenhang heeft miR-486-3p de potentie om te dienen als marker voor ondersteunende diagnose of prognostische voorspelling van neonatale ARDS.
LUS is een volwassen bedside-beeldgevingsindicator die de pulmonale beluchting evalueert op basis van ultrasone kenmerken van het longweefsel21. In het bijzonder dient LUS als een effectieve kwantitatieve maatstaf voor het bepalen van de mate van alveolaire ventilatie22. Onderzoek heeft het nut ervan bevestigd bij het evalueren van zowel de ernst als de prognose van neonatale ARDS23. In overeenstemming met eerdere studies onthulde onze klinische studie dat LUS-metingen bij neonaten met ARDS significant verhoogd waren in vergelijking met die bij gezonde neonaten. Bovendien vertoonde, binnen de getroffen neonaten, de ernstige subgroep merkbaar hogere LUS-waarden dan de milde subgroep, wat een direct verband onderstreept tussen verhoogde LUS-metingen en de ernst van atelectase, longoedeem en longconsolidatie24. Onze bevindingen gaven verder aan dat patiënten die uiteindelijk overleden waren, ook een opmerkelijk hogere LUS vertoonden dan overlevers. In niet-overlevende neonaten werd een sterke positieve correlatie waargenomen tussen LUS en serum miR-486-3p, wat de synergetische waarde van de twee indicatoren verder ondersteunt. Elke methode heeft inherente kenmerken: LUS is stralingsvrij, draagbaar en geschikt voor real-time monitoring aan het bed, maar de interpretatie ervan is sterk afhankelijk van de ervaring van de operator en is onderhevig aan subjectieve bias. Serum miR-486-3p-detectie levert objectieve, reproduceerbare kwantitatieve resultaten, maar kan geen real-time morfologische veranderingen in het longweefsel reflecteren. In de klinische praktijk wordt deze gecombineerde aanpak aanbevolen voor routinematig gebruik op neonatale intensive care units. Het is geschikt voor vroege risicostratificatie van neonaten met vermoedelijke of bevestigde ARDS, regelmatige dynamische beoordeling van de ziekteprogressie en ondersteunend oordeel over de klinische kortetermijnprognose. Deze methode is echter niet bedoeld om definitieve beeldvorming of etiologische onderzoeken te vervangen; het vertoont beperkte specificiteit wanneer het wordt toegepast op neonaten met andere inflammatoire longziekten. Daarnaast moet, aangezien ons onderzoek in één centrum is uitgevoerd, de toepasbaarheid op populaties uit verschillende regio's nog worden geverifieerd.
Klinisch hebben we waargenomen dat verhoogde LUS-waarden, in combinatie met hoge serum miR-486-3p-niveaus, geassocieerd waren met een slechte prognose bij neonatale ARDS, wat suggereert dat miR-486-3p nauw verbonden kan zijn met ernstig longvasculair letsel en een verminderd vasculair herstelvermogen in de onrijpe long. Onze in vitro celexperimenten vulden deze klinische observatie aan door aan te tonen dat miR-486-3p direct de proliferatie en apoptose van endotheelcellen moduleert, wat kernprocessen zijn die de vasculaire integriteit en het herstel in de neonatale long bepalen. Bovendien heeft onderzoek aangetoond dat miRNA's cruciale rollen spelen in diverse cellulaire processen25,26. Het is algemeen bekend dat miRNA's hun effecten primair uitoefenen via post-transcriptionele regulatie van doelgenen, waarbij voornamelijk miRNA-splicing en de repressie van eiwitvertaling betrokken zijn27. Het DLL4-gen speelt een belangrijke rol bij de vasculaire ontwikkeling en angiogenese28. Onderzoek heeft aangetoond dat de microRNA-30-familie DLL4 target om het gedrag van endotheelcellen tijdens angiogenese te moduleren29. Deze bevindingen suggereren dat modulatie van endotheliaal DLL4 geassocieerd kan zijn met longvasculair letsel bij neonatale ARDS. In ons onderzoek hebben we de targeting-relatie tussen miR-486-3p en DLL4 geïdentificeerd en gevalideerd. Vervolganalyses onthulden dat een verhoogde expressie van miR-486-3p de proliferatie van LPS-geïnduceerde HPMEC's significant remde, terwijl apoptose werd bevorderd. Belangrijk is dat DLL4-expressie de door miR-486-3p gemedieerde effecten gedeeltelijk kon omkeren. Dit suggereert dat miR-486-3p DLL4 target om de functie van HPMEC's te beïnvloeden en de progressie van neonatale ARDS te reguleren. Echter, of het direct pulmonary vasculaire dysfunctie beïnvloedt en bijdraagt aan ARDS, moet nog verder worden geverifieerd. Opvallend is dat DLL4 de door miR-486-3p geïnduceerde cellulaire veranderingen slechts gedeeltelijk omkeerde. Als een typisch miRNA moduleert miR-486-3p meerdere downstream doelgenen. Toekomstige studies zullen zich richten op het identificeren van meer doelgenen om het volledige mechanisme van miR-486-3p bij neonatale ARDS te verduidelijken.
Ten slotte is het vermeldens waard dat een strikte standaardisatie van cruciale protocolstappen zorgt voor betrouwbare en reproduceerbare gegevens. We hebben de procedures voor monstername geünificeerd, gestandaardiseerde celkweek- en transfectieprotocollen gehanteerd en onafhankelijke replica's opgenomen om experimentele fouten te minimaliseren. Veelvoorkomende operationele problemen en oplossingen zijn als volgt samengevat: Voor LUS-beoordeling moet het scanprotocol voor 12 regio's en de scoreregels worden gestandaardiseerd en geünificeerd, en dient de houding van de neonate te worden aangepast om heldere beelden te verkrijgen. Voor de detectie van serum-miRNA moeten herhaalde vries-dooi-cycli worden vermeden, moet de RNA-zuiverheid worden geverifieerd (A260/A280 = 1,8–2,1) en moeten technische replica's worden opgenomen. Voor LPS-geïnduceerde celmodellen moet vers bereid 1 mg/L LPS en stabiele kweekcondities worden gebruikt. Optimaliseer de celconfluentie en de reagensverhouding tijdens transfectie en vervang het medium om cytotoxiciteit te verminderen. Zorg voor volledige cellyse en gestandaardiseerde uitvoering bij dual-luciferase assays.
In zijn geheel is de gecombineerde LUS/miR-486-3p-strategie, vergeleken met conventionele methoden zoals thoraxbeeldvorming, bloedgasanalyse en tests voor enkelvoudige biomarkers, stralingsvrij, goedkoop en eenvoudig uit te voeren, met een verbeterde voorspellende waarde. Het dient als een betrouwbaar complementair prognostisch instrument voor neonatale ARDS. Klinisch kan deze methode worden toegepast voor vroege risicostratificatie en dynamische bewaking van de conditie op neonatale intensive care-units. Het kan daarnaast dienen as een uniforme evaluatie-index voor multicentrische studies. Mechanistisch biedt de gevalideerde miR-486-3p/DLL4-as nieuwe richtingen voor het onderzoeken van pathologische mechanismen en gerichte therapie. Deze gecombineerde aanpak kent echter ook inherente technische beperkingen. LUS-resultaten variëren per operator en miR-486-3p mist ziekte-specificiteit voor inflammatoire longziekten. Deze methode ondersteunt enkel detectie op één tijdstip en kan definitieve beeldvorming of etiologische onderzoeken niet vervangen.
Ondanks de veelbelovende resultaten verdienen enkele beperkingen aandacht. Ten eerste beperkt het ontwerp binnen één enkele instelling de generaliseerbaarheid van onze conclusies. Ten tweede ontbrak een externe validatiecohort om de robuustheid van de voorspellende prestaties van het LUS/miR-486-3p panel te verifiëren. Ten derde werd serum miR-486-3p slechts op één enkel tijdstip gemeten, waardoor de dynamische associatie met de ziekteprogressie niet is vastgelegd. Ten vierde beperkt het ontbreken van aanvullende eiwitanalyses en in vitro/in vivo validatie de robuustheid van onze mechanistische gevolgtrekkingen. Tot slot is de specifieke rol van miR-486-3p in de pathofysiologie van neonatale ARDS nog onvolledig opgehelderd en is verder onderzoek hiertoe gerechtvaardigd. Concluderend dienen de verhoogde LUS en de verhoogde serumspiegels van miR-486-3p bij neonaten met ARDS als belangrijke referentiepunten in de klinische praktijk. De synergetische evaluatie van deze twee biomarkers kan een nauwkeurige voorspelling van zowel de ernst als de prognose van neonatale ARDS faciliteren, waarmee een zekere klinische toepassingswaarde wordt aangetoond.
Openbaarmakingen
Grammarly is gebruikt voor de optimalisatie van de Engelse uitdrukkingswijze, grammarcontrole en standaardisatie van het formaat. Alle onderzoeksideeën, experimenten, gegevens en conclusies zijn origineel werk van de auteurs.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,2 mL PCR-buisjes | Axygen | PCR-02-C | |
| 0,25% trypsine-EDTA-oplossing | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| 1,5 mL microcentrifugebuisjes | Axygen | MCT-150-C | |
| Bevocht cellenkweekincubator met 5% CO2 | Thermo Fisher | 3111 | |
| 6-wells kweekplaten voor cellen | Corning | 3516 | |
| 96-wells celkweekplaten | Corning | 3599 | |
| Absoluut ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Annexine V-FITC Apoptosis Detectie Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| Benchtopcentrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Biologische veiligheidskast | Thermo Fisher | 1300 Serie A2 | |
| CCK-8 celtelkit | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Wegwerpbuizen voor steriele bloedafname | BD Vacutainer | 367815 | |
| Plasmide voor overexpressie van DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| DLL4-MUT Luciferase Reporter-plasmide | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| DLL4-WT Luciferase Reporter Plasmid | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | Biolab | BL101A | |
| Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-lezer | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| Foetaal runderserum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Filterpipetpunten (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Flowcytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flowcytometrie buizen | BD Biosciences | 352054 | |
| Gekoelde hogesnelheidscentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Lipopolysaccharide (LPS) van E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Long-echografiesysteem | Mindray | M9 | |
| Microvolume-spectrofotometer | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| miR-486-3p-remmer | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| miR-486-3p mimic | RiboBio | HmiR0000486 | |
| miR-486-3p qPCR-primer set | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Negatieve controle-inhibitor (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Negatieve controle-mimic (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Negatief controle-overexpressieplasmid (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Penicilline-streptomycine-oplossing (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Pipetset (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Propidiumjodide (PI)-kleuringsoplossing | BD Biosciences | 556463 | |
| Real-time kwantitatieve PCR-systeem | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| RNase-vrij water | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| RT-PCR Quick Master Mix | Toyobo | FSQ-101 | |
| Steriele wegwerppipetten | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| SYBR Green Real-time PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| Trizol-reagens | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| U6 snRNA qPCR-primerset | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Vortexmixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Referenties
- Chi M, Mei YB, Feng ZC. A review on neonatal acute respiratory distress syndrome. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2018;20(9):724-728.
- Garcia MJ, Amarelle L, Malacrida L, Briva A. Novel opportunities from bioimaging to understand the trafficking and maturation of intracellular pulmonary surfactant and its role in lung diseases. Front Immunol. 2023;14:1250350.
- Wu H, et al. The value of oxygen index and base excess in predicting the outcome of neonatal acute respiratory distress syndrome. J Pediatr (Rio J). 2021;97(4):409-413.
- Coppola S, et al. Respiratory mechanics, lung recruitability, and gas exchange in pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2019;47(6):792-799.
- Bello G, Blanco P. Lung ultrasonography for assessing lung aeration in acute respiratory distress syndrome: a narrative review. J Ultrasound Med. 2019;38(1):27-37.
- Wu HL, et al. Lung ultrasound score for monitoring the withdrawal of extracorporeal membrane oxygenation on neonatal acute respiratory distress syndrome. Heart Lung. 2024;63:9-12.
- King A, Blank D, Bhatia R, Marzbanrad F, Malhotra A. Tools to assess lung aeration in neonates with respiratory distress syndrome. Acta Paediatr. 2020;109(4):667-678.
- Zhu Z, et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017;5(1):38.
- Long G, Zhang Q, Yang X, Sun H, Ji C. Diagnostic and predictive significance of serum miR-141-3p in acute respiratory distress syndrome patients with pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 2024;262(3):157-162.
- Liang Y, et al. MiR-124-3p helps to protect against acute respiratory distress syndrome by targeting p65. Biosci Rep. 2020;40(5).
- Najafipour R, et al. Screening for differentially expressed microRNAs in BALF and blood samples of infected COVID-19 ARDS patients by small RNA deep sequencing. J Clin Lab Anal. 2022;36(11):e24672.
- Zhang S, et al. Clinical significance and potential mechanism of hsa_circ_0006892 in acute respiratory distress syndrome complicated with pulmonary fibrosis. Mol Biol Rep. 2024;51(1):1120.
- Yao MY, et al. Long non-coding RNA MALAT1 exacerbates acute respiratory distress syndrome by upregulating ICAM-1 expression via microRNA-150-5p downregulation. Aging (Albany NY). 2020;12(8):6570-6585.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-338-3p is a biomarker in neonatal acute respiratory distress syndrome and has roles in the inflammatory response of ARDS cell models. Acta Med Okayama. 2022;76(6):635-643.
- Shi S, et al. Evaluation of the neonatal sequential organ failure assessment and mortality risk in neonates with respiratory distress syndrome: a retrospective cohort study. Front Pediatr. 2022;10:911444.
- Martucci G, et al. Identification of a circulating miRNA signature to stratify acute respiratory distress syndrome patients. J Pers Med. 2020;11(1).
- Wang ZF, Yang YM, Fan H. Diagnostic value of miR-155 for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome in patients with sepsis. J Int Med Res. 2020;48(7):300060520943070.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-629-5p may serve as a biomarker for pediatric acute respiratory distress syndrome and can regulate the inflammatory response. Pediatr Neonatol. 2024. doi:10.1016/j.pedneo.2024.05.003.
- Li Q, Chen Y, Lin L. Value of serum miR-34a and Ang-1 in severity evaluation and prognosis of neonatal respiratory distress syndrome. Emerg Med Int. 2022;2022:5480026.
- Deng Y, Zhang R, Jiang X. Association of umbilical cord blood miR-375 with neonatal respiratory distress syndrome and adverse neonatal outcomes in premature infants. Acta Biochim Pol. 2022;69(3):605-611.
- Ostras O, Shponka I, Pinton G. Ultrasound imaging of lung disease and its relationship to histopathology: an experimentally validated simulation approach. J Acoust Soc Am. 2023;154(4):2410-2425.
- Soliman RM, et al. Prediction of extubation readiness using lung ultrasound in preterm infants. Pediatr Pulmonol. 2021;56(7):2073-2080.
- Huang L, Ye D, Wang J. Analysis of diagnosing neonatal respiratory distress syndrome with lung ultrasound score. Pak J Med Sci. 2022;38(5):1101-1106.
- Chardoli M, et al. Lung ultrasound in predicting COVID-19 clinical outcomes: a prospective observational study. J Am Coll Emerg Physicians Open. 2021;2(6):e12575.
- Jafari N, Abediankenari S. Role of microRNAs in immunoregulatory functions of epithelial cells. BMC Immunol. 2024;25(1):84.
- Sun LL, Li WD, Lei FR, Li XQ. The regulatory role of microRNAs in angiogenesis-related diseases. J Cell Mol Med. 2018;22(10):4568-4587.
- Hynes C, Kakumani PK. Regulatory role of RNA-binding proteins in microRNA biogenesis. Front Mol Biosci. 2024;11:1374843.
- Chowdhury TA, Li K, Ramchandran R. Lessons learned from a lncRNA odyssey for two genes with vascular functions, DLL4 and TIE1. Vascul Pharmacol. 2019;114:103-109.
- Bridge G, et al. The microRNA-30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis. Blood. 2012;120(25):5063-5072.