Een computationele workflow voor het prioriteren van gastheergenen geassocieerd met microbiële metabolieten bij constipatie-predominant prikkelbare darmsyndroom

Samenvatting

Dit protocol integreert de voorspelling van microbiële metabolietdoelen, transcriptomica van het rectale slijmvlies, eiwit-eiwitinteractie en padverrijking, moleculaire docking, moleculaire dynamicasimulatie en de schatting van de vrije bindingsenergie via Molecular mechanics/Poisson–Boltzmann surface area (MM-PBSA) om een gerangschikte, hypothesevormende shortlist van kandidaat-gastheergeneen geassocieerd met metabolieten en structureel geprioriteerde eiwit-ligandcomplexen te genereren voor experimentele follow-up.

Samenvatting

Er bestaat geen gestandaardiseerde computationele pijplijn voor het systematisch prioriteren van gastheergeneven geassocieerd met microbiële metabolieten en eiwit-ligandcomplexen uit openbaar beschikbare chemische, genomische en structurele databases. Dit artikel beschrijft een workflow in acht fasen die een door de gebruiker gedefinieerde set van uit de darmmicrobiota afgeleide metabolieten accepteert en een gerangschikte shortlist produceert van kandidaat-gastheergeneven geassocieerd met metabolieten, verrijkte biologische pathways en structureel geprioriteerde eiwit-ligandcomplexen voor experimentele follow-up. De pijplijn integreert (i) chemo-informatische metabolietprofilering; (ii) voorspelling van kandidaat-targets via meerdere databases met behulp van een tool voor eiwit-chemische interactie en ligand-gebaseerde target-voorspelling en een moleculaire docking-programma; (iii) differentiële genexpressieanalyse van openbaar beschikbare transcriptomische gegevens; (iv) overlap tussen targets en differentieel tot expressie gebrachte genen; (v) constructie van een eiwit-eiwitinteractienetwerk en pathway-verrijking; (vi) moleculaire docking met een moleculaire docking-programma; (vii) een moleculaire dynamicasimulatie van 200 ns met een moleculaire dynamica-engine met een eiwitkrachtveld gebruikt voor moleculaire dynamicasimulaties; en (viii) MM-PBSA schatting van de vrije bindingsenergie. Als praktijkvoorbeeld werden negen uit de darmmicrobiota afgeleide of door de microbiota gemodificeerde metabolieten, vertegenwoordigers van kortketenige vetzuren, galzuren, uit tryptofaan afgeleide metabolieten en urolithine A, verwerkt met behulp van de openbare IBS-C rectale mucosale transcriptomische dataset GSE36701. De workflow rangschikte 17 unieke voorspelde metaboliet-geassocieerde genen die in deze dataset differentieel tot expressie werden gebracht. Docking, moleculaire dynamicasimulatie en MM-PBSA-analyses prioriteerden structureel vijf metaboliet-eiwitcomplexen: lithocholzuur-VDR, lithocholzuur-NR1H4/FXR, ursodeoxycholzuur-NR1H4/FXR, tryptamine-HTR2A (gesimuleerd in een expliciete 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) lipide dubbellaag) en urolithine A-CASP3. Het protocol is ontworpen om aanpasbaar te zijn aan andere metabolietsets, ziekte-transcriptomische datasets en targetklassen; alle resultaten zijn hypothese-genererende computationele voorspellingen die onafhankelijke transcriptomische replicatie, validatie op eiwitniveau en functionele ligand-respons assays vereisen voordat causale of therapeutische conclusies kunnen worden getrokken.

Inleiding

Prikkelbare darmsyndroom met constipatie (PDS-C) is een veelvoorkomende functionele gastro-intestinale stoornis die wordt gekenmerkt door terugkerende buikpijn, veranderde ontlastingsgewoonten, een opgeblazen gevoel en constipatie, met een wereldwijde prevalentie die wordt geschat op ongeveer 10–15% van de algemene bevolking^1,2. Huidige farmacologische therapieën, waaronder secretagogen, prokinetica en antispasmodica, kunnen individuele symptomen verbeteren bij een subset van patiënten; echter blijft de respons op de behandeling heterogeen en wordt een duurzame remissie zelden bereikt, wat de complexe, multifactoriële pathobiologie van de aandoening weerspiegelt^1,3,4. Een vollediger mechanistisch begrip van hoe microbiële signalen uit de darm op mucosaal niveau worden getransduceerd is daarom vereist om testbare hypothesen te genereren voor nieuwe therapeutische doelwitten.

Het darmmicrobioom draagt bij aan de homeostase van de lagere gastro-intestinale tractus via de productie en biotransformatie van chemisch diverse metabolieten, waaronder kortketenige vetzuren (SCFA's), secundaire galzuren, tryptofaan-afgeleide verbindingen en polyfenool-afgeleide metabolieten zoals urolithinen^5,6,7,8. Deze moleculen communiceren met gastheercellen via een breed en onvolledig gekarakteriseerd repertoire van moleculaire targets dat zich ruim uitstrekt voorbij de canonieke metaboliet-detecterende membraanreceptoren en ook nucleaire receptoren, cytosolische enzymen, histon-modificerende eiwitten, peptidehormoonprecursoren en intracellulaire signaleringseiwitten omvat⁹. Veranderde samenstellingen van de darmmicrobiële gemeenschap en metabolietenprofielen zijn gedocumenteerd bij patiënten met het prikkelbare darmsyndroom (PDS), wat een biologische rationale biedt voor onderzoek naar de vraag of gastheergenen die geassocieerd zijn met de responsiviteit op microbiële metabolieten transcriptioneel verstoord zijn in het rectale slijmvlies bij PDS-C¹⁰.

Het panel van negen metabolieten werd a priori gedefinieerd om een compacte, chemisch diverse en biologisch interpreteerbare set van door darmmicrobiota afgeleide of gemodificeerde kleine moleculen te bieden. De selectie was gebaseerd op vijf criteria: representatie van belangrijke klassen microbiële metabolieten die betrokken zijn bij signalering tussen gastheer en microbiota; bekende of aannemelijke blootstelling van het distale intestinale slijmvlies; beschikbaarheid van ondubbelzinnige PubChem-identificatoren en canonieke structuren; moleculaire grootte en structurele hanteerbaarheid voor ligand-gebaseerde doelvoorspelling en docking; en eerdere aannemelijkheid voor epitheliale, neuro-immune, entero-endocriene, nucleaire receptor- of motiliteitsgerelateerde signalering bij IBS-C. Het geselecteerde panel omvatte butyraat en propionaat als SCFA's; chenodeoxycholzuur, lithocholzuur en ursodeoxycholzuur als galzuren; tryptamine, indol-3-propionzuur en indol-3-melkzuur als tryptofaan-afgeleide metabolieten; en urolithine A als een door darmmicrobiota afgeleide polyfenolmetaboliet^5,6,7,8,9,10.

De meeste eerdere computationele en experimentele onderzoeken hebben individuele metaboliet-receptor- of metaboliet-enzymparen geïsoleerd bestudeerd, een aanpak die de gedistribueerde, convergente aard van microbiële metabolietsignalering over gastheerpaden heen niet vastlegt^9,11. De integratie van meerdere analytische fasen biedt een wederzijds versterkende filtercapaciteit die geen enkele fase onafhankelijk kan leveren. Computationele targetvoorspelling aan de hand van gecureerde databases levert een brede set kandidaate gastheerproteïnen op voor elke metaboliet. Doorsneeing met ziekterelevante transcriptomische gegevens filtert deze set aanzienlijk, waarbij alleen kandidaten overblijven waarvan de transcripten in de context van de ziekte zijn veranderd. Pathway-verrijking en analyses van proteïne-proteïne-interactienetwerken mappen vervolgens de gereduceerde kandidatenlijst naar bekende biologische modules. Molecular docking biedt een eerste computationele beoordeling van de complementariteit van de bindingspocket voor elk kandidaatcomplex, en een aanvullende 200 ns molecular dynamics (MD) simulatie met MM-PBSA bindingsvrije-energie-decompositie voegt een tijdgevoelige, thermodynamische dimensie toe aan de structurele prioritering die niet enkel uit docking-scores beschikbaar is. Het onafhankelijk uitvoeren van elke stap, zonder systematische integratie en sequentiële filtering, zou resulteren in kandidatenlijsten die te breed zijn om experimenteel hanteerbaar te zijn en zou er niet in slagen om convergente pathway-architectuur te detecteren.

Binnen het kader van dit volledige protocol bedoelen we met de term “metaboliet-geassocieerd gen” (MAG) een menselijk gen waarvan het eiwitproduct is aangemerkt als een hypothetisch moleculair doelwit van één of meer metabolieten afkomstig uit het darmmicrobioom door ten minste één gecureerde computationele voorspellingsdatabase, en waarvan het transcript differentieel tot expressie komt in de ziekte-relevante transcriptomische dataset die wordt gebruikt om de workflow aan te tonen. Deze operationele definitie omvat bewust membraanreceptoren plus nucleaire receptoren, cytosolische enzymen, signaaleiwitten, peptidehormoonprecursors en andere intracellulaire eiwitten. De aanwijzing als MAG is geen experimenteel bewijs dat een metaboliet bindt, een eiwit-ligandcomplex vormt, een receptor activeert, de eiwitovervloed verandert of een ziekte veroorzaakt, maar een computationeel afgeleide, hypothese-genererende nominatie die experimentele validatie vereist.

Dit protocol beschrijft de volledige computationele workflow in acht fasen (Figuur 1>) met voldoende operationele details om onafhankelijke replicatie, aanpassing aan andere metabolietenpanels of ziekte-datasets en uitbreiding naar andere contexten van interacties tussen gastheer en microbiota mogelijk te maken. De workflow is expliciet opgezet als een kader voor hypothesegeneratie en structurele prioritering dat uitsluitend gebruikmaakt van publiek beschikbare omics- en structurele bronnen en op basis van computationele resultaten alleen geen conclusies trekt over veranderde metabolietconcentraties, receptoractivatietoestanden, veranderingen in eiwitexpressie, downstream signaleringsactiviteit of klinische significantie. Hier demonstreren we het protocol aan de hand van een praktijkvoorbeeld met negen metabolieten die zijn afgeleid van of gemodificeerd door de darmmicrobiota en de publieke IBS-C rectale mucosale transcriptomische dataset GSE36701, met als doel MAG's te identificeren en metaboliet-eiwitcomplexen te prioriteren voor subsequent experimentele follow-up.

Protocol

Voor de analyse werden uitsluitend openbaar beschikbare, gedeïdentificeerde transcriptomische gegevens uit GSE36701 en openbare chemische, eiwit- en structurele databanken gebruikt. De databanken werden geraadpleegd tussen januari en mei 2026. Elke latere toegangsdatum is gedocumenteerd in de aparte tabel met materialen.

1. Onderzoeksopzet, hardware- en softwarevereisten

1. Definieer de workflow voordat u met de analyse begint. Gebruik acht fasen: metabolietselectie, targetvoorspelling, differentieel-expressieanalyse, overlap van targets en differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG), proteïne-proteïne interactie (PPI) / pathway-verrijking, moleculaire docking, MD-simulatie en MM-PBSA schatting.
2. Noteer dat docking, MD en MM-PBSA uitsluitend instrumenten zijn voor structurele prioritering. Interpreteer deze resultaten niet als experimenteel bewijs voor binding, receptoractivatie, verandering in proteïne-abundantie, therapeutische effectiviteit of ziektecausaliteit.
3. Controleer de computerhardware voordat u MD-simulaties uitvoert. Gebruik een 64-bits Linux OS, een 6-core CPU of beter, een GPU-acceleratieplatform met ≥8 GB VRAM, of een equivalent GPU-acceleratieplatform met ≥8 GB VRAM met ten minste 8 GB VRAM, minimaal 32 GB RAM en ten minste 200 GB vrije opslagruimte per MD-systeem.
4. Noteer de kernsoftware: een moleculaire dynamica-engine, software voor moleculaire docking van metabolietliganden aan targetproteïnen, chemische bestandsformaatconversie¹², driedimensionale ligandgeneratie, ligandpreparatie, een toolkit voor docking-inputpreparatie, een moleculaire docking van metabolietliganden aan targetproteïnen, een programmeeromgeving voor algemeen gebruik, een statistische computeromgeving met een bio-informatica softwareframework en een pakket voor differentieel gen-expressieanalyse.
5. Noteer de instrumenten voor structurele analyse: een webgebaseerd instrument voor de constructie van membraansystemen, een CHARMM-compatibele ligandparameterisatiedienst, een instrument voor de berekening van bindingsenergie via moleculaire mechanica/continuüm-oplosmiddel, een bibliotheek voor moleculaire topologie- en parameterconversie, een driedimensionaal moleculaire visualisatieprogramma en een instrument voor moleculaire visualisatie en tweedimensionale interactiediagrammen 2021 (zie de Tabel met materialen voor downloadlinks en versie-informatie).
6. Noteer de exacte gebruikte proteïne-force field voor moleculaire dynamica-simulaties, CGenFF, CHARMM-GUI, R/bio-informatica softwareframework en de release-identificatoren van het instrument voor de berekening van bindingsenergie via moleculaire mechanica/continuüm-oplosmiddel in de Tabel met materialen/omgevingsbestand. Markeer ontbrekende identificatoren als "niet herstelbaar"; leid deze niet af.

2. Selectie van metabolieten en chemo-informatische karakterisering

1. Definieer het metabolietenpaneel vóór de targetvoorspelling. Neem butyraat (PubChem CID: 264), propionaat (CID: 1032), chenodeoxycholzuur (CID: 10133), lithocholzuur (CID: 9903), ursodeoxycholzuur (CID: 31401), tryptamine (CID: 1150), indole-3-propionzuur (CID: 3744), indole-3-melkzuur (CID: 92904) en urolithine A (CID: 5488186) op.
2. haal de canonieke Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) en PubChem CID op voor elke metaboliet. Verifieer synoniemen en dubbele structuren vóór de targetvoorspelling. Sla de definitieve identificatoren op in het masterblad voor metabolieten.
3. Dien de canonieke SMILES-strings in bij de webtool voor fysisch-chemische eigenschappen en ADME-voorspelling¹³ (zie Tabel van Materialen). Noteer het molecuulgewicht, het Topologische polaire oppervlak (TPSA), de consensus logP, waterstofbrugdonoren, waterstofbrugacceptoren, roteerbare bindingen, de voorspelde gastro-intestinale absorptie, de P-glycoproteïne-voorspelling en de Lipinski-, Veber-, Ghose-, Egan-, Muegge- en PAINS-alerts.
4. Behoud metabolieten met een succesvolle structuurherkenning, een molecuulgewicht ≤500 Da en zonder PAINS-alerts. Noteer elk mislukt criterium en de beslissing om de metaboliet te behouden of uit te sluiten.
5. Wijs ionisatietoestanden toe vóór de daaropvolgende targetvoorspelling en docking. Gebruik gedeprotoneerde carboxylaten voor butyraat en propionaat, neutrale carbonzuurvormen voor galzuren, geprotoneerd ammonium voor tryptamine en neutrale vormen voor de overige metabolieten.

3. Voorspelling van potentiële menselijke targets

1. Open een tool voor de voorspelling van chemische-eiwitinteractiedoelen¹⁴ (zie Table of Materials). Voer de naam van elke metaboliet of het PubChem CID in, selecteer Homo sapiens (taxonomie-ID: 9606) en stel de minimale gecombineerde interactiescore in op ≥0.700.
2. Geef in de voorspelling van chemische-eiwitinteractiedoelen prioriteit aan bewijskanalen uit experimentele en gecureerde databases. Download de volledige eiwitassociatietabel voor elke metaboliet.
3. Open een programma voor moleculaire docking¹⁵ (zie Table of Materials). Dien elke canonieke SMILES-string in met Homo sapiens geselecteerd en behoud doelen met een waarschijnlijkheid van ≥0.70.
4. Voeg de resultaten van de voorspelling van chemische-eiwitinteractiedoelen en het moleculaire dockingprogramma samen als een unieset voor elke metaboliet. Behoud elk doel dat aan een van de database-drempelwaarden voldoet en verwijder exacte dubbele vermeldingen van gensymbolen.
5. Standaardiseer eiwitvermeldingen naar door het HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) goedgekeurde gensymbolen met behulp van het mappen van eiwitidentificatoren naar gestandaardiseerde HGNC-goedgekeurde gensymbolen of de geïntegreerde database voor menselijke geninformatie (zie Table of Materials). Resolveer aliassen, verouderde symbolen en isovorm-annotaties naar één gensymbool per eiwit.
6. Classificeer elk doel als een membraanreceptor, nucleaire receptor, enzym, intracellulair signaaleiwit, peptidehormoon, hormoongerelateerd eiwit of ander intracellulair eiwit. Noteer de klasse in de doeltabel.

4. Transcriptomische dataset en analyse van differentiële genexpressie

1. Krijg toegang tot GSE36701 via de webgebaseerde tool voor differentiële genexpressieanalyse van NCBI^16,17 (zie Tabel van materialen). Noteer dat de dataset expressiegegevens van rectale mucosa-biopten bevat van IBS-C, diarree-predominant prikkelbaar darmsyndroom (IBS-D), post-infectieuze IBS en gezonde vrijwilligersgroepen¹⁸.
2. Zoek in GEO en ArrayExpress naar een onafhankelijke validatiecohort. Gebruik combinaties van IBS-C, constipation-predominant irritable bowel syndrome, rectale mucosa, colonic mucosa, biopsie, transcriptoom, microarray en RNA-seq. Noteer de repositories, zoektermen, zoekdatum en of er een vergelijkbare validatiedataset is geïdentificeerd.
3. Start de webgebaseerde tool voor differentiële genexpressieanalyse vanuit het GSE36701-record (zie Tabel van materialen). Wijs de 18 IBS-C-monsters toe aan de IBS-C-groep, wijs de 40 gezonde vrijwilligers toe aan de controlegroep en laat de IBS-D- en post-infectieuze IBS-monsters niet toegewezen.
4. Voer de differentiële expressieanalyse uit met behulp van het framework van het pakket voor differentiële genexpressieanalyse met Benjamini-Hochberg False discovery rate (FDR) correctie¹⁹. Download de volledige resultatentabel met probe ID, gensymbool, gentitel, logFC, AveExpr, gemodereerde t-statistiek, ruwe P-waarde en aangepaste P-waarde.
5. Vouw probes samen tot vermeldingen op genniveau. Verwijder probes zonder gensymbolen; behoud de probe met de laagste FDR bij dubbele symbolen; en gebruik de grootste absolute logFC als beslissingsregel.

5. Overlapanalyse tussen target en deg en statistische beoordeling

1. Kruis elke voorspelde targetlijst per metaboliet met de DEG-lijst op genniveau bij een FDR < 0,05. Noteer de overlappende genen, de herkomstmetaboliet, de logFC, de aangepaste P-waarde en de expressierichting.
2. Voeg de metaboliet-specifieke overlaplijsten samen tot een niet-redundante MAG-lijst. Tel het totaal aantal voorspelde targets, de metaboliet-specifieke overlaps en het totaal aantal unieke MAGs.
3. Beoordeel de directionele consistentie op probe-niveau voor genen met meerdere probes. Markeer elk gen waarbij de probes verschillen in expressierichting.
4. Stel de contingentietabel voor de exacte toets van Fisher op met gebruik van het totaal aantal gene-collapsed entries, het totaal aantal DEGs, het totaal aantal unieke voorspelde targets en de geobserveerde MAGs. Bereken de eenzijdige P-waarde, de odds ratio en het 95% betrouwbaarheidsinterval met de implementatie van de exacte toets van Fisher.
5. Als de achtergrond-DEG-rate 50% overschrijdt, rapporteer de overlap dan als beschrijvend in plaats van als onafhankelijk gevalideerde verrijking. Behandel uniforme downregulatie als een beschrijvend directioneel patroon, tenzij er een aparte directionaliteitstoets wordt uitgevoerd.

6. Analyse van het eiwit-eiwitinteractienetwerk en pathway-verrijking

1. Dien de volledige unieke lijst met MAG's in bij protein-protein interaction network construction and pathway enrichment²⁰ (zie Tabel met materialen). Selecteer Homo sapiens en stel de minimale interactiescore in op 0.700.
2. Exporteer het gecombineerde Protein-protein interaction network construction and pathway enrichment-netwerk en de volledige interactietabel. Als text-mining leidt tot een kunstmatig dichte topologie, deselecteer dan text-mining en behoud de kanalen voor experimentele gegevens, co-expressie en databases.
3. Genereer subnetwerken voor metabolietklassen voor SCFA-geassocieerde, galzuur-geassocieerde en tryptamine/serotonerge MAG's. Gebruik dezelfde organisme- en betrouwbaarheidsinstellingen als bij Protein-protein interaction network construction and pathway enrichment.
4. Voer Protein-protein interaction network construction and pathway enrichment uit tegen de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)²¹, Reactome²² en Gene Ontology (GO) Biological Process^23,24. Pas Benjamini–Hochberg BH FDR <0.05 toe en exporteer alle verrijkingstabellen.

7. Moleculaire docking

1. Haal experimenteel bepaalde receptorstructuren op uit de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank RCSB PDB²⁵ (zie Tabel met Materialen). Gebruik VDR/1DB1, NR1H4/FXR/3DCT, CASP3/2DKO en HTR2A/6A93 voor de vijf geprioriteerde eiwit-ligandcomplexen.
2. Prepareer elke receptor door keten A te behouden en water, co-gecrystaliseerde liganden, cofactoren, ionen en niet-eiwit HETATM-records te verwijderen. Verwijder voor 6A93 het T4 lysozym-fusiesegment vóór de receptorpreparatie.
3. Voeg polaire waterstofatomen toe, wijs Gasteiger-ladingen toe en sla elke receptor op als PDBQT met de molecular-structure toolkit. Inspecteer de protoneringstoestanden van histidine in de bindingsplaats vóór de PDBQT-conversie en documenteer de geselecteerde toestanden.
4. Genereer de 3D-structuur van elk ligand in de chemical structure file-conversion toolkit. Minimaliseer de energie met het Universal Force Field (UFF) gedurende 500 stappen, wijs de ionisatietoestand bij pH 7.4 toe, wijs Gasteiger-ladingen toe en sla op als PDBQT.
5. Definieer een dockingbox van 25 Å x 25 Å x 25 Å gecentreerd op het centroïde van het co-gecrystaliseerde ligand. Gebruik centra van (10, 19, 33) voor VDR, (137, 31, 78) voor FXR, (37, 34, 32) voor CASP3 en (12, −1, 61) voor HTR2A.
6. Voer een moleculaire docking van metabolietliganden op doeleiwitten uit^26,27 met exhaustiveness = 8, seed = 42, num_modes = 9 en energy_range = 3 kcal/mol. Registreer de hoogst gerangschikte Vina-score en de Root-mean-square deviation (RMSD)-waarden voor alle poses.
7. Selecteer modus 1 voor elk geprioriteerd complex. Genereer tweedimensionale ligand-residue-diagrammen in een moleculaire visualisatie- en tweedimensionale interactiediagram-tool, en driedimensionale receptor-ligandweergaven in een driedimensionaal moleculair visualisatieprogramma.
8. Voer redocking-controles uit voor VDR/1DB1 en FXR/3DCT. Accepteer de receptor-dockingopstelling wanneer de zware-atoom RMSD <2.0 Å is ten opzichte van de crystallografische pose.
9. Voer cross-docking-controles uit door lithocholzuur (LCA) in CASP3 en tryptamine in VDR te docken. Vergelijk cognate- en non-cognate-scores en registreer gevallen waarin het scoreverschil <1.0 kcal/mol is.

8. Moleculaire dynamicasimulatie

1. Genereer ligandparameters met een CHARMM-compatibele ligandparameterisatieservice²⁸ (zie Table of Materials). Inspecteer alle penalty-scores en markeer elke parameter met een penalty >50.
2. Converteer ligand stream-bestanden naar .itp- en .prm-bestanden die compatibel zijn met de molecular dynamics-engine met behulp van het force-field topologie-conversiescript. Combineer de topologiebestanden van het ligand en het eiwit voor elk complex.
3. Pas hydrogen mass repartitioning toe met een library voor moleculaire topologie- en parameterconversie. Genereer waterige topologieën met het eiwit-force-field dat is gebruikt voor de molecular dynamics-simulaties²⁹ en een expliciet three-site watermodel³⁰.
4. Solvatiseer de waterige complexen in een dodecahedrale box met een minimale afstand van 1.2 nm tussen het opgeloste bestand en de rand. Neutraliseer de systemen en voeg NaCl toe tot 0.15 M.
5. Bouw het tryptamine-HTR2A membraansysteem met een webgebaseerde tool voor de constructie van membraansystemen^31,32,33 (zie Table of Materials). Gebruik receptorcoördinaten die zijn uitgelijnd met een database voor membraan-eiwit oriëntatie³⁴ (zie Table of Materials), een zuivere POPC-bilayer, waterlagen van 22.5 Å en 0.15 M NaCl.
6. Minimaliseer de energie van alle systemen via steepest descent voor maximaal 50.000 stappen. Bevestig convergentie bij Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1 vóór de equilibratie.
7. Equilibreer de waterige systemen met fasen van een ensemble met een constant aantal deeltjes, volume en temperatuur (NVT) en een ensemble met een constant aantal deeltjes, druk en temperatuur (NPT). Equilibreer het membraansysteem met de webgebaseerde, zesstaps multistage workflow voor de preparatie en equilibratie van moleculaire systemen met geleidelijk vrijgegeven restraints.
8. Voer voor alle vijf de complexen een productie-MD van 200 ns uit. Gebruik een tijdstap van 4 fs met Hydrogen mass repartitioning HMR, een V-rescale thermostaat bij 310 K, een Parrinello-Rahman barostaat bij 1 bar, Particle mesh Ewald (PME) elektrostatica³⁵ en LINCS constraints³⁶.
9. Analyseer de uiteindelijke trajecten met utilities voor de analyse van molecular dynamics-trajecten. Bereken de backbone RMSD, Cα Root-mean-square fluctuation (RMSF), gyratie-straal, Solvent-accessible surface area (SASA) en eiwit-ligand waterstofbruggen, waarbij de laatste 150 ns als primair analysevenster dienen.

9. Schatting van de vrije bindingsenergie via MM-PBSA

1. Extraheer trajectory-snapshots voor MM-PBSA-analyse. Gebruik 2.001 frames voor elk complex in waterige oplossing en 201 verwerkte frames voor het in het membraan ingebedde HTR2A-subsysteem.
2. Voer de tool voor de berekening van de bindingsenergie via moleculaire mechanica/continuüm-oplosmiddel³⁷ uit met Poisson-Boltzmann-solvatatie, interne diëlektrische constante = 1, externe diëlektrische constante = 80, SASA-gebaseerde apolaire solvatatie en zonder entropiecorrectie. Rapporteer de gemiddelde vrije bindingsenergie en de standaardafwijking.
3. Voer per residu een decompositie uit voor alle vijf de complexen. Rapporteer stabiliserende en destabiliserende residuen met absolute bijdragen ≥0,5 kcalmol⁻¹.

    

Resultaten

Kandidaat-doelwitstoffen geassocieerd met metabolieten

De negen metabolieten produceerden heterogene voorspelde doelsetten via een programma voor de voorspelling van chemische-eiwitinteractie-doelwitten en een moleculaire docking-procedure. Propionaat, tryptamine, galzuren en urolithine A leverden verschillende doelwitten op met een bekende relevantie voor gastro-intestinale signalering. Het voorspelde doelwitlandschap omvatte canonieke membraanreceptoren, nucleaire receptoren, intracellulaire enzymen, signaleringsproteïnen en peptidehormoon-gerelateerde proteïnen. Downstream-resultaten worden daarom beschreven als metaboliet-geassocieerde genen (MAG's) in plaats van enkel receptor-bevindingen (Tabel 1).

Benchmarken tegenover gerapporteerde metaboliet-eiwitinteracties

Om de output van de doelwitvoorspelling te benchmarken tegen bestaande experimentele kennis, werden de voorspelde relaties tussen metabolieten en doelwitten geclassificeerd in drie bewijsniveaus: (i) experimenteel ondersteunde directe of nauwe interacties op klasse-niveau tussen metabolieten en eiwitten, waarbij is gerapporteerd dat de metaboliet of een nauw verwante endogene metaboliet het gecodeerde eiwit bindt, activeert, remt of functioneel reguleert; (ii) interacties ondersteund door pathways of doelwitklassen, waarbij het voorspelde doelwit behoort tot een gevestigde metaboliet-responsieve pathway of receptorfamilie, maar direct bewijs voor het exacte metaboliet-eiwitpaar beperkt is; en (iii) uitsluitend computationele associaties waarvoor in de geraadpleegde literatuur geen direct experimentele interactie is geïdentificeerd. Deze benchmarking werd gebruikt om de voorspelde MAGs te contextualiseren, niet om ze te valideren.

Verschillende voorspellingen recapituleerden eerder gerapporteerde biologische bevindingen. Propionaat-FFAR2 werd als experimenteel ondersteund beschouwd omdat FFAR2/GPR43 een canonieke receptor voor kortketenige vetzuren is. Butyraat-HDAC3 werd geclassificeerd als experimenteel of klasse-ondersteund omdat butyraat een erkende histondeacetylaseremmer is en de voorspelde overlap een lid van de HDAC-familie betrof. Voorspellingen geassocieerd met galzuren waarbij NR1H4/FXR en VDR betrokken waren, werden beschouwd als ondersteund door gevestigde biologie van galzuur-kernreceptoren, in het bijzonder voor hydrofobe galzuren zoals LCA; voorspellingen voor FXR geassocieerd met ursodeoxycholzuur (UDCA) werden met voorzichtigheid geïnterpreteerd omdat UDCA over het algemeen een zwakkere of contextafhankelijke FXR-ligand is. Voorspellingen voor HTR1B, HTR2A, HTR2B en HTR6 geassocieerd met tryptamine werden geclassificeerd als ondersteund door de serotonergische route in plaats van als bevestigde directe receptorspecifieke interacties, omdat tryptamine een microbiële monoamine is afgeleid van tryptofaan en serotoninereceptoren gevestigde regulatoren zijn van gastro-intestinale motiliteit en secretie. Urolithine A-CASP3 werd beschouwd als route-ondersteund op basis van gepubliceerde verbanden tussen urolithine A en apoptotische/caspase-gerelateerde responsen, maar niet op basis van direct bewijs voor CASP3-binding. Indool-3-melkzuur-KYAT1 en indool-3-propionzuur-KYAT1 werden behouden als uitsluitend computationele hypothesen, omdat de bredere literatuur gast-signalering door microbiële indoolderivaten ondersteunt, maar geen directe KYAT1-binding door deze exacte metabolieten^7,8,38,39,40.

Overeenkomstig hiermee maakt Tabel 1 onderscheid tussen computationele doelwitnominatie en het niveau van voorafgaande experimentele ondersteuning of ondersteuning via signaalpaden. Voor elk doelwit worden tevens de voorspellingsbron (een voorspelling van chemische-eiwitinteractie, een moleculair dockingprogramma, of beide), de gecombineerde interactiescore voor de voorspelling van de chemische-eiwitinteractie en de waarschijnlijkheid van het moleculair dockingprogramma vermeld wanneer het doelwit door een moleculair dockingprogramma is geïdentificeerd. Voorspelde doelwitten zonder direct voorafgaand experimenteel bewijs worden beschreven als kandidaat-metaboliet-geassocieerde genen die onafhankelijke validatie op eiwitniveau en ligandrespons vereisen.

Overlap tussen voorspelde targets en differentieel tot expressie gebrachte genen bij IBS-C

De doorsnede van de gecombineerde voorspelde targetlijsten en de resultaten van de differentiële expressie op genniveau identificeerde 17 unieke voorspelde metaboliet-geassocieerde genen die significant differentieel tot expressie kwamen in de vergelijking tussen IBS-C en gezonde vrijwilligers. Alle 17 genen waren downgereguleerd. De set omvatte membraan- en kernreceptoren (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) en niet-receptorproteïnen (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) (Tabel 1, Figuur 2A,B).

Alle 17 MAG's voldeden aan een drempelwaarde voor de false discovery rate (FDR) van minder dan 0,05; 16 van de 17 voldeden aan de strengere FDR < 0,001, waarbij het resterende gen (HTR1B) significant was bij een FDR < 0,05. Zeven van de 17 targets (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R) voldeden aan zowel FDR < 0,001 als een absolute log₂ fold change van meer dan 1,0 (logFC-bereik −1,34 tot −1,10), wat wijst op een sterke en consistente downregulatie voor deze subset. De resterende targets vertoonden een matige maar statistisch significante downregulatie (|logFC| variërend van 0,45 tot 0,97). Dit uniforme beschrijvende patroon werd met voorzichtigheid geïnterpreteerd, rekening houdend met de genoombrede expressiekenmerken van de dataset (zie de statistische beoordeling hieronder).

Statistische beoordeling van de overlap van target-DEG's

Om de statistische significantie van de overlap van 17 genen formeel te beoordelen, werd een eenzijdige Fisher's exact test toegepast, waarbij de 17 voorspelde doelgenen als queryset werden gebruikt en alle 18.296 unieke gene-collapsed vermeldingen gedetecteerd in GSE36701 als genomische achtergrond dienden. Van deze achtergrond waren 17.296 genen (94,5%) differentieel tot expressie gebracht bij FDR < 0,05, wat wijst op een bijna universele transcriptionele onderdrukking in de vergelijking van het rectale mucosa bij IBS-C. Alle 17 voorspelde doelgenen behoorden tot de differentieel tot expressie gebrachte genen (waargenomen overlap 17/17, 100%). Gezien de achtergrondrate van differentiële expressie van 94,5%, is de verwachte overlap voor elke willekeurig geselecteerde set van 17 genen 16,1 genen. Fisher's exact test leverde p = 0,384 op met een continuïteitscorriged odds ratio van 2,03 (95% betrouwbaarheidsinterval 0,12–33,73), wat niet statistisch significant was bij α = 0,05 (Figuur 3A–C).

Dit resultaat geeft aan dat de waargenomen overlap van 17/17 niet groter is dan de overlap die op basis van toeval zou worden verwacht bij het genoombrede expressieprofiel van deze dataset. Bijgevolg worden deze bevindingen geïnterpreteerd als een beschrijvend directioneel patroon, waarbij alle 17 voorspelde targets consistent en significant gedownreguleerd waren in rectale mucosale weefsels bij IBS-C, en niet als bewijs voor statistische verrijking of onafhankelijke validatie ten opzichte van een genomische achtergrond. Formele verrijkingstests zouden replicatie vereisen in transcriptomische datasets met selectievere differentieel-expressieprofielen, waarin aanzienlijk minder dan de helft van alle genen significant is. Er moet worden benadrukt dat de uniforme downregulatie van alle 17 overlappende genen een beschrijvende observatie is en geen afzonderlijk gevalideerd statistisch resultaat, aangezien de differentieel tot expressie gekomen achtergrond van deze dataset zelf overwegend gedownreguleerd is; een gedeelde neerwaartse richting onder de overlappende genen is derhalve te verwachten en is niet onderworpen aan een formele directionaliteitstest. Deze uniforme richting mag daarom niet worden geïnterpreteerd als onafhankelijk statistisch bewijs voor gecoördineerde, metaboliet-specifieke regulatie.

Metaboliet-specifieke patronen

Propionaat had het grootste aantal overlappende genen, waaronder CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN en TBXA2R, wat wijst op een mogelijke betrokkenheid van signalering die reageert op kortketenige vetzuren en Gq-geassocieerde signalering. Butyraat overlapte met HDAC3, wat consistent is met de butyraat-geassocieerde histondeacetylase-biologie, hoewel mRNA-downregulatie alleen geen gewijzigde butyraatrespons vaststelt. Galzuur-geassocieerde overlap omvatte de kernreceptoren VDR en NR1H4, beide erkende effectoren van galzuursignalering in de darm^38,39. Tryptamine overlapte met HTR1B, HTR2A, HTR2B en HTR6, waardoor serotonerge signalering als een kandidaatmodule wordt aangewezen, een systeem met goed gedefinieerde rollen in gastro-intestinale motiliteit en secretie⁴⁰. Indool-3-melkzuur en indool-3-propionzuur overlapten met KYAT1, en urolithine A overlapte met CASP3.

Pathway-verrijking

Functionele verrijkingsanalyse van de 17 overlappende genen identificeerde paden gerelateerd aan downstream-signalering van G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR), Gαq-signalering, GPCR-ligandbinding, serotonerge synapsen, neuroactieve ligand-receptorinteractie, calcium-signaaltransductie, cAMP-signalering en peptidehormoonsecretie. Deze resultaten zijn consistent met de samenstelling van de genset en ondersteunen de biologische coherentie ervan, maar zij weerspiegelen de functionele annotatie van de ingediende genen in plaats van onafhankelijk bewijs van activiteit op pad-niveau.

Structuur van het eiwit-eiwitinteractienetwerk

De constructie van het eiwit-eiwitinteractienetwerk en de analyse van padverrijking werden geïnterpreteerd over drie complementaire netwerken. In het gecombineerde meta-netwerk van 17 genen (Netwerk 1) was de meest evidente door annotaties ondersteunde structuur een GNAQ-gecentreerde GPCR/Gαq-signaleringcomponent die GNAQ koppelde aan receptor-geassocieerde genen, waaronder TBXA2R, CASR, HTR2A en HTR2B. Beperkte connectiviteit van serotonine-receptoren bleef ook behouden, het meest prominent tussen HTR2A en HTR2B, terwijl verschillende andere genen geïsoleerd of zwak verbonden bleven bij de geselecteerde betrouwheidsdrempel. Het propionaat-specifieke netwerk (Netwerk 2) vertoonde een beperktere topologie, waarbij GNAQ annotatie-ondersteunde verbindingen met CASR en TBXA2R behield, terwijl FFAR2, GPR68, GCG, GPHN en MLN geïsoleerd of zwak verbonden waren. Het tryptamine/serotonine-netwerk (Netwerk 3) omvatte HTR1B, HTR2A, HTR2B en HTR6; binnen deze subset vertoonden HTR2A en HTR2B de belangrijkste door annotaties ondersteunde verbinding, terwijl HTR1B en HTR6 bij de gekozen drempelwaarde niet direct verbonden waren (Afbeelding 4A–C).

Moleculaire docking

Moleculaire docking werd uitgevoerd op vijf geselecteerde metaboliet-eiwitcomplexen. De paren van galzuren en kernreceptoren vertoonden gunstigere Vina-scores dan urolithine A-CASP3 en tryptamine-HTR2A. LCA-VDR had de beste score met −10,0 kcal/mol, gevolgd door LCA-NR1H4/FXR (−9,9 kcal/mol) en UDCA-NR1H4/FXR (−9,4 kcal/mol). Urolithine A-CASP3 en tryptamine-HTR2A hadden lagere, maar nog steeds redelijke scores van −7,1 kcal/mol (Tabel 2).

Voor het LCA-VDR-complex (PDB ID: 1DB1) werd de voorspelde pose ondersteund door een conventionele waterstofbinding tussen het LCA-carboxylaat-zuurstofatoom en Ser278 (4,29 Å), samen met uitgebreide hydrofobe contacten met Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233 en His397, en aanvullende van der Waals-contacten met Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275 en Phe150. De best geklasseerde pose had een Vina-score van −10,0 kcal/mol, een caviteitsgrootte van 2055 ų en een gridcentrum van (10, 19, 33) (Tabel 3, Figuur 5A,B).

Voor het LCA-NR1H4/FXR-complex (PDB ID: 3DCT) ging de docking score van −9.9 kcal/mol gepaard met voorspelde waterstofbruggen met His294 en Ile335, een π-Sigma-interactie met His294 en hydrofobe Alkyl- of π-Alkyl-contacten met Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352 en His447, waarbij verdere van der Waals-contacten de accommodatie van het steroïde geraamte in de FXR-pocket ondersteunden (Tabel 4, Figuur 6A,B).

De voorspelde pose van het UDCA-NR1H4/FXR-complex (PDB ID: 3DCT) vertoonde een conventionele waterstofbinding met His447 (3,66 Å), een andere waterstofbinding met Gly322 (3,46 Å), een π-anion-interactie met Val325 (4,96 Å) en een koolstof-waterstofbinding met Trp469 (4,51 Å). De interactiekaart identificeerde daarnaast ongunstige donor-donorcontacten met Arg395 (3,89 Å) en Gln396 (3,40 Å), wat suggereert dat de lagere Vina-score van UDCA vergeleken met LCA in dezelfde receptorpocket mogelijk te wijten is aan een minder gunstige lokale geometrie of elektrostatica (Tabel 5, Figuur 7A,B).

In het urolithin A-CASP3 complex (PDB ID: 2DKO) vertoonde de voorspelde bindingsmodus conventionele waterstofbruggen met Gln161 (3,78 en 4,19 Å), Ser120 (3,95 Å) en Arg207 (3,05 en 3,77 Å), en werd deze verder gestabiliseerd door π-Kation interacties met Arg207, een π-Donor waterstofbrug met Cys163 en additionele π-Alkyl en van der Waals contacten met Arg64, Ala162, His121, Ser205 en Trp206 (Tabel 6, Figuur 8A,B).

Voor het tryptamine-HTR2A-complex (PDB ID: 6A93) werd de voorspelde pose gestabiliseerd door een elektrostatische zoutbrug tussen de geprotoneerde amine van tryptamine en Asp155, het geconserveerde aspartaat in transmembrane helix 3 (D3.32 in de Ballesteros-Weinstein-nummering) dat de geprotoneerde amine van aminerge liganden verankert in serotonine- en verwante receptoren^41,42,43, samen met waterstofbrugvorming met Thr160 en Ser159, aromatische contacten met Phe340 en Trp336, en π-alkylinteracties met Val156 en Ile163. Aanvullende van der Waals-contacten met Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332 en Leu123 ondersteunden een orthosterisch pocket-bindingspatroon (Tabel 7, Figuur 9A,B).

Validatie van het docking-protocol

Om de betrouwbaarheid van het docking-protocol te evalueren, werden twee complementaire controle-experimenten uitgevoerd. Voor redocking-controles (positief) werden co-gekristalliseerde liganden uit hun referentie-röntgenstructuren geëxtraheerd en opnieuw gedockt in hun natuurlijke bindingsplaatsen. De best gerankte voorspelde pose voor de vitamine D-analoga VDX in VDR/1DB1 week 0,87 Å af van de kristallografische positie, en het co-kristal-ligand WAY-362450 in FXR/3DCT week 1,79 Å af; beide waarden lagen onder de conventionele acceptatiedrempel van 2,0 Å, wat de geometrische validiteit van het docking-protocol voor deze receptorsystemen ondersteunt (Figuur 10A,B). Voor cross-docking-controles (negatief) werd lithocholzuur gedockt in caspase-3 (2DKO), een cysteïne-protease waarvoor het geen bekend ligand is, wat resulteerde in een voorspelde score (−8,3 kcal/mol) die 1,7 kcal/mol zwakker was dan bij het cognate target VDR (−10,0 kcal/mol), wat consistent is met de voorspelde selectiviteit van de bindingsplaats. Tryptamine gedockt in VDR leverde een voorspelde score op van −6,4 kcal/mol vergeleken met −7,1 kcal/mol bij het cognate HTR2A-target, een verschil van 0,7 kcal/mol dat binnen de gerapporteerde onzekerheid valt van de scores bij moleculaire docking van metaboliet-liganden op target-eiwitten en daarom slechts een bescheiden voorspelde selectiviteit indiceert voor dit kleinere ligand (Figuur 10C). Samen geven deze controles aan dat het docking-protocol bekende bindingsgeometrieën reproduceert en onderscheid maakt tussen cognate en non-cognate paren onder de geteste condities, terwijl het computationele voorspellingen blijven die geen vervanging vormen voor experimentele affiniteitsmetingen (Tabel 8).

Moleculaire dynamicasimulatie

Moleculaire dynamicasimulaties werden uitgevoerd voor de vijf geprioriteerde complexen over productietrajecten van 200 ns. De vier oplosbare en nucleaire receptorcomplexen werden gesimuleerd in een expliciete waterige oplosmiddel, terwijl het tryptamine-HTR2A-complex werd gesimuleerd in een expliciete POPC-lipide dubbellaag om een fysiologisch passende membraanomgeving te bieden voor deze G-eiwitgekoppelde receptor. Analyses testten de dynamische stabiliteit van de gedockte posities onder tijdsafhankelijke omstandigheden en maakten een vergelijking mogelijk van het relatieve structurele gedrag tussen de complexen (Tabel 9).

Het RMSD-profiel van het LCA-VDR/1DB1-complex vertoonde een korte equilibratieperiode tijdens de eerste 10 ns, gevolgd door een stabiel plateau, met fluctuaties voornamelijk in het bereik van 0,20–0,28 nm (Figuur 11A). De RMSF-waarden waren laag, en de fluctuaties van de backbone waren < 0,15 nm voor de meeste residuen (Figuur 11B). Waterstofbrug-analyse toonde een persistent netwerk van 2–5 waterstofbruggen, met incidentele stijgingen tot 7 (Figuur 11C). De gyratie-straal (Rg) bleef binnen het bereik van 1,25–1,75 nm, en het oplosmiddel-toegankelijke oppervlak (SASA) bleef rond de 130 nm² (Figuur 11D,E).

Het urolithine A-CASP3/2DKO-complex vertoonde een grotere dynamische activiteit. De RMSD nam aanvankelijk toe en oscilleerde vervolgens tussen 0,4 en 0,7 nm, met een kortstondig event van hoge afwijking rond 165 ns (Figuur 12A). RMSF-analyse toonde een hoge mobiliteit op residuniveau, met de grootste fluctuaties in het flexibele loop-gebied rond residu 175 (Figuur 12B). Waterstofbrug-analyse onthulde een initieel uitgebreid netwerk van ongeveer 2–5 bindingen gedurende de eerste 30–40 ns, gevolgd door grotendeels 0 tot 2 intermitterende bindingen (Figuur 12C). De overeenkomstige profielen van de gyratie-straal en SASA worden weergegeven in Figuur 12D,E.

Voor de NR1H4/FXR (3DCT) galzuursystemen bleef het RMSD-profiel van de backbone gedurende het grootste deel van de trajectorie binnen een relatief nauw bereik (Figuur 13A), terwijl het RMSF-profiel een lagere mobiliteit in de kernregio's en hogere fluctuaties in flexibele regio's vertoonde (Figuur 13B). Het LCA-3DCT-complex behield gedurende de gehele trajectorie ongeveer drie tot vier persistente waterstofbruggen, terwijl het UDCA-3DCT-complex een grotere fluctuatie van waterstofbruggen vertoonde en een afname in waterstofbrugvorming na ongeveer 125 ns. De gyratie-radiusprofielen voor de systemen gebonden aan LCA en UDCA worden respectievelijk getoond in Figuur 13C,D, en de corresponderende SASA-profielen worden getoond in Figuur 13E,F.

Membraanmoleculaire dynamica van het tryptamine-HTR2A-complex

Het tryptamine-HTR2A/6A93-complex werd gedurende 200 ns gesimuleerd in een expliciete POPC-lipide dubbellaag bestaande uit 258 lipidemoleculen, een expliciet driepunts watermodel en 0,15 M NaCl, voor een totale systeemgrootte van ongeveer 100.925 atomen^33,44,45. De receptor bleef gedurende het gehele traject stabiel ingebed in de dubbellaag (Figuur 14). De RMSD van de backbone steeg van ongeveer 0,10 nm naar een stabiel plateau nabij 0,15–0,20 nm binnen de eerste 100 ns en bleef daarna stabiel, waarbij alle waarden onder de 0,25 nm lagen, wat aangeeft dat de receptor een stabiele conformatie behield in de membraanomgeving zonder globale ontvouwing (Figuur 15A). De RMSF per residu vertoonde lage fluctuaties in de transmembrane helicale kern met de verwachte hogere mobiliteit in de loop- en terminale regio's, wat consistent is met de typische flexibiliteit van GPCR's (Figuur 15B). De gyratie-straal was strikt beperkt tussen ongeveer 2,06 en 2,12 nm, en de SASA fluctueerde binnen een smalle band zonder progressieve drift, wat beide de behoud van het compacte transmembrane bundel bevestigt (Figuur 15C,D).

Waterstofbrugvorming tussen het eiwit en het ligand bleef gedurende de gehele trajectorie behouden (Figuur 15E), met aanzienlijke fluctuaties in het aantal waterstofbruggen, variërend van 1 tot 3. Om specifiek de persistentie van de belangrijkste ionische interactie te evalueren, werd de minimale afstand tussen de geprotoneerde ammoniumstikstof van tryptamine en de carboxylaatzuurstofatomen van Asp155 (D3.32) gedurende de gehele trajectorie gemonitord. Deze afstand bleef nauw verdeeld rond een gemiddelde van 0,270 nm (minimum 0,247 nm, maximum 0,424 nm), en het zoutbrugcontact (< 0,4 nm) bleef gedurende 99,9% van de simulatie behouden, met slechts twee korte kortstondige afwijkingen en geen aanhoudende dissociatiegebeurtenis (Figuur 16). Deze resultaten suggereren dat de geconserveerde ionische interactie van Asp155 voldoende was om de tryptamine binnen de orthosterische pocket van HTR2A te stabiliseren gedurende de membranesimulatie.

MM-PBSA bindingsvrije energie en per-residu decompositie

MM-PBSA-analyse werd uitgevoerd om een extra energetische prioritiseringslaag toe te voegen aan de vijf complexen (Tabel 10). Voor de vier waterige complexen identificeerde decompositie per residu de belangrijkste energetische bijdragers voor elke voorspelde bindingsmodus. In het LCA-VDR/1DB1-complex hadden het ligand en Gln317 een gunstige bijdrage, terwijl Trp286 een ongunstige bijdrage had. In het urolithine A-CASP3/2DKO-complex vertoonden Arg64 en Arg207 sterk negatieve bijdragen per residu, wat wijst op aanzienlijke polaire of elektrostatische stabilisatie; desondanks bleef de overeenkomstige trajectorie zeer dynamisch, wat aantoont dat gunstige energetica op residuniveau alleen geen aanhoudende stabiliteit van het complex garanderen. Voor de 3DCT-systemen werd de LCA-binding primair gedreven door Arg331, terwijl de UDCA-binding een meer verspreid energetisch netwerk omvatte bestaande uit Glu326, Asp394, Arg395, Arg441 en Asp470. Over de vier waterige systemen terzijde ondersteunde de MM-PBSA-decompositie de relatieve prioritisering van de LCA-gebaseerde complexen.

Voor het membraan-ingebedde tryptamine-HTR2A/6A93-complex werd een MM-PBSA-analyse uitgevoerd op het eiwit-ligand-subsysteem dat uit de bilayer-trajectorie was geëxtraheerd^46,47. Gunstige bijdragen werden waargenomen voor het ligand en Asp155 (D3.32), dat veruit de dominante stabiliserende bijdrager op residuniveau was, wat consistent is met de zoutbruginteractie die werd geïdentificeerd in zowel de docking- als de trajectorie-afstandanalyses. Trp137 vertoonde de grootste ongunstige bijdrage per residu onder de omliggende residuen van de orthosterische pocket (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171), die samen het aromatische en polaire contactnetwerk vormen dat de bindingspocket bekleedt. Deze waarden vertegenwoordigen relatieve computationele schattingen voor structurele prioritering en zijn geen experimentele bindingsaffiniteiten.

Figuur 1: Computationele workflow voor prioritering van gastheergenen geassocieerd met metabolieten bij IBS-C. Schematische weergave van de achtstaps workflow waarin metabolietselectie, doelwitvoorspelling, transcriptomische differentiële expressie, overlapanalyse, netwerk- en pathway-verrijking, moleculaire docking, moleculaire dynamicasimulatie en MM-PBSA bindingsvrije-energieanalyse zijn geïntegreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Analyse van differentiële expressie en overlap tussen metabolieten en targets in IBS-C mucosa. (A) Volcano plot van differentiële expressie op genniveau in GSE36701. Blauwe punten, significant gedownreguleerde genen; rode punten, significant geupreguleerde genen; grijze punten, niet-significante genen. Geselecteerde overlappende metaboliet-geassocieerde genen zijn gelabeld. (B) Venn-diagram dat de overlap toont tussen 330 unieke voorspelde metaboliet-targets en gedownreguleerde genen in GSE36701; 17 genen waren gemeenschappelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Statistische beoordeling van de 17 voorspelde metabolietdoelgenen tegenover GSE36701. (A) Log2-vouwverandering per gen voor alle 17 genen, gekleurd op basis van significantieniveau. (B) Differentieel expressiesnelheid van achtergrondgenen versus voorspelde doelwitten, met de exacte test van Fisher. (C) Een twee-bij-twee contingentietabel wordt gebruikt voor de exacte test van Fisher. Alle 17 doelwitten waren significant gedownreguleerd; de overlap wordt geïnterpreteerd als een beschrijvend directioneel patroon in plaats van statistische verrijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Constructie van een samengesteld eiwit-eiwitinteractienetwerk en pathway-verrijking van eiwit-eiwitinteractienetwerken van overlappende metaboliet-geassocieerde genen. (A) Netwerk 1: gecombineerd metanetwerk van alle 17 genen. (B) Netwerk 2: propionaat-specifiek netwerk van acht genen (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R). (C) Netwerk 3: tryptamine/serotoninenetwerk van vier genen (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6). Netwerken werden gegenereerd voor Homo sapiens met een minimum, gebruikmakend van constructie van eiwit-eiwitinteractienetwerken en pathway-verrijking met een betrouwbaarheid ≥ 0,700. Randen representeren annotatie-ondersteunde functionele associatie Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Driedimensionale en tweedimensionale structurele weergave van lithocholzuur in complex met VDR (PDB ID: 1DB1). (A) Driedimensionale weergave van het oppervlak en cartoon-model waarbij lithocholzuur als sferen is weergegeven. (B) Tweedimensionale interactiekaart die de Ser278 waterstofbrug en de omringende hydrofobe en van der Waals-contacten toont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Driedimensionale en tweedimensionale structurele weergave van lithocholzuur in complex met NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (A) Driedimensionale oppervlakte- en cartoonweergave. (B) Tweedimensionale interactiekaart die waterstofbrugvorming met His294 en Ile335, een π-Sigma-interactie en omliggende contacten toont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Driedimensionale en tweedimensionale structurele weergave van ursodeoxycholzuur in complex met NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). (A) Driedimensionale oppervlakte- en cartoonweergave. (B) Tweedimensionale interactiekaart die waterstofbruggen met His447 en Gly322, een π-anioninteractie met Val325, een koolstof-waterstofbinding met Trp469 en ongunstige donor-donorcontacten met Arg395 en Gln396 laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Driedimensionale en tweedimensionale structurele weergave van urolithine A in complex met CASP3 (PDB ID: 2DKO). (A) Driedimensionale oppervlakte- en cartoonweergave. (B) Tweedimensionale interactiekaart die waterstofbruggen met Gln161, Ser120 en Arg207, π-kation-interacties met Arg207, een π-donor waterstofbrug met Cys163 en omringende contacten laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Driedimensionale en tweedimensionale structurele weergave van tryptamine in complex met HTR2A (PDB ID: 6A93). (A) Driedimensionale oppervlakte- en cartoonweergave gegenereerd in een driedimensionaal moleculair visualisatieprogramma. (B) Een tweedimensionale interactiekaart gegenereerd in een moleculaire visualisatie- en tweedimensionale interactiediagramtool, waarop de Asp155 zoutbrug en aanvullende interacties in de bindingsplaats worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Validatie van het dockingprotocol. (A,B) Redocking van co-gekristalliseerde liganden in VDR/1DB1 (RMSD 0,87 Å) en FXR/3DCT (RMSD 1,79 Å); de kristallografische en geredockte poses zijn over elkaar heen gelegd, beide onder de acceptatiedrempel van 2,0 Å. (C) Cross-docking selectiviteit: cognate versus non-cognate Vina-scores voor lithocholzuur en tryptamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11. Moleculaire dynamica-trajectanalyse van het LCA-VDR/1DB1-complex over 200 ns. (A) RMSD-profiel. (B) RMSF-profiel. (C) Aantal waterstofbruggen. (D) Radius-of-gyration-profiel. (E) SASA-profiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Moleculaire dynamica-trajectanalyse van het urolithine A-CASP3/2DKO-complex over 200 ns. (A) RMSD-profiel dat brede conformationele fluctuaties en een kortstondige gebeurtenis met een hoge afwijking rond 165 ns laat zien. (B) RMSF-profiel dat een uitgesproken flexibiliteit op residuniveau nabij residu 175 laat zien. (C) Aantal waterstofbindingen. (D) Gyratie-straalprofiel. (E) SASA-profiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: Analyse van de moleculaire dynamica-trajectorie van de NR1H4/FXR (3DCT) galzuursystemen gedurende 200 ns. (A) Backbone RMSD-profiel voor het 3DCT-complex. (B) Backbone RMSF-profiel. (C) Radius-of-gyration-profiel voor 3DCT-LCA. (D) Radius-of-gyration-profiel voor 3DCT-UDCA. (E) SASA-profiel voor 3DCT-LCA. (F) SASA-profiel voor 3DCT-UDCA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 14: Het tryptamine-HTR2A-complex ingebed in een expliciete POPC-lipidenbilayer. De receptor is weergegeven als een cartoon die de bilayer overspant, POPC-lipiden als lijnen met gemarkeerde fosfaatkopgroepen, en tryptamine binnen de orthosterische pocket. Water is zichtbaar boven en onder het membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 15: Analyse van de moleculaire dynamica-trajectorie van het tryptamine-HTR2A/6A93-complex over 200 ns in een expliciete POPC-lipide dubbellaag. (A) Backbone RMSD-profiel. (B) RMSF-profiel per residu. (C) Radius-of-gyration-profiel. (D) SASA-profiel. (E) Aantal waterstofbindingen tussen eiwit en ligand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 16: Persistentie van de ionische interactie tussen tryptamine en Asp155 (D3.32) gedurende de membraantrajectorie van 200 ns. De minimale afstand tussen de ammoniumstikstof van tryptamine en de carboxylaatzuurstofatomen van Asp155 is uitgezet tegen de tijd; de stippellijn markeert de drempelwaarde van 0,4 nm voor contact via een zoutbrug. Het contact werd gedurende 99,9% van de simulatie behouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genensymbool	Metaboliet(en) van herkomst	Functionele categorie	log2FC	FDR (adj. P-waarde)	Significantieniveau
GCG	Propionaat	Peptidhormoon-gerelateerd eiwit	−1.342	1.97e−7	FDR <0.001 & |logFC > 1
HDAC3	Butyraat	Enzym	−1.234	2.44e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
CASP3	Urolithine A	Enzym	−1.198	6.66e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPR68	Propionaat	Membraanreceptor	−1.137	4.35e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GNAQ	Propionaat	Intracellulair signaleringseiwit	−1.122	1.05e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
GPHN	Propionaat	Overig intracellulair eiwit	−1.109	1.13e−6	FDR <0.001 & |logFC| > 1
TBXA2R	Propionaat	Membraanreceptor	−1.104	4.04e−7	FDR <0.001 & |logFC| > 1
HTR6	Tryptamine	Membraanreceptor	−0.967	2.17e−5	FDR <0.001
VDR	Lithocholzuur	Kernreceptor	−0.942	5.73e−7	FDR <0.001
HTR2A	Tryptamine	Membraanreceptor	−0.937	4.99e−6	FDR <0.001
FFAR2	Propionaat	Membraanreceptor	−0.889	1.44e−4	FDR <0.001
NR1H4	Lithocholzuur / Ursodeoxycholzuur	Kernreceptor	−0.861	3.68e−6	FDR <0.001
HTR2B	Tryptamine	Membraanreceptor	−0.702	1.29e−4	FDR <0.001
MLN	Propionaat	Peptidhormoon-gerelateerd eiwit	−0.605	7.39e−5	FDR <0.001
KYAT1	Indool-3-melkzuur / Indool-3-propionzuur	Enzym	−0.530	3.61e−4	FDR <0.001
CASR	Propionaat	Membraanreceptor	−0.483	4.05e−4	FDR <0.001
HTR1B	Tryptamine	Membraanreceptor	−0.455	3.18e−2	FDR <0.05

Tabel 1: Voorspelde metaboliet-geassocieerde targetgenen die overlappen met differentieel tot expressie gebrachte genen in de IBS-C rectale mucosa-dataset. Alle vermelde overlappende genen waren downgereguleerd. Tabel 1 is afzonderlijk ingediend als een spreadsheet-tabel en vermeldt voor elk target de metaboliet(en) van oorsprong, de functionele categorie, de bron van de target-voorspelling (een chemische-eiwitinteractie targetvoorspelling, een moleculaire docking-programma, of beide), een gecombineerde interactiescore voor de chemische-eiwitinteractie targetvoorspelling en, indien beschikbaar, de waarschijnlijkheid van het moleculaire docking-programma, het voorspellingsniveau (tier), de log2 fold change en de FDR met het niveau van expressie-significantie. Bron: Genexpressiewaarden zijn verkregen uit de gen-gecollapte GSE36701 differentieel-expressietabel (probe met laagste FDR per gen). De bron van de target-voorspelling en betrouwheidswaarden zijn samengesteld uit de output van een chemische-eiwitinteractie targetvoorspelling en een moleculair docking-programma, gebruikmakend van drempelwaarden van een gecombineerde interactiescore voor chemische-eiwitinteractie targetvoorspelling ≥ 0,700 en een waarschijnlijkheid van het moleculaire docking-programma ≥ 0,70. Scores voor chemische-eiwitinteractie targetvoorspellingen zijn gecombineerde scores op een schaal van 0–1; STP staat voor de waarschijnlijkheid van een moleculair docking-programma. Niveau 1 = strikte ondersteuning door chemische-eiwitinteractie targetvoorspelling; Niveau 1+ = strikte ondersteuning door chemische-eiwitinteractie targetvoorspelling, kruislings ondersteund door een moleculair docking-programma.

Complex	Eiwit (PDB ID)	Ligand	Vina-score (kcal/mol)	Holtegrootte (A^3)	Gridcentrum X,Y,Z (A)	Zoekvak (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	Lithocholzuur	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	Lithocholzuur	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	Ursodeoxycholzuur	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
Urolithin A-CASP3	CASP3 (2DKO)	Urolithine A	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
Tryptamine-HTR2A	HTR2A (6A93)	Tryptamine	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

Tabel 2: Resultaten van moleculaire docking: scores van de hoogst gerangschikte moleculaire docking van metabolietliganden aan doelproteïnen en caviteitsparameters voor de vijf geprioriteerde proteïne-ligandcomplexen. Caviteitsgrootte is weergegeven in ų. Bron: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx, blad 'Original_Docking_Scores'. Moleculaire docking van metabolietliganden aan doelproteïnen; exhaustiveness = 8, seed = 42 (vast), num_modes = 9 voor alle complexen; hoogst gerangschikte (mode 1) pose weergegeven.

Interactietype	Residue(s)	Afstand (A)	Opmerkingen
Conventionele waterstofbinding	Ser278	4.29	LCA-carboxylaatzuurstof
Hydrofoob / Pi-alkyl contact	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
Van der Waals-contact	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

Tabel 3: Bindingsmodi gegenereerd voor docking van lithocholzuur met VDR (PDB ID: 1DB1). Bron: moleculaire visualisatie en tweedimensionaal interactiediagram-hulpmiddel 2D ligand-residu-interactiediagrammen, zoals gerapporteerd in de Resultaten van het manuscript (Moleculaire docking). '-' geeft aan dat er geen individuele afstandswaarde is gerapporteerd voor dat contact.

Interactietype	Residu(s)	Afstand (A)	Notities
Waterstofbinding	His294	-
Waterstofbrug	Ile335	-
Pi-sigma-interactie	His294	-
Alkyl / Pi-Alkyl (hydrofoob)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
Van der Waals-contact	Additionele pocketresiduen (niet afzonderlijk gespecificeerd in de bron)	-	Ondersteunt de accommodatie van het steroïde geraamte

Tabel 4: Gegenereerde bindingsmodi voor docking van lithocholzuur met NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT).

Bron: moleculaire visualisatie en tweedimensionale interactiediagramtool 2D ligand-residu interactiediagrammen, zoals gerapporteerd in het manuscript Resultaten (Moleculaire docking). '-' geeft aan dat er voor dat contact geen individuele afstandswaarde is gerapporteerd.

Interactietype	Residu(s)	Afstand (A)	Opmerkingen
Conventionele waterstofbinding	His447	3.66
Waterstofbrug	Gly322	3.46
Pi-anion-interactie	Val325	4.96
Koolstof-waterstofbinding	Trp469	4.51
Ongunstig donor-donorcontact	Arg395	3.89
Ongunstig donor-donor contact	Gln396	3.40

Tabel 5: Gegenereerde bindingsmodi voor het docken van ursodeoxycholzuur met NR1H4/FXR (PDB ID: 3DCT). Bron: moleculaire visualisatie en tool voor tweedimensionale interactiediagrammen 2D ligand-residu-interactiediagrammen, zoals gerapporteerd in de Resultaten van het manuscript (Moleculaire docking). '-' geeft aan dat er voor dat contact geen individuele afstandswaarde is gerapporteerd.

Interactietype	Residu(s)	Afstand (A)	Opmerkingen
Conventionele waterstofbrug	Gln161	3.78
Conventionele waterstofbrug	Gln161	4.19	tweede contact
Conventionele waterstofbrug	Ser120	3.95
Conventionele waterstofbrug	Arg207	3.05
Conventionele waterstofbrug	Arg207	3.77	tweede contact
Pi-kation interactie	Arg207	-
Pi-donor waterstofbrug	Cys163	-
Pi-alkyl / van der Waals-contact	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

Tabel 6: Bindingsmodi gegenereerd voor docking van urolithine A met CASP3 (PDB ID: 2DKO). Bron: moleculaire visualisatie en tweedimensionale interactiediagramtool 2D liganden-residu interactiediagrammen, zoals vermeld in de Resultaten van het manuscript (Moleculaire docking). '-' geeft aan dat er voor dat contact geen individuele afstandswaarde is gerapporteerd.

Interactietype	Residu(s)	Afstand (A)	Opmerkingen
Elektrostatische zoutbrug	Asp155 (D3.32)	-	geprotoneerde amine van tryptamine
Waterstofbrug	Thr160	-
Waterstofbrug	Ser159	-
Aromatisch contact	Phe340, Trp336	-
Pi-alkyl interactie	Val156, Ile163	-
Van der Waals-contact	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

Tabel 7: Gegenereerde bindingsmodi voor tryptamine-docking met HTR2A (PDB ID: 6A93). Bron: moleculaire visualisatie en tweedimensionale interactiediagram-tool 2D ligand-residu-interactiediagrammen, zoals vermeld in de Resultaten van het manuscript (Moleculaire docking). '-' geeft aan dat er voor dat contact geen individuele afstandswaarde is gerapporteerd.

(A) Redocking-validatie (positieve controles)
PDB ID	Proteïne	Co-kristal ligand	Vina-score (kcal/mol)	RMSD (A)	Drempelwaarde (A)	Resultaat
1DB1	VDR	VDX (vitamine D-analogon)	−13.0	0.87	2.0	GESLAAGD
3DCT	FXR	WAY-362450 (064)	−11.9	1.79	2.0	GESLAAGD
(B) Cross-docking-validatie (negatieve controles)
Ligand	Cognaat target (PDB)	Cognate score (kcal/mol)	Niet-cognaat target (PDB)	Niet-cognate score (kcal/mol)	Delta (kcal/mol)	Selectiviteit
Lithocholzuur	VDR (1DB1)	−10.0	CASP3 (2DKO)	−8.3	1.7	Bevestigd
Tryptamine	HTR2A (6A93)	−7.1	VDR (1DB1)	−6.4	0.7	Bescheiden (binnen Vina-onzekerheid +/−0.5–1.0)

Tabel 8: Resultaten van de validatie van het docking-protocol: redocking RMSD-waarden (positieve controles) en cross-docking-scores (negatieve controles). Bron: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx en Docking_Validation/Logs/*.log (een moleculaire docking van metabolietliganden aan doelwitproteïnen, exhaustiveness = 8, seed = 42, 25 Å × 25 Å × 25 Å box). RMSD berekend via zware-atoom, atoomnaam-matching (zonder superpositie).

Complex	RMSD (nm), gemiddelde + / – SD (bereik)	Rg (nm), gemiddelde + / – SD (bereik)	SASA (nm^2), gemiddelde + / – SD (bereik)	H-bruggen, gemiddelde + / – SD (bereik)	RMSF (nm), gemiddelde (max)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (max 0.600 bij residu 120)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (max 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (max 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (max 2.532 bij residu 175)
Tryptamine-HTR2A/6A93 (membraan)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (max 0.319)

Tabel 9: Samenvatting van het gedrag van de 200 ns moleculaire dynamicasimulatie voor de vijf geprioriteerde eiwit-ligandcomplexen, inclusief het in het membraan ingebedde tryptamine-HTR2A-systeem.Bron: bestanden van utilities voor trajectanalyse van moleculaire dynamica (.xvg) — gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf — berekend over de laatste 150 ns (50–200 ns) van elke 200 ns productierun, conform protocolstap 8.8. RMSD/Rg gefit op de backbone; SASA-sonderadius 0,14 nm; H-binding donor-acceptor afkapwaarde 0,35 nm / 30 °. LCA-3DCT en UDCA-3DCT delen één eiwit-backbone traject (RMSD, RMSF) met ligand-specifieke Rg/SASA/H-bindingen.

Tryptamine-HTR2A/6A93 (membraan) — kwantitatieve per-residue decompositie
Residu	Totale ddG-bijdrage (kcal/mol), gemiddelde + / − SD	Richting
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	Stabiliserend (dominant)
Tryptamine (ligand)	−13.01 + / − 6.22	Stabiliserend
Tyr171	13.62 + / − 4.54	Destabiliserend
Val167	23.32 + / − 3.96	Destabiliserend
Val156	20.03 + / − 3.81	Destabiliserend
Thr160	4.86 + / − 3.64	Destabiliserend
Ser159	24.16 + / − 3.48	Destabiliserend
Ser86	24.48 + / − 3.65	Destabiliserend
Phe87	35.18 + / − 4.04	Destabiliserend
Phe133	32.80 + / −3.70	Destabiliserend
Phe140	30.63 + / − 3.84	Destabiliserend
Phe141	35.25 + / − 3.55	Destabiliserend
Ile163	27.64 + / − 3.71	Destabiliserend
Trp137	53.77 + / − 4.32	Destabiliserend (grootste ongunstige)
Overige vier complexen — residuen geïdentificeerd in per-residue decompositie (kwalitatief)
Complex	Residu	Richting
LCA-VDR/1DB1	Ligand (LCA)	Gunstig
LCA-VDR/1DB1	Gln317	Gunstig
LCA-VDR/1DB1	Trp286	Ongunstig
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	Gunstig (dominant)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	Gemengd/gedistribueerd netwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	Gemengd/gedistribueerd netwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	Gemengd/gedistribueerd netwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	Gemengd/gedistribueerd netwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	Gemengd/gedistribueerd netwerk
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	Sterk gunstig (polair/elektrostatisch)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	Sterk gunstig (polair/elektrostatisch)

Tabel 10: MM-PBSA-decompositie per residu KORTE SAMENVATTING: stabiliserende en destabiliserende residuen (absolute bijdrage ≥ 0,5 kcal mol⁻¹) voor elk van de vijf geprioriteerde eiwit-ligandcomplexen, inclusief het in het membraan ingebedde tryptamine-HTR2A-systeem. Bron: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (molecular mechanics/continuum-solvent binding-energy calculation tool Generalized Born (GB) per-residue decomposition, 'Complex: Total Energy Decomposition'). Residunummers zijn omgezet van de interne nummering van het via CHARMM-GUI gebouwde systeem (offset +68) naar de oorspronkelijke 6A93 PDB-nummering die elders in dit manuscript is gebruikt.

Bron: Previous_MD Simulation data/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg en manuscript Resultaten (MM-PBSA bindingsvrije-energie en per-residue decompositie). Deze vier complexen hebben geen numerieke per-residue .dat/.csv output in de projectdirectory (alleen gerenderde SVG-plots met vectorpad-tekst die niet machinaal extraheerbaar is); alleen de residue-identiteit en de gunstige/ongunstige richting, zoals vermeld in de tekst van het manuscript, worden gerapporteerd. Exacte kcal/mol bijdragen voor deze vier complexen zijn niet beschikbaar in de bronrepository.

Discussie

Deze verkennende computationele studie demonstreert een geïntegreerde, reproduceerbare workflow voor het prioriteren van gastheergeneen en eiwit-ligandcomplexen geassocieerd met microbiële metabolieten, hier toegepast op een publieke transcriptomische dataset van het rectale slijmvlies bij IBS-C. Met behulp van deze workflow overlapte een subset van voorspelde genen geassocieerd met microbiële metabolieten met consistent gedownreguleerde genen in de dataset, die clusterden binnen GPCR-, serotonerge, calcium-signalering, neuroactieve ligand-receptor en nucleaire receptor-geassocieerde pathways; systemen die in toenemende mate worden geïmpliceerd in de communicatie tussen microbiota en gastheer^48,49. Deze bevindingen moeten strikt worden geïnterpreteerd als hypothese-genererend: de analyse meet geen concentraties van microbiële metabolieten, abundantie van receptorproteïnen, ligandbinding, receptoractivatie, downstream signalering, motiliteit, secretie, pijnreacties of klinische uitkomsten. De sterkste ondersteunbare conclusie is dat de geïdentificeerde genen en pathways kandidaten zijn voor experimentele validatie in plaats van bevestigde ziektemechanismen.

De cruciale betekenis van dit protocol, in vergelijking met eerder werk waarbij individuele metaboliet-receptorparen geïsoleerd werden onderzocht, ligt in de integratie van targetvoorspelling, publieke transcriptomica, netwerkanalyse, docking met validatiecontroles, moleculaire dynamica en MM-PBSA in één enkele sequentiële prioriteringspipeline. Elke fase vernauwt en contextualiseert de set kandidaten die in de voorgaande fase is gegenereerd, en deze sequentiële filtering maakt de uiteindelijke kandidatenlijst experimenteel hanteerbaar. De GNAQ-gecentreerde GPCR-module en de module geassocieerd met de serotonine-receptor die hier zijn geïdentificeerd, zijn biologisch plausibel gezien de rol van Gq-signalering bij de activatie van fosfolipase C, de productie van inositol 1,4,5-trifosfaat, calciummobilisatie, secretie en enteroendocrine functie, evenals de gevestigde rollen van signalering door kortketenvetzuren en tryptofaan-derivaten bij mucosale homeostase en van serotonerge signalering bij gastro-intestinale motiliteit, secretie, viscerale sensitiviteit en communicatie tussen darm en hersenen^10,18,50,51.

Een belangrijk methodologisch kenmerk van deze studie is de behandeling van de membraan-ingebedde receptor HTR2A. Omdat een simulatie in de oplosbare fase de lipide-omgeving die het conformationele gedrag van een G-proteïnegekoppelde receptor bepaalt niet kan reproduceren, werd het tryptamine-HTR2A-complex gesimuleerd in een expliciete POPC-dubbellaag. In deze membraanomgeving bleef de receptor structureel stabiel gedurende de volledige trajectorie van 200 ns, en de zoutbrug tussen het tryptamine-ammonium en Asp155 (D3.32) bleef gedurende vrijwel de gehele simulatie behouden. Het feit dat drie onafhankelijke bewijslijnen — de docking-pose, de aanhoudende contactafstand gedurende de trajectorie en de dominante MM-PBSA-bijdrage per residu — convergeren naar dezelfde geconserveerde D3.32-interactie, biedt interne consistentie voor de voorspelde bindingswijze van tryptamine, die de canonieke bindingsgeometrie van aminerge liganden bij serotonine-receptoren recapituleert.

Er zijn bepaalde methodologische kwesties om rekening mee te houden bij het reproduceren van deze workflow. Fouten in de canonieke structuur of verbindingen die zijn gemarkeerd als Pan-assay interference compounds ((PAINS)) planten zich voort via target-predictie en docking, waardoor nauwkeurige selectie van metabolieten en chemoinformatische curatie vereist zijn. Minimaliseer door ruis gedreven target-sets door de betrouwbaarheidscriteria consistent toe te passen (target-predictie van chemische-eiwitinteracties: ≥0,700; moleculair docking-programma: ≥0,70; constructie van eiwit-eiwitinteractienetwerken en pathway-enrichment: ≥0,700). Voorspelde targets moeten worden gegroepeerd per functionele categorie om te voorkomen dat alle met metabolieten geassocieerde genen onterecht als receptoren worden gekarakteriseerd. Precieze preprocessing van PDB-structuren, energieminisatie van liganden en grid-plaatsing rondom bekende bindingsresiduen zijn essentiële aspecten van docking, en de hier geïntroduceerde redocking- en cross-docking-controles bieden een objectieve maat voor de correctheid van de docking-methodologie. De reproduceerbaarheidskader in moleculaire dynamica wordt bepaald door een combinatie van force-field-parametrisering, juiste solvatatie of membraanopbouw, gefaseerde equilibratie en adequate production sampling.

Typische aanpassingen en stappen voor probleemoplossing omvatten het versoepelen van drempelwaarden als de doelvoorspelling geen hits oplevert, het controleren van de directionele consistentie op probeniveau voor genen met meerdere probes, en het interpreteren van geïsoleerde nodes bij de constructie van proteïne-proteïne-interactienetwerken en pathway-enrichment als drempelwaarde-afhankelijk in plaats van biologisch irrelevant. Voor membraanreceptoren moet expliciete lipide-dubbellaagsimulatie worden gebruikt in plaats van simulatie in waterig milieu, zoals geïllustreerd door de hier beschreven HTR2A-methode. Wanneer een energie-decompositie per residu noodzakelijk is, moet de berekening worden uitgevoerd met een engine die decompositie ondersteunt, en de gerapporteerde residunummering moet worden afgestemd op de oorspronkelijke receptor-nummering om ambiguïteit te voorkomen. Wij stellen voor dat resultaten van pathway-enrichment bij voorkeur worden beschouwd als een organisatorische context voor de kandidatenlijst, in plaats van als validatie op pathway-niveau. Mechanisch gezien zal enrichment van GPCR-, serotonerge of calcium-signalerings termen optreden zodra de genenlijst meerdere serotonine-receptorgenen bevat, ongeacht de co-regulatie op proteïneniveau. RMSD-, Rg- en RMSF-waarden voor het membraangebonden HTR2A-systeem moeten worden geïnterpreteerd met inachtneming van de lipide-dubbellaag: een afname van Rg in de latere trajectory kan een door de dubbellaag gedreven conformationele adaptatie van het transmembraanbundel weerspiegelen in plaats van globale ontvouwing, en persistente ligand-proteïne waterstofbruggen moeten worden geïnterpreteerd in samenhang met de algemene RMSD-stabiliteit.

De beperkingen van deze studie zijn aanzienlijk en beperken de interpretatie. Het onderzoek was gebaseerd op één relatief kleine publieke dataset, en een zoekopdracht in de belangrijkste publieke transcriptomische repositories (web-gebaseerde tool voor differentiële genexpressie-analyse en ArrayExpress) identificeerde ten tijde van de analyse geen onafhankelijke transcriptoomdataset van het rectale slijmvlies bij IBS-C met een vergelijkbaar ontwerp en platform die als replicatiecohort kon dienen. Het ontbreken van onafhankelijke transcriptomische replicatie is een belangrijke beperking, en geen enkele uitspraak in dit manuscript mag worden geïnterpreteerd als externe validatie van de bevindingen uit de enkele dataset. De dataset vertoont een bijna universele differentiële expressie (ongeveer 94,5% van de genen is significant, waarvan de overgrote meerderheid is downgereguleerd), een eigenschap waardoor conventionele verrijkingsstatistieken niet informatief zijn en conclusies over de specificiteit van de downregulatie van target-genen ten opzichte van de genomische achtergrond worden belemmerd; de overlap wordt daarom gerapporteerd als een beschrijvend directioneel patroon in plaats van statistische verrijking. Bulk transcriptomics van het slijmvlies kan werkelijke genregulatie niet onderscheiden van veranderingen in de celcompositie. mRNA-expressie bepaalt de eiwitovervloed of functionele respons niet. Databases voor targetpredictie lijden aan annotatiebias, en de resultaten van docking, MD en MM-PBSA zijn afhankelijk van de keuze van het force field, ligandparametrisering, startpositie, simulatietijd en de adequaatheid van de sampling. Exacte minor/build-identificatoren voor sommige webserver- en packagecomponenten, inclusief de CHARMM-compatibele ligandparametriseringsdienst, CHARMM-GUI en de statistische computeromgeving

Package-builds en subversies van de tool voor moleculaire mechanica/continuüm-solvent bindingsenergieberekeningen konden niet volledig worden hersteld uit het gearchiveerde projectrecord en moeten worden gerapporteerd als beschikbaar in de aparte Tabel van Materialen. De MM-PBSA-waarden zijn relatieve schattingen, bevatten geen expliciete configurationele entropieterm en mogen niet worden geïnterpreteerd als experimentele affiniteiten. De studie bevat geen metabolomische gegevens en kan niet bepalen of de beschikbaarheid van liganden is gewijzigd bij IBS-C, of dat de waargenomen expressiewijzigingen oorzaken, gevolgen, compensatoire reacties of irrelevante correlaties zijn.

Toekomstige toepassingen van deze methode zouden onafhankelijke transcriptomische replicatie, Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) en validatie op proteïneniveau, celtype-lokalisatie via single-cell of spatiale transcriptomics, metabolomische profilering van de relevante metabolietklassen en functionele ligand-respons-assays in patiënt-afgeleide colonoiden, mucosale explantaten of vergelijkbare modellen moeten omvatten. Vergelijkingen met cohorten van diarree-predominante IBS, gemengde IBS, inflammatoire darmziekten en niet-IBS obstipatie^1,2 zouden helpen om de ziektespecificiteit vast te stellen. Voor het structurele onderdeel zouden het repliceren van MD-trajecten, het uitvoeren van sensitiviteitsanalyses met alternatieve startposities en het volledig documenteren van de depositie van de topologie, trajecten en MM-PBSA input- en outputbestanden de reproduceerbaarheid verder versterken. Experimentele ligand-respons-assays blijven noodzakelijk om te bepalen of de geprioriteerde complexen functioneel relevant zijn; de huidige resultaten ondersteunen geen klinische of therapeutische claims.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AutoDock Vina	Scripps Research / open source	v1.2.7; https://vina.scripps.edu/	Moleculaire docking van metabolietliganden aan doelwitproteïnen.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / University of Maryland	v4.6; https://cgenff.com/	Ligand force-field parametrisering voor moleculaire dynamica.
CHARMM36m force field	CHARMM developers / open source	CHARMM36m; https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	Proteïne force field gebruikt voor moleculaire dynamica simulaties.
CHARMM-GUI Membrane Builder	CHARMM-GUI / Lehigh University	Webserver; exacte release niet herleidbaar; https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	Constructie en equilibratie-opstelling van het expliciete POPC-membraansysteem.
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)	2021; https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	Tweidimensionale analyse van ligand-residu interacties.
GEO2R	NCBI Gene Expression Omnibus	Webtool; geraadpleegd jan-mei 2026; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	Differentieel-expressieanalyse van GSE36701.
GeneCards	Weizmann Institute of Science	Webdatabase; geraadpleegd jan-mei 2026; https://www.genecards.org/	Verificatie van gensymbool en geninformatie tijdens target-standaardisatie.
gmx_MMPBSA	Open source (Valdés-Tresanco et al.)	1.5.x; https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	MM-PBSA binding vrije-energie schatting en per-residu decompositie.
GROMACS	GROMACS development team / open source	2024.2; https://www.gromacs.org/	Simulatiemachine voor moleculaire dynamica.
GSE36701 transcriptoom-dataset	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE36701; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	Publieke IBS-C rectumslijmvlies expressie-dataset.
Open Babel	Open source	3.2.0; https://openbabel.org/	Conversie van chemische bestandsformaten, genereren van driedimensionale liganden en ligand-preparatie.
OPM database	University of Michigan	Webdatabase; geraadpleegd jan-mei 2026; https://opm.phar.umich.edu/	Oriëntatie van Proteïnen in Membranen coördinaten gebruikt om HTR2A uit te lijnen.
ParmEd	ParmEd developers / open source	4.x; https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	Herverdeling van waterstofmassa's en verwerking van molecuulsimulatie-topologie.
PyMOL	Schrödinger / open source	2.x; https://www.pymol.org/	Driedimensionale structurele visualisatie en receptor-ligand figuren.
RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	Webdatabase; geraadpleegd jan-mei 2026; https://www.rcsb.org/	Bron van experimentele proteïnestructuren en PDB-coördinaten.
STITCH	STITCH consortium (EMBL)	v5.0; https://stitch.embl.de/	Voorspelling van chemisch-proteïne interactie-doelwitten.
STRING	STRING Consortium / ELIXIR	v12.0; https://version-12-0.string-db.org/	Constructie van proteïne-proteïne interactienetwerken en pathway-enrichment.
SwissADME	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / University of Lausanne	Webtool; geraadpleegd jan-mei 2026; https://www.swissadme.ch/	Chemo-informatische descriptoren, farmacokinetische voorspellingen en PAINS-beoordeling.
SwissTargetPrediction	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / University of Lausanne	Webtool; geraadpleegd jan-mei 2026; https://www.swisstargetprediction.ch/	Ligand-gebaseerde voorspelling van menselijke proteïne-doelwitten.
UniProt ID Mapping	UniProt Consortium	Webservice; geraadpleegd jan-mei 2026; https://www.uniprot.org/id-mapping	Mapping van proteïne-identificatoren naar gestandaardiseerde, HGNC-goedgekeurde gensymbolen.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/driver versie niet gespecificeerd in manuscript	CUDA-compatibele grafische processoreenheid gebruikt voor moleculaire dynamica simulaties.
CUDA-compatibele GPU	NVIDIA Corporation	CUDA toolkit versie niet gespecificeerd in manuscript; ≥8 GB VRAM	CUDA-compatibele GPU met ≥8 GB VRAM; het werkstation vereiste tevens ≥32 GB RAM en een 6-core CPU.
Ubuntu Linux	Canonical Ltd. / open source	22.04 LTS	64-bits Linux besturingssysteem.
Python 3.9	Python Software Foundation	3.9	Algemene programmeeromgeving gebruikt voor workflow-scripting en analyse.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI / U.S. National Library of Medicine	Publieke webrepository; geen softwareversie gespecificeerd in manuscript	Publieke repository voor functionele genomica-gegevens.
AutoDockTools/MGLTools	Molecular Graphics Laboratory, Scripps Research	1.5.7	Toolkit voor molecuulstructuur en docking-input preparatie.
GROMACS analyse tools	GROMACS development team / open source	2024.2	Hulpmiddelen voor analyse van moleculaire dynamica trajecten.
CHARMM-GUI zes-stappen protocol	CHARMM-GUI / Lehigh University	Webprotocol; exacte release niet herleidbaar	Web-gebaseerde meerstaps workflow voor preparatie en equilibratie van moleculaire systemen.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	Open-source conversiescript; bron niet gespecificeerd in manuscript	Versie niet gespecificeerd in manuscript	Script voor conversie van force-field topologie.
Python	Python Software Foundation	3.9	Algemene programmeeromgeving.
SciPy	SciPy community / open source	Versie niet gespecificeerd in manuscript	Bibliotheek voor wetenschappelijke berekeningen.
scipy.stats.fisher_exact	SciPy community / open source	SciPy versie niet gespecificeerd in manuscript	Implementatie van de exacte test van Fisher’s.
R	R Foundation for Statistical Computing	4.3.x	Statistische rekenomgeving.
Bioconductor	Bioconductor project / open source	3.18	Bio-informatica softwareframework.
limma	Bioconductor project / open source	Versie niet gespecificeerd in manuscript	Pakket voor analyse van differentiële genexpressie.
Benjamini–Hochberg procedure	Statistische methode	Niet van toepassing (statistische procedure)	Methode voor aanpassing van de false-discovery-rate.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/driver versie niet gespecificeerd in manuscript	Grafische processoreenheid met ten minste 8 GB videogeheugen.
CUDA-compatibele GPU	NVIDIA Corporation	CUDA toolkit versie niet gespecificeerd in manuscript; ≥8 GB VRAM	Grafische processoreenheid die algemene parallelle berekeningen ondersteunt.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	Canonical Ltd. / open source	22.04 LTS	64-bits Linux besturingssysteem.
TIP3P	CHARMM force-field developers / open source	TIP3P; geen softwareversie van toepassing	Expliciet driepuntig watermodel.
MM/PBSA	gmx_MMPBSA developers / open source	gmx_MMPBSA 1.5.x	Moleculaire mechanica/Poisson–Boltzmann surface-area methode voor bindingsenergie.