Dit protocol demonstreert de evaluatie van Modified Xiaoyao San in een muismodel van depressie geïnduceerd door chronische onvoorspelbare milde stress, inclusief gedragsmatige, histologische en moleculaire beoordelingen van neuronale necroptose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Gemodificeerde Xiaoyao San verbetert depressie-achtige symptomen en neuronale necroptose in een muismodel van chronische onvoorspelbare milde stress
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neuraal verlies en beschadiging zijn belangrijke pathologische kenmerken van depressie, en necroptose is voorgesteld als een potentieel mechanisme van neuronale celdood. Analyse van Gene Expression Omnibus (GEO) datasets (GSE54565, GSE54566 en GSE54568) identificeerde een associatie tussen depressie en necroptose, wat suggereert dat inhibitie van deze route een potentiële therapeutische strategie kan vormen. Modified Xiaoyao San (MXYS), een aangepaste formulering van de traditionele Chinese geneeskunde Xiaoyao San, werd ontwikkeld door kruiden toe te voegen die hitte klaren, het bloed koelen, de cognitie verbeteren en reanimatie bevorderen om de therapeutische effectiviteit te verhogen. De effecten ervan op neuronale necroptose en de actieve bestanddelen die het hersenweefsel bereiken, blijven echter onduidelijk. Ultra-high-performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge-resolutie massaspectrometrie (UHPLC-HRMS) werd gebruikt om de in hersenweefsel gedetecteerde bestanddelen van MXYS voorlopig te identificeren. De therapeutische effectiviteit werd geëvalueerd in een muismodel van depressie met chronische onvoorspelbare milde stress (CUMS) middels gedragsbeoordelingen, histologisch onderzoek, immunofluorescentie, western blotting en bio-informatische analyses. Toediening van MXYS was geassocieerd met verbeterde depressie-achtige symptomen, vermindering van pathologische hersenschade en een afname van de fosforylering van receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL). Deze bevindingen suggereren dat MXYS antidepressieve effecten uitoefent die geassocieerd zijn met een vermindering van markers voor neuronale necroptose, wat experimentele ondersteuning biedt voor verder onderzoek naar MXYS als een potentiële therapeutische strategie voor depressie.
Inleiding
Depressie, een ernstige geestesstoornis binnen het spectrum van stemmingsstoornissen, wordt primair gekenmerkt door een aanhoudende sombere stemming en wordt beïnvloed door meerdere factoren1. Klinisch vertonen patiënten met depressie vaak symptomen zoals een depressieve stemming, cognitieve vertraging, verminderde verbale communicatie en fysieke activiteit en, in ernstige gevallen, zelfbeschadigend gedrag en suïcidale gedachten2. Vanwege de hoge prevalentie, recidieven, invaliditeit en suïcidecijfers is depressie een van de belangrijkste oorzaken van handicap wereldwijd en brengt het aanzienlijke sociale en economische lasten met zich mee3. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie wordt verwacht dat depressie tegen 2030 de grootste bijdrager zal zijn aan de wereldwijde ziektelast, waarmee het kanker en cardiovasculaire en cerebrovasculaire ziekten zal overtreffen3. Daarnaast werd de pandemie van het coronavirus 2019 (COVID-19) geassocieerd met een toename van 27,6% in de wereldwijde prevalentie van een majeure depressieve stoornis4. In China is de jaarlijkse prevalentie van depressie 3,6%, met een prevalentie gedurende het hele leven van 6,8%5. De pathogenese van depressie is nog niet volledig begrepen vanwege de complexe etiologie en de uiteenlopende bijdragende factoren. Bijgevolg blijven de behandelingsopties beperkt, en ongeveer 30%–40% van de patiënten ontwikkelt een behandelresistente depressie door een inadequate respons op de momenteel beschikbare antidepressiva6. Bovendien blijven het vertraagde begin van de werking, residuele symptomen, neurotoxiciteit en bijwerkingen die geassocieerd worden met bestaande antidepressiva belangrijke therapeutische uitdagingen vormen7.
Geprogrammeerde celdood is al lange tijd een belangrijk focuspunt van biomedisch onderzoek. Toenemend bewijs suggereert dat depressie geassocieerd is met necroptose8,9,10,11. Necroptose is, net als apoptose, een vorm van geprogrammeerde celdood; echter, in tegenstelling tot apoptose, roept het uitgesproken immuun- en ontstekingsreacties op12. Bij afwezigheid van caspase-8-activiteit bindt tumornecrosefactor-α (TNF-α) aan tumornecrosefactorreceptor 1 (TNFR1), wat resulteert in de activering van receptor-interagerend proteïnekinase 1 (RIPK1)13. Geactiveerd RIPK1 interageert met receptor-interagerend proteïnekinase 3 (RIPK3) om het necrosome-complex te vormen, dat vervolgens mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) activeert14. Na oligomerisatie transloceert MLKL van het cytoplasma naar het plasmamembraan, wat leidt tot zwelling van organellen15,16, verstoring van de integriteit van het celmembraan en vrijgave van intracellulaire inhoud, waaronder damage-associated molecular patterns (DAMPs) en ontstekingsmediatoren zoals TNF-α, interleukine (IL)-1 en IL-6, waardoor ontstekingsreacties worden verergerd17. Necroptose is betrokken bij talrijke inflammatoire en neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder multiple sclerose, depressie, amyotrofische laterale sclerose, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer18,19,20. Proteomische analyses hebben aangetoond dat door chronische onvoorspelbare milde stress (CUMS) geïnduceerde depressie geassocieerd is met een verhoogde expressie van RIPK3 en MLKL en activering van de necroptose-route2. In een ander CUMS-muismodel voor depressie vertoonde fluoxetine antidepressieve effecten die geassocieerd waren met remming van RIPK1-gemedieerde necroptose10. Bovendien is aangetoond dat Nec-1s, een remmer van necroptose, lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerd depressie-achtig gedrag verbetert21. Omdat neuronale beschadiging een belangrijk pathologisch kenmerk van depressie is, kan het targeten van necroptose een veelbelovende therapeutische strategie vormen voor de behandeling van depressie.
Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) heeft een lange geschiedenis in de behandeling van depressie. Volgens de TCM-theorie reguleert de lever de vrije stroom van qi; depressie wordt daarom primair toegeschreven aan emotionele stress die leidt tot stagnatie van lever-qi. Bijgevolg is de belangrijkste therapeutische strategie het kalmeren van de lever en het verlichten van de depressie. Xiaoyao San (XYS) is een klassiek kruidenrecept dat hiervoor veelvuldig wordt gebruikt, en uitgebreid bewijs ondersteunt de toepassing ervan bij de behandeling van depressie22. Bovendien is gerapporteerd dat XYS anti-necroptotische eigenschappen bezit23,24. Op basis van de TCM-concepten van "leverdepressie die overgaat in vuur" en "heldere yang die naar de hersenen stijgt", werd XYS gemodificeerd door de toevoeging van Moutan Cortex (Mudan Pi) en Gardeniae Fructus (Zhizi) om hitte te klaren en het bloed te koelen, samen met Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) en Polygalae Radix (Yuan Zhi) om de cognitieve functie en het herstel te bevorderen. De resulterende formulering werd Modified Xiaoyao San (MXYS) genoemd en werd ontwikkeld om verbeterde therapeutische effecten te bieden op basis van TCM-principes. Een directe vergelijking met de oorspronkelijke XYS-formulering is in deze studie echter niet uitgevoerd25. Klinische studies hebben de antidepressieve effectiviteit van MXYS aangetoond26,27,28, en de therapeutische effecten kunnen geassocieerd zijn met regulatie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier-as (HPA-as) en remming van neuro-inflammatie29,30,31. Desondanks blijft onduidelijk of MXYS geassocieerd is met een vermindering van neuronale necroptose.
In de huidige studie werd ultra-hogeprestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge-resolutie massaspectrometrie (UHPLC-HRMS) gebruikt om MXYS-afgeleide verbindingen die in hersenweefsel zijn gedetecteerd, voorlopig te identificeren. Openbaar beschikbare Gene Expression Omnibus (GEO) datasets en bio-informatische analyses, waaronder weighted gene co-expression network analysis (WGCNA), differentiële expressieanalyse en verrijkingsanalyse, werden gebruikt om de associaties tussen MXYS, depressie en necroptose te onderzoeken. Op basis van deze bevindingen hebben we verondersteld dat MXYS antidepressieve effecten kan uitoefenen die geassocieerd zijn met verminderde markers van neuronale necroptose, waarbij de activating transcription factor 4 (ATF4)/cAMP response element-binding protein (CREB)/brain-derived neurotrophic factor (BDNF) route een kandidaat-correlatief mechanisme vertegenwoordigt. Om deze hypothese te evalueren, werden verbindingen gedetecteerd in hersenweefsel voorlopig geïdentificeerd met behulp van UHPLC-HRMS, werden bio-informatische analyses uitgevoerd om potentiële therapeutische doelwitten te identificeren, en werden in vivo experimenten uitgevoerd om te onderzoeken of een behandeling met MXYS geassocieerd is met veranderingen in necroptosemarkers en de ATF4/CREB/BDNF route. Deze bevindingen leveren preliminaire bewijzen voor de potentiële therapeutische toepassing van MXYS bij depressie, terwijl wordt erkend dat vergelijkende studies met de oorspronkelijke XYS-formulering en dosis-responsvalidatie noodzakelijk blijven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierproeven zijn goedgekeurd door de commissie voor dierethiek van de Henan University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer DWLLGZR202200023). Alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen voor dierenwelzijn en voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen. Mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten werden verkregen van een erkende leverancier van laboratoriumdieren. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid met een licht/donkercyclus van 12 u en kregen standaardvoer en water ad libitum.
Identificatie van de componenten van MXYS in hersenweefsel
Bereiding van gevriesdroogd MXYS-poeder:
De 11 kruiden van MXYS werden gedurende 2 h geweekt in 10 volumes gedestilleerd water en vervolgens 40 min gekookt. Pepermunt werd toegevoegd tijdens de laatste 5 min van het kookproces. Een tweede decoct werd op dezelfde wijze bereid met gebruik van 8 volumes gedestilleerd water. De twee decocten werden gecombineerd, gefiltreerd door gaas, onder vacuüm geconcentreerd tot een concentratie van 1 g/mL (ruw drug-equivalent) en gedurende 48 h gevriesdroogd onder vacuüm om gevriesdroogd MXYS-poeder te verkrijgen. Het extractieopbrengst was 21,7% (w/w)25,29,31.
Dieren en toediening van MXYS:
Twaalf mannelijke SD-ratten werden willekeurig toegewezen aan twee groepen en kregen tweemaal daags MXYS of gezuiverd water toegediend via orale gavage. De twee dagelijkse toedieningen vonden plaats om 8:00 uur en 20:00 uur (interval van 12 u). Het MXYS-poeder werd opgelost in gezuiverd water en toegediend in een dosering van 24,4 g/kg (ongeveer tweemaal de klinische dosis voor ratten)25. De controlegroep kreeg gezuiverd water in een equivalent volume (10 mL/kg).
Voorbereiding van hersenweefsel bevattend MXYS:
Na 14 dagen werden alle ratten geanestheseerd met natriumpentobarbital (40 mg/kg, intraperitoneaal) 2 u na de laatste toediening van MXYS. Hersenweefsels werden verzameld na transcardiale perfusie met normale zoutoplossing. De volledige hersenen werden onmiddellijk verwijderd en op ijs geplaatst om blanco hersenweefsel en met MXYS behandelde hersenweefselmonsters te verkrijgen.
Chromatografische/massaspectrometriecondities en database:
Gevriesdroogd MXYS-poeder, blanco hersenweefsel gespike met MXYS-poeder, blanco hersenweefsel en hersenweefselextracten met MXYS werden geanalyseerd met een ultra-high-performance vloeistofchromatografiesysteem uitgerust met een HSS-T3 kolom (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) bij een temperatuur van 35°C. De mobiele fasen bestonden uit water met 0,1% mierenzuur (mobiele fase A) en acetonitril met 0,1% mierenzuur (mobiele fase B). De monsters werden gescheiden bij een stroomsnelheid van 0,3 mL/min met een gradiënt van 5% B gedurende 1 min, toenemend naar 98% B over 16 min, terugkerend naar 5% B in 0,5 min, en vastgehouden op 5% B gedurende 2,5 min.
Massaspectra werden verkregen in zowel positieve als negatieve electrospray-ionisatiemodi met behulp van data-afhankelijke acquisitie over een m/z bereik van 90–1.300. MS/MS-spectra werden gegenereerd van de 10 meest intense precursor-ionen met behulp van stapsgewijze higher-energy collisional dissociation-botsingsenergieën van 20, 40 en 60 eV. De capillaire temperatuur werd gehandhaafd op 320°C en de temperatuur van de probe-verwarmer werd ingesteld op 350°C.
Annotatie van verbindingen werd uitgevoerd door de exacte massa, isotopenverdeling en MS/MS-spectra te matchen met een interne database voor traditionele Chinese geneeskunde en de openbare GNPS32, ReSpect33 en MassBank34 databases. Verbindingen met betrouwbare MS/MS-matching en consistente chromatografische piekvormen werden behouden. De volledige lijst van voorlopig geïdentificeerde verbindingen is opgenomen in Aanvullende Tabel 1.
Bio-informatica
Selectie en preprocessing van datasets uit de GEO-database:
De potentiële betrokkenheid van necroptose bij de pathologie van depressie werd onderzocht door in de GEO-database te zoeken op het trefwoord “depression”. Op basis van de selectiecriteria werden drie datasets (GSE54566, GSE54565 en GSE54568) geïdentificeerd voor verdere analyse. De datasets waren afkomstig uit verschillende hersenregio's: GSE54565 (anterior cingulate cortex), GSE54566 (amygdala) en GSE54568 (dorsolaterale prefrontale cortex, BA9). Alle datasets werden gegenereerd met het Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array-platform (GPL570) en bestonden uit postmortem hersenweefselmonsters van patiënten met een depressieve stoornis (MDD) en niet-psychiatrische controles. Gedetailleerde monsterkenmerken voor elke dataset zijn samengevat in Supplementary Table 2. Deze datasets bevatten transcriptomische gegevens van drie hersenregio's die betrokken zijn bij depressie. Voor elke dataset werd een differentieel genexpressie-analyse uitgevoerd tussen de MDD- en controlegroepen, en consistent opgereguleerde en neergereguleerde genen werden geïntegreerd met behulp van het Robust Rank Aggregation (RRA) R-pakket.
Alle datasets werden vooraf verwerkt met behulp van het robust multi-array average (RMA) algoritme voor achtergrondcorrectie en normalisatie. Na de RMA-normalisatie werd het ComBat-algoritme, geïmplementeerd in het sva R-pakket, toegepast om batch-effecten tussen datasets te corrigeren, waarbij de herkomst van de dataset als batch-covariaat werd behandeld. Deze procedure verminderde de technische variatie tussen de datasets en verbeterde de vergelijkbaarheid voor downstream-analyses.
Bio-informatische analyses werden uitgevoerd met R-software (versie 4.2.1). De belangrijkste R-pakketten waren ClusterProfiler (versie 4.8.2) voor Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses, WGCNA (versie 1.72) voor gewogen gen-co-expressienetwerkanalyse, RRA voor integratie van differentieel tot expressie gebrachte genen, en sva (versie 3.48.0) voor ComBat-batchcorrectie. De analytische workflow omvatte data-acquisitie, RMA-normalisatie, ComBat-batchcorrectie, differentieel expressie-analyse met RRA-integratie, constructie van WGCNA-modules, GO- en KEGG-verrijkingsanalyses met een false discovery rate (FDR) < 0.05, en targetvoorspelling met proteïne-proteïne interactie (PPI) netwerkanalyse.
Gebruik van WGCNA voor de constructie van co-expressienetwerken van genen en het identificeren van modules die significant geassocieerd zijn met depressie en necroptose:
WGCNA construeert gewogen co-expressienetwerken van genen door een soft-thresholding power (β-waarde) toe te passen om een schaalloze topologie te benaderen. De β-waarde werd geselecteerd wanneer de correlatiecoëfficiënt tussen log(k) en log(p(k)) ten minste 0,9 bereikte. Na selectie van de β-waarde werden genmodules geïdentificeerd met behulp van de dynamic tree cut-methode. Aanvullende parameters werden als volgt ingesteld: minModuleSize = 30, cutHeight = 0,25 en deepSplit = 2. De β-waarde werd geselecteerd wanneer de correlatiecoëfficiënt tussen log(k) en log(p(k)) ten minste 0,9 bereikte. Voor de constructie van het netwerk werd een soft-thresholding power van β = 7 gebruikt. Voor elke module werd de Module Eigengene (ME) berekend om genexpressiepatronen samen te vatten en associaties met biologische kenmerken te evalueren. Vervolgens werden de Gene Significance (GS) en Module Membership (MM) berekend, en werden module-kenmerkrelaties geëvalueerd met behulp van de correlatiecoëfficiënt (cor) en de bijbehorende p-waarde. Hogere correlatiecoëfficiënten en lagere p-waarden duidden op sterkere associaties tussen genmodules en biologische kenmerken.
Functionele verrijkingsanalyse en constructie van het PPI-netwerk:
ClusterProfiler werd gebruikt om de KEGG-pathway-verrijkingsanalyse uit te voeren. De Benjamini–Hochberg FDR-methode werd toegepast voor correctie voor meervoudig testen, en een aangepaste p-waarde (FDR) < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Na het identificeren van de doelmodule werden sleutelgenen binnen de module gekruist met genen geassocieerd met MXYS en necroptose. Vervolgens werd een PPI-netwerk geconstrueerd met behulp van de STRING-database.
Doelwitvoorspelling voor verbindingen gedetecteerd in hersenweefsel:
De 143 verbindingen die voorlopig waren geïdentificeerd in rattenhersenweefsel na toediening van MXYS werden gebruikt voor doelwitvoorspelling. Voor elke verbinding werden potentiële doelwitten opgehaald uit de GeneCards-database met behulp van de Related Targets-functie met een relevantiescore > 5. Dubbele doelwitten werden samengevoegd en alleen menselijke genen met officiële gensymbolen werden behouden, wat resulteerde in 3.164 unieke doelwitten. Deze doelwitten werden onderworpen aan GO- en KEGG-verrijkingsanalyses met behulp van het ClusterProfiler R-pakket, waarbij een FDR < 0,05 als statistisch significant werd beschouwd. De achtergrondgenenset bestond uit alle menselijke eiwitcoderende genen die zijn geannoteerd in de KEGG-database.
Experimentele Verificatie
Celkweek:
HT-22 cellen zijn verkregen van Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) en gekweekt in groeimedium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FBS) en 100 U/mL penicilline/streptomycine. Cellen werden onderhouden bij 37°C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
Anti-necroptotische activiteit van MXYS:
Gevriesdroogd MXYS-poeder werd gereconstitueerd in celgroeimedium tot een concentratie van 1,0 g/mL, gesteriliseerd door een 0,22 μm membraanfilter en bewaard bij −20°C tot gebruik. HT-22-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 8.000 cellen per well in 96-well platen, met drie wells per groep. MXYS werd verdund in groeimedium tot uiteindelijke concentraties van 2, 4 en 6 mg/mL. Na incubatie gedurende 12 u werden de cellen 30 min behandeld met SM-164 hydrochloride (10 nM) en de caspase-remmer z-VAD-fmk (20 μM), gevolgd door stimulatie met menselijke tumornecrosefactor-α (h-TNF-α; 20 ng/mL) gedurende nog eens 12 u. De celviabiliteit werd beoordeeld met een luminescente celviabiliteitsassay volgens de instructies van de fabrikant. Luminescentie werd gemeten met een microplate reader. De celmorfologie werd onderzocht met een geïnverteerde microscoop, en representatieve beelden werden vastgelegd voor analyse.
Dieren:
De dierproeven zijn goedgekeurd door de Commissie voor Dierethiek van de Henan University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer DWLLGZR202200023). Alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen voor dierenwelzijn en voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen. Voor de vestiging van het CUMS-model zijn uitsluitend mannelijke BALB/c-muizen in de leeftijd van 6–8 weken gebruikt. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid met een licht/donkercyclus van 12 u en kregen ad libitum standaardvoer en water.
CUMS-geïnduceerd depressiemodel:
Muizen werden willekeurig toegewezen aan een controlegroep of een CUMS-groep. Na één week acclimatisatie werden de muizen in de CUMS-groep blootgesteld aan intermitterende en onvoorspelbare milde stressoren, terwijl de controlemuizen ongestoord bleven. Het stressparadigma bestond uit 13 verschillende stressoren, waaronder het kantelen van de kooi, het schudden van de kooi, kooiwisseling, natte strooisel, waterdeprivatie, stroboscopische verlichting, blootstelling aan lawaai, constant licht, constante duisternis, intermitterende verlichting, zwemmen in koud water (4°C), zwemmen in warm water (40°C), immobilisatiestress en andere milde stressoren. Elke stressor werd gedurende 2–6 h per sessie toegepast in een gerandomiseerde volgorde om de onvoorspelbaarheid te waarborgen. Muizen werden dagelijks blootgesteld aan één of twee verschillende stressoren volgens een gerandomiseerd schema.
Groepen en drugbehandeling:
Na zes weken blootstelling aan CUMS werden de muizen willekeurig toegewezen aan de CUMS-, MXYS-, paroxetine- of Nec-1-behandelingsgroepen. De MXYS-groep kreeg gevriesdroogd MXYS-poeder via orale gavage in een dosis van 35,2 g/kg/dag. De paroxetine-groep kreeg paroxetine (20 mg/kg) via orale gavage, terwijl de Nec-1-groep Nec-1 (10 mg/kg) kreeg via intraperitoneale injectie gedurende vier opeenvolgende weken. Gedurende dezelfde periode kregen de controle- en CUMS-groepen een equivalent volume normale zoutoplossing via orale gavage.
Gedragsexperimenten:
Muizen werden vóór het begin van de toediening van het geneesmiddel willekeurig toegewezen aan experimentele groepen aan de hand van een door de computer gegenereerde reeks willekeurige getallen. De randomisatiesequentie werd gegenereerd door een onafhankelijke onderzoeker die niet betrokken was bij de daaropvolgende experimenten of data-analyse.
Gedragstests werden uitgevoerd door een onderzoeker die niet op de hoogte was van de behandelingsgroepen. Dezelfde onderzoeker voerde de videogebaseerde gedragsscoring uit (immobiliteitstijd, afgelegde afstand en tijd doorgebracht in het centrum) met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware om subjectieve bias te minimaliseren. De geblindeerde onderzoeker had geen toegang tot de groepsallocatiecodes totdat alle gedragsgegevens waren verzameld en geregistreerd.
Immunofluorescentie-analyses werden uitgevoerd door een aparte onderzoeker die eveneens geblindeerd was voor de experimentele groepen. Monsters werden gelabeld met gecodeerde identificatoren, en de groepsindeling werd pas onthuld nadat de densitometrische metingen of metingen van de fluorescentie-intensiteit waren voltooid. Statistische analyses werden uitgevoerd door een derde onderzoeker die geblindeerd was voor zowel de groepsindeling als de bijbehorende experimentele resultaten totdat alle kwantitatieve gegevens waren verzameld.
Sucrosevoorkeurstest (SPT): Gedragstests werden uitgevoerd na de laatste toediening van het medicijn. Voorafgaand aan de tests werden de muizen gewend aan een 1% sucrose-oplossing door gedurende 12 uur twee flessen met een 1% sucrose-oplossing aan te bieden, gevolgd door nog eens 12 uur waarbij één fles een 1% sucrose-oplossing bevatte en één fles drinkwater. De muizen werden vervolgens 12 uur vóór de formele test onthouden van voedsel en water. Tijdens de test kreeg elke muis één fles met een 1% sucrose-oplossing en één fles met drinkwater. Na 12 uur werd het geconsumeerde volume uit elke fles gemeten. De sucrosevoorkeur werd als volgt berekend:
Tail Suspension Test (TST): De staart van elke muis werd met plakband aan de bovenkant van het testapparaat bevestigd. Het gedrag van de muizen werd gedurende 6 min vastgelegd met behulp van software voor gedragsvideo-registratie en -analyse. De duur van de immobiliteit tijdens de laatste 4 min van de test werd gekwantificeerd.
Open Field Test (OFT): Elke muis werd individueel in het midden van de open-field apparatus geplaatst. De gedragsactiviteit, waaronder de locomotieafstand en bewegingsactiviteit, werd gedurende 5 min geregistreerd en geanalyseerd met behulp van software voor gedragsregistratie. Na elke test werd de apparatus gereinigd met 75% ethanol.
Monsterverzameling:
Muizen die stierven tijdens de CUMS-procedure of tekenen van ernstige ziekte vertoonden (bijv. >20% gewichtsverlies, zichtbare infectie of onvermogen om te bewegen) werden uitgesloten van de studie. Euthanasie werd uitgevoerd door gecertificeerd personeel met een overdosis natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneaal). Na het verlies van het bewustzijn werd cervicale dislocatie uitgevoerd als secundaire methode om de dood te bevestigen. Voor Nissl-kleuring en immunofluorescentie-analyses werden willekeurig drie muizen per groep geselecteerd. Hippocampusweefsels voor western blot-analyse werden onmiddellijk op ijs gedisseceerd en snel ingevroren in vloeibare stikstof.
Nissl-kleuring:
Voor Nissl-kleuring en immunofluorescentie-analyses werden muizen diep genarceerd met natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneaal) en gedecapiteerd zonder transcardiale perfusie. De hersenen werden snel verwijderd en gedurende 24–48 u gefixeerd in 4% paraformaldehyde voorafgaand aan de inbedding in paraffine. Paraffinesneden werden gesneden met een dikte van 3 μm. Paraffinesneden werden gedeparaffineerd door opeenvolgende incubatie in ontwasoplossing, absolute ethanol en 75% ethanol, gevolgd door spoelen met stromend water. Indien van toepassing werden cryosneden op kamertemperatuur gebracht, 15 min gefixeerd met weefselfixatief en gespoeld met stromend water. Weefselsneden werden gedurende 2–5 min gekleurd met Nissl-kleuringsoplossing, gespoeld met water, gedifferentieerd met 0,1% glaciaal azijnzuur, gewassen om de reactie te stoppen, microscopisch gecontroleerd om de differentiatie te bewaken, gedroogd, gedurende 10 min geklaard in xyleen en gemonteerd met een neutraal montagemedium.
Immunofluorescentie:
De procedures voor immunofluorescentie werden uitgevoerd volgens standaardmethoden. Hersenweefsel werd gefixeerd in 4% paraformaldehyde en ingebed in paraffine voor immunofluorescentiekleuring. Weefselsneden werden overnacht bij 4°C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) en CREB (1:1000). Na incubatie met de primaire antilichamen werden de sneden vier keer gewassen met PBS en gedurende 1 u in het donker geïncubeerd met de overeenkomstige fluorescerende secundaire antilichamen: CY3-geconjugeerd geiten anti-muis IgG (1:300, Servicebio, GB21301) voor muis anti-ATF4; Alexa Fluor 488-geconjugeerd geiten anti-muis IgG (1:400, Servicebio, GB25301) voor muis anti-MLKL; CY3-geconjugeerd geiten anti-konijn IgG (1:300, Servicebio, GB21303) voor konijn anti-NeuN; en Alexa Fluor 488-geconjugeerd geiten anti-konijn IgG (1:400, Servicebio, GB25303) voor konijn anti-CREB. De sneden werden vervolgens 10 min bij kamertemperatuur gekleurd met DAPI, gewassen met PBS, gemonteerd met een antifade montagemedium, waarna fluorescentiebeelden werden vastgelegd met behulp van confocale microscopie.
Western blot:
Hersenweefsels werden gehomogeniseerd in radioimmunoprecipitatie-assay (RIPA) lysisbuffer. De eiwitconcentraties werden bepaald, waarna 20 μg totaal eiwit per lane werd gescheiden via 10% sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) voorafgaand aan overdracht op polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen. Na blokkering werden de membranen gedurende de nacht bij 4°C geïncubeerd met primaire antilichamen (1:1000), gevolgd door incubatie met horseradishperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 h. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met een chemiluminescentie-beeldvormingssysteem en de bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software. Voor de western blot-analyse van hippocampusweefsels werden twee muizen per groep geanalyseerd; representatieve immunoblots worden getoond. Voor de HT-22 cel-experimenten werd de western blot-analyse één keer uitgevoerd als representatief experiment. Deze gegevens worden gepresenteerd als kwalitatieve trendobservaties in plaats van statistisch gekwantificeerde resultaten.
Statistische analyse:
Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met behulp van eenweg-variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de multiple comparison test van Tukey. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Een p-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Beschikbaarheid van gegevens:
De datasets die tijdens deze studie zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en de bijbehorende aanvullende materialen. De resultaten van de UHPLC-HRMS verbindingidentificatie worden gepresenteerd in Aanvullende Tabel 1, en de kenmerken van de GEO-datasets die zijn gebruikt voor de bioinformatische analyses zijn samengevat in Aanvullende Tabel 2. Aanvullende ondersteunende gegevens, waaronder GFAP-immunofluorescentie (Aanvullende Figuur 1), immunofluorescentiekleuring van p-RIPK3 en p-MLKL (Aanvullende Figuur 2), het experimentele ontwerp en de tijdlijn van de dierentoewijzing (Aanvullende Figuur 3), en de oorspronkelijke onbijgesneden western blot-afbeeldingen (Aanvullende Figuur 4), zijn beschikbaar in de aanvullende materialen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
WGCNA identificeert een depressie-geassocieerde genmodule verrijkt in het necroptose-pad
Het RRA-pakket werd gebruikt om consistent opgereguleerde en neereguleerde differentieel tot expressie gebrachte genen uit de datasets GSE54566, GSE54565 en GSE54568 te integreren, wat resulteerde in de identificatie van 2.513 genen. Een heatmap van deze genen is weergegeven in Figuur 1A. De drie datasets waren afkomstig uit verschillende hersenregio's — de anterior cingulate cortex,...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Abnormale neuronale dood speelt een cruciale rol in de pathogenese van depressie8. Necroptose, een vorm van geprogrammeerde celdood, is uitgebreid onderzocht, wat heeft geleid tot belangrijke vorderingen in de ontwikkeling van remmers die op deze route zijn gericht39. Sinds de identificatie van de necroptoseremmer Nec-1 in 200540 is er aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van verbindingen die zich richten op sleutelcomponenten van de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Belangenverstrengeling:
De auteurs hebben niets te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Key Scientific Research Project of Henan Higher Education Institutions of China (No. 26A360008), het Scientific Research Project of Traditional Chinese Medicine of Henan Province (No. 2025ZY3152), de National Natural Science Foundation of China (No. 82274496), het Science and Technology Research Project of Henan Province (No. 232301420018) en het Zhang Zhongjing Inheritance and Innovation Project of the Science and Technology Department of the National Administration of Traditional Chinese Medicine (No. GZY-KJS-2022-044-1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acori Tatarinowii Rhizoma (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 231001 | Kruidensamenstelling (12 g) |
| Kleefband | Niet van toepassing | Niet van toepassing | Staartophangingstest |
| Angelicae Sinensis Radix (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | G01230507-16 | Kruidensamenstelling (10 g) |
| Anti-ATF4 antilichaam (immunofluorescentie) | Servicebio | GB111137 | Primair antilichaam |
| Anti-ATF4 antilichaam (western blot) | MedChemExpress | HY-P80486 | Primair antilichaam |
| Anti-BDNF antilichaam | MedChemExpress | HY-P80567 | Primair antilichaam voor western blot |
| Anti-CREB antilichaam | Beyotime | AF1018 | Primair antilichaam voor western blot en immunofluorescentie |
| Anti-GAPDH antilichaam | Abcam | ab181602 | Loadingcontrole |
| Anti-MLKL antilichaam | Proteintech | 66675-1-Ig | Primair antilichaam voor western blot en immunofluorescentie |
| Anti-NeuN antilichaam | Servicebio | GB11138 | Primair antilichaam voor immunofluorescentie |
| Anti-fosfo-CREB antilichaam | Beyotime | AF5785 | Primair antilichaam |
| Anti-fosfo-MLKL antilichaam | Bioss | bsm-54104R | Primair antilichaam |
| Anti-fosfo-RIPK1 antilichaam | Biolynx | BX60008 | Primair antilichaam |
| Anti-fosfo-RIPK3 antilichaam | Abcam | ab195117 | Primair antilichaam |
| Anti-RIPK1 antilichaam | Cell Signaling Technology | 3493S | Primair antilichaam |
| Anti-RIPK3 antilichaam | Proteintech | 17563-1-AP | Primair antilichaam |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Kruidensamenstelling (10 g) |
| Geautomatiseerde software voor gedragsregistratie | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | SMART 3.0 video tracking software voor open veld- en staartophangingstesten |
| BCA-proteïne assay kit | CWBIO | CW0014S | Proteïnekwantificering |
| Systeem voor gedragsregistratie | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Open veld- en staartophangingstesten |
| Bio-Rad chemiluminescentie-beeldvormingssysteem | Bio-Rad | 12003154 | ChemiDoc MP Imaging System voor chemiluminescentie western blot detectie |
| CellTiter-Lumi II luminescente cellevensvatbaarheidsassay kit | Beyotime | C0056XL | Cellevensvatbaarheidsassay |
| Confocale microscoop | Nikon Eclipse C1 | N/A | Immunofluorescentie-beeldvorming |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Kernkleuring |
| Milieuvriendelijke ontwasoplossing | Servicebio | G1128 | Paraffine-deparaffinisatie |
| Foetaal runderserum (FBS) | BI | C04001-500 | Supplement voor celkweek |
| Gardeniae Fructus (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22102109 | Kruidensamenstelling (12 g) |
| Glycyrrhizae Radix (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230301 | Kruidensamenstelling (3 g) |
| CY3-geconjugeerde geit anti-muis IgG | Servicebio | GB21301 | Fluorescent secundair antilichaam voor muis anti-ATF4 (IF, CY3, 1:300) |
| Alexa Fluor 488-geconjugeerde geit anti-muis IgG | Servicebio | GB25301 | Fluorescent secundair antilichaam voor muis anti-MLKL (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| CY3-geconjugeerde geit anti-konijn IgG | Servicebio | GB21303 | Fluorescent secundair antilichaam voor konijn anti-NeuN (IF, CY3, 1:300) |
| Alexa Fluor 488-geconjugeerde geit anti-konijn IgG | Servicebio | GB25303 | Fluorescent secundair antilichaam voor konijn anti-CREB (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| HRP geit anti-konijn IgG | Absin | abs20040 | Secundair antilichaam voor western blot |
| HRP-geconjugeerde muis anti-konijn IgG lichte keten | ABclonal | AS061 | Secundair antilichaam voor western blot |
| Humaan TNF-α | Novoprotein | C008 | Necroptose-inducer |
| HT-22 cellen | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| HyClone groeimedium | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Celkweekmedium |
| ImageJ | NIH | Gratis software | Bandkwantificering |
| Omgekeerde microscoop | Nikon | Eclipse Ti-SR | Celmorfologie |
| Vloeibare stikstof | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | N/A | Weefselbewaring |
| Molecular Devices microplatereader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Luminescentiemeting |
| Moutan Cortex (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 22121714 | Kruidensamenstelling (12 g) |
| Necrostatine-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | RIPK1-remmer |
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Weefselfixatie |
| Paroxetinehydrochloride hemihydraat | Aladdin | P129711 | Positieve controle |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | Wasbuffer |
| Pepermunt (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230101 | Kruidensamenstelling (6 g) |
| Penicilline–streptomycine | Gibco | 15140-122 | Antibioticum voor celkweek |
| Polygalae Radix (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 20221101 | Kruidensamenstelling (12 g) |
| Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western blot |
| Poria (Wolfiporia cocos; Fu Ling) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | D23070601 | Kruidensamenstelling (15 g) |
| Radioimmunoprecipitatie assay (RIPA) lysisbuffer | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Proteïne-extractie |
| Radix Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, China | 230801 | Kruidensamenstelling (12 g) |
| SDS-PAGE reagentia | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | Niet van toepassing | Acrylamide, bis-acrylamide, Tris, SDS, APS en TEMED in eigen beheer bereid |
| Natriumpentobarbital | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Anestheticum |
| Ultra-hogedruk vloeistofchromatografiesysteem | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC System | LC-MS analyse |
| UHPLC HSS-T3 kolom (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) | Waters | 186003539 | Chromatografische scheiding |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Pan-caspase-remmer |
Referenties
- Zhang Y, et al. Natural volatile oils derived from herbal medicines: A promising therapy way for treating depressive disorder. Pharmacol Res. 2021;164:105376.
- O’Connor EA, et al. Depression and suicide risk screening: Updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force. JAMA. 2023;329(23):2068-85.
- World Health Organization. The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization; Geneva; 2008.
- Pedrosa-Naudín MA, et al. Non-adherence to antidepressant treatment and related factors in a region of Spain: A population-based registry study. Pharmaceutics. 2022;14(12):2696.
- Huang Y, et al. Prevalence of mental disorders in China: A cross-sectional epidemiological study. Lancet Psychiatry. 2019;6(3):211-24.
- Thase ME. New medications for treatment-resistant depression: A brief review of recent developments. CNS Spectr. 2017;22(S1):39-48.
- Monteggia LM, Malenka RC, Deisseroth K. Depression: The best way forward. Nature. 2014;515(7526):200-1.
- Cao H, et al. Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Behav Brain Res. 2021;403:113261.
- Sun Y, et al. Dysmyelination by oligodendrocyte-specific ablation of Ninj2 contributes to depressive-like behaviors. Adv Sci (Weinh). 2022;9(3):e2103065.
- Zeb S, et al. Necroptotic kinases are involved in the reduction of depression-induced astrocytes and fluoxetine’s inhibitory effects on necroptotic kinases. Front Pharmacol. 2022;13:1060954.
- Duan YW, Chen SX, Li QY, Zang Y. Neuroimmune mechanisms underlying neuropathic pain: The potential role of the TNF-α-necroptosis pathway. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7191.
- Frank D, Vince JE. Pyroptosis versus necroptosis: Similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019;26(1):99-114.
- Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: An ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-14.
- Linkermann A, Green DR. Necroptosis. N Engl J Med. 2014;370(5):455-65.
- Sun L, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-27.
- Cai Z, et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014;16(1):55-65.
- Kaczmarek A, Vandenabeele P, Krysko DV. Necroptosis: The release of damage-associated molecular patterns and its physiological relevance. Immunity. 2013;38(2):209-23.
- Wallach D, Kang TB, Kovalenko A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: A historical perspective. Nat Rev Immunol. 2014;14(1):51-9.
- Yuan J, Amin P, Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019;20(1):19-33.
- Mitroshina EV, Saviuk M, Vedunova MV. Necroptosis in CNS diseases: Focus on astrocytes. Front Aging Neurosci. 2022;14:1016053.
- Gong Q, et al. RIPK1 inhibition mitigates neuroinflammation and rescues depressive-like behaviors in a mouse model of LPS-induced depression. Cell Commun Signal. 2024;22(1):427.
- Kwon TG, et al. A review of antidepressant and anxiolytic effects of Soyo-san (Xiaoyao-san) and modified Soyo-san in animal models. Phytomedicine. 2024;135:155387.
- Jiao H, et al. Xiaoyaosan ameliorates CUMS-induced depressive-like and anorexia behaviors in mice via necroptosis-related cellular senescence in the hypothalamus. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt A):116938.
- Yan ZY, et al. Antidepressant mechanism of traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan in a CUMS-induced depressed mouse model via RIPK1-RIPK3-MLKL-mediated necroptosis based on network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 2021;12:773562.
- Wu M, et al. Integration of network pharmacology and experimental verification to reveal the active components and molecular mechanism of modified Danzhi Xiaoyao San in the treatment of depression. J Ethnopharmacol. 2025;337:118739.
- Chen X, et al. Therapeutic effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder combined with intravenous human umbilical cord mesenchymal stem cells on post-stroke depression. Chin J Pathophysiol. 2019;35(12):2274-79.
- Zhang J. Clinical observation of Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets in the treatment of 30 cases of depression. New J Tradit Chin Med. 2008;40(11):48-49.
- Zhang J, Zhang B. Thirty-five patients with post-stroke depression were treated with Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets. New J Tradit Chin Med. 2006;38(3):75-76.
- Su P, et al. Modified Xiaoyao San reverses lipopolysaccharide-induced depression-like behavior through suppressing microglial M1 polarization by enhancing autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. J Ethnopharmacol. 2023;308:116659.
- Guo X, et al. Effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder on mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus of depression model rats. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 2014;20(11):119-22.
- Wang B, et al. Modified Danzhi Xiaoyaosan inhibits neuroinflammation by regulating the TRIM31/NLRP3 inflammasome in chronic unpredictable mild stress-induced depression. Exp Gerontol. 2024;187:112451.
- Wang M, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828-37.
- Sawada Y, et al. RIKEN tandem mass spectral database (ReSpect) for phytochemicals: A plant-specific MS/MS-based data resource and database. Phytochemistry. 2012;82:38-45.
- Horai H, et al. MassBank: A public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J Mass Spectrom. 2010;45(7):703-14.
- Wang M, et al. Targeting programmed cell death in inflammatory bowel disease through natural products: New insights from molecular mechanisms to targeted therapies. Phytother Res. 2024;38:4587-611.
- Huang X, et al. Shikonin overcomes drug resistance and induces necroptosis by regulating the miR-92a-1-5p/MLKL axis in chronic myeloid leukemia. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17662-80.
- Yuan J, Najafov A, Py BF. Roles of caspases in necrotic cell death. Cell. 2016;167(7):1693-704.
- Mu R, et al. Activation of TGR5 ameliorates streptozotocin-induced cognitive impairment by modulating apoptosis, neurogenesis, and neuronal firing. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:3716609.
- Gardner CR, et al. From (tool)bench to bedside: The potential of necroptosis inhibitors. J Med Chem. 2023;66(4):2361-85.
- Degterev A ,et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-19.
- Cao L, Mu W. Necrostatin-1 and necroptosis inhibition: Pathophysiology and therapeutic implications. Pharmacol Res. 2021;163:105297.
- Vissers M, et al. Safety, pharmacokinetics and target engagement of the novel RIPK1 inhibitor SAR443060 (DNL747) for neurodegenerative disorders: Randomized, placebo-controlled, double-blind phase I/Ib studies in healthy subjects and patients. Clin Transl Sci. 2022;15(8):2010-23.
- Mo K, et al. Targeting HNRNPC suppresses thyroid follicular epithelial cell apoptosis and necroptosis through m6A-modified ATF4 in autoimmune thyroid disease. Pharmacol Res. 2023;195:106933.
- Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor elevates activating transcription factor 4 (ATF4) in neurons and promotes ATF4-dependent induction of SESN2. Front Mol Neurosci. 2018;11:62.
- Tang H, Kang R, Liu J, Tang D. ATF4 in cellular stress, ferroptosis, and cancer. Arch Toxicol. 2024;98(4):1025-41.
- Pang BPS, et al. Deficiency of muscle-generated brain-derived neurotrophic factor causes inflammatory myopathy through reactive oxygen species-mediated necroptosis and pyroptosis. Redox Biol. 2024;74:103418.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.