Een uitgebreide dual-platform end-to-end workflow voor metabole profilering van gedroogde bloedmicromonsters

Samenvatting

Dit protocol presenteert een uitgebreide, end-to-end untargeted metabolomics-workflow met gebruik van Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS)-apparaten. Het doel is om het monster efficiënt te analyseren met een enkele extractie over twee complementaire analytische platforms (RP-LC-MS en GC-MS), waardoor een robuust kader wordt gecreëerd voor grootschalige, gedecentraliseerde klinische studies.

Samenvatting

Bloedmicrosampling (BµS) is ontstaan als een robuust, minimaal invasief alternatief voor traditionele venepunctie, waardoor de afname van kleine volumes monsters buiten conventionele klinische omgevingen mogelijk is. Door gedecentraliseerde bemonstering te ondersteunen en de therapietrouw van patiënten te verbeteren, kunnen deze apparaten worden geïntegreerd met geavanceerde omics-technologieën om grootschalige en longitudinale onderzoeksontwerpen te faciliteren. Een succesvolle implementatie vereist echter de optimalisatie van meerdere kritische stappen, van monstername en opslag tot extractie en analytische preparatie. In dit werk stellen wij een uitgebreide end-to-end untargeted metabolomics-workflow voor voor BµS, met de nadruk op sleutelparameters die de monsterpreparatie en analytische prestaties bepalen. Volumetrische absorptieve microsampling (VAMS)-apparaten werden geëvalueerd met behulp van twee complementaire platforms: reversed-phase vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie en gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Toepassing van de geoptimaliseerde workflow demonstreerde een brede metabolomische dekking over diverse chemische klassen, wat het potentieel van VAMS-gebaseerde bemonstering benadrukt om schaalbare, gedecentraliseerde metabolomics-studies te ondersteunen, terwijl de analytische robuustheid, reproduceerbaarheid en biologische relevantie behouden blijven.

Inleiding

Metabolomics, de systematische studie van laagmoleculaire moleculen in biologische matrices, heeft een prominente rol gekregen als een essentieel instrument voor het ontrafelen van cellulaire fenotypen en dynamische metabole toestanden^1,2. In klinische settings is bloedmetabolomics zeer veelbelovend door de diagnostische efficiëntie te verhogen en een uitgebreidere risicobeoordeling van ziekten mogelijk te maken, waarbij vaak hiaten worden opgevuld die door conventionele diagnostiek openblijven. Het vastleggen van het volledige metaboloom is echter inherent uitdagend. Gezien de enorme chemische complexiteit en de uiteenlopende concentratiebereiken van endogene metabolieten kan geen enkel enkelvoudig analytisch platform een volledige dekking bereiken, waardoor de inzet van complementaire analytische technieken essentieel is om het metabole overzicht te maximaliseren.

Bloedmicrosampling (BµS) is een minimaal invasieve techniek voor monstername waarbij een paar µL bloed wordt afgenomen. De vereenvoudigde monstername maakt flebotomie overbodig, waardoor afname aan huis mogelijk is en het comfort voor de patiënt wordt vergroot. Bovendien is aangetoond dat de overgang van een vloeibare naar een gedroogde matrix de stabiliteit van diverse labiele metabolieten verbetert en de logistiek rondom transport en opslag vereenvoudigt, aangezien lage temperaturen niet vereist zijn^3,4,5. Hoewel BµS al decennia wordt gebruikt, voornamelijk in de vorm van gedroogde bloedvlekken (Dried Blood Spots, DBS) voor de diagnose van aangeboren stofwisselingsziekten, heeft deze klassieke techniek enkele analytische nadelen. De afnameprocedure maakt kwantitatieve monstername niet mogelijk, waardoor de techniek gevoelig is voor het "hematocrieteffect", waarbij variaties in de bloedviscositeit de distributie van het bloed beïnvloeden en daarmee de kwantitatieve nauwkeurigheid in gevaar brengen. Om deze beperking te overwinnen, zijn kwantitatieve BµS-apparaten ontwikkeld. Volumetrische absorptieve microsampling (VAMS) is een recente BµS-technologie die gebruikmaakt van een polymere tip die is ontworpen om een nauwkeurig volume bloed af te nemen en de beperkingen van traditionele DBS te overwinnen^6,7,8.

Bijgevolg heeft het globale metabole profiel van BµS de afgelopen jaren een toenemende belangstelling gewekt^{9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. In gepubliceerde werken waarin BµS wordt vergeleken met traditionele matrices, worden verschillende analysetechnieken gebruikt die een breed scala aan polariteiten bestrijken, van capillaire elektroforese¹⁷ (CE) en hydrophilic interaction liquid chromatography^18,19 (HILIC) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) voor polaire verbindingen, tot reversed-phase massaspectrometrie^18,19,21 (RP-MS) voor metabolieten en lipiden met een gemiddelde polariteit. Traditionele extractiemethoden stuiten op een fundamenteel knelpunt: optimalisatie voor één enkel instrument betekent vaak dat cruciale chemische fracties worden verworpen en metabole gegevens verloren gaan. Wanneer monstervolumes zeer beperkt zijn, is het uitvoeren van meerdere afzonderlijke analyses uitdagend. De ontwikkeling van een enkel extractieprotocol dat compatibel is met meerdere analyseplatforms blijft daarom een aanzienlijke hindernis.

Deze workflow beschrijft de procedures voor de dubbele RP-LC-MS- en Gaschromatografie (GC)-analyses van VAMS-apparaten. Voor zover ons bekend is dit de eerste workflow voor ongerichte metabolische profilering van BµS die deze twee orthogonale platforms combineert met behulp van één enkele monster-extractieprocedure. Bovendien worden de meest kritische stappen benadrukt die nodig zijn om de betrouwbare en reproduceerbare acquisitie van een uitgebreid ongericht metabolisch profiel te waarborgen.

Protocol

Alle deelnemers hebben schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven voor deelname. De studie is goedgekeurd door de Onderzoeksethische Commissie van de Aristoteles Universiteit van Thessaloniki (#306272/2022).

1. Monstername

1. Was de handen van de proefpersoon met warm water om potentiële verontreinigingen te verwijderen en de doorbloeding te verhogen.
2. Reinig de vinger met een 70% ethanoloplossing. Wacht tot de oplossing op natuurlijke wijze is verdampt.
   OPMERKING: Het gebruik van jodiumhoudende desinfectiemiddelen of zeep kan de LC-MS-analyses beïnvloeden.
3. Draai de dop van een steriele, eenmalige contactgeactiveerde lancet (1,5 mm diepte) eraf. Plaats deze tegen het midden van de vingertop en druk toe.
4. Veeg de eerste bloeddruppel weg en wacht tot er een nieuwe druppel wordt gevormd.
   OPMERKING: Vanwege mogelijke contaminatie door lokale extracellulaire vloeistof weerspiegelt de eerste druppel mogelijk niet de systemische circulerende waarden.
5. Raak, zonder het apparaat uit de houder te halen, met de 20 µL tip van het VAMS-apparaat de bloeddruppel aan. Het apparaat moet verticaal boven het monster worden geplaatst. Vermijd dat de tip volledig in het bloed wordt ondergedompeld, omdat dit kan leiden tot oversampling.
   OPMERKING: Bij afname uit een buis met veneus bloed, zoals in een laboratoriumomgeving noodzakelijk kan zijn, moet ervoor worden gezorgd dat de tip alleen het oppervlak van de vloeistof raakt, zonder deze onder te dompelen, om oversampling te voorkomen.
6. Nadat de tip verzadigd is (te herkennen aan het feit dat deze volledig rood is geworden), houdt u deze nog twee seconden op zijn plaats en verwijdert u deze vervolgens uit het bloedmonster.
7. Plaats de monsters in hun originele doosjes op een vlak, schoon oppervlak, uit direct zonlicht of hitte, terwijl u voorkomt dat de tip een extern object raakt, en laat ze 2 h drogen bij kamertemperatuur en omgevingsvochtigheid.
8. Bewaar de monsters in een zak met droogmiddel bij −80 °C tot het moment van analyse. Transport dient te geschieden onder droogijs.
   OPMERKING: In gevallen van gerichte analyse van BµS waarbij de stabiliteit van de analyt al is onderzocht, kunnen de monsters gedurende de aanbevolen tijd bij kamertemperatuur worden bewaard. Voor niet-gerichte analyse wordt bewaring bij –80 °C echter aanbevolen, aangezien sommige analyten gevoelig blijven voor degradatie, zelfs in de gedroogde matrix. Een tabel voor het oplossen van de meest voorkomende problemen bij monstername staat in Tabel 1.

2. Procedure voor metabolietextractie

1. Verwijder de volledige tip van de plastic houder en plaats deze in een microcentrifugebuis met ronde bodem (gebruik de dop van een microcentrifugebuis om de tip van de houder te scheiden).
2. Rehydrateer door 50 µL ultrapuur water direct op de tip toe te voegen.
3. Voeg 400 µL methanol toe die een IS-mix bevat (bijv. isotopisch gelabeld D-myristinezuur) om de metabolieten te extraheren en eiwitprecipitatie te bevorderen.
   OPMERKING: VOORZICHTIG: Methanol is toxisch en zeer brandbaar. Het moet in een zuurkast worden gehanteerd.
4. Sonicate de monsters in een ijsbad gedurende 10 min bij continue werking (aanbevolen vermogen 215/860 W, frequentie 35 kHz).
5. Verwijder de tip voorzichtig met een pincet en reinig deze met methanol tussen de monsters door.
6. Centrifugeer bij 6720 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
7. Overbreng 150 µL van het supernatant naar nieuwe buisjes. Gebruik voor elk monster hetzelfde volume. Gebruik een nieuwe microcentrifugebuis voor de RPLC-analyse en een nieuw glazen vial van 1,5 mL voor de GC-analyse.
8. Overbreng 50 µL van elk monster-supernatant naar één enkel vial om een gepoelde intra-studie QC-monster voor te bereiden.
9. Vortex kortstondig om volledige homogenisatie te garanderen en verdeel dit vervolgens in meerdere aliquots van hetzelfde volume als de studiemonsters. Gebruik een nieuwe microcentrifugebuis voor de RPLC-analyse en een nieuw glazen vial van 1,5 mL voor de GC-analyse.
10. Verdampt de supernatanten tot droogte met een vacuümconcentrator, in de modus voor waterige verdamping, bij een vacuümniveau van −600 mmHg (−800 mbar) en een rotatie van 1400 rpm, bij kamertemperatuur. De monsters zijn in ongeveer 2 u droog.
    OPMERKING: Controleer de verdamping zorgvuldig en verwijder de vials uit de concentrator zodra het oplosmiddel volledig is verdampt om verlies van vluchtige verbindingen te voorkomen. Pausepunt: Monsters kunnen in gedroogde vorm gedurende de nacht bij −80 °C worden ingevroren tot aan de analyse.

3. Procedure voorafgaand aan LC-MS analyse

1. Reconstitueer het gedroogde residu in 100 µL van een reconstitutie-oplosmiddel zoals de initiële mobiele fase (bijv. 5–10% methanol in water).
   OPMERKING: Het volume en het reconstitutie-oplosmiddel kunnen worden aangepast op basis van de chromatografische omstandigheden.
2. Reconstitueer de QC in hetzelfde oplosmiddel en volume als het studie monster (houd altijd dezelfde verhouding tussen monstervolume en oplosmiddelvolume aan).
3. Vortex kort en plaats in de centrifuge voor 10 min bij 6720 x g bij 4 °C.
4. Overbreng de supernatant naar een autosampler-vial met een insert.

4. Procedure voorafgaand aan GC-MS-analyse

OPMERKING: Alle volgende stappen moeten in een zuurkast worden uitgevoerd.

1. Bereid het methoxyamineringsmiddel voor door 40 mg methoxyaminehydrochloride op te lossen in 1 mL pyridine.
   OPMERKING: VOORZICHTIG: Pyridine is toxisch. Het moet in een zuurkast worden gehanteerd.
2. Bereid het derivatiseringsmiddel voor door 10 µL trimethylchloorsilaan (TMCS) toe te voegen aan 1 mL N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamide (MSTFA).
   OPMERKING: VOORZICHTIG: TMCS en MSTFA zijn beide toxisch. Ze moeten in een zuurkast worden gehanteerd.
3. Voeg 10 µL van het methoxyamineringsmiddel (methoxyaminehydrochloride 40 mg/mL in pyridine) toe aan de gedroogde residuen van de testmonsters en QC-monsters.
4. Vortex de monsters kort om ervoor te zorgen dat het reagens grondig is gemengd.
5. Incubeer de monsters 90 min bij 30 °C. De incubatie wordt statisch uitgevoerd.
6. Wacht tot de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur en voeg vervolgens 90 µL van het derivatiseringsmiddel (MSTFA 1% TMCS) toe.
7. Vervang de dopjes van de vials door nieuwe en vortex de monsters 30 s om een homogeen mengsel te verkrijgen.
8. Incubeer het mengsel 30 min bij 37 °C. De incubatie wordt statisch uitgevoerd.
9. Wacht tot de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur en voeg vervolgens 10 µL injectiestandaard (bijv. pentadecaan 6,25 mg/L in pyridine) toe aan elk monster.
10. Vervang de dopjes van de vials door nieuwe, vortex kort en breng het uiteindelijke mengsel over in glazen chromatografievials met micro-inserts.
11. Plaats de vials in het plateau van de autosampler.
12. Laat de monsters 4 u bij kamertemperatuur equilibreren in de autosampler vóór de eerste injectie.
    OPMERKING: De derivatisering is na 4 u voltooid en metabolieten zijn bij kamertemperatuur tot 24 u stabiel na volledige derivatisering. Pas het aantal monsters per batch dienovereenkomstig aan, zodat monsters niet langer dan 28 u in de autosampler blijven (na toevoeging van MSTFA 1% TMCS). Schema's van de monstervoorbereidingsmethoden zijn weergegeven in Figuur 1A–C.

5. RP-LC-MS Configuratie

1. Bereid de RP-eluenten en wasoplossingen voor volgens Tabel 2.
   OPMERKING: VOORZICHTIG: Mierenzuur en isopropanol zijn brandbaar. Mierenzuur is bovendien toxisch. Beiden moeten in een zuurkast worden gehanteerd.
2. Installeer de HSS T3 C18 (100 mm x 2.1 mm, 1.7 µm) kolom in de kolomoven.
3. Plaats alle leidingen in het overeenkomstige kanaal en spoel elk kanaal dienovereenkomstig door.
4. Stel de kolomtemperatuur in op 40 °C.
5. Start het spoelen van de kolom met 100% A:0% B met een stroomsnelheid van 0.1 mL/min.
6. Verhoog de stroomsnelheid in stappen van 0.1 mL/min, waarbij tussen de stappen wordt gewacht tot de kolomdruk is gestabiliseerd, totdat een stroomsnelheid van 0.35 mL/min is bereikt. Controleer op lekken.
7. Equilibreer de kolom gedurende ongeveer 30 min bij de begincondities van de gradiënt (0% B).
   OPMERKING: Bewaak de kolomdruk en zorg dat deze binnen het verwachte bereik blijft (5000–6000 psi).
8. Start de monstersequentie.

6. GC-MS Configuratie

1. Installeer de DB-5 capillaire kolom (5% – fenyl-methyl-polysiloxaan) in de kolomoven.
2. Stel de kolom in op een begintemperatuur van 60 °C.
3. Stel de PTV-injector in op een begintemperatuur van 110 °C.
4. Start de monstersequentie.

Resultaten

Representatieve resultaten van de niet-doelgerichte analyse van VAMS-apparaten, volgens de hierboven beschreven procedure, worden hier gepresenteerd.

De gegevens van de triplaat-analyse van een gepoolde monsterset, bereid uit veneus bloed van 10 personen en afgenomen met VAMS, werden geëvalueerd, en de kenmerken van de resulterende metabolische vingerafdrukken worden getoond. De kwaliteit van de gegevens en de vastgelegde informatie van de VAMS-apparaten werden beoordeeld aan de hand van twee primaire criteria: het totale aantal gedetecteerde chemische kenmerken en de reproduceerbaarheid van de kenmerken (n = 3), uitgedrukt als het percentage relatieve standaarddeviatie (%RSD). Het totale aantal kenmerken werd gebruikt om de breedte van de extractie en de chemische dekking van het oplosmiddel te beoordelen, terwijl de %RSD werd gemonitord om de technische precisie en robuustheid van de methode te garanderen; een lagere %RSD duidt op een zeer reproduceerbaar extractieproces dat analytische ruis minimaliseert.

Na extractie en verwerking van de ruwe gegevens werd een matrix van m/z-retentietijd (RT) kenmerken verkregen, samen met hun intensiteiten. Alleen kenmerken met een detecteerbaar signaal in twee van de drie replica's werden meegenomen, na 적절le voorbehandelings- en blank-filterstappen. Figuur 2A,B toont m/z-over-RT plots voor hetzelfde monster dat is geanalyseerd volgens de beschreven protocollen voor zowel LC-MS als GC-MS.

Het grote aantal kenmerken dat vroeg in de RPLC-run elueert, wordt toegeschreven aan sterk hydrofiele metabolieten die door het toegepaste protocol zijn geëxtraheerd, maar slecht worden vastgehouden op de reversed-phase kolom. Hoewel vroeg eluerende metabolieten uitdagingen vormen voor de identificatie, zijn nauwkeurige annotaties nog steeds mogelijk door MS/MS-fragmentatiedata te gebruiken in combinatie met vergelijkingen met spectrale databanken en interne referentiestandaarden. Bovendien wordt verwacht dat een aanzienlijk deel van deze hydrofiele fractie wordt vastgelegd via GC-MS-analyse. Uiteindelijk vertegenwoordigt dit een inherente beperking van het vakgebied, aangezien de enorme complexiteit van het metaboloom het gebruik van meerdere analytische platforms noodzakelijk maakt.

De multiplatformevaluatie van de methanolextracten demonstreert duidelijk de sterk complementaire aard van de LC- en GC-analytische workflows, waarbij de prestatiemeters binnen het verwachte bereik liggen voor een uitgebreide metabolomics-profilering. Figuur 3A,B beeldt de totale nummering van de features en de RSD%-distributie voor elk platform uit. Het LC-platform bood een uitgebreide chemische dekking door 4.169 features te scheiden, wat overeenstemt met de gevestigde capaciteit om een breed scala aan polaire, semi-polaire en niet-vluchtige verbindingen vast te leggen. Tegelijkertijd vertoonde het GC-platform een kleinere subset van features, namelijk 187. Dit was te verwachten, aangezien GC alleen vluchtige verbindingen kan detecteren die zich lenen voor derivatisering.

Wat betreft de reproduceerbaarheid, zoals getoond in de vioolplot, zijn de algemene distributie en spreiding van de RSD%-waarden opvallend vergelijkbaar tussen LC-MS en GC-MS. De gemiddelde %RSD was voor beide platforms typerend, ongeveer 29,7% voor LC (2.655 van de 4.169 hadden een %RSD lager dan 30%) en 32,3% voor GC (114 van de 187 hadden een %RSD lager dan 30%). Hoewel een klein aantal kenmerken aan beide zijden hogere RSD-waarden vertoonde, is deze variatie gebruikelijk en verwacht in untargeted metabolomics. Deze hogere waarden behoren doorgaans tot metabolieten met een lage abundantie die dicht bij de detectiegrens van het instrument liggen. Over het geheel genomen bevestigen de nauwe distributieprofielen een bevredigende reproduceerbaarheid voor beide analytische opstellingen.

De chemische ruimte van de metabolieten die met het protocol zijn vastgelegd, kan worden geanalyseerd aan de hand van de annotaties van de metabolieten. Zoals verwacht, gezien de inherente complementariteit van de twee platforms, werden verschillende verbindingen gedetecteerd via LC-MS en GC-MS. Een volledige lijst met metabolietannotaties voor VAMS-apparaten is opgenomen in Supplementary Table 1 en Supplementary Table 2. In totaal werden 97 metabolieten gedetecteerd en geannoteerd (niveau 1 en 2, zoals voorgesteld door Sumner et al. (2007)²²) met dit protocol via de twee technieken, naast andere putatief gekarakteriseerde verbindingen van niveau 3. GC-annotaties werden verder bevestigd door de experimentele retentie-indexen – verkregen door vergelijking met FAMES – te vergelijken met getabelleerde waarden²³. Figure 4A,B toont de distributie van subklassen van de geannoteerde metabolieten voor beide methoden, terwijl Figure 4C de overlap tussen de technieken laat zien, wat hun complementariteit benadrukt. Een paar belangrijke intermediaire metabolieten kunnen door beide technieken worden gecrossvalideerd, terwijl structureel unieke of platformspecifieke kenmerken hiaten in de centrale koolstof- en secundaire metabole routes kunnen opvullen. Hoewel aminozuren en peptiden de belangrijkste chemische klassen zijn in beide analyses, overlappen slechts enkele metabolieten tussen de technieken. Veel metabolietklassen zijn instrument-specifiek, zoals acylcarnitines in LC-MS en hexoses in GC-MS.

Om de efficiëntie van methanol als extractiemiddel voor beide technieken aan te tonen, werden vergelijkende proeven uitgevoerd op VAMS-monsters met behulp van verschillende oplosmiddelsystemen, gevolgd door LC-MS- en GC-MS-analyses. Drie verschillende oplosmiddelsystemen werden in drievoud vergeleken met methanol: zuiver acetonitril (ACN), een methanol-watermengsel (60:40, v/v) en een acetonitril-methanolmengsel (70:30, v/v). De keuze voor deze oplosmiddelen en mengsels was gebaseerd op preliminaire experimenten uitgevoerd door onze groep, alsook op eerder gepubliceerde literatuur^13,14,24,25. De extractie-efficiëntie van elk systeem werd geëvalueerd aan de hand van drie belangrijke parameters: het totale aantal gedetecteerde kenmerken, de totale intensiteit van de kenmerken en de reproduceerbaarheid van de kenmerken, uitgedrukt als de relatieve standaarddeviatie (RSD, %).

Voor de LC-MS workflow werd het hoogste aantal kenmerken gedetecteerd met MeOH-H2O (60:40, v/v), met een gemiddelde van 4.514 kenmerken over de triplicaten, nauw gevolgd door pure MeOH (4.169 kenmerken). Het ACN–MeOH (70:30, v/v) mengsel leverde een gemiddelde van 3.502 kenmerken op, terwijl pure ACN het laagste gemiddelde aantal kenmerken opleverde, namelijk 2.836. Een grafische weergave van deze aantallen kenmerken per replica is geïllustreerd in Figuur 5A.

Om de precisiekenmerken voor elke extractieconditie te onderzoeken, werden de feature-intensiteiten en RSD's (%) van triplikaat injecties geanalyseerd. Een vergelijking van de totale feature-abundantie en de gemiddelde %RSD per extractiemiddel voor LC-MS wordt getoond in Figuur 5A. De log₂ signaalverdelingen waren vergelijkbaar voor alle extracten, waarbij MeOH-H2O 60:40 (v/v), ACN en MeOH iets hogere abundanties gaven dan ACN-MeOH 70:30 (v/v). MeOH resulteerde in een lagere totale gemiddelde %RSD, wat aangeeft dat de extractie reproducebaarder was met dit oplosmiddel.

Een soortgelijke beoordeling van de efficiëntie van het extractiesolvent-systeem werd uitgevoerd op basis van de GC-MS-gegevens. Opnieuw werden voor de evaluatie van het aantal kenmerken alleen die kenmerken overwogen waarvan het signaal in ten minste twee van de drie replica's was gedetecteerd. Het solvent dat het hoogste aantal kenmerken opleverde, was ACN-MeOH 70:30 (v/v) (216 kenmerken), nauw gevolgd door MeOH (187 kenmerken). Een grafische illustratie van het aantal gedetecteerde kenmerken per extractiesolvent en BµS is weergegeven in Figuur 5B.

Wat betreft de totale abundantie van de gedetecteerde kenmerken bleek MeOH het meest efficiënt te zijn en resulteerde dit in een hogere abundantie, zoals weergegeven in Figuur 5B. MeOH-H₂O 60:40 (v/v) was de op één na beste, gevolgd door ACN-MeOH 70:30 (v/v). ACN was het minst effectieve oplosmiddel. Met betrekking tot de %RSD van de kenmerken leverde MeOH-H₂O 60:40 (v/v) de laagste RSD's op voor VAMS (RSD = 38,57%), nauw gevolgd door ACN (42,65%), MeOH (44,14%) en ACN-MeOH 70:30 (v/v) (49,14%). Deze waarden zijn weergegeven in Figuur 5B.

Het bovenstaande komt goed overeen met eerder gepubliceerde literatuur. Couacault et al. (2026)¹⁹ rapporteerden een vergelijkbaar aantal kenmerken in de RP-LC-MS-analyse van DBS en VAMS met gebruik van een soortgelijke samenstelling van het extractiemiddel (rehydratie met 80 µL water, gevolgd door de toevoeging van 320 µL MeOH). Op een vergelijkbare manier detecteerden Cala et al. (2017)¹¹ een vergelijkbare hoeveelheid kenmerken (153) via GC-MS-analyse van VAMS-tips. Hoewel de meeste bestaande studies de precisie van de analyses met deze apparaten niet hebben geëvalueerd, komen onze algemene bevindingen overeen met de verwachtingen voor een niet-gerichte analyse. Bovendien stemmen de LC-resultaten overeen met die gerapporteerd door Bossi et al. (2025)²⁶ voor de HILIC-analyse van DBS- en qDBS-microstalen, waarbij de meeste gedetecteerde kenmerken RSD's < 30% hadden.

Over het algemeen tonen deze resultaten aan dat methanolgebaseerde extractie een robuuste balans biedt tussen het aantal kenmerken, intensiteit en precisie (gemiddelde RSD, %) voor zowel LC-MS- als GC-MS-analyse van VAMS-monsters. Daarom kan een enkel methanol-extractieprotocol de dubbele monstervoorbereiding stroomlijnen, de parallelle acquisitie van complementaire metabole profielen faciliteren en de informatieopbrengst maximaliseren.

Figuur 1: Protocolschema's die (A) het monster-extractieprotocol, (B) LC-MS reconstitutie en (C) GC-MS/MS derivatisatie tonen. Gemaakt in BioRender. Marques, D. (2026) https://BioRender.com/dprdv18, https://biorender.com/xu2qh34, https://biorender.com/7ztz2qv. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Vergelijkingen van m/z en rt van een representatief monster voor (A) LC-MS- en (B) GC-MS-analyse. Elke stip vertegenwoordigt een enkel signaal voordat deze is gegroepeerd in kenmerken. De kleuren geven de intensiteit van het MS1-signaal voor een bepaald kenmerk weer, waarbij de intensiteit toeneemt van blauw naar rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Featuredekking en reproduceerbaarheid over analytische platforms. (A) Featuredekking: Totaal aantal unieke features gedetecteerd door LC (blauwgroen) en GC (oranje), waarbij de exacte aantallen boven elke staaf zijn genoteerd. (B) Feature-reproduceerbaarheid: Violindiagrammen die de distributiedichtheid van relatieve standaarddeviaties (RSD%) voor alle features tonen. Ingevoegde boxplots geven de mediaan en interkwartielafstanden aan; individuele datapunten zijn weggelaten voor de visuele helderheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Histogrammen die het aantal verbindingen van de verschillende chemische klassen tonen die gedetecteerd zijn door (A>) LC-MS en (B>) GC-MS. (C) Overlap van metabolieten geannoteerd op niveau 1 en 2 tussen platformen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Resultaten van extractie-oplosmiddelen uit de LC-MS (A>) en GC-MS (B>) analyse van VAMS-apparaten. De staafdiagrammen bovenaan de figuur representeren het aantal kenmerken verkregen uit elk extractie-oplosmiddel toegepast op VAMS-apparaten per replicaat. De grafieken onderaan de figuur tonen de som van de intensiteiten en de gemiddelde RSD (%) voor elk extractie-oplosmiddel dat met het VAMS-apparaat is gebruikt. De grootte van de cirkel representeert de totale somintensiteit van gedetecteerde kenmerken op een log2-schaal, wat de extractie-efficiëntie weerspiegelt. De kleurgradiënt geeft de analytische precisie aan, uitgedrukt als de relatieve standaarddeviatie (RSD), waarbij geel een hogere precisie representeert en rood een grotere variabiliteit aanduidt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Tabel voor probleemoplossing. Overzicht van veelvoorkomende bemonsteringsproblemen, oorzaken en oplossingen bij bemonstering met VAMS-apparaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 2: RP-eluenten en wassoplossingen. Overzicht van de mobiele fasen, seal-was, purge-oplosmiddel en wasoplosmiddelcomposities die zijn gebruikt voor chromatografische analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Aanvullende experimentele details. LC-MS- en GC-MS-parameters. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: LC-MS annotaties. Componenten geïdentificeerd met het huidige protocol op het LC-MS platform. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 2: GC-MS annotaties. Verbindingen geïdentificeerd met het huidige protocol op het GC-MS platform. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Niet-gerichte metabolomics biedt een uniek inzicht in de chemische samenstelling van biologische monsters. Gezien de grote chemische diversiteit van het metaboloom kan echter geen enkele techniek de aanwezige kleine moleculen in bloed volledig karakteriseren. Daarom is het gebruik van complementaire technieken noodzakelijk om de metabolietdekking te vergroten en de algemene informatie uit deze studies te verbeteren. Echter, het kleine volume van bloedmicromonsters, zoals VAMS, maakt de monstervoorbereiding voor verschillende analyses uitdagend.

In dit protocol wordt een uitgebreide workflow gepresenteerd voor metabole profilering van VAMS-tips met behulp van dubbele extractie en twee complementaire analysetechnieken. Hoewel er eerdere werken zijn gepubliceerd waarin niet-doelgerichte analyses op VAMS-monsters zijn uitgevoerd^{11,12,13,15,17,18,19,20,21,27}, richt elk van deze zich op een enkele analysetechniek. Dit is het eerste protocol dat de extractie van VAMS-apparaten aanpast om zowel LC- als GC-MS-analyses binnen een enkele workflow te ondersteunen.

Dit protocol geeft specifieke volumes van oplosmiddelen en extracten op om de gepresenteerde resultaten te genereren; kleine wijzigingen kunnen worden aangepast aan individuele opstellingen op basis van de gevoeligheid van de apparatuur, de beschikbare injectievolumes en de vereisten voor QC-monsters. Zo zou het rehydratievolume van water dat in stap 2.2 wordt toegevoegd, kunnen worden gewijzigd van 50 naar 80 µL om ervoor te zorgen dat de tip volledig nat is. Het volume methanol in stap 2.3 zou kunnen worden verhoogd van 400 naar 500 µL om een groter extractvolume te verkrijgen voor het verdelen over meer QC-monsters. Er moet echter op worden gemerkt dat het verhogen van het oplosmiddelvolume zal leiden tot een hogere verdunning van de analyten. Bovendien kunnen de volumes die in stap 2.7 en 2.8 worden gepipetteerd voor de analyse- en QC-monsters respectievelijk worden aangepast (van 150 naar 200 µL in stap 2.7 en van 20 naar 50 µL in stap 2.8) om overeen te komen met het gewenste volume per monster. Opvallend is dat deze oplosmiddelvolumes vrij kunnen worden aangepast zonder dat proportionele schaling vereist is. Hoewel een standaard verhouding tussen oplosmiddel en monster van 3:1 doorgaans voldoende is voor volledige extractie, maakt deze methode gebruik van een groter overschot aan oplosmiddel om ervoor te zorgen dat het gehele BµS-apparaat volledig ondergedompeld blijft, waardoor het protocol robuust en direct toepasbaar is voor alle gesuggereerde volumes.

Zowel LC-MS- als GC-MS-gegevens kunnen worden geanalyseerd met behulp van diverse open-source softwaretools. In dit onderzoek werden de LC-MS-resultaten verkregen met de Metabonaut-workflow²⁸ met XCMS. Voor de GC-MS-monsters werd de gegevensverwerking uitgevoerd met MSDial v. 5.5.2603²³. Tutorials zijn te vinden op (https://systemsomicslab.github.io/mtbinfo.github.io/MS-DIAL/tutorial.html). Gedetailleerde parameters voor de gegevensverwerking van LC-MS en GC-MS zijn opgenomen in Supplementary File 1.

Het wordt aanbevolen om elke dataset individueel te verwerken, waarbij de QC-monsters in een aparte batch worden gebruikt om de verwerkingsparameters te optimaliseren voordat deze op de gehele dataset worden toegepast. Normalisatie dient na de datapreprocessing te worden uitgevoerd. Zowel XCMS als MSDial beschikken over ingebouwde tools voor normalisatie. Voor het huidige werk werd de normalisatie uitgevoerd met de opensource-software QCMXP²⁹, gebruikmakend van een lineair model gebaseerd op QC-responsen.

Enkele kritische stappen, voornamelijk in het deel van de monstervoorbereiding, moeten worden benadrukt om te garanderen dat de resultaten betrouwbaar zijn.

Het huidige protocol is ontwikkeld met gebruik van een LC-systeem gekoppeld aan een quadrupole time-of-flight massaspectrometer (LC-QTOF-MS) en een gaschromatografie-massaspectrometriesysteem (GC-MS), met parameters zoals vermeld in Aanvullend Materiaal S1. Indien een ander type LC of GC wordt gebruikt, moeten de parameters worden geoptimaliseerd voor de specifieke opstelling. Bij metabolomics-analyses op basis van GC- en LC-MS moeten blanco injecties worden gepland aan het begin en aan het einde van de analytische batch. Voordat QC-monsters worden geïnjecteerd, moeten conditionerings-QC's 10 tot 15 keer in het LC-MS-systeem en 5 tot 10 keer in het GC-MS-systeem worden geïnjecteerd om de kolom te conditioneren met de te analyseren matrix. Conditionerings-QC's moeten worden bereid volgens dezelfde procedure als de overige QC's. Intra-studie QC-monsters moeten periodiek worden geïnjecteerd en moeten ongeveer 10% van de geïnjecteerde oplossingen uitmaken.

Het hanteren van de VAMS-tips is een van de meest kritieke stappen in deze workflow. Het is belangrijk dat de tip geen andere oppervlakken aanraakt dan de binnenkant van de microcentrifugebuis, omdat dit kan leiden tot verlies van analyten. Bovendien is de pre-hydratatiestap essentieel voor een juiste extractie van de analyten: hoewel initiële rehydratatie de recovery lijkt te verbeteren door de afgifte van analyten vóór de precipitatie te vergemakkelijken, wordt verondersteld dat het direct toevoegen van organische oplosmiddelen onmiddellijke proteïneprecipitatie binnen de structuur van de tip veroorzaakt, waardoor een fysieke barrière ontstaat die de daaropvolgende extractie van metabolieten beperkt.

Bovendien moet men ervoor zorgen dat de pipetpunt wordt verwijderd vóór de centrifugatiestap. Hoewel dit kan leiden tot een klein verlies aan oplossing, beïnvloedt het niet verwijderen van de punt het herstel van het supernatant. De punt kan het precipitaat gemakkelijk opnieuw suspenderen, waardoor het opvangen van een schoon supernatant onmogelijk wordt.

Enkele algemene aandachtspunten met betrekking tot de stabiliteit moeten worden benadrukt om de beste resultaten te garanderen. Ten eerste moeten monsters gekoeld worden bewaard, bij voorkeur bij −80 °C tot op het moment van analyse. Het wordt aanbevolen om de monsters te ontdooien in een ijsbad of in een koelkast. Om degradatie te voorkomen, wordt geadviseerd het monster zo snel mogelijk in het chromatografiesysteem te injecteren. Indien injectie echter niet mogelijk is vanwege tijdgebrek, kan het gedroogde extract overnacht worden ingevroren zonder dat dit leidt tot een aanzienlijk verlies aan stabiliteit.

Sommige stappen in de GC-MS-workflow moeten ook worden toegelicht. Het derivatiseringsproces bestaat uit twee stappen. De eerste stap is methoxyaminering, waarbij ketongroepen worden beschermd die, indien onbeschermd, carboxylverlies ondergaan in de vorm van koolstofdioxide. Dit wordt gevolgd door trimethylsilylering. De MSTFA reageert met moleculen die zure protonen bevatten, welke veel voorkomen in carboxyl-, hydroxyl-, amino-, imino- en sulfonylgroepen. Een dergelijke reactie vermindert de polariteit van de analyten en introduceert een grote, hinderende groep, waardoor hun kookpunt wordt verlaagd²³. Het is cruciaal dat het monster volledig droog is voordat methoxyamine wordt toegevoegd, aangezien water de bescherming van de analyten kan verstoren. Men moet er ook rekening mee houden dat het belangrijk is om de monsters op kamertemperatuur te laten stabiliseren na het verwijderen uit de oven, omdat het voortijdig openen van het vial kan leiden tot verlies van vluchtige metabolieten. Bovendien kunnen de GC-doppen uitzetten bij verhitting, wat kan leiden tot een onjuiste afdichting van het vial en het verloop van analyten in de tijd. Om die reden wordt aanbevolen de GC-dop na elke incubatiestap te vervangen.

Wat betreft het GC-MS-protocol moet er echter rekening worden gehouden met de derivatiseringstijd. Er is aangetoond dat metabolieten blijven reageren, zelfs nadat ze uit de oven zijn gehaald, waarbij de concentratie na 4 h een plateau bereikt. Dit plateau blijft tot 24 h na volledige derivatisering stabiel^30,31. Daarom is het zeer belangrijk om de monstervoorbereiding zo te organiseren dat gederivatiseerde monsters niet langer dan 28 h in de autosampler blijven na de reactie met MSTFA. Bij grote analytische batches wordt aanbevolen om alle monsters gelijktijdig voor te bereiden om inter-day variabiliteit in de monstervoorbereiding te verminderen en ervoor te zorgen dat aliquoten van elk monster kunnen worden samengevoegd in de QC-mix. De monsters kunnen worden bewaard als gedroogde residuen bij −80 °C, waarbij alleen de monsters die binnen de volgende 24 h geanalyseerd moeten worden, ontdooid en gederivatiseerd worden²⁷. Het wordt ook aanbevolen om de vials af te dekken met laboratoriumfolie om te voorkomen dat het monster vocht absorbeert in de vriezer. Tot slot wordt aangeraden om vers bereide derivatiseringsoplossingen te gebruiken en de algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging in metabolomica-analyse voor beide methodologieën te volgen om betrouwbare resultaten te garanderen³².

Hoewel een vergelijking tussen de huidige workflow en traditionele plasma-analyse buiten de reikwijdte van dit werk valt, is dit onderwerp uitgebreid onderzocht in de literatuur^{17,18,19,20,21,27}. Over het algemeen leveren VAMS-apparaten kwalitatieve profielen die vergelijkbaar zijn met die van plasma, maar de abundanties variëren tussen matrices op een analyt-specifieke wijze, zelfs bij equivalente volumes (20 µL). Deze verschillen zijn waarschijnlijk te wijten aan het cellulaire component dat aanwezig is in de BµS, verschillen tussen capillair en veneus bloed, of interferentie door de gedroogde matrix tijdens de analyse. Dit maakt validatie van de bevindingen uit de BµS-apparaten noodzakelijk alvorens ze in de klinische praktijk worden toegepast.

Om het voorgestelde protocol aan te passen voor routinematige high-throughput laboratoriumworkflows, kunnen verschillende modificaties en strategieën voor probleemoplossing worden geïmplementeerd. Ten eerste kunnen de volumes van het extractiesolvent worden opgeschaald, met name bij het voorbereiden van grotere batches QC-monsters. Men dient echter in gedachten te houden dat het verhogen van het extractievolume inherent het monster verdunt, wat de intensiteit potentieel kan verminderen, tenzij het daaropvolgende reconstitutievolume proportioneel wordt aangepast. Daarnaast kan de samenstelling van het reconstitutiesolvent voor vloeistofchromatografie worden geoptimaliseerd om aan te sluiten bij de initiële mobiele fase-gradiënt van specifieke instrumentconfiguraties.

De belangrijkste beperking van dit protocol is de kleine steekproefomvang. Omdat één enkel monster van 20 µL wordt gesplitst voor analyse op twee verschillende systemen, kunnen verbindingen met een lage abundantie onder de detectiegrenzen van het minder gevoelige instrument vallen. Desalniettemin weegt dit nadeel niet op tegen het gemak van monstername geboden door BµS en de bredere chemische dekking die wordt gefaciliteerd door complementaire technieken. Bovendien zou de verdampingsstap in het protocol theoretisch kunnen leiden tot het verlies van vluchtige verbindingen, hoewel de werkelijke impact op vluchtige stoffen nog niet is beoordeeld. Toch wegen de praktische voordelen zwaarder dan enig potentieel signaalverlies, omdat verdamping essentieel is voor de derivatisering van het monster en reconstitutie in een kleiner volume mogelijk maakt om de LC-gevoeligheid te verhogen. Hoewel eerdere studies zich hebben gericht op niet-doelgerichte microsample-analyse^{7,11,12,13,15,17,18,19,20,27} is dit protocol, naar kennis van de auteurs, de eerste volledige workflow voor het analyseren van volumetric absorptive microsampling (VAMS)-apparaten via LC- en GC-MS-analyse vanuit één enkele extractie.

Daarnaast zou het evalueren van aanvullende metrieken deze bevindingen verder versterken. Ten eerste zou het valideren van de resultaten via een multi-laboratoriumvergelijking met gebruik van exact hetzelfde dual-platform-protocol de robuustheid van de methode bevestigen en de prestaties op verschillende LC-MS- en GC-MS-instrumenten beoordelen. Bovendien is in de huidige studie de variabiliteit tussen verschillende operators tijdens de monstervoorbereiding of monstername niet geëvalueerd. Ten slotte vormen verdere analyses naar de effecten van bewaring op de monsterintegriteit en het hematocrieteffect belangrijke gebieden waarop het huidige onderzoek uitgebreid zou kunnen worden. Aangezien we bij untargeted-analyse prioriteit geven aan de breedte van de metabolietdekking en relatieve vergelijkingen tussen monsters, compromitteren individuele verschillen in specifieke metabolieten over diverse chemische klassen de datavaliditeit niet. Hematocriet- en bewareffecten zouden daarom vanuit dat aspect bestudeerd moeten worden. Dergelijke gegevens zijn schaars, afgezien van een studie door Volani et al. (2023), waaruit bleek dat VAMS-apparaten stabiel blijven bij −80 °C gedurende 6 maanden²⁴.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,5 ml glazen vials	Laboplossingen	ACSV0902A	Wordt gebruikt voor het overbrengen en verdampen van de GC-fractie, het uitvoeren van derivatiseringsreacties en de uiteindelijke GC-injectie.
Acetonitril (AcN)	VWR BDA Chemicals	BDH92497.320	LC-MS-kwaliteit. Geëvalueerd als onderdeel van een extractiemiddel.
D27-Myristinezuur	Sigma Aldrich	366889	Toegevoegd aan het methanol-extractiesolvent om de extractie-efficiëntie en de analytische prestaties te bewaken.
DBS-5 capillaire kolom (5% - fenyl-methyl-polysiloxaan)	Agilent Technologies	122-5332UI	Gaschromatografische capillaire kolom geïnstalleerd in de GC-oven voor GC-MS-analyse.
Eppendorf Concentrator plus	Eppendorf	5,3E+09	Wordt gebruikt om monstersupernatanten volledig te laten verdampen tot droogresidu vóór opslag of reconstitutie/derivatisering.
Standaardmengsel van vetzuurmethylesters	Sigma Aldrich	SMB00937-1ML	Wordt gebruikt om de retentie-indexen van de metabolieten te bepalen voor GC-annotatie.
Mierenzuur	VWR BDA Chemicals	PI85178	LC-MS-zuiverheid. Gebruikt als 0,1% additief in mobiele fasen A en B voor RP-LC-MS.
HSS T3 C18-kolom (100 mm x 2,1 mm, 1.7 µm)	Waters Corporation	1,9E+08	Omgekeerde-fase vloeistofchromatografiekolom geïnstalleerd in de kolomoven voor RP-LC-MS/MS-analyse.
Isopropanol	Chem-Lab	CL00.0926.2500	LC-MS-kwaliteit. Component van de seal-spoeloplossing (H2Isopropanol 80:20 v/v).
Labfilm	Parafilm	PM-996	Wordt gebruikt om de vials in te wikkelen en af te dekken tijdens bewaring bij -80°C om de opname van vocht te voorkomen.
Methanol (MeOH)	VWR BDA Chemicals	AA47192-K2	LC-MS- of GC-MS-zuiver. Gebruikt voor de optimalisatie van extractiesolventia, de bereiding van interne standaarden en mobiele fasen.
Methoxyaminehydrochloride	Sigma Aldrich	89803	Wordt gebruikt voor het bereiden van het methoxyamineringsmiddel (40 mg/mL in pyridine) om keton-/carbonylgroepen te beschermen.
Micro-inserts	Laboplossingen	ACIV300IC	Wordt gebruikt om de oplossing vast te houden vóór injectie.
Mitra Blood Microsampling (BµS) Apparatuur 20 µL	Neoteryx / Trajan Scientific and Medical	200004	Polymere tips voor volumetrische absorptieve microsampling (VAMS), gebruikt voor de nauwkeurige afname van bloedmonsters met een laag volume.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (MSTFA)	Restek	35601	Silyleringsreagens dat wordt gebruikt om de polariteit en kookpunten van analyten te verlagen door te reageren met zure protonen.
Oven	Heraleus	8,1E+09	Gebruikt voor derivatiseringsreacties: methoxyaminering bij 30°C gedurende 90 min en trimethylsilylering bij 37°C gedurende 30 min.
Pentadecaan	Sigma Aldrich	K2015R	Voorbereid in een concentratie van 6,25 mg/L. Toegevoegd aan elk monster vóór de uiteindelijke overdracht naar het GC-vial om de injectiekwaliteit te verifiëren.
Pro-Research Gekoelde Centrifuge	Centurion Scientific Lab	CL00.1688.2500	In staat om te koelen tot 4°C en snelheden tot 10.000 x g bereikt.
Pyridine	Sigma Aldrich	23053	Watervrije kwaliteit. Oplosmiddel gebruikt om methoxyaminehydrochloride op te lossen voor de eerste derivatiseringsstap.
Ronde bodem microcentrifugebuisjes	FL Medical	TS-88530	Wordt gebruikt voor het loskoppelen en huisvesten van de VAMS-tip tijdens rehydratatie, extractie en centrifugatie.
Trimethylchloorsilaan (TMCS)	Alfa Aesar	N/A	Derivatiseringskatalysator. Toegevoegd aan MSTFA in een verhouding van 1% v/v.
Pincet	Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling genereren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben.	Het is niet mogelijk om een vertaling te maken omdat er geen brontekst is verstrekt. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben.	Wordt gebruikt om de VAMS-tips voorzichtig uit de buisjes te verwijderen. Moet tussen de monsters door met methanol worden gereinigd.
Ultrapuur water (H2O)	Hydrolab demineralisator (Straszyn, Polen)	N/A	18,2 MΩ·cm resistiviteit. Gebruikt voor rehydratatie van de tip, extractiemengsels en mobiele fase A.
Ultrasoonbad Sonorex Digitec DT	Bandelin	N/A*	Wordt gebruikt met een ijsbad voor een extractie-optie van 10 minuten in plaats van 30-60 minuten op een agitatietafel.
Eenmalige contactgeactiveerde lancet (1,5 mm diepte)	[bedrijf — gelieve te bevestigen	[catalogusnummer # — gelieve te bevestigen	Wordt gebruikt om de vingerprik uit te voeren voor capillaire bloedafname (stap 1.3).
Ethanollossting (70%)	[bedrijf — Gelieve te bevestigen	[catalogusnr. — gelieve te bevestigen	Wordt gebruikt om de vingertop te desinfecteren voorafgaand aan de bemonstering (Stap 1.2).
LC-QTOF-MS-systeem (Bruker Elute LC gekoppeld aan een quadrupole time-of-flight-massaspectrometer)	Bruker	[catalogusnummer # — gelieve te bevestigen	Omgekeerde-fase LC-MS-systeem gebruikt voor RP-LC-MS-analyse (Sectie 5); voorheen rechtstreeks benoemd in de tekst van de Discussie zonder vermelding in de Tabel met Materialen.
GC-MS-systeem (Bruker EVOQ-456)	Bruker	[catalogusnummer # — gelieve te bevestigen	Gaschromatografie-massaspectrometriesysteem gebruikt voor GC-MS-analyse (Sectie 6); eerder direct benoemd in de proza van de Discussie zonder een  bb, of Materialen-vermelding.