Methodenartikel

Bereiding van met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde beenmergmonsters voor ruimtelijke transcriptomica met gebruik van EDTA-gebaseerde decalcificatie

26 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

In dit artikel

Samenvatting

Een gestandaardiseerde workflow voor het voorbereiden van met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde botmonsters voor ruimtelijke transcriptomica omvat een decalcificatiestap van 10 dagen met EDTA om de RNA-integriteit te behouden. Belangrijke kwaliteitscontrolepunten helpen bepalen of de monsters voldoen aan de vereisten voor daaropvolgende analyse van ruimtelijke genexpressie.

Samenvatting

Beenmerg (BM) is een complexe en dynamische structuur waarin ruimtelijke relaties het celgedrag, de signalering en de functie beïnvloeden. Om deze reden is voor het begrijpen van de volledige dynamiek van cellulaire interacties gebruik van complementaire ruimtelijke technieken nodig die de architectuur van celpopulaties in situ behouden en in kaart brengen. Ondanks aanzienlijke vorderingen in single-cell technologieën, die hebben bijgedragen aan het begrip van de transcriptionele heterogeniteit van gezond en ziek BM-weefsel, behoeven de ruimtelijke organisatie van verschillende celtypen, niche-specifieke regulatieprogramma's en hun interacties nog nader onderzoek. Recente ontwikkelingen in ruimtelijke transcriptomica hebben onbevooroordeelde genexpressieanalyse met ruimtelijke context in verschillende weefsels mogelijk gemaakt, waardoor deze technologieën complementair zijn aan single-cell methoden die geen ruimtelijke resolutie hebben. Hoewel ruimtelijke transcriptomica op grote schaal is toegepast in zachte weefsels, blijft het gebruik ervan in gemineraliseerde weefsels zoals BM beperkt vanwege de uitdagingen die gepaard gaan met de verwerking van botweefsel. Het hier gepresenteerde protocol is gebruikt voor het prepareren van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebette (FFPE) monsters van gezond en ziek muis- en mensweefsel. Een decalcificatiestap van 10 dagen op basis van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is opgenomen om de RNA-integriteit te behouden en het gebruik van ruimtelijke transcriptomica op monsters van lange beenderen te ondersteunen. Dit protocol beschrijft de preparatie van BM-monsters voor ruimtelijke transcriptomische analyse, inclusief weefselverwerking, conservering en coupesnijden, evenals essentiële stappen voor kwaliteitsbeoordeling, zoals het evalueren van de integriteit van de coupes, de weefselmorfologie en de RNA-kwaliteit. De workflow ondersteunt daarnaast de identificatie van celtypen en integratie met single-cell transcriptomische data om de cellulaire samenstelling te karakteriseren, cel-celinteracties te definiëren en de ruimtelijke distributie van transcriptioneel heterogene cellen in gezonde en zieke toestanden te visualiseren. In zijn geheel bereidt deze workflow volledig gemineraliseerde gezonde en maligne weefsels voor op ruimtelijke transcriptomische analyse, terwijl de BM-architectuur behouden blijft.

Inleiding

Het beenmerg (BM) is een zeer complex en gecompartimenteerd orgaan dat fungeert als de primaire locatie voor hematopoiese en de rijping van immuuncellen1,2. Dit heterogene weefsel bestaat uit een diverse verzameling hematopoëtische, mesenchymale, endotheliale en immuuncel-lijnen die samenbestaan in een zeer gespecialiseerde en georganiseerde driedimensionale niche3,4. Binnen deze niche neemt elke celpopulatie verschillende anatomische gebieden in, en de ruimtelijke context speelt een fundamentele rol bij het reguleren van het cellulaire gedrag, de signalering en de functie4,5. Fysieke nabijheid tot specifieke structuren, zoals trabeculair bot of vasculaire netwerken, bepaalt essentiële fysiologische processen, waaronder het behoud van de rusttoestand (quiescentie) van hematopoëtische stamcellen (HSC) en botremodellering6,7. Bijgevolg vormen deze dynamische micro-omgeving en de strak gereguleerde interacties tussen de cellulaire en stromale componenten de regulatoire netwerken die de homeostase handhaven en de progressie van hematologische maligniteiten beïnvloeden8,9,10,11,12,13.

Vooruitgang in single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) heeft ons begrip van de cellulaire diversiteit in het beenmerg (BM) gerevolutioneerd, waardoor de ontdekking van voorheen onbekende cel-subtypen en hun voorspelde interacties binnen de niche mogelijk werd3,10,11,12,14,15,16. Echter, hoewel single-cell transcriptomica hoge-resolutie-informatie biedt over de individuele componenten van de hematopoëtische niche, is deze inherent beperkt door het weefseldigestieproces, dat cellen scheidt van hun natuurlijke omgeving en potentieel hun natuurlijke toestand verandert17, en door het gebrek aan ruimtelijke context die de organisatie van het botweefsel definieert4,18. Dit verlies van positionele context maakt het onmogelijk om definitief in kaart te brengen waar specifieke transcriptioneel verschillende populaties zich bevinden of hoe zij interageren met naburige cellen19. Bovendien wordt dicht botweefsel vaak slechts gedeeltelijk gedissocieerd, wat resulteert in een onderrepresentatie van cruciale celpopulaties, zoals osteocyten en adipocyten, in scRNA-seq-datasets en een bevooroordeelde weergave van de weefsheterogeniteit20,21. Ruimtelijke transcriptomica maakt de studie van genexpressie in situ mogelijk, binnen ruimtelijk behouden weefselcoupes, waardoor contextuele informatie wordt hersteld en de beperkingen van single-cell-technologieën worden weggenomen8,19,22,23,24,25,26. Deze technologie vertegenwoordigt een essentiële vooruitgang in het veld, omdat het een precieze ruimtelijke positionering en structurele organisatie maakt mogelijk van de verschillende celpopulaties die het BM vormen, wat onontbeerlijk is voor het begrijpen van hun interacties en functionele rollen binnen hun natuurlijke micro-omgeving8,26. Bovendien stelt ruimtelijke transcriptomica, in de context van ziekten, onderzoekers en clinici in staat om de kloof tussen traditionele pathologie en high-throughput genomics te overbruggen, waardoor moleculaire gegevens over morfologische beelden kunnen worden gelegd1,8. Technieken voor ruimtelijke transcriptomica kunnen worden ingedeeld in twee hoofdgroepen: sequencing-gebaseerde methoden en imaging-gebaseerde methoden17,24. Sequencing-gebaseerde platforms, zoals Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) en het opensource Open-ST, vangen mRNA op ruimtelijk gebarcodeerde arrays of beads op voordat next-generation sequencing plaatsvindt. Imaging-gebaseerde methoden, waaronder Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX en Xenium, visualiseren transcripten direct in situ via gemultiplexe hybridisatie of padlock-probe-chemie27,28. Alternatieve platforms kunnen worden gecategoriseerd als targeted of untargeted, afhankelijk van of ze probe-gebaseerde detectie vereisen17,24.

Ruimtelijke transcriptomiemethoden zijn gemakkelijk toegepast op weke delen, zoals de hersenen, het hart en de lever, waarbij het genereren van intacte histologische coupes eenvoudig is29,30,31. Daarentegen is de implementatie van ruimtelijke transcriptomie in bot aanzienlijk uitdagender vanwege de gemineraliseerde aard ervan, wat een decalcificatieproces vereist32,33, waarbij calciumfosfaat gecontroleerd wordt verwijderd om het weefsel zacht genoeg te maken voor coupes en daaropvolgende histologische of moleculaire analyses8,20,23,34. Traditionele decalcificatiemethoden die routinematig in de klinische praktijk worden gebruikt, vertrouwen doorgaans op agressieve zure oplossingen zoals zoutzuur, salpeterzuur, mierenzuur of fosforzuur, die de RNA-integriteit ernstig aantasten en de cellulaire morfologie verstoren35,36. Dergelijke moleculaire degradatie vermindert de signaal-ruisverhouding in ruimtelijke assays, wat vaak resulteert in onaanvaardbaar lage gen-detectiepercentages in vergelijking met weke delen8,10. Deze beperking benadrukt de noodzaak van gestandaardiseerde decalcificatie-workflows die de mRNA-integriteit in gemineraliseerde monsters betrouwbaar behouden voor sequentiegebaseerde ruimtelijke analyses8,20.

Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde workflow voor het voorbereiden van in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) BM-monsters voor ruimtelijke transcriptomica, voorheen toegepast door Muiños-Lopez et al.8. De workflow bevat een decalcificatiestap van 10 dagen met ethylenediaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij een gecontroleerde pH. In tegenstelling tot agressieve zuren fungeert EDTA als een milde chelator die de microscopische structuur behoudt en de kwaliteit van de nucleïnezuren in stand houdt, wat het gebruik ervan in moleculaire toepassingen ondersteunt8,20,33,36,37. Als proof of concept is het protocol geïmplementeerd op botweefselmonsters van gezonde muismodellen en muismodellen met multipel myeloom (MM), alsof menselijke BM-monsters van zowel gezonde als zieke personen, waarna de monsters zijn gesequenced op het Visium Spatial Gene Expression-platform38. De workflow omvat gestandaardiseerde procedures voor weefselwerving uit zowel menselijke als muizenbotmonsters, fixatie, decalcificatie, dehydratatie, paraffine-inbedding en coupesnijden, gevolgd door een uitgebreide kwaliteitscontrolepijplijn bestaande uit beoordeling van de integriteit van de coupes, hematoxyline en eosine (H&E)-kleuring, evaluatie van de RNA-kwaliteit (DV200) en optionele immunofluorescentie (IF) voor celtypeverificatie. Deze voorbereidende stappen zorgen ervoor dat alleen coupes van hoge kwaliteit doorgaan naar downstream workflows voor ruimtelijke transcriptomica, inclusief de voorbewerking van weefselcoupes, libraryconstructie, sequencing en daaropvolgende datakwaliteitscontrole en analyse.

Deze gestandaardiseerde procedure ondersteunt de preparatie en kwaliteitsbeoordeling van menselijke en muize BM-monsters voor ruimtelijke transcriptomische analyse. Het is bedoeld om onderzoek naar niche-specifieke reguleringsprogramma's bij hematologische en skeletale aandoeningen te faciliteren.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Richtlijn 2010/63/EU betreffende de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en zijn goedgekeurd door de Dierethische Commissie van de Universiteit van Navarra (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protocollen CEEA082-20 en CEEA039-20). De verzorging, hantering en euthanasie van de dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Spaanse wetgeving om pijn en lijden te minimaliseren.

De humane studie werd goedgekeurd door de Onderzoeksethische Commissie van de School voor Geneeskunde van de Universiteit van Navarra (Comisión de Ética de Investigación, CEI; projecten 2022.100mod1 en 2023.172) en de Onderzoeksethische Commissie van de Gezondheidsdienst van Navarra (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Alle procedures met menselijke deelnemers werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes van de Verklaring van Helsinki. Persoonsgegevens werden vertrouwelijk behandeld conform de Spaanse Organieke Wet 3/2018 over de bescherming van persoonsgegevens en de garantie van digitale rechten en de Spaanse Wet 14/2007 over biomedisch onderzoek.

OPMERKING: Een gedetailleerde lijst van de reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, wordt gegeven in de Tabel met materialenDe uitgebreide experimentele pijplijn voor de implementatie van ruimtelijke transcriptomics in botweefsels is schematisch weergegeven in Figuur 1 en georganiseerd in drie operationele fasen: monstername, kwaliteitscontrole (QC) en ruimtelijke transcriptomische profilering. De monstername omvat het verzamelen van menselijke of murine botfragmenten, gevolgd door fixatie, EDTA-decalcificatie, dehydratie, paraffine-inbedding, en het maken van coupes en objectglaspreparaten. In de QC-fase worden de histologische integriteit en de RNA-preservatie beoordeeld. Gevalideerde botcoupes ondergaan vervolgens permeabilisatie van het weefsel op het objectglas, library-preparatie, sequencing en data-analyse.

figure-protocol-1
Figuur 1: Workflow voor monsterneming en EDTA-gebaseerde preparatie van muis- en menselijke botweefsels. Muisfemora en menselijke botmonsters worden verzameld, gefixeerd, gedecalcificeerd in EDTA, gedehydrateerd, in paraffine ingebed en gesneden. De monsterkwaliteit wordt geëvalueerd via H&E-kleuring en bepaling van de RNA-integriteit (DV200), gevolgd door ruimtelijke transcriptomische weefselpre-processing, library-preparatie, sequencing en kwaliteitscontrole van de data. Afkortingen: BM = beenmerg; DV200 = percentage RNA-fragmenten langer dan 200 nucleotiden; EDTA = ethylenediaminetetraazijnzuur; H&E = hematoxyline en eosine; QC = kwaliteitscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Verkrijging en verwerking van botweefselmonsters

  1. Verzamelen van muisbot
    1. Anestheseer de dieren met 5% isofluraan en bevestig het verlies van reflexen.
    2. Zodra ze volledig onder narcose zijn, wordt euthanasie uitgevoerd door cervicale dislocatie volgens de institutionele en wettelijke richtlijnen.
      ​OPMERKING: Euthanasie moet worden uitgevoerd door getraind personeel, en de dood moet zijn bevestigd voordat men overgaat tot weefselverzameling.
    3. Desinfecteer de huid door 70% ethanol op het dorsale oppervlak van de muis te spuiten en maak met een chirurgische schaar een kleine incisie om de huid voorzichtig te verwijderen en de achterpoten bloot te leggen.
    4. Dissekeer de achterpoten door boven het heupgewricht door te snijden en breng ze over naar een 50 mL buis met 10 mL koud Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS). Plaats de buis op ijs.
    5. Verwijder aanhechtende spieren en bindweefsel met een steriele pincet en een scalpel.
    6. Breng de botten over naar een steriele container van 50 mL die is voorgevuld met schone, koude DPBS, en plaats de container vervolgens op ijs.
    7. Ga onmiddellijk over tot fixatie van het weefselmonster om de weefselintegriteit te behouden.
  2. Hantering van menselijke botmonsters
    1. Ontvang botkernbiopten of chirurgische botfragmenten in steriele containers van 100 mL.
    2. Breng de botfragmenten over naar een schone, steriele container van 100 mL die is voorgevuld met koude DPBS, en plaats deze op ijs.
    3. Ga onmiddellijk over tot fixatie van het monster om de weefselintegriteit te behouden.
      WAARSCHUWING: Menselijke monsters moeten onder BSL 2-condities worden behandeld.
  3. Fixatie van botweefsel
    1. Neem de container van 50 mL of 100 mL met het botmonster en gooi de DPBS weg.
    2. Label plastic cassettes en plaats de botmonsters in individuele cassettes. Sluit de deksels stevig om weefselverlies tijdens de verdere verwerking te voorkomen.
      ​OPMERKING: Plaats bij muismonsters één bot per cassette. Gebruik bij menselijke botmonsters, indien nodig, een steriel scalpel om het weefsel in fragmenten te snijden die klein genoeg zijn om in standaardcassettes te passen, en plaats één fragment per cassette. Als menselijke botmonsters in dit stadium te hard zijn om te snijden, kunnen ze intact worden gelaten en worden overgebracht naar de decalcificatie-oplossing; zodra ze gedecalcificeerd zijn, kan het verzachte weefsel in fragmenten van passende grootte worden gesneden en in gelabelde cassettes worden geplaatst.
    3. Voeg een 4% gebufferde formaldehydeloplossing toe in een monster-fixatief-verhouding van 1:20 en incubeer het monster gedurende 24 u bij 4 °C.
      WAARSCHUWING: Hanteer het fixatief in een chemische zuurkast vanwege de toxiciteit en vluchtige dampen.
      OPMERKING: Vermijd overfixatie (>48 u), aangezien dit de RNA-integriteit in FFPE-workflows vermindert39.
  4. Decalcificatie van gemineraliseerd botweefsel
    1. Gooi de formaline weg en was het botmonster met ultrapuur water. Spoel met water, agiteer kort en gooi weg om eventuele resterende formalineresten te elimineren.
    2. Bereid een 0,25 M EDTA-oplossing in ultrapuur water voor en stel de pH in op 6,95.
      OPMERKING: Hoewel EDTA in traditionele decalcificatieprotocollen vaak wordt ingesteld op pH 8,0, gebruikt deze workflow EDTA bij ongeveer pH 6,95 om efficiënte chelatie te ondersteunen terwijl de weefselmorfologie en RNA-kwaliteit behouden blijven8.
    3. Voeg de EDTA-oplossing toe aan de container met het botmonster en incubeer gedurende 10 dagen bij 4 °C met zachte agitatie.
      ​OPMERKING: Voor muismonsters is ongeveer 50 mL EDTA-oplossing doorgaans voldoende. Voor menselijke botmonsters wordt doorgaans ongeveer 100 mL gebruikt. Dit volume kan echter worden aangepast op basis van de botgrootte om volledige onderdompeling en effectieve decalcificatie te garanderen.
    4. Gooi na 5 dagen decalcificatie de EDTA-oplossing weg en vervang deze door hetzelfde volume verse EDTA, aangezien de chelatiecapaciteit na verloop van tijd verzadigd raakt. Zet de incubatie voort onder dezelfde condities.
    5. Gooi na 10 dagen incubatie de EDTA-oplossing weg en beoordeel of de decalcificatie voltooid is.
      1. Maak een kleine snede met een steriel scalpel of steek een fijne steriele naald in een hoek of perifeer gebied van het weefsel; selecteer altijd een gebied met een lage analytische relevantie om het vermijden van gebieden van interesse. Plaats het bot op een steriele Petrischaal om het monster te stabiliseren tijdens het snijden of het inbrengen van de naald. Als het weefsel gemakkelijk kan worden gesneden of de naald met minimale weerstand doorheen gaat, is het monster voldoende gedecalcificeerd.
      2. Buig bij muisfemuren het bot voorzichtig met een pincet om de flexibiliteit te beoordelen, een betrouwbare indicator voor volledige mineraalverwijdering.
        OPMERKING: De duur van de decalcificatiestap hangt af van de grootte en dikte van het botmonster, evenals het gebruikte EDTA-volume. Als het bot na de initiële incubatieperiode stevig blijft, zet de decalcificatie dan voort tot het weefsel voldoende zacht is om gemakkelijk te kunnen snijden. Overmatige verlenging kan de weefselkwaliteit en RNA-integriteit in gevaar brengen, dus de verlenging moet worden beperkt tot de minimale tijd die nodig is om voldoende verzachting te bereiken20.
  5. Dehydratie
    1. Was door ultrapuur water toe te voegen aan de container met het botmonster en incubeer vervolgens gedurende 5 min bij 4 °C met agitatie.
    2. Gooi het water weg en vervang het door een 70% ethanoloplossing. Incubeer gedurende 1 u bij 4 °C.
      OPMERKING: Deze stap kan dienen als stopmoment. Monsters kunnen worden bewaard in 70% ethanol bij 4 °C voordat men overgaat tot de volgende stappen. De maximale bewaartermijn is in dit protocol niet experimenteel gevalideerd, dus gebruikers dienen te handelen volgens de standaardprocedures van hun laboratorium.
    3. Dehydrateer het monster sequentieel in oplopende concentraties ethanol (70%, 80%, 96%; telkens 1 u bij 4 °C), gevolgd door 100% ethanol gedurende de nacht bij 4 °C.
    4. Gooi de 100% ethanol weg en vervang deze door xyleen. Incubeer gedurende 4 u bij kamertemperatuur (RT).
    5. Gooi het xyleen weg en plaats de monstercassette in een glas met gesmolten, schone paraffine. Incubeer in gesmolten paraffine gedurende de nacht bij 60 °C.
      OPMERKING: Kortere infiltratietijden kunnen worden gebruikt wanneer vacuüm-ondersteunde verwerkingssystemen beschikbaar zijn, aangezien deze apparaten een efficiëntere paraffinepenetratie faciliteren40,41,42.
      WAARSCHUWING: Alle stappen waarbij xyleen en gesegmenteerde ethanoloplossingen worden gebruikt, moeten in een chemische zuurkast worden uitgevoerd om een goede ventilatie te garanderen en blootstelling aan toxische en brandbare dampen te minimaliseren.
  6. Paraffine-inbedding
    ​OPMERKING: Reinig de oppervlakken van het inbedstation met een RNase-decontaminatie-oplossing om RNA-degradatie te voorkomen.
    1. Zet het inbedstation aan en verwarm het paraffine-reservoir, het cassette-paraffinebad, het mal-paraffinebad en de warmteplaat voor de malen voor tot 60 °C. Activeer de koudeplaat zodat deze kan afkoelen voor de inbedding.
    2. Laat de paraffine volledig smelten en plaats pas daarna de cassettes met paraffine-geïnfiltreerde monsters in het cassette-paraffinebad. Incubeer gedurende 2 u om volledige verwijdering van xyleen vóór de inbedding te garanderen.
    3. Plaats alle benodigde malen in het mal-paraffinebad.
      OPMERKING: Gebruik voor menselijke monsters standaard metalen inbedmalen. Gebruik voor muismonsters plastic inbedmalen die compatibel zijn met het Visium-platform en die een vierkante holte hebben met afmetingen die geschikt zijn voor een juiste plaatsing van de secties op Visium-slides. Omdat hele muisbotten niet volledig in de vierkante holte van deze malen passen, moeten de botten vlak voor de inbedding met een steriel scalpel worden doorgesneden om fragmenten van passende grootte te verkrijgen. Afhankelijk van de afmetingen kunnen één of twee botfragmenten per mal worden ingebed.
    4. Voeg een dunne basislaag verse paraffine toe door gesmolten paraffine uit de centrale uitlaat van het inbedstation te dispenseren.
    5. Open de cassette en breng het weefsel voorzichtig van de cassette naar de mal over met behulp van een warme pincet.
    6. Plaats de met paraffine gevulde mal op de warmteplaat en oriënteer het weefsel, terwijl de paraffine vloeibaar blijft, met een warme pincet in het gewenste snijvlak.
    7. Plaats de mal op het koude oppervlak van het inbedstation om de positie van het botfragment kort vast te leggen.
    8. Vul de mal volledig met gesmolten paraffine uit de dispenser, waarbij u er zeker van bent dat het weefsel volledig bedekt is en er geen grote bellen overblijven.
    9. Plaats de gelabelde cassette bovenop de mal zodat deze de basis van het paraffineblok vormt.
    10. Breng de mal met de bevestigde cassette over naar de koudeplaat van het inbedstation. Laat de paraffine 10 min volledig stollen, totdat het blok opaak en stevig is.
    11. Verwijder het paraffineblok zodra het gestold is uit de mal en bewaar het bij 4 °C tot aan het snijden.
      OPMERKING: Deze stap kan dienen als stopmoment. Het paraffineblok kan bij 4 °C worden bewaard; echter, indien mogelijk, moeten het snijden van het weefsel en de daaropvolgende spatiale transcriptomische analyses zo spoedig mogelijk na de inbedding worden uitgevoerd om RNA-degradatie tijdens de bewaring te minimaliseren43,44.
  7. Snijden en slide-preparatie
    OPMERKING: Reinig de microtoom en het waterbad met een RNase-decontaminatie-oplossing om RNA-degradatie te voorkomen.
    1. Vul het waterbad met gedestilleerd water en verwarm het voor tot 42 °C. Zet de microtoom aan en installeer een nieuw mesje. Label de microscopische slides met een potlood.
    2. Monteer het paraffineblok in de monsterhouder, waarbij u er zeker van bent dat de cassette is georiënteerd volgens het gewenste longitudinale snijvlak.
      ​OPMERKING: Bereid een plastic zak gevuld met ijs voor en wanneer het snijden moeilijk wordt door zachte paraffine, plaats de ijszak direct over het blok terwijl dit in de microtoom gemonteerd blijft, en zet dit enkele minuten vast met een elastiekje om de paraffine te verstevigen en de sectiekwaliteit te verbeteren.
    3. Stel de dikte van de microtoom in op 20 µm en voer de trim-sneden uit.
    4. Wijzig de instelling van de microtoom naar 5 µm. Verzamel vier secties van 5 µm in een gelabelde RNase-vrije microcentrifugebuis van 1,5 mL. Houd de buis op droogijs en bewaar deze bij -80 °C.
    5. Zet voort met snijden bij 5 µm en laat de linten drijven in het waterbad. Zodra de sectie volledig is uitgezet en rimpelvrij is, wordt deze opgepakt met de gelabelde slide.
      1. Verzamel bij elke vastgestelde set secties (bijv. elke 5-10 linten, afhankelijk van de weefselgrootte) nog eens 4 secties van 5 µm in een nieuwe gelabelde buis van 1,5 mL. Herhaal dit proces totdat er in totaal drie buisjes van 1,5 mL zijn verkregen die 5 µm secties bevatten.
        OPMERKING: Als het weefsel scheurt, breekt of niet in een continue sectie kan worden verkregen, is het monster niet volledig gedecalcificeerd en is extra decalcificatietijd nodig. Herstel het monster door de workflowstappen terug te draaien tot de decalcificatiefase is bereikt. Smelt hiervoor het paraffineblok gedurende ongeveer 2 u bij 60 °C en breng het specimen over naar xyleen (2 u). Rehydrateer het monster via gesegmenteerde ethanoloplossingen (100%, 96%, 80%, 70%) gevolgd door gedestilleerd water. Breng het gerehydrateerde monster terug naar verse 0,25 M EDTA (pH 6,95) en verleng de decalcificatieperiode indien nodig voordat u overgaat tot dehydratie, opnieuw inbedden en snijden. Deze herstelprocedure moet strikt als laatste redmiddel worden gebruikt, aangezien het terugdraaien van de FFPE-verwerking de RNA-integriteit kan compromitteren.
    6. Plaats de slides gedurende de nacht in een oven van 37 °C om eventueel resterend water te laten verdampen, en bewaar ze vervolgens bij 4 °C.
    7. Om de weefseladhesie te verbeteren, kunnen de slides optioneel 3 u bij 42 °C worden gebakken voordat ze gedurende de nacht bij 37 °C worden geïncubeerd.
      OPMERKING: Deze stap is over het algemeen niet nodig bij gebruik van de glazen slides die in de Tabel met Materialen worden vermeld, aangezien deze slides een sterke adhesie bieden en het weefsel doorgaans stevig vast blijft zitten tijdens de verwerking. Deze stap kan dienen als stopmoment. Slides kunnen bij 4 °C worden bewaard; echter, indien mogelijk, moeten de daaropvolgende spatiale transcriptomische analyses zo spoedig mogelijk na de inbedding worden uitgevoerd om RNA-degradatie tijdens de bewaring te minimaliseren43,44.

2. Kwaliteitsbeoordeling van het monster

  1. Evaluatie van de sectiekwaliteit
    1. Examineer alle secties één voor één onder een standaard lichtmicroscoop in helderveld (4×–10×). Inspecteer elke slide om er zeker van te zijn dat de coupes niet gefragmenteerd zijn en noteer de kwaliteit van elke coupe.
      ​OPMERKING: Controleer op plooien, rimpels, compressie of chatter-sporen, wat kan duiden op problemen met de hardheid van de paraffine, de scherpte van het mes of een onvolledige decalcificatie. Verifieer dat er geen weefselgebieden ontbreken als gevolg van loslating tijdens het snijden of de overdracht naar het waterbad.
    2. Selecteer de best geconserveerde secties voor ruimtelijke transcriptomica (meest compleet, beste morfologie).
    3. Identificeer de opeenvolgende secties grenzend aan de geselecteerde secties en reserveer deze voor H&E-kleuring en IF, om ervoor te zorgen dat het gekleurde beeld zo nauwkeurig mogelijk overeenkomt met het weefsel dat gesequenced zal worden.
  2. H&E-kleuring voor weefselintegriteit
    1. Plaats de objectglaasjes in een glazen kleurrek en incubeer deze gedurende 15 min bij 60 °C.
    2. Plaats het rek gedurende 15 minuten in glazen kleuringspotten met xyleen min.
    3. Rehydrateer de coupes door het rek door kleurpotten met 100%, 96%, 80% en 70% ethanol te bewegen, met een incubatietijd van 5 min in elke oplossing.
      ​WAARSCHUWING: Alle stappen waarbij xyleen en graduele ethanoloplossingen worden gebruikt, moeten in een chemische zuurkast worden uitgevoerd om een goede ventilatie te waarborgen en blootstelling aan toxische en brandbare dampen te minimaliseren.
    4. Spoel de objectglazen gedurende 5 minuten af min in een kleuringspot gevuld met water.
    5. Dompel het rek 10 min lang onder in hematoxyline en spoel vervolgens af onder stromend kraanwater totdat het spoelwater helder is.
    6. Dompel het rek onder in water met vijf druppels geconcentreerd zoutzuur en schud voorzichtig totdat er een roodachtige tint verschijnt.
    7. Plaats het rek in water verzadigd met lithiumcarbonaat totdat een stabiele blauwe kleur ontstaat, en spoel vervolgens kort af met water.
    8. Kleur de coupes gedurende 5 min in 1% (w/v) eosine en spoel ze vervolgens opnieuw af met water.
    9. Dehydrateer de coupes door het rek door kleurpotten te bewegen die water, 70%, 80%, 96% en 100% ethanol bevatten, met een incubatietijd van 5 minuten in elke oplossing.
    10. Klaar de coupes in xyleen gedurende 15 minuten min.
    11. Droog de achterzijde van elke objectglas voorzichtig, breng monteermedium aan op een dekglas en monteer de coupes. Laat de objectglazen drogen bij KM voor 24 uur vóór de beeldvorming.
    12. Voer weefselbeeldvorming uit met een hoge-resolutiemicroscoop bij een 20x vergroting.
      OPMERKING: Voer H uit&E-kleuring op aangrenzende coupes als eerste kwaliteitscontrole om de geschiktheid van het monster voor ruimtelijke transcriptomica te beoordelen. Voer na selectie een tweede H&E-kleuring direct op de sectie die bedoeld is voor ruimtelijke transcriptomica, volgens de richtlijnen voor weefselpreparatie van de fabrikant voor het in de lijst vermelde platform voor ruimtelijke genexpressie Tabel met materialen.
  3. Beoordeling van de RNA-integriteit (DV200)
    ​OPMERKING: Voor het protocol voor ruimtelijke genexpressie is het traditionele RNA Integrity Number (RIN) niet effectief, omdat de 18S- en 28S-ribosomaal RNA-pieken doorgaans afwezig zijn in gefixeerde weefsels. Daarom wordt de DV200-metriek, gedefinieerd als het percentage RNA-fragmenten groter dan 200 nucleotiden, gewoonlijk gebruikt als een informatievere kwaliteitsparameter dan het RIN. voor gedegradeerde klinische monsters. Voor Visium v2 adviseert 10x Genomics het gebruik van FFPE-blokken met een DV200-waarde ≥ 30% om een efficiënte hybridisatie van probes en optimale assayprestaties te garanderen. Het selecteren van weefselblokken met de hoogst beschikbare DV200-waarden helpt sequencing-dropouts te voorkomen en maximaliseert de spotgevoeligheid.
    1. Haal de 1,5 ml buisjes op die de 5 µm verzamel de secties tijdens de stap van het doorsneden van het weefsel en plaats deze op ijs om RNA te extraheren.
    2. Extraheer totaal RNA. Deze gestandaardiseerde procedure omvat deparaffinering van de monsters, digestie met proteinase K om formaline-crosslinks ongedaan te maken, verwijdering van genomisch DNA via een DNase I-behandeling en uiteindelijke elutie van het gezuiverde RNA in RNase-vrij water.
    3. Beoordeel de RNA-integriteit met behulp van een op capillaire elektroforese gebaseerd systeem met een RNA-assay met hoge gevoeligheid. Een samenvatting van de workflow is te vinden in Aanvullend bestand 142,45,46,47,48.
  4. Optionele IF voor verificatie van het celtype
    1. Plaats de FFPE-preparaatglasplaat in een glazen kleurrekje en incubeer deze gedurende 15 min bij 60 °C.
    2. Plaats het rek in glazen kleuringspotten met xyleen gedurende 15 min.
    3. Rehydrateer het coupesnijframe door dit gedurende elk 2 minuten te verplaatsen door 100%, 96%, 80% en 70% ethanol, gevolgd door 5 minuten in water en 5 minuten in PBS-Tween (1x PBS aangevuld met 0,1% Tween-20).
      WAARSCHUWING: Alle stappen waarbij xyleen en ethanol worden gebruikt, moeten in een chemische zuurkast worden uitgevoerd.
    4. Voer de antigeenherstelprocedure uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het primaire antilichaam, waarbij moet worden gewaarborgd dat de herstelbuffer, de pH en de verhittingcondities overeenkomen met het informatieblad van het antilichaam. OPMERKING: In deze workflow wordt antigeenherstel uitgevoerd met 10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 9,0, in een verwarmingssysteem met kookpot gedurende 30 min bij 95 °Cen vervolgens 20 min bij kamertemperatuur gekoeld.
    5. Was het objectglas twee keer gedurende 10 minuten per keer in PBS-Tween.
    6. Teken een hydrofobe barrière rond het weefsel met een hydrofobe barrièrepen en blokkeer aspecifieke binding door 5% BSA in 1x DPBS gedurende ten minste 40 minuten op de weefselcoupes aan te brengen. min bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
      OPMERKING: De vochtige kamer wordt klaargemaakt door een vel filterpapier in een plastic kleurdoosje voor objectglazen te plaatsen en dit grondig te bevochtigen met gedestilleerd water om een stabiele vochtige omgeving te behouden tijdens de incubatie van de antilichamen.
    7. Bereid de primaire antilichaamoplossing in 1x DPBS voor in de aanbevolen verdunning voor elk antilichaam.
      OPMERKING: In deze workflow werden primaire antilichamen tegen Emcn (V.7C7) en Cd271 (ME20.4) gebruikt om respectievelijk muis-EC en MSC te identificeren, terwijl antilichamen tegen CD31 (JC70A) of PRRX1 (polyclonaal) werden gebruikt om hun menselijke tegenhangers te identificeren, conform het protocol van de fabrikant.
    8. Verwijder de blokkeringsoplossing door voorzichtig met de rand van het objectglas op absorberend papier te tikken om resterende druppels te verwijderen, breng vervolgens het mengsel van het primaire antilichaam aan en incubeer het objectglas gedurende de nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    9. Was het objectglas twee keer gedurende 5 min in PBS-Tween en bereid de secundaire antilichaamoplossing in de door de fabrikant aanbevolen verdunning, waarbij moet worden gewaarborgd dat de fluoroforen spectraal compatibel zijn en elkaar niet overlappen.
      OPMERKING: In deze workflow werd een met Alexa Fluor geconjugeerd secundair antilichaam in een verdunning van 1:200 gebruikt.
    10. Breng de mix van secundaire antilichamen aan en incubeer gedurende 30 min bij RT, beschermd tegen licht in een bevochtigde kamer.
    11. Was het preparaat twee keer gedurende 5 min in PBS-Tween.
    12. Breng een 1:10 verdunning aan van het DAPI-bevattende montage-medium (zie Tabel met Materialen), bereid in een 1:1 PBS-glyceroloplossing, en incubeer het monster gedurende 5 min.
    13. Monteer het preparaat met een dekglas en verzegel de randen met nagellak om uitdroging te voorkomen.
    14. Visualiseer het gekleurde weefsel met behulp van een multispectraal beeldvormingsplatform.

Aanvullend bestand 1: Samenvatting van de protocolstappen voor RNA-integriteitsbeoordeling en de Visium Spatial Transcriptomics-workflow. Dit aanvullende bestand biedt een gedetailleerde samenvatting van de procedurele stappen die zijn uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Het omvat: (i) de High Sensitivity RNA ScreenTape Assay die is gebruikt om de RNA-integriteit (DV200) te evalueren, zoals beschreven in stap 2.3.3 van het hoofdprotocol, en (ii) een overzicht van de Visium CytAssist Spatial Gene Expression-workflow, inclusief weefselvoorbehandeling, bibliotheekpreparatie en sequencing (stappen 3.1–3.3 van het hoofdprotocol).Klik hier om dit bestand te downloaden.

3. Ruimtelijke transcriptomica

OPMERKING: Voer de workflow voor ruimtelijke transcriptomics uit met het platform en de reagentia die zijn vermeld in de Tabel met Materialen, volgens de bijbehorende gebruikershandleidingen42,45,46. In Aanvullend Bestand 1 zijn de belangrijkste stappen voor weefselvoorbehandeling, bibliotheekpreparatie en sequencing samengevat.

  1. Kwaliteitscontrole van ruimtelijke transcriptomische gegevens
    1. Demultiplex de ruimtelijke transcriptomische gegevens met de standaardpijplijn voor Visium-datasets (zie Tabel met Materialen).
    2. Koppel de reads aan het juiste Ensembl 105 referentiegenoom.
      OPMERKING: GRCh38 voor menselijke monsters en mm10 voor muismonsters zijn gebruikt.
    3. Genereer de gefilterde feature-barcode matrices met behulp van dezelfde pijplijn en importeer deze in de downstream single-cell/ruimtelijke analyse-omgeving (zie Tabel met Materialen).
    4. Inspecteer de H&E-beelden in de visualisatie-interface die wordt geleverd door de ruimtelijke transcriptomische pijplijn (zie Tabel met Materialen) en verwijder handmatig spots die overlappen met het corticale botgebied of botweefsel, afhankelijk van de dataset.
    5. Normaliseer de datasets met een variantie-stabiliserende transformatiemethode die gewoonlijk wordt toegepast in single-cell analyse-workflows (zie Tabel met Materialen).

Resultaten

Om de toepasbaarheid van deze EDTA-gebaseerde workflow over verschillende soorten en ziektecontexten te evalueren, is het protocol toegepast op vier BM-monsters: twee muizenfemurs en twee menselijke botmonsters die gezonde condities en multiple myeloom (MM) vertegenwoordigen (Tabel 1 en Figuur 1).

MonsteridentificatieSoortGeslachtLeeftijdZiekte
YFPcγ1MuisVrouwelijk210 daysGezond
mMMMuisMannelijk314 daysMM
hHBMMensMannelijk76 yearsGezond
hMMMensVrouwelijk50 yearsMM

Tabel 1: Muis- en menselijke botmonsters opgenomen in de studie. Soort, geslacht, leeftijd en gezondheidsstatus zijn vermeld voor elk monster. Afkortingen: hHBM = gezond menselijk beenmerg; hMM = menselijk multipel myeloom; mMM = muis multipel myeloom; MM = multipel myeloom; YFPcγ1 = gezonde controlemuis.

De monsters die in deze studie zijn gebruikt, zijn eerder gekenmerkt en gerapporteerd in eerdere publicaties van de onderzoeksgroep, specifiek in de werken van Muiños-Lopez et al. en Cenzano et al., met uitzondering van het MM-muismonster. Voor de eerder gerapporteerde exemplaren worden de ruimtelijke transcriptomics-gegevens en resultaten gepresenteerd in die studies8,10. Daarom wordt het hier opgenomen materiaal gebruikt om de technische geschiktheid van het protocol voor ruimtelijke transcriptomics te evalueren, in plaats van om nieuwe biologische bevindingen te presenteren.

Monsters van dijbeenbot van muizen werden verkregen uit het genetisch gemodificeerde MM-muismodel BIC (BIcγ1), dat de klinische en immunologische kenmerken van MM-patiënten nabootst, en van de corresponderende gezonde controlemuis (YFPcγ1)8,49. Uit elk dier werd één dijbeen geoogst, gereinigd en verwerkt volgens het gestandaardiseerde protocol (Figuur 2A). Dijbeenderen werden specifiek voor deze analyses gebruikt omdat ze een overvloed aan beschikbaar merg, een superieure nichekwaliteit en een eenvoudige reproduceerbare verwerking bieden, waardoor ze uitermate geschikt zijn voor een sequencing-gebaseerd ruimtelijk transcriptomisch platform8,10. De succesvolle decalcificatie van het dijbeen van de controlemuis werd macroscopisch bevestigd door een merkbare toename van de weefselflexibiliteit tijdens handmatige manipulatie met een pincet (Figuur 2B). Vervolgens werd dit botfragment efficiënt in paraffine ingebed met behulp van een gespecialiseerde, compatibele mal voor ruimtelijke transcriptomics om de RNA-integriteit en de weefselarchitectuur te behouden voor verdere moleculaire analyse (Figuur 2C).

Twee menselijke BM-monsters met contrasterende verwerkingsgeschiedenissen werden ook geanalyseerd8,10. Een hematologisch gezond vers menselijk BM-monster werd verkregen uit chirurgisch afval tijdens een orthopedische heupvervanging in het Hospital Universitario de Navarra (Figuur 2D–F). Om het translationele nut van het protocol aan te tonen, werd dit monster verwerkt op dezelfde wijze als de muizenmonsters. In overeenstemming met de resultaten waargenomen in muisweefsel werd de succesvolle EDTA-decalcificatie van menselijk bot macroscopisch bevestigd door volledige verzachting van het weefsel, wat bleek uit moeiteloze penetratie van de naald (Figuur 2E). Het gedecalcificeerde menselijke botfragment werd succesvol in paraffine ingebed met behulp van een standaard metalen vorm voor verdere verwerking (Figuur 2F). Het tweede menselijke monster bestond uit gearchiveerde FFPE BM-biopten van de crista iliaca van een MM-patiënt bij de afdeling Pathologie van de Clínica Universidad de Navarra (CUN). Opvallend is dat dit gearchiveerde MM-monster eerder was gedecalcificeerd met behulp van een standaard klinisch protocol met sterke zuren36. Dit monster biedt een kwalitatief contrast met de met EDTA verwerkte specimens; verschillen in weefselbron, fixatiegeschiedenis, bewaring en decalcificatie betekenen echter dat de waargenomen verschillen niet uitsluitend kunnen worden toegeschreven aan het decalcificatiemiddel.

figure-results-1
Figuur 2: Muis- en menselijke botmonsters tijdens EDTA-gebaseerde preparatie. (A) Intacte controle-dijbeenderen van muizen vóór decalcificatie. (B) Gedecalcificeerd controle-dijbeen van een muis met een verhoogde flexibiliteit. (C) Controle-botfragmenten van muizen ingebed in paraffine. (D) Gezonde menselijke botfragmenten uit een heupoperatie vóór decalcificatie. (E) Hetzelfde fragment na EDTA-decalcificatie, waarbij naaldpenetratie zichtbaar is. (F) Met EDTA gedecalcificeerd gezond menselijk bot ingebed in paraffine. Schaalbalken: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Afkorting: EDTA = ethylenediaminetetra-azijnzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de algemene weefselarchitectuur te analyseren, werd H&E-kleuring uitgevoerd (Figuur 3). De betere morfologische preservatie die werd waargenomen in de murine secties kan het resultaat zijn van verschillen in monsterbehandeling en verwerking, in plaats van inherente soortspecifieke kenmerken. De muizenfemuren werden specifiek verzameld voor ruimtelijke transcriptomica en direct verwerkt als intacte botten, waardoor hun architectuur behouden bleef (Figuur 3A, B). In contrast hiermee zijn de menselijke monsters afkomstig van restmateriaal verkregen tijdens een heupoperatie (Figuur 3C) of van diagnostische MM-botbiopten (Figuur 3D), waarbij beide een variabele pre-analytische weefselkwaliteit kunnen hebben. Als gevolg hiervan zijn de morfologische verschillen tussen het met EDTA gedecalcificeerde menselijke monster en het met zuur gedecalcificeerde MM-biopt subtiel, aangezien beide menselijke preparaten al baseline structurele beperkingen vertonen die niet alleen door decalcificatie, maar ook door algemene weefselverwerking zijn geïntroduceerd (Figuur 3C, D). Bijgevolg vereist een volledige beoordeling van de monsterkwaliteit voor ruimtelijke transcriptomica de evaluatie van meerdere afzonderlijke parameters. Ten eerste moet de weefselintegriteit zorgvuldig worden bewaakt, aangezien de structurele preservatie aanzienlijk kan variëren afhankelijk van het specifieke monstertype en niet uitsluitend door het gebruikte decalcificerende zuur. Ten tweede moet ook de RNA-kwaliteit worden geëvalueerd, omdat decalcificatiecondities deze kunnen beïnvloeden20,35,36.

figure-results-2
Figuur 3: Met H&E gekleurde coupes gebruikt voor de beoordeling van de weefselkwaliteit. Opeenvolgende FFPE-coupes komen overeen met (A) een gezonde controlemuis10, (B) een muis met MM, (C) gezond menselijk bot8,10, en (D) een menselijke MM-biopsie8. Schaalbalken = 500 µm. Afkortingen: FFPE = formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed; H&E = hematoxyline en eosine; MM = multipel myeloom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ter aanvulling op de histologische analyse werd de RNA-kwaliteit geëvalueerd. Hoewel H&E-kleuring ambigue verschillen opleverde, differentieerde de RNA-integriteit duidelijk de effecten van de twee decalcificatiemethoden (Tabel 2). De DV200-waarden van zowel de murine monsters als het gezonde menselijke botmonster overschreden de drempelwaarde die wordt aanbevolen voor Visium FFPE-assays, wat duidt op een voldoende RNA-fragmentlengteverdeling voor probe-hybridisatie en library-constructie. Het YFP-gezonde muismonster vertoont een DV200 van 82,55%, en het gezonde menselijke botmonster (hHBM) bereikt 58%, beide ruim boven de acceptabelledrempel van 30% die door 10x Genomics is gedefinieerd. Het MM-muismonster (mMM) vertoont een DV200 van 31,3%, dicht bij de ondergrens van acceptabiliteit, wat mogelijk het gevolg is van langere bewaring van het paraffineblok bij 4 °C vóór het snijden, naast andere monsterspecifieke factoren. Daarentegen vertoont de zuur-gedecalcificeerde menselijke MM-biopsie (hMM) een DV200 van slechts 8%, wat geassocieerd werd met een merkelijk lagere RNA-integriteit, zelfs wanneer de morfologische verslechtering minder uitgesproken is. Samenvattend is het uitvoeren van zowel structurele als moleculaire beoordelingen essentieel voor het vaststellen van de geschiktheid van monsters voor daaropvolgende ruimtelijke analyse.

MonsteridentificatieDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Percentage van het totale RNA-fragmenten > 200 nucleotiden.
2Dit monster is gedecalcificeerd met behulp van een standaard klinisch protocol met sterke zuren.

Tabel 2: RNA-kwaliteit van de studie monsters. DV200 is het percentage RNA-fragmenten langer dan 200 nucleotiden; waarden van ten minste 30% werden beschouwd als geschikt voor daaropvolgende ruimtelijke transcriptomica. Afkortingen: hHBM = gezond menselijk beenmerg; hMM = menselijk multipel myeloom; mMM = muis multipel myeloom.

Er kunnen daarnaast aanvullende kwaliteitsbeoordelingen worden uitgevoerd. Om de weefselintegriteit verder te valideren en de behoud van specifieke cellulaire compartimenten na EDTA-decalcificatie te bevestigen, werd optionele IF-kleuring uitgevoerd op aangrenzende FFPE-secties van muis- en menselijke weefsels. Endomucin (Emcn)- en Cd271-antilichamen werden gebruikt om respectievelijk endotheelcellen (EC) en mesenchymale cellen (MSC) te visualiseren in het MM-muismonster (Figuur 4A). Deze kleuring toonde aan dat EDTA-behandelde weefsels goed gedefinieerde vasculaire structuren vertoonden met continue Emcn-kleuring en behouden stromale netwerken, wat aantoont dat de geteste markers detecteerbaar bleven na de verwerking. Bovendien leverde beeldvorming met een hoge resolutie met behulp van een geautomatiseerd multispectraal beeldvormingssysteem aanvullend bewijs dat de geteste antigenen detecteerbaar bleven voor celtype-verificatie, wat een extra laag kwaliteitscontrole bood voorafgaand aan de ruimtelijke transcriptomische analyse. Verder werden deze bevindingen ook waargenomen in gezonde menselijke monsters van ouderen, waarbij EC-expressie werd gedetecteerd door CD31 en MSC door PRRX1 (Paired Related Homeobox 1) antilichamen, wat aantoont dat de geteste niche-markers identificeerbaar bleven na EDTA-decalcificatie (Figuur 4B). In tegenstelling hiermee konden deze bevindingen niet worden gereproduceerd in menselijke MM-biopten die waren onderworpen aan verschillende zuurgebaseerde decalcificatieprotocollen. Zoals eerder vermeld, was de RNA-integriteit in deze monsters laag, wat de daaropvolgende transcriptomische analyse beperkte. Vanwege de gedegradeerde aard van deze menselijke monsters was hun verdere bruikbaarheid beperkt tot basis transcriptomische profilering8 en immunohistochemische (IHC) evaluatie van maligne plasmacellen (PC) (Figuur 4C).

figure-results-3
Figuur 4: Optionele immunofluorescentie en immunohistochemie voor verificatie van het celtype. (A) Muis-MM-weefsel waarop DAPI-gelabelde kernen (blauw), CD271-positieve MSC (groen) en EMCN-positieve EC (rood) te zien zijn. (B) Gezond menselijk bot waarop DAPI-gelabelde kernen (blauw), PRRX1-positieve MSC (groen) en CD31-positieve EC (rood) te zien zijn10. (C) Menselijke MM-biopsie waarop CD138-positieve maligne PC te zien zijn8. Schaalbalken: (A) 250 µm (overzicht), 20 µm (samengevoegde vergroting) en 50 µm (enkelkanaalsbeelden); (B) 500 µm (overzicht) en 20 µm (samengevoegde en enkelkanaals vergrotingen); (C) 500 µm. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = endotheelcel; MM = multipel myeloom; MSC = mesenchymale stromale cel; PC = plasmacel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Samen ondersteunen de weefselmorfologie en de DV200-resultaten de geschiktheid van met EDTA verwerkte monsters voor daaropvolgende ruimtelijke transcriptomische analyse. Ruimtelijke transcriptomische toepassingen van deze preparatieworkflow zijn eerder gerapporteerd8,10.

Discussie

Door de integratie van gecontroleerde decalcificatie op basis van EDTA, gestandaardiseerde FFPE-verwerking en strikte kwaliteitscontrolepunten, overwint dit protocol veel van de beperkingen die traditioneel worden geassocieerd met de voorbereiding van botweefsel voor ruimtelijke transcriptomica, in het bijzonder die met betrekking tot RNA-degradatie en morfologische schade veroorzaakt door sterke zuurgebaseerde decalcificatiemethoden8,10,20,33,36. De meest kritische stap bij het verwerken van gemineraliseerde monsters voor ruimtelijke transcriptomica is de decalcificatie. Onvoldoende decalcificatie resulteert in bot dat te rigide blijft om te snijden, waardoor het fysiek onmogelijk is om secties van hoge kwaliteit te verkrijgen voor ruimtelijke transcriptomica8,20,23,37,50. Wanneer botweefsel te hard blijft, versplintert of trilt het tegen het microtoommes, wat leidt tot versnipperde secties of gaten die de oorspronkelijke BM-architectuur niet nauwkeurig weergeven. Belangrijk is dat het succes van de decalcificatie pas volledig kan worden bevestigd tijdens de microtomiefase: zelfs monsters die oppervlakkig verzacht lijken, kunnen nog residu van mineralen bevatten dat pas zichtbaar wordt bij het proberen te snijden van dunne FFPE-secties. Om deze reden is zorgvuldige monitoring van de voortgang van de decalcificatie essentieel om reproduceerbare resultaten te garanderen.

De workflow maakt gebruik van 0,25 M EDTA bij pH 6,95 gedurende 10 dagen met constante agitatie en vervanging van de oplossing op de vijfde dag8,10. Tijdens de ontwikkeling van het protocol werden EDTA alleen, EDTA aangevuld met polyvinylpyrrolidon en 10% mierenzuur geëvalueerd, samen met verschillende decalcificatieduren en schema's voor de vervanging van de oplossing; de vergelijkende gegevens worden hier niet gepresenteerd. Duren korter dan 10 dagen resulteerden vaak in weefselbreuken tijdens het snijden van muizenmonsters, terwijl menselijke monsters een monster-afhankelijk gedrag vertoonden. De duur van 10 dagen wordt daarom gebruikt voor muizenfemura, terwijl menselijke monsters een langere decalcificatie kunnen vereisen, afhankelijk van de dichtheid en het trabeculaire gehalte. Fysieke kwaliteitscontrole-checkpoints moeten worden gebruikt vóór het paraffineren. Als onvoldoende decalcificatie blijkt tijdens de microtomie, gebruik de herverwerkingsprocedure dan alleen als laatste redmiddel, omdat extra warmte, blootstelling aan oplosmiddelen en rehydratatie de RNA-kwaliteit kunnen aantasten.

De belangrijkste beperking van deze methode is de verlengde verwerkingstijd, wat scherp contrasteert met de snelle zuurgebaseerde protocollen die gewoonlijk in de klinische pathologie worden gebruikt20,36. Hoewel langere verwerkingstijden over het algemeen acceptabel zijn in onderzoeksomgevingen, benadrukken recente studies, zoals het protocol beschreven door Miao et al., waarin de oplossing van Morse (22,5% mierenzuur en 10% natriumcitraat) wordt gebruikt om binnen 24 u te decalcificeren, de groeiende belangstelling voor het versnellen van de botpreparatie voor ruimtelijke assays20. Echter, zuurgebaseerde methoden brengen historisch gezien een veel hoger risico op RNA-degradatie met zich mee, wat de DV200-waarden verlaagt en uiteindelijk hun compatibiliteit met ruimtelijke transcriptomics beperkt1,8,35,36. Deze EDTA-gebaseerde benadering geeft prioriteit aan RNA-preservatie boven snelheid, waardoor de compatibiliteit met sequencing-gebaseerde ruimtelijke platforms zoals Visium wordt gewaarborgd.

Een potentiële beperking van ruimtelijke transcriptomica van het beenmerg (BM) is de hoge abundantie van immunoglobuline-transcripten afkomstig van plasmacellen (PC), wat de detectie van genen met een lage abundantie kan verminderen. Net als bij de kwaliteitscontrole- en filterstrategieën die zijn toegepast in een eerdere studie van de onderzoeksgroep, waaronder het verwijderen van spots van lage kwaliteit (<200 UMI's en <150 gedetecteerde genen), het filteren van celtypen met een lage bijdrage (<20% per spot) tijdens deconvolutieanalyses en de selectie van markergenen gedetecteerd in de ruimtelijke transcriptomische datasets, kunnen immunoglobuline-transcripten tijdens de downstream-analyse computationeel worden gefilterd om hun impact te minimaliseren wanneer dat passend is8. Gerichte ruimtelijke transcriptomische benaderingen kunnen de detectie van transcripten met een lage abundantie in specifieke toepassingen verder verbeteren.

De potentiële toepassingen voor deze methode zijn uitgebreid. Recente integratie van ruimtelijke en single-cell data heeft gespecialiseerde menselijke osteogene niches en complexe signaleringsgradiënten onthuld die vanuit het trabeculair bot uitstralen3,26. Bovendien heeft ruimtelijke transcriptomica aangetoond dat veroudering de micro-omgeving van het BM hervormt door de ruimtelijke organisatie en communicatie van EC te veranderen, wat leidt tot een verminderde osteogene ondersteuning en het ontstaan van inflammatoire signaleringsnetwerken binnen de verouderde niche10. Multiomische profilering heeft ook verschillende micro-omgevingsbuurten geïdentificeerd, zoals arterio-endostale regio's die vroege myelopoëse ondersteunen en peri-adipocytaire zones die verrijkt zijn met hematopoëtische stam- en progenitorcellen3. In de context van MM maakt dit protocol de integratie van ruimtelijke en single-cell transcriptomische kaders mogelijk om de samenstelling van ziek BM van muizen en cel-celinteracties te karakteriseren. Voorgaand werk onthulde ruimtelijk verschillende distributies van maligne PC en identificeerde immuun- en inflammatoire programma's, zoals NETosis en IL-17 signalering, die omgekeerd geassocieerd waren met tumor-verrijkte regio's. Daarnaast correleerde een toename in de dichtheid van maligne PC met een verschuiving van effector- naar uitgeputte T-celtoestanden. Deze bevindingen werden ook gevalideerd in menselijke FFPE BM-monsters, wat hun translationele relevantie over verschillende ziektelasten demonstreert8. Uiteindelijk biedt deze preparatieworkflow de technische basis voor het verkennen van de complexe cellulaire interacties binnen de gemineraliseerde architectuur van het BM.

Platforms voor ruimtelijke genexpressie met een hoge resolutie kunnen transcriptoomprofilering van het volledige genoom bieden met een resolutie die die van een enkele cel benadert38,51,52. Deze benaderingen kunnen het gebruik van de workflow voor preparatie uitbreiden naar analyses met een hogere resolutie van ruimtelijk georganiseerd BM en hematologische maligniteiten. De workflow biedt daarom een technische basis voor toekomstige studies naar fysiologische en maligne hematopoëse.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. Een patent op de knowhow en het experimentele gebruik van de MIcγ1-muismodellen voor MM is gelicentieerd aan MIMO Biosciences (aanvraag nr. PCT/EP2023/071025).

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Instituto de Salud Carlos III en medegefinancierd door ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) en RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020- 000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC en AIRC onder het Accelerator Award Program; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) en The Paula and Rodger Riney Foundation aan FP. IAC werd ondersteund door een Marie Curie-beurs (H2020- MSCA-IF-837491) van de Europese Commissie, een AECC Talent-beurs (INVES258003CALV), en het Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC werd ondersteund door een FPU-beurs (FPU22/03283) van het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Wij willen het personeel van het Advanced Genomics Laboratory en de Animal Facility at CIMA Universidad de Navarra bedanken voor hun onschatbare technische en intellectuele ondersteuning. We danken ook de afdelingen Pathologie van de Clínica Universidad de Navarra (CUN) en het Hospital Universitario de Navarra voor het leveren van BM-monsters en voor hun uitstekende samenwerking. Bijzonder dank is verschuldigd aan José Ángel Martínez-Climent en Marta Larrayoz voor hun MM-muismodellen. Dank aan Patxi San Martín-Uriz, Tania López en Eduardo Larequi voor hun uitstekende ondersteuning bij technologieoptimalisatie, protocolontwikkeling en het oplossen van problemen bij de verwerking van muis- en menselijke BM-monsters voor ruimtelijke transcriptomics. We danken ook Beñat Ariceta en Asier Ullate voor al hun computationele werk aan ruimtelijke transcriptomics. Tot slot zijn we diep dankbaar aan de patiënten en gezonde donoren die genereus aan deze studie hebben deelgenomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,5 mL buisjesEppendorf15625367
100 mL steriele container deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991AOp capillaire elektroforese–gebaseerd systeem voor de beoordeling van de RNA-integriteit
50 mL steriele container IberoMedREOR001
50 mL buisje FALCON352070
Advanced PAP PenTed Pella 22309Z377821-1EAHydrofobe barrièrepen 
Anti-PRRX1 antilichaam geproduceerd in konijnSigma-AldrichHPA051084
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma-AldrichA9418-50G
Cassettes KartellLABWARE2921
CD271 (NGF-receptor) monoklonaal antilichaam (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, endotheliale cel (concentraat) kloon JC70AAligent DakoM0823
DekglasplaatjesFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (VECTASHIELD Antifade Mounting Medium met DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
DeparaffineringsoplossingQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS, 1×), Dulbecco's formule, zonder calcium, zonder magnesium
DPX monteermiddel voor histologieSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Ethylenediaminetetraazijnzuur, (EDTA), 0,5 M oplossing, moleculaire biologie graad, ultrapuur
Inbedstation Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Emcn-antilichaam (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Ensembl referentiegenoom (GRCh38 / mm10, release 105)EMBL-EBIN/AReferentiegenoom gebruikt voor read-alignment.
EosineMillipore SigmaHT110116
EthanolMillipore SigmaE7023-500MLChirurgische scharen
Falc Instruments B-I histologie waterbadFalc610.1030.00
Formaline 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldehyde 3,7%–4,0% w/v gebufferd tot pH = 7 en gestabiliseerd met methanol (CE-IVD) voor klinische diagnostiek
Kleurrek voor glazen objectglaasjes WHEATONZ710970-3EA
Glazen kleurpotten BRANDBR472200-10EAMastercycler  X50
GlycerolSigma-AldrichC3H803
Geit anti-muis IgG (H+L) cross-adsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Geit anti-muis IgG (H+L) sterk cross-adsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Geit anti-konijn IgG (H+L) sterk cross-adsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hematoxyline Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Beoordeling van de RNA-integriteit
High Sensitivity RNA ScreenTape LadderAgilent5067-5581Beoordeling van de RNA-integriteit
High Sensitivity RNA ScreenTape monstertbufferAgilent5067-5580Beoordeling van de RNA-integriteit
Hoge-resolutie microscoop Leica BiosystemsN/AAperio CS2 Scanner
Zoutzuur (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
Illumina NextSeq 2000 platformIllumina20038897
Invitrogen geit anti-rat IgG (H+L) cross-adsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Iris-schaar - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Isofluraan
Lithiumcarbonaat Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsN/ASoftware gebruikt voor het visualiseren van HE-beelden en het cureren van Visium-spots; opent .cloupe-bestanden gegenereerd door de analyse-pipeline.
Metalen inbedmallenBio-Optica07-BM24256
Microscoopglaasjesavantor631-0108Superfrost Plus microscoopglaasjes
MicrotoomesmessenFEATHERFEAT207500006_U
Microtoom HM 340EEprediaN/AModel HM 340E
NaaldBD301156BD Microlanc 3 naald 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Brightfield lichtmicroscoop
Paraffine PanReac AppliChem256993Paraffine M.P. 55–58°C geplastificeerd + DMSO pellets (CE-IVD) voor klinische diagnostiek
Petrischaal CorningCLS430167-100EA
Plastic inbedmallen Bio-Optica07-MP7070
Potts-Smith pincetF.S.T 11012-18Pincet
Qubit 3.0 fluorometerInvotrogen Q33216
Qubit assaybuisjesInvotrogen Q32856
Qubit RNA HS assaykitInvotrogen Q32855
RNAse-vrij 1,5 mL microcentrifugebuisjeThermo Scientific AM12400
RNase-vrij water MerkW4502
RNaseZap RnaseInvotrogen AM9780Decontaminatieoplossing
RNeasy FFPE-kit (50)Qiagen73504Totale RNA-extractie
SCTransform (v0.3.5)Satija LabN/AVariantie-stabiliserende normalisatiemethode geïmplementeerd in Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Satija LabN/AR-package gebruikt voor single-cell en ruimtelijke transcriptomics-analyse.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsN/ASoftware gebruikt voor demultiplexing, alignment en generatie van feature-barcode matrices voor Visium-datasets.
Stlime scalpel Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Bergen LabN/AR-package gebruikt voor ruimtelijke transcriptomics-visualisatie en integratie.
Chirurgisch scalpelmes No. 23Swann-Morton210Chirurgische scalpelmessen
Thermocycler Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Multispectrale imaging-platform voor IF-visualisatie
Visium Accessory Kit 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Visium Mouse Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
XyleenPanreac214736Xyleen, mengsel van isomeren voor analyse, ACS, ISO

Referenties

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FFPE monstersEDTA decalcificatieweefselcoupesRNA integriteitceltype identificatieweefselmorfologiegenexpressieanalysesingle cell integratie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen