Methodenartikel

Een labelvrije, real-time impedantiegebaseerde methode voor high-throughput antivirale screening

0 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72539

⸱

3 september 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vanderbilt Center for Antibody Therapeutics, Vanderbilt University Medical Center, 2Agilent Technologies, Inc., 11011 N Torry Pines, 3Department of Pathology, Microbiology and Immunology, 4Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

De op impedantie gebaseerde real-time celanalyse (RTCA) maakt real-time, labelvrije kwantificering van virus-geïnduceerde cytopathische effecten mogelijk, wat een snelle methode biedt om antivirale verbindingen en monoklonale antilichamen te evalueren via een geïntegreerde, softwaregestuurde assay-workflow.

Samenvatting

Op impedantie gebaseerde technologieën bieden een robuuste en objectieve methode om cytopathische effecten (CPE) in monolaags celculturen te kwantificeren, waardoor de beperkingen van traditionele eindpuntanalyses of visueel subjectieve assays worden overwonnen. Cytolytische virussen induceren doorgaans uitgesproken morfologische veranderingen en celdood in geïnfecteerde culturen, waardoor impedantiemetingen, die veranderingen in celadhesie, morfologie en viabiliteit weerspiegelen, een gevoelige en dynamische indicator zijn voor virale infectie en progressie. Bijgevolg bieden impedantie-gebaseerde read-outs een krachtige en efficiënte benadering voor het evalueren van de beschermende effecten van antivirale interventies. Deze studie presenteert een real-time, labelvrij screeningsplatform dat gebruikmaakt van geavanceerde impedantiemeting-systemen om virus-geïnduceerde CPE continu te monitoren. Deze aanpak maakt een snelle, kwantitatieve beoordeling van de antivirale werkzaamheid mogelijk voor zowel kleine-molecuulmedicijnen als monoklonale antilichamen, zonder aanvullende labelings- of kleuringsstappen. Het protocol beschrijft de volledige workflow van de assay, van het uitplaten van cellen en virale infectie tot data-acquisitie en analyse. Bovendien stroomlijnt de in het systeem geïntegreerde software, die specifiek is afgestemd op virologische toepassingen, de verwerking en interpretatie van gegevens, wat de bepaling van de neutraliserende potentie van monoklonale antilichamen en de activiteit van antivirale verbindingen faciliteert.

Inleiding

Wanneer men wordt geconfronteerd met de dreiging van een virale uitbraak, vormen vaccins en antivirale therapieën de primaire strategieën om virale transmissie te beperken en geïnfecteerde patiënten te behandelen1. Vaccins voorkomen infectie door het immuunsysteem voor te bereiden op het herkennen van pathogenen, wat zorgt voor proactieve bescherming op de lange termijn. Antivirale therapieën hebben diverse toepassingen, afhankelijk van de modaliteit en het ontwerp van het geneesmiddel. Net als vaccins kunnen monoklonale antilichamen proactieve, aanhoudende bescherming bieden (van weken tot vele maanden) en kunnen ze ook worden ingezet als instrument voor controle na blootstelling. Zowel monoklonale antilichamen als antivirale kleinformige therapeutica worden gebruikt om bestaande infecties te behandelen door virale componenten direct te targeten of te remmen, waardoor de ernst van de ziekte wordt verminderd en ze dienen als een reactieve interventie op de korte termijn.

De conventionele benadering voor het functioneel beoordelen van antivirale activiteit in biologische systemen is de virusreductie-neutralisatietest (VRNT), die reducties in plaquevorming kwantificeert in plaque-reductie-neutralisatietesten (PRNT), foci via immunovleking in focus-reductie-neutralisatietesten (FRNT), of cytopathische effecten (CPE) met behulp van assays gebaseerd op cellevensvatbaarheid. De PRNT wordt beschouwd als de gouden standaard voor fenotypische methoden om de remmende activiteit van antivirale middelen tegen een breed scala aan virale infecties te bepalen2. PRNT is echter tijdrovend en arbeidsintensief, en de interpretatie van de resultaten kan subjectief zijn, vooral wanneer er plaque-overgroei of fusie optreedt tijdens langdurige incubatie. De objectiviteit van de assay-read-outs kan worden verbeterd door FRNT te gebruiken, dat steunt op de detectie van virus-specifieke antigenen of de expressie van reportergenen. Deze benadering kan echter worden beperkt door de beschikbaarheid en prestaties van hoogwaardige antilichamen of detectie-enzymen. Verschillende reagentia en assay-protocollen zijn goed gevestigd en worden veelvuldig gebruikt voor de beoordeling van de cellevensvatbaarheid om bepaalde aspecten van CPE te meten. Enzymatische reductie van het mono-tetrazoliumzout MTT-colorimetrisch reagens (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromide) door mitochondriale dehydrogenasen in levende cellen produceert een kwantificeerbaar colorimetrisch signaal veroorzaakt door het gekleurde formazanproduct. Het reagens voor de levensvatbaarheidsassay (dat cellen lyseert en intracellulair ATP vrijmaakt dat een luciferase-gekatalyseerde reactie aandrijft, waarbij het substraat luciferine wordt omgezet in oxyluciferine) is een homogene luminescente assay. dergelijke assays voor cellevensvatbaarheid kunnen worden ingezet om de afname van CPE te kwantificeren tijdens het screenen van antivirale middelen3. Deze methoden vereisen echter ook meerdere was- en kleuringsstappen en zijn, net als PRNT- en FRNT-assays, eindpuntassays. Als gevolg hiervan kunnen gedeeltelijk effectieve antivirale middelen die vertraagde effecten hebben op de virale infectie over het hoofd worden gezien als de antivirale assay op een suboptimaal tijdstip wordt beëindigd. Er is daarom een dringende behoefte aan een geautomatiseerde assay met een middel tot hoge doorvoer die real-time monitoring van cellulaire reacties op virale infecties mogelijk maakt.

Systemen voor real-time celanalyse (RTCA) maken continue monitoring van de ontwikkeling van CPE en antivirale responsen in permissieve celmodellen mogelijk via een labelvrije, niet-invasieve uitlezing op basis van impedantie. Virus-geïnduceerde CPE omvat niet alleen celdood, maar ook veranderingen in cellulaire morfologie en adhesie, die allemaal gevoelig kunnen worden gedetecteerd door veranderingen in de elektrische impedantie4,5. Deze impedantiemetingen worden verkregen met gouden micro-elektrodesensoren die zijn ingebed in een gespecialiseerde 96-wells celkweekplaat, waardoor een kwantitatieve beoordeling van dynamische cellulaire responsen mogelijk is zonder dat labels of expressie van reportergenen nodig zijn. RTCA-technologie is breed gerapporteerd voor de detectie van CPE in diverse celmodellen die zijn geïnfecteerd met virussen uit meerdere families, en voor de evaluatie van de neutraliserende activiteit van antilichamen6–10.

Hierin werden de kritieke stappen van deze real-time en labelvrije impedantiegebaseerde in vitro antivirale assay gedefinieerd. Deze aanpak was gebaseerd op eerdere studies met betrekking tot de screening van antivirale verbindingen in adenovirus 5-geïnfecteerde HEK293A-cellen en de evaluatie van neutraliserende antilichamen met behulp van een replicatie-competent recombinant vesiculair stomatitisvirus dat het Lassa-glycoproteïne tot expressie brengt (rVSV-LASV(Lin IV)) in Vero CCL-81-cellen11. Al deze experimenten werden uitgevoerd op een RTCA MP-systeem, dat het gelijdig draaien van maximaal 6× 96-wellplaten ondersteunt. Het doel van dit werk was om een basis te leggen voor impedantiegebaseerde antivirale screening. De methode kan eenvoudig worden uitgebreid naar een breed scala aan virus-celmodellen zodra de optimale assaycondities zijn gedefinieerd met behulp van het hier beschreven protocol.

Protocol

De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Permissieve celkweek en passageren

OPMERKING: In dit protocol worden Vero CCL-81-cellen gebruikt voor antilichaamneutralisatie, terwijl HEK293A-cellen worden gebruikt voor het screenen van antivirale verbindingen. Om variatie tussen experimenten te verminderen, wordt sterk aangeraden om een cellijnbank van permissieve cellen met hetzelfde passagenummer voor de assay aan te leggen.

  1. Warm het celgroeimedium—Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine—voor gebruik voor in een waterbad van 37°C.
  2. Ontdooi een vial met cryogepreserveerde permissieve cellen in een waterbad van 37°C totdat er slechts een klein ijskristal overblijft; dompel de dop niet onder in het waterbad. 
  3. Plaats de vial met de gerevitaliseerde cellen in de biologische veiligheidskabinet (BSC) nadat de buitenkant is afgeveegd met 70% ethanol.
  4. Breng de cellen voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 50 mL en voeg druppelsgewijs 9 mL warm groeimedium toe aan de cellen. Meng voorzichtig.
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 × g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).
  6. Breng de geresuspendeerde cellen in 5 mL voorverwarmd groeimedium over naar een nieuwe T-25 fles.
  7. Kweek de cellen tot 80%–90% confluentie in een incubator van 37°C met 5% CO2 vóór de volgende celsubcultuur. 
  8. Passageer de cellen.
    1. Aspireer het medium en was de cellaag voorzichtig twee keer met 3 mL 1× calcium- en magnesiumvrije Phosphate-Buffered Saline (PBS) om resterend groeimedium te verwijderen.
    2. Voeg 2 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de fles om de cellen te bedekken.
    3. Na 2–5 min incubatie bij 37°C wordt de trypsine geneutraliseerd door een 5-voudig volume voorverwarmd groeimedium toe te voegen.
    4. Resuspendeer de cellen door de celsuspensie voorzichtig tegen de wand van de fles op en neer te pipetteren.
    5. Zaai de cellen uit met vers medium tegen de gewenste zaaidichtheid of split-ratio. 
      OPMERKING: De gewenste zaaidichtheid wordt empirisch bepaald op basis van de celgroeisnelheid, de passagefrequentie en de doelconfluentie op het moment van passageren. Bijvoorbeeld, het zaaien van Vero CCL-81 cellen bij een minimum van 0,4 × 104 cellen/cm2 maakt het mogelijk de cellen elke 3 dagen te passageren voordat ze 90% confluentie bereiken.

2. Screening van antivirale middelen

OPMERKING: Figuur 1 illustreert de workflow van de op impedantie gebaseerde antivirale screeningsassay. Kort samengevat worden permissieve cellen uitgezaaid in 96-well microplaten met geïntegreerde micro-elektroden, waarbij de celprestaties ongeveer 24 u voor de assay worden gemonitord. Voor antilichaamneutralisatietests worden virussen bij een vaste multipliciteit van infectie (MOI) gemengd met antilichamen en 1 u gepreïncubeerd voordat ze aan de cellen worden toegevoegd. Bij screening op antivirale verbindingen worden virussen bij een vaste MOI en verbindingen daarentegen gelijktijdig aan de cellen toegevoegd. Door het virus geïnduceerde CPE wordt continu gemonitord met behulp van op impedantie gebaseerde uitlezingen, en de data-analyse kan worden uitgevoerd tijdens de assay of na voltooiing ervan.

  1. Dag 0: Meting van de plaatachtergrond en uitzaaien van permissieve cellen
    1. Om een experiment te starten, opent u de instrumentsoftware (RTCA Pro) en selecteert u de gewenste houder voor de assay. Kies vervolgens de module Virology voordat u het experiment start.
    2. Voer alle relevante notities in het tabblad Exp Notes in (bijv. Experiment Name, Device SN, Device Type of andere relevante details). Deze velden zijn optioneel en kunnen leeg worden gelaten indien niet van toepassing.
    3. Ga naar het tabblad Layout en definieer de wells die in het experiment worden gebruikt. Als bepaalde wells niet worden gebruikt, selecteert u de ongebruikte wells, klikt u met de rechtermuisknop in de interface van de plaatindeling en selecteert u Turn Off Well(s) uit het dropdownmenu om deze uit te sluiten van de assay.
    4. Meting van de achtergrond van de microelectrode-geïntegreerde 96-wells microplaat
      1. Dispenseer 50 µL assaymedium in elke well van de plaat met een multichannelpipet in reverse pipetteermodus om belvorming te minimaliseren.
        OPMERKING: De keuze van het assaymedium moet vóór de screening worden geoptimaliseerd om interferentie met de gevoeligheid van de assay te minimaliseren en een nauwkeurige beoordeling van de effectiviteit van de behandeling te garanderen. Zo werden antilichaamneutralisatie-assays uitgevoerd in DMEM met 2% FBS en 1% penicilline-streptomycine, terwijl screening-assays voor antivirale verbindingen gebruikmaakten van celgroeimedium, DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
      2. Plaats de plaat in de instrumenthouder in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Zorg ervoor dat de plaat correct is georiënteerd met well A1 op de aangegeven positie. Controleer vervolgens het tabblad Message op foutmeldingen.
        OPMERKING: Controleer elke keer dat de plaat in de houder wordt geplaatst of het bericht ‘‘Plate scanned. Connections okay’’ wordt weergegeven. Als er een fout optreedt, verwijdert u de plaat en plaatst u deze opnieuw in de houder.
      3. Ga naar het tabblad Schedule; Stap 1 verschijnt standaard, aangezien dit een vereiste stap is voor de meting van de plaatachtergrond. Klik op de knop Start om de registratie vanuit de wells te starten. De stap wordt automatisch beëindigd nadat er één achtergrondimpedantiemeting is geregistreerd.
        OPMERKING: Deze achtergrondstap moet vóór elk experiment worden uitgevoerd. Alle wells die in het experiment worden gebruikt, mogen alleen assaymedium bevatten (d.w.z. vóór het uitzaaien van de cellen).
    5. Uitzaaien van permissieve cellen in de microelectrode-geïntegreerde 96-wells plaat
      1. Trypsiniseer de permissieve cellen in de T25-fles volgens de stappen die worden beschreven in de sectie over het passeren van permissieve cellen.
      2. Tel de in het assaymedium geresuspendeerde cellen en voer de volgende berekeningen uit:
        1. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen in de suspensie met behulp van de dichtheid van levensvatbare cellen: Totaal aantal levensvatbare cellen = dichtheid levensvatbare cellen × suspensievolume
        2. Pas de celsuspensie aan naar een uiteindelijke dichtheid (bijv. 0,30–0,35 × 106 cellen/mL voor Vero CCL-81, wat overeenkomt met ongeveer 15.000–18.000 cellen per 50 µL, of 0,12 × 106 cellen/mL voor HEK293A, wat overeenkomt met 6.000 cellen per 50 µL).
          OPMERKING: Deze zaaidichtheden zijn eerder bepaald als optimaal voor elk virus-celmodel. De juiste zaaidichtheid van de cellen is essentieel, aangezien het gebruik van te veel of te weinig cellen de gevoeligheid van de assay kan beïnvloeden.
      3. Verwijder de microplaat met 50 µL assaymedium uit het instrument en breng deze over naar de BSC voor het uitzaaien van de cellen.
      4. Dispenseer 50 µL van de celsuspensie in elke well van de plaat met een multichannelpipet in reverse pipetteermodus om belvorming te minimaliseren, waardoor het uiteindelijke volume van elke well 100 µL wordt.
    6. Laat de plaat na toevoeging van de cellen 30 min bij kamertemperatuur in de BSC staan om een gelijkmatige verdeling van de cellen op de bodem van elke well mogelijk te maken.
    7. Plaats de plaat terug in de instrumenthouder in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Als er meerdere platen worden gebruikt, labelt u elke plaat duidelijk en zorgt u ervoor dat deze wordt teruggeplaatst in dezelfde houder die tijdens de achtergrondmeting is gebruikt.
    8. Ga naar het tabblad Layout en open het subtabblad Cell. Selecteer de juiste wells, voer de Name en het Number van de permissieve cel in en klik op Apply om de informatie op te slaan. Celinformatie kan op elk gewenst moment tijdens het experiment worden ingevoerd of bijgewerkt.
    9. Voeg Stap 2 toe op het tabblad Schedule met de standaardregistratie-instellingen (100 sweeps en een interval van 15 min), en klik vervolgens op Start om de continue monitoring van celhechting en proliferatie gedurende de nacht te starten.
      OPMERKING: Deze stap dient als een kwaliteitscontrole (QC) voor de cellen vóór de virusinoculatie. Aangezien de Cell Index (CI) de celhechting en proliferatie weerspiegelt, worden de CI-waarden die tijdens de periode van 18–24 uur na het uitzaaien worden verkregen, gebruikt als een belangrijke QC-metriek. Reproduceerbaar celgedrag over verschillende experimenten is essentieel voor een optimale reproduceerbaarheid van de assay. Opvallend is dat zowel de CI-amplitude als de kinetische profielen celtype-specifiek zijn. Zo vertonen gezonde Vero CCL-81 cellen die zijn uitgezaaid met 18.000 cellen/well na een nachtelijke kweek doorgaans een Cell Index van 6–8, terwijl gezonde HEK293A cellen uitgezaaid met 6.000 cellen/well over het algemeen een Cell Index van 0,8–1,2 vertonen.
  2. Dag 1: Impedantie-gebaseerde screening van antivirale middelen
    OPMERKING: Vóór het uitvoeren van de screening-assay moet het virus op de juiste wijze getitreerd worden om de optimale werkverdunning te bepalen. Deze stap stelt een virusconcentratie vast die een robuuste, reproduceerbare assayprestatie ondersteunt terwijl aan door de gebruiker gedefinieerde vereisten wordt voldaan, zoals de gewenste assayduur. In het antilichaamneutralisatieprotocol11 werd bijvoorbeeld een multiplicity of infection (MOI) van 0,01 gekozen voor de neutralisatie-assay, omdat dit leidde tot volledige (100%) CPE binnen 40 uur na inoculatie. In de impedantie-gebaseerde assay wordt volledige CPE aangegeven door een daling van de Cell Index of Normalized Cell Index naar nul. Tijdens de screening van antivirale verbindingen werd een MOI van 1 gebruikt, waarbij 100% CPE werd waargenomen binnen 70 uur na inoculatie. Het virustitratieprotocol volgde gevestigde procedures zoals beschreven in een eerder rapport12. Indien infectieuze virussen in de assay worden gebruikt, dient te worden gewaarborgd dat alle toepasbare veiligheidsvoorschriften worden nageleefd. Raadpleeg de sectie over veiligheidsrichtlijnen voor het omgaan met infectieuze virussen.
    1. Bereid het virus voor in de vooraf bepaalde concentratie en maak seriële verdunningen van het antilichaam of de antivirale verbinding in assaymedium.
    2. Voor monoclonal antilichaamneutralisatie-assays mengt u 60 µL virus bij 4× de uiteindelijke assayconcentratie met 60 µL antilichaam bij 4× de uiteindelijke assayconcentratie en incubeert u dit 1 uur bij 37 °C vóór toevoeging aan de permissieve cellen. Na het mengen zijn het virus en het antilichaam aanwezig in 2× hun uiteindelijke assayconcentraties. Daarentegen is voor screening-assays van antivirale verbindingen geen preincubatie van virus-verbinding vereist.
    3. Ga naar het tabblad Layout en selecteer het subtabblad Treatment om behandelingsinformatie over antivirale middelen in de juiste wells in te voeren.
    4. Selecteer de wells voor dezelfde behandeling, voer vervolgens de Name van de middelen in en voer de begin-Dilution of Concentration in. Als de startconcentratie bijvoorbeeld 10 µg/mL is, voert u 10 in en selecteert u µg/mL als de „Unit”. Voer 3 in als de Dilution Factor en specificeer de Direction van verdunning (bijv. Top to Bottom).
      OPMERKING: Na het klikken op Apply worden de concentraties of verdunningen van het antivirale middel automatisch berekend en opgeslagen op basis van de invoer van de plaatindeling en weergegeven in de overeenkomstige wells. De berekende waarden worden ook opgeslagen voor latere data-analyse. Het invoeren van virusinformatie (bijv. Name en Dilution) is optioneel, aangezien de assay een enkele vaste MOI gebruikt voor alle virusbehandelde wells.
    5. Wijs wells die alleen met virus zijn behandeld toe als positieve controles door de juiste wells te selecteren en Positive ctrl te kiezen onder Well Type.
    6. Wijs niet-geïnfecteerde wells toe als negatieve controles door de bovenstaande stap te volgen en Negative ctrl aan te vinken onder Well Type.
      OPMERKING: De juiste toewijzing van alleen-virus- en niet-geïnfecteerde wells als respectievelijk Positive ctrl en Negative ctrl met behulp van de Well Type-instelling is cruciaal, omdat de CI-waarden van deze wells worden gebruikt in alle neutralisatie-gerelateerde berekeningen (bijv. %Neutralisatie). Voor CPE-gerelateerde berekeningen (bijv. %CPE) zijn expliciet aangewezen negatieve-controle-wells vereist. Voor antilichaamneutralisatie-assays wordt sterk aanbevolen om zowel positieve als negatieve controle-antilichamen op dezelfde plaat op te nemen om een nauwkeurige interpretatie van de gegevens te garanderen. Deze controle-antilichamen moeten echter worden aangeduid als Samples onder Well Type.
    7. Wanneer de assay klaar is voor de toevoeging van het antivirale middel, drukt u op de knop Abort Current Step om de resterende sweeps in Stap 2 over te slaan en door te gaan naar de volgende stap.
    8. Klik op de knop Unlock Plate, verwijder vervolgens de plaat uit de houder en plaats deze in de BSC.
    9. Dispenseer voorzichtig 100 µL van het virus-antilichaammengsel of virus-antiviraal verbindingmengsel in elke well met een multichannelpipet, wat resulteert in een uiteindelijk well-volume van 200 µL. Het inoculum bevat virus en antilichaam of antiviraal middel in 2× hun uiteindelijke assayconcentraties, die bij toevoeging aan de cellen worden verdund tot de uiteindelijke werkconcentraties.
    10. Nadat u de plaat in de houder heeft teruggeplaatst, gaat u naar het tabblad Schedule en voegt u Stap 3 toe. Specificeer het aantal Sweeps en het Interval tussen de sweeps. Zorg ervoor dat de totale sweepduur (aantal sweeps × interval) langer is dan de verwachte behandelingsduur. Klik op Start om de data-acquisitie te hervatten en de assay voort te zetten.
      OPMERKING: Het aanwijzen van een aparte stap (bijv. Stap 3) na toevoeging van het antivirale middel vergemakkelijkt de identificatie van de monitoringperiode na de behandeling. Programmeer elke stap (behalve Stap 1) altijd zo dat deze langer loopt dan de verwachte assayduur. Als de geprogrammeerde looptijd wordt bereikt, stopt het instrument met het verzamelen van metingen, wat resulteert in ontbrekende datapunten.
  3. Dag 1 en verder: Data-analyse
    1. Om de real-time registratie en/of analyse van cellulaire responsen tijdens de data-acquisitie te bekijken, gaat u naar het tabblad Data Analysis, selecteert u een specifiek tijdstip of tijdsinterval, en selecteert en voegt u vervolgens de wells toe die in de analyse moeten worden opgenomen voor weergave op de grafiek.
    2. Selecteer parameters uit het dropdownmenu Y-axis . Wanneer Normalized Cell Index (NCI) is geselecteerd, specificeert u de Normalization Time, het tijdstip direct vóór de behandeling, uit de tijdsdropdownlijst. %CPE of %Neutralization kan ook worden weergegeven door de overeenkomstige optie uit het dropdownmenu van de Y-as te selecteren.
      OPMERKING: Het instrument gebruikt een eenheidsloze parameter, Cell Index (CI), om impedantie weer te geven. De Normalized Cell Index (NCI) wordt aanbevolen voor het evalueren van behandelingsverschillen terwijl de impact van inherente variatie tussen wells wordt geminimaliseerd.
    3. Ga naar de sectie Parameter op het tabblad Data Analysis om verschillende soorten figuren te berekenen en te genereren, zoals een staafdiagram en 4-parameter logistieke (4PL, variabele helling) regressie dosis-respons-curves op een specifiek tijdstip (bijv. op het middenpunt of eindpunt van de assay). Alternatief biedt de IC₅₀, afgeleid van de oppervlakte onder de curve (AUC) van de Cell Index of Normalized Cell Index na behandeling, een maat voor de totale dosis-respons van antivirale middelen gedurende de behandelingsperiode.
    4. Klik aan het einde van de test op Pause en druk vervolgens op de knop Unlock Plate. Verwijder de plaat uit de houder en Release deze elektronisch via het menu Plate.

3. Veiligheidsrichtlijnen voor het omgaan met infectieuze virussen

  1. Draag适当 PBM door middel van dubbele handschoenen, een gelaatsscherm en een laboratoriumjas. Dit wordt sterk aanbevolen bij het werken met virussen.
  2. Hanteer virusbevattende materialen en voeg deze uitsluitend binnen een operationele BSC toe aan de platen.
  3. Transporteer de virusbuisjes en alle platen die virussen bevatten van en naar de BSC in een afgesloten biosafety-container.
  4. Spuit vóór en na het hanteren van virusbevattende materialen in de BSC alle binnenoppervlakken grondig in met een desinfectiemiddel en hanteer een contacttijd van 5 min om volledige virale inactivatie te garanderen. Veeg de oppervlakken schoon en desinfecteer ze vervolgens met 70% ethanol om eventueel resterend desinfectiemiddel te verwijderen.
  5. Verwijder na voltooiing van de op impedantie gebaseerde antivirale screeningassay alle platen uit het instrument en transporteer deze met een afgesloten biosafety-container direct naar een schone BSC.
  6. Bereid een verse 20% bleekoplossing en voeg deze toe aan elke put op de assayplaten. Laat het bleekmiddel 10 min inwerken voordat het uit alle putten wordt geaspireerd en de platen worden weggegooid.
  7. Decontamineer alle assayplaten, serologische pipetten, pipetpunten, buisjes en andere wegwerpplastics die in contact kunnen zijn gekomen met het virus met bleekmiddel, en voer deze af in aangewezen zakken voor biologisch gevaarlijk afval.
  8. Spuit niet-wegwerpbare plastics, zoals buisjesrekken en pipetten, in met een desinfectiemiddel en veeg ze schoon.

Resultaten

Labelvrije, real-time impedantie-uitlezing onthult virus-geïnduceerde CPE en antivirale bescherming
Zoals weergegeven in Figuur 2A, werden HEK293A gastcellen gezaaid in een 96-wells plaat met geïntegreerde micro-elektroden bij een dichtheid van 6.000 cellen per well13. Na een incubatie van 24 u werd adenovirus type 5 toegevoegd bij een MOI van 1 in de aanwezigheid of afwezigheid van antivirale verbindingen. Cellulaire responsen op virale infectie en antivirale behandeling werden continu gemonitord met behulp van real-time, labelvrije impedantiemetingen. In afwezigheid van het virus prolifereerden de cellen continu gedurende de monitoringsperiode van 80 u, waarbij confluentie werd bereikt, zoals aangegeven door een gestage toename van de impedantie gevolgd door een plateau. Adenovirusinfectie liet aanvankelijk celgroei toe gedurende ongeveer 20 u, waarna een uitgesproken CPE werd waargenomen, wat resulteerde in een snelle daling van het impedantiesignaal naar de basislijn rond 65 u na infectie. Behandeling met stavudine (50 µM) of ribavirine (20 µM) had een minimaal effect op de virus-geïnduceerde CPE, waarbij de impedantietraceringen sterk leken op die van cellen die alleen met het virus waren geïnfecteerd. Ganciclovir (50 µM) vertoonde bescheiden antivirale activiteit, evidenced door een gedeeltig herstel van de Normalized Cell Index. In contrast hiermee attenuateerden cidofovir (50 µM) en brincidofovir (1 µM) de CPE aanzienlijk, wat resulteerde in impedantieprofielen die vergelijkbaar waren met die waargenomen in niet-geïnfecteerde negatieve controlecellen. Opmerkelijk is dat geen van de verbindingen de Cell Index significant beïnvloedde in vergelijking met de met vehicle behandelde controles bij de geteste concentraties in preliminaire studies (gegevens niet getoond).

In een op impedantie gebaseerde antilichaamneutralisatie-assay werden Vero CCL-81-cellen gezaaid met een dichtheid van 18.000 cellen per well op een 96-well plaat met geïntegreerde micro-elektroden en gedurende 24 u gekweekt vóór infectie. Op de dag van de assay werden monoclonale antilichamen gedurende 1 u gepreïncubeerd met rVSV–LASV bij een MOI van 0,01 voordat ze aan de cellen werden toegevoegd. Er werden verschillende neutralisatieprofielen waargenomen bij de geteste monoclonale antilichamen (mAbs). Ter verduidelijking presenteert Figuur 2B representatieve resultaten van antilichamen die potente, partiële of geen neutraliserende activiteit vertonen. Niet-neutraliserende antilichamen induceerden volledige CPE, waarbij de impedantiesporen overlapten met die van de virus-alleen controles. Antilichamen met een intermediaire neutraliserende activiteit reduceerden de virus-geïnduceerde cytotoxiciteit gedeeltelijk, wat resulteerde in verminderde maar detecteerbare CPE. In contrast hiermee remden volledig neutraliserende antilichamen de CPE volledig, waardoor impedantiesignalen werden behouden die vergelijkbaar waren met die van niet-geïnfecteerde celcontroles. Samen maakten deze impedantieprofielen een duidelijke differentiatie mogelijk tussen niet-neutraliserende, gedeeltelijk neutraliserende en volledig neutraliserende monoclonale antilichamen.

Kwantificering en karakterisering van antivirale activiteit
Nadat de mogelijkheid van de impedantie-gebaseerde RTCA-assay om "hits" te identificeren uit een bibliotheek van geneesmiddelen en mAb's was aangetoond, streefde de studie vervolgens naar het karakteriseren van de effectiviteit van de leidende verbindingen en antilichamen. Een progressieve verhoging van de concentratie van het antivirale middel brincidofovir van 15,6 nM naar 1.000 nM resulteert in een stapsgewijze toename van het impedantiesignaal; hoe hoger de concentratie van het middel, hoe meer de cellen zich gedragen als de niet-geïnfecteerde controle (Afbeelding 3A). Bovendien leidde behandeling met alleen brincidofovir slechts bij de hoogste geteste concentratie (1100 nM) tot een marginale toename van de NCI. Echter, bij concentraties onder de 1100 nM nam de NCI matig af, hoewel dit effect niet dosisafhankelijk was. Dit resultaat geeft aan dat het herstel van de Cell Index uitsluitend toe te schrijven was aan de antivirale activiteit van het middel en niet aan een directe stimulatie van de celproliferatie of -aanhechting (Afbeelding 3B). Het uitzetten van de oppervlakte onder de Normalized Cell Index (AUC) als functie van de brincidofovirconcentratie levert de dosis-responscurve op, die een uitstekende fit vertoont (R2 van 0,99) en wijst op een IC50 van 265 nM (Afbeelding 3C). In de antilichaam-neutralisatieassay berekende de systeemsoftware aan het einde van de assay (ongeveer 50 u na behandeling) automatisch de neutralisatiepercentages bij elke mAb-concentratie, waarna de IC50-waarden werden afgeleid. Zoals getoond in Afbeelding 3D, vertoonden in tegenstelling tot het negatieve controle-antilichaam rANDV-5 de andere drie mAb's, r37.2D, r25.1C en r12.1F, een hoge antivirale potentie, met IC₅₀-waarden van respectievelijk 4.315 ng/mL, 83 ng/mL of 232 ng/mL14,15.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van de workflow voor de op impedantie gebaseerde antivirale screeningassay. Dag 0, Stap 1: Permissieve cellen werden uitgezaaid in microplaten en de celgroei werd gemonitord in de instrumenthouder in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende ongeveer 24 u. Dag 1, Stap 2: Het virus werd klaargemaakt bij een vaste MOI en seriële verdunningen van antivirale middelen. Voor antilichaamneutralisatieassays werd het virus vooraf 1 u bij 37 °C gepreincubeerd met antilichamen voordat het mengsel aan de cellen werd toegevoegd. Stap 3: Mengsels van virus en antivirale middelen werden aan de cellen toegevoegd. Dag 1 en daarna, Stap 4: De door het virus geïnduceerde CPE werd gedurende meerdere dagen continu gemonitord met behulp van impedantiemetingen. Stap 5: De gegevens werden in real-time of na voltooiing van de assay geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Real-time monitoring van antivirale activiteit met behulp van impedantie-gebaseerde Cell Index-metingen. (A) Screening van antivirale middelen beoordeeld via impedantieanalyse. Alle verbindingen werden getest bij 50 µM, behalve ribavirine (20 µM) en brincidofovir (1 µM) in aanwezigheid van adenovirus type 5 bij een MOI van 1. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van drie replicate wells. De figuur is aangepast van Zhang et al.13. (B) Impedantie-gebaseerde neutralisatie-assay met monoklonale antilichamen. Representatieve Cell Index-profielen worden getoond voor monoklonale antilichamen die geen neutralisatie vertonen (volledige CPE, rood), gedeeltelijke neutralisatie (gedeeltelijke CPE, oranje), of potente neutralisatie (geen detecteerbare CPE, zwart). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kwantificering van antivirale activiteit met behulp van impedantie. (A) Dynamische veranderingen van de real-time genormaliseerde celindex na behandeling met toenemende concentraties brincidofovir in combinatie met een adenovirus type 5 infectie bij een MOI van 1. (B) Dynamische veranderingen van de real-time genormaliseerde celindex na behandeling met toenemende concentraties brincidofovir alleen. (C) De oppervlakte onder de impedantiecurven werd uitgezet als functie van brincidofovir om een dosis-responscurve te verkrijgen. (A) en (C) zijn aangepast van Zhang et al.13. (D) Representatieve rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) neutralisatiecurven voor monoklonale antilichamen r37.2D, r25.1C, r12.1F, en rANDV-5 als negatieve controle. Monoklonale antilichamen 37.2D, 25.1C, 12.1F, en ANDV-5 werden recombinant geproduceerd op basis van bestaande literatuur (zie sectie Resultaten). De getoonde gegevens zijn representatieve curven van twee onafhankelijke experimenten en worden gerapporteerd als het gemiddelde ± SD van drie replica-wells. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Zoals alle celgebaseerde assays, vereist de RTCA-antivirale screeningassay optimalisatie voor elk virus-celsysteem. Omdat de assay virus-geïnduceerde CPE detecteert via impedantiewijzigingen, is deze afhankelijk van een permissief celmodel dat virale replicatie en meetbare CPE ondersteunt. Virussen die geen impedantie-detecteerbare CPE genereren, zijn mogelijk niet geschikt voor deze aanpak; in dergelijke gevallen kunnen alternatieve methoden zoals FRNT worden gebruikt wanneer virus-specifieke antilichamen beschikbaar zijn. Een andere belangrijke overweging is dat wijzigingen in de Cell Index niet uitsluitend worden veroorzaakt door virus-geïnduceerde cytolyse. Veranderingen in celmorfologie, adhesie, proliferatie en aanhechting kunnen ook de impedantiesignalen beïnvloeden en potentieel de beoordeling van de antivirale activiteit verstoren. Daarom moeten de effecten van antivirale middelen op de Cell Index worden geëvalueerd in preliminaire studies of via passende controles met enkel het middel. In de huidige studie zijn, om het aantal geëvalueerde middelen per plaat te maximaliseren, controles met enkel het antivirale middel getest vóór de screeningassay om de baseline-effecten van elke kandidaat in afwezigheid van virale infectie vast te stellen. De prestaties van de assay worden ook beïnvloed door factoren zoals de zaaidichtheid van de cellen, het tijdstip van virusinoculatie en de mediumcondities, die de celgroei, virale replicatie, CPE-ontwikkeling en de reproduceerbaarheid van de assay kunnen beïnvloeden7,10,16. Bijgevolg is systematische optimalisatie essentieel voor een robuuste en betrouwbare RTCA-gebaseerde antivirale screening.

Nadat de optimale assaycondities zijn vastgesteld, vereist de succesvolle implementatie van impedantie-gebaseerde real-time antivirale assays een consistente celuitplating, gezonde cellen en stabiele assaycondities. Een hoge variabiliteit tussen de wells wordt vaak veroorzaakt door een ongelijkmatige celverdeling of onnauwkeurig pipetteren; daarom moeten celsuspensies grondig worden gemengd vóór het uitplaten, en moeten platen na het uitplaten 30 min op RT blijven staan om een uniforme bezinking van de cellen te bevorderen en randeffecten te verminderen. Minimaal drie replica's per behandeling worden aanbevolen, terwijl extra replica's voor negatieve (niet-geïnfecteerde) en positieve (alleen virus) controles sterk worden aangemoedigd, aangezien deze waarden dienen als referentiepunten voor de berekeningen van %CPE en %Neutralisatie over alle behandelingscondities. Als de door het virus geïnduceerde CPE zwak of inconsistent is, moet de kwaliteit van de virusstock en de gezondheid van de permissieve cellijn worden geverifieerd. Om de virale infectiviteit te behouden, moeten herhaalde vries-dooi-cycli worden vermeden door eenmalig te gebruiken virusaliquoten voor elk experiment voor te bereiden. Ten slotte wordt het gebruik van een celbank met permissieve cellen met een consistent passagenummer sterk aanbevolen om experimentele variabiliteit te minimaliseren en de reproduceerbaarheid van de assay te verbeteren. Indien de Cell Index die direct vóór infectie wordt gemeten (typisch ongeveer 24 h na uitplating) onder de vastgestelde benchmark voor de permissieve cellijn valt, wat duidt op suboptimale celgezondheid of groei, moet het experiment worden gestaakt. In dergelijke gevallen moet een nieuw vial cryogebewaarde cellen worden ontdooid en moet de antivirale screeningassay worden herhaald.

Wanneer de antivirale screeningassay wordt uitgevoerd onder goed gecontroleerde, geoptimaliseerde omstandigheden, zoals aangetoond door de hier gepresenteerde screeningsgegevens, kan de impedantiegebaseerde assay de real-time reductie van CPE door antivirale middelen nauwkeurig kwantificeren. In tegenstelling tot traditionele benaderingen die afhankelijk zijn van arbeidsintensieve eindpuntmetingen, maakt de continue en niet-invasieve impedantie-uitlezing longitudinale monitoring mogelijk van het volledige spectrum aan virus-geïnduceerde cellulaire schade en de kinetische profielen van antivirale responsen. Deze real-time meetmogelijkheid vergemakkelijkt de identificatie van optimale temporele vensters voor het detecteren van niet alleen vroegtijdig werkende, maar ook vertraagde antivirale effecten die conventionele eindpuntassays mogelijk missen.

Bovendien biedt het hier beschreven RTCA-protocol een snellere en aanzienlijk vereenvoudigde workflow voor antivirale screening in vergelijking met traditionele methoden. De assay vereist slechts een initiële stap voor het uitplaatten van cellen, gevolgd door de toevoeging van het virus in de aanwezigheid of afwezigheid van antivirale middelen. Er is geen aanvullende handling of verwerking na de assay nodig. De experimentele opzet en data-analyse worden verder gestroomlijnd door de aangepaste Virology-softwaremodule van het systeem, die automatische berekening mogelijk maakt van parameters die gebruikelijk zijn in VRNT, waaronder %CPE, %neutralisatie en de hoogste verdunning of laagste concentratie van een antiviraal middel die een door de gebruiker gedefinieerd neutralisatieniveau bereikt. Gezamenlijk maken deze voordelen een snelle en parallelle screening van veel meer assaycondities mogelijk (vergelijkingen tussen geneesmiddelen, uitgebreide verdunningsreeksen, etc.) dan gewoonlijk mogelijk is met traditionele methoden.

Hoewel de hier beschreven assay is ontwikkeld in een 96-wells plaatformaat, met de hierboven beschreven geschikte assay-condities, kan deze worden aangepast naar een 384-wells plaatformaat. Om deze assay met een hogere doorvoersnelheid op basis van impedantie te ondersteunen, kan een geautomatiseerd impedantiegebaseerd RTCA-systeem worden ingezet, waarmee de gelijktijdige verwerking van maximaal vier 384-wells platen mogelijk is.

Naast antivirale screening kan deze RTCA-methode worden toegepast voor studies naar combinatietherapie, serologie en onderzoek naar virale immuunontwijking. Door de capaciteit van therapeutische antilichamen of immuunsera om door het virus geïnduceerde CPE te voorkomen te meten, biedt de assay een labelvrije real-time beoordeling van de neutraliserende activiteit en beschermende immuunresponsen na infectie of vaccinatie. Daarnaast kan het vergelijken van neutralisatieprofielen tussen virale varianten veranderingen in gevoeligheid onthullen die geassocieerd zijn met immuunontwijking. In combinatie met genomische sequencing kan deze benadering de identificatie van antilichaam-resistente varianten faciliteren en de ontwikkeling van volgende-generatie vaccins, antilichaamtherapieën en antivirale strategieën ondersteunen.

Openbaarmakingen

J.E.C. is adviseur geweest voor Moderna en Merck, is de oprichter van IDBiologics en ontvangt royalty's van UpToDate. Het laboratorium van J.E.C. heeft tijdens de uitvoering van de studie niet-gerelateerde gesponsorde onderzoeksovereenkomsten ontvangen van IDBiologics.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door beurzen U19 AI181979 en U19AI181930 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) van de US National Institutes of Health.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Brincidofovir (CMX001)AdooQA13326
CaviCideMetrex13-5024desinfectiemiddel 
CidofovirSelleck S1516
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
E-Plate 96Agilent5232368001micro-elektrode-geïntegreerde 96-well plaat
Foetaal runderserumAvantor97068-085
Ganciclovir Sodium Selleck S5065
HEK293A-celThermo Fisher Scientific  R70507
Multichannel ViafloINTEGRAVIAFLO 96
Penicilline-streptomycine-oplossingGibco10378016
Phosphate buffered saline (1x)HyCloneSH30256.01
Recombinante mAbsCrowe LabN/A
RibavirineSelleck S2504
rVSV-LASV (Lin IV)Crowe LabN/A
Stavudine Selleck S1398
0.25% Trypsine 0.53 mM EDTA  (1x )ATCC30-2101
12-kanaals reagentiereservoirsVistaLab Technologies3054-1011
Vero CCL-81ATCCCCL-81
Virologie-moduleAgilentS2807-90089
xCELLigence RTCA MP-systeemAgilent380601040

Referenties

  1. Pardi N, Weissman D. Development of vaccines and antivirals for combating viral pandemics. Nat Biomed Eng. 2020;4(12):1128-1133.
  2. Rocha VPC, Quadros HC, Fernandes AMS, Gonçalves LP, Badaró R, Soares MBP, et al. An overview of the conventional and novel methods employed for SARS-CoV-2 neutralizing antibody measurement. Viruses. 2023;15(7). doi:10.3390/v15071552.
  3. Chen CZ, Shinn P, Itkin Z, Eastman RT, Bostwick R, Rasmussen L, et al. Drug repurposing screen for compounds inhibiting the cytopathic effect of SARS-CoV-2. Front Pharmacol. 2021;11:592737.
  4. Giaever I, Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 1993;366(6455):591-592.
  5. Giaever I, Keese CR. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(17):7896-7900.
  6. Suryadevara N, Shrihari S, Gilchuk P, VanBlargan LA, Binshtein E, Zost SJ, et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell. 2021;184(9):2316-2331.e15.
  7. Charretier C, Saulnier A, Benair L, Armanet C, Bassard I, Daulon S, et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018;252:57-64.
  8. Ebersohn K, Coetzee P, Venter EH. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014;199:25-28.
  9. Marlina S, Shu MH, Abubakar S, Zandi K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasit Vectors. 2015;8:240.
  10. Teng Z, Kuang X, Wang J, Zhang X. Real-time cell analysis—a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. J Virol Methods. 2013;193(2):364-370.
  11. Suryadevara N, Gilchuk P, Zost SJ, Mittal N, Zhao LL, Crowe JE Jr, et al. Real-time cell analysis: a high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 2022;3(2):101387.
  12. Zhang J, Abassi YA, Li N, Wang X, Zhang X. A streamlined, label-free real-time 50% tissue culture infectious dose (TCID50) assay using impedance for automated viral titer quantification. J Vis Exp. 2026;(227). doi:10.3791/73686.
  13. Zhang J, Giang C, Li N, Abassi YA, Lamarche BJ. Screening and characterizing antiviral drugs in real time using xCELLigence RTCA eSight's combination of impedance and imaging. Agilent Technologies; 2022.
  14. Engdahl TB, Kuzmina NA, Ronk AJ, Mire CE, Hyde MA, Kose N, et al. Broad and potently neutralizing monoclonal antibodies isolated from human survivors of New World hantavirus infection. Cell Rep. 2021;35(5):109086.
  15. Robinson JE, Hastie KM, Cross RW, Yenni RE, Elliott DH, Rouelle JA, et al. Most neutralizing human monoclonal antibodies target novel epitopes requiring both Lassa virus glycoprotein subunits. Nat Commun. 2016;7:11544.
  16. Piret J, Goyette N, Boivin G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. J Clin Microbiol. 2016;54(8):2120-2127.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Impedantiegebaseerde screeningcytopathische effectenreal time monitoringcelcultuur monolagenvirusinfectie assayhigh throughput screeningantivirale effectiviteitmonoklonale antilichamencelviabiliteit
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.