Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Snelverslag
Deze studie suggereert dat dimethylsulfoxide (DMSO) silica-geïnduceerde pulmonale inflammatie en fibrose bij muizen kan verlichten. Transcriptomische en experimentele analyses suggereren dat de beschermende effecten mogelijk verband houden met de onderdrukking van de IL-6/STAT3-signaleringsroute en de downregulatie van de MMP12-expressie, wat potentiële therapeutische inzichten biedt voor de behandeling van silicose.
Deze studie heeft tot doel de ontstekingsremmende en antifibrotische effecten van dimethylsulfoxide (DMSO) te onderzoeken in een muismodel voor silicose, om zo de potentiële therapeutische waarde ervan te verkennen.
Een muismodel voor silicose werd vastgesteld door intranasale instillatie, en DMSO-behandeling werd toegediend via intraperitonele injectie. Het experiment werd uitgevoerd over een periode van 1 maand. Longweefsels werden verzameld van alle muizen; een subset werd onderworpen aan transcriptomische analyse, en differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd met behulp van het limma-pakket. Gene ontology (GO) en Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met ClusterProfiler om genfuncties en geassocieerde pathways te onderzoeken. De overige monsters werden onderworpen aan histopathologische beoordeling door hematoxyline- en eosinekleuring (HE) en Masson's trichroomkleuring, terwijl Western blot-analyse werd uitgevoerd om de transcriptomische resultaten te valideren.
Deze studie suggereert dat DMSO het fibrotische proces bij silicose kan verlichten door de IL-6/STAT3-MMP12-signaleringsas te moduleren. In het silica-geïnduceerde muismodel voor silicose verminderde DMSO het ziekte-geassocieerde gewichtsverlies en reduceerde het de collageendepositie. Transcriptomanalyse wees uit dat DMSO de activiteit van meerdere fibrose-gerelateerde routes onderdrukte en identificeerde 51 sleutelgenen, waaronder MMP12, dat significant downgereguleerd was. Western blot-analyse bevestigde verder een verminderde expressie van MMP12, gepaard gaande met merkbaar verlaagde niveaus van IL-6 en p-STAT3, wat suggereert dat de IL-6/STAT3-route een cruciale rol kan spelen bij het reguleren van de MMP12-expressie.
DMSO kan inflammatoire reacties en longfibrose bij silicose verminderen door de activering van de IL-6/STAT3-signaleringsroute te remmen, waardoor de MMP12-expressie wordt verlaagd.
Silicose is een van de belangrijkste vormen van beroepsmatige pneumoconiose1, gekenmerkt door aanhoudende pulmonale ontsteking en onomkeerbare pulmonale fibrose als gevolg van langdurige blootstelling aan silicastof2,3. De pathogenese van deze silicose is zeer complex. Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat aberrante macrofaagactivatie4, overmatige proliferatie van fibroblasten, epitheliale-mesenchymale transitie en abnormale depositie van extracellulaire matrix (ECM)-componenten kritische bijdragers zijn aan de fibrotische ontwikkeling5,6. De kern van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontstekings-fibrotische vicieuze cirkel is nog onvolledig begrepen. In het bijzonder speelt de matrixmetalloproteïnase (MMP)-familie een cruciale rol bij de ECM-remodellering en de progressie van pathologische fibrose7. Hiervan is matrixmetalloproteïnase 12 (MMP12), dat specifiek door macrofagen wordt uitgescheiden, verantwoordelijk voor de afbraak van belangrijke ECM-componenten zoals elastine, fibronectine en collageen type IV, en speelt het een belangrijke rol in de pathogenese van fibrotische ziekten, waaronder chronisch obstructieve longziekte8. Recente studies suggereren verder dat MMP12 afkomstig van macrofagen de fibrose mogelijk verder kan bevorderen door endotheelcellen te beschadigen tijdens het proces van pulmonale fibrose9.
Dimethylsulfoxide (DMSO), een verbinding met een laag molecuulgewicht en diverse biologische activiteiten10, heeft ontstekingsremmende effecten aangetoond bij verschillende inflammatoire aandoeningen, waaronder cystitis, en is door de U.S. Food and Drug Administration goedgekeurd voor de behandeling van interstitiële cystitis11. Recente studies suggereren dat DMSO de progressie van fibrose tot op zekere hoogte kan vertragen door de afgifte van inflammatoire factoren te remmen en oxidatieve stressresponsen te verminderen12. Onderzoek uitgevoerd door Ingrid Elisia et al. rapporteerde dat DMSO specifiek de activatie van de ERK1/2-, p38 MAPK-, JNK- en PI3K/Akt-signaleringsroutes in menselijke monocyten in全bloedmodellen remt, waardoor het zijn ontstekingsremmende effecten uitoefent13.
Hoewel is aangetoond dat de MMP-familie een kritieke rol speelt in het fibroseproces bij silicose, hebben geen enkele studie definitief aangetoond of DMSO de pathologische progressie van silicose kan beïnvloeden via de regulatie van MMP-expressie. Daarom richt deze studie zich op het onderzoeken van de ontstekingsremmende en antifibrotische effecten van DMSO in een muismodel voor silicose, met als doel het belangrijkste regulerende gennetwerk en het moleculaire mechanisme van DMSO-interventie te onthullen en theoretische ondersteuning te bieden voor innovatieve behandelstrategieën op basis van MMP.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierproeven die in deze studie zijn uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Science and Technology Ethics Committee van de Anhui University of Science and Technology (goedkeuringsnummer GZ2025-048) en voldeden strikt aan de nationale normen voor het welzijn van laboratoriumdieren (GB/T 35892-2018) van China. Figuur 1 toont het studieontwerp.
Bereiding van oplossingen
Bereiding van de silica-suspensie:
Kristallijn silica (SiO₂, 80%, deeltjesgrootte 1–5 µm) werd gesteriliseerd door middel van autoclaveren. Het steriele silicapoeder werd vervolgens gedispergeerd in steriele zoutoplossing om een eindconcentratie van 10 mg/mL te verkrijgen, waarna de suspensie vlak voor toediening grondig werd gehomogeniseerd met een ultrasone homogenisator om een uniforme deeltjessuspensie te waarborgen.
Bereiding van DMSO-oplossing:
Onder aseptische omstandigheden werd DMSO (≥99,9%) verdund met steriele fysiologische zoutoplossing om een DMSO-oplossing van ongeveer 10% (v/v) te bereiden, die werd gehomogeniseerd door middel van ultrasone agitatie. Elke muis kreeg een injectie met de DMSO-oplossing in een dosis van 0,9 g/kg, zoals eerder beschreven14,15.
Experimentele dieren
Voor deze studie werden tweeendertig gezonde mannelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van 8–12 weken gebruikt, die gedurende 1 week werden geacclimatiseerd voorafgaand aan de experimenten. De muizen werden met behulp van een door de computer gegenereerde randomisatiemethode willekeurig toegewezen aan vier experimentele groepen (n = 8 per groep): de controlegroep, de DMSO-groep, de silica-groep en de silica+DMSO-groep. De steekproefomvang werd bepaald op basis van eerdere studies met hetzelfde muismodel voor silicose en onze eigen voorlopige experimentele ervaring, waaruit bleek dat 8 dieren per groep voldoende waren om histopathologische en moleculaire verschillen tussen de groepen te detecteren. De dieren werden gehuisvest onder standaard laboratoriumcondities met een gecontroleerde temperatuur, een licht/donkercyclus van 12 u en vrije toegang tot voedsel en water. Voorafgaand aan de studie werden humane eindpunten vastgesteld; geen enkel dier voldeed aan de vooraf gedefinieerde criteria voor vroegtijdige euthanasie.
Vestiging van een silicosemodel en medicamenteuze interventie
Silicose werd geïnduceerd door een enkele intranasale instillatie van 60 µL steriele kristallijne silica-suspensie (10 mg/mL). Na het induceren van anesthesie werden de muizen in rugligging geplaatst. Zodra een diepe en trage ademhaling werd waargenomen, werd 60 µL van de silica-suspensie voorzichtig druppelgewijs in de neusgaten geïnstilleerd, waardoor de suspensie spontaan in de longen werd geïnhaleerd16. Muizen in de DMSO-administratiegroep ontvingen tweemaal per week intraperitoneale injecties van een DMSO-oplossing in een vaste dosis, met een interval van 3–4 dagen tussen de injecties, gedurende één opeenvolgende maand. Muizen in de overige groepen werden op identieke wijze behandeld met een gelijk volume steriele zoutoplossing. Gedurende het gehele experiment werd het lichaamsgewicht dagelijks gemonitord. Op de 30ste dag na het modelleren werden alle muizen geëuthanaseerd en werden longweefsels onder steriele omstandigheden verzameld. Euthanasie werd uitgevoerd door cervicale dislocatie na intraperitonele toediening van tribromethanol (0,2 mL/10 g) om anesthesie te induceren. Delen van het longweefsel werden bewaard in vloeibare stikstof voor transcriptoomsequencing. Een deel van de weefsels werd gedurende 48 u gefixeerd in 4% paraformaldehyde voorafgaand aan pathologische kleuring, en de resterende weefsels werden bewaard bij -80 °C voor daaropvolgende moleculaire experimenten. Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen voor dieren.
De histopathologische evaluatie, inclusief de Ashcroft-fibrosescore, werd onafhankelijk uitgevoerd door twee onderzoekers die blind waren voor de toewijzing aan de experimentele groepen.
Pathologisch onderzoek van de longen
Gefixeerde longweefsels werden gedehydrateerd, transparant gemaakt en ingebed in paraffineblokken, waarna ze in coupes van 5 µm dik werden gesneden.
hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring: De coupes werden 3–5 min gekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd in een zure oplossing, blauw gemaakt onder stromend water en 5 min tegengekleurd met eosine. Na dehydratatie via een reeks ethanolconcentraties werden de coupes ontkleurd in xyleen en verzegeld met neutrale hars17.
Trichroomkleuring van Masson: De coupes werden opeenvolgend gekleurd met hematoxyline, Lichun Red–zuurfuchsine, fosfomolybdeenzuur en Bright Green. Na zure differentiatie werden de coupes gedehydrateerd, ontkleurd in xyleen en ingebed in neutrale hars18,19.
Transcriptoomsequencing
Longweefsels van muizen uit de vier experimentele groepen werden direct na opoffering verzameld en gesnapfrozen in vloeibare stikstof. Totaal RNA werd geëxtraheerd met TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden bepaald, en de RNA-integriteit werd geëvalueerd met een Bioanalyzer met ingebouwde software. Monsters met RIN-waarden groter dan 8,0 werden als acceptabel beschouwd. De bibliotheekpreparatie omvatte poly(A) mRNA-verrijking met Oligo(dT)-beads, RNA-fragmentatie, cDNA-synthese, adapterligatie en PCR-amplificatie. Sequencing werd uitgevoerd op een Illumina-platform, waarbij ongeveer 6,2–6,4 Gb aan schone data per monster werd gegenereerd. Alle in deze studie gegenereerde ruwe sequencingdata zijn gedeponeerd in de Gene Expression Omnibus (GEO)-database onder toegangsnummer GSE311671.
Schone reads werden uitgelijnd op het referentiegenoom van Mus musculus (mm8) met behulp van de STAR aligner. Genexpressieniveaus werden gekwantificeerd als ruwe read counts. De analyse van differentiële expressie werd uitgevoerd met het limma-pakket in R. Voorafgaand aan de lineaire modellering werden de ruwe count-gegevens getransformeerd met de voom-functie om de gemiddelde-variantie-relatie te schatten en precisiegewichten te genereren. Ruwe P-waarden werden gecorrigeerd voor meervoudig testen met de Benjamini-Hochberg (BH)-methode, en genen met |log₂FoldChange| > 1,5 en een false discovery rate (FDR) < 0,05 werden beschouwd als differentieel tot expressie gebracht. Functionele verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met het clusterProfiler-pakket in R. Een Gene Ontology (GO)-verrijkingsanalyse werd uitgevoerd om significant verrijkte categorieën voor biologische processen (BP), cellulaire componenten (CC) en moleculaire functies (MF) te identificeren, terwijl een Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-pathwayverrijkingsanalyse werd uitgevoerd om significant verrijkte signaleringspaden te identificeren. De significantie van de verrijking werd beoordeeld met een hypergeometrische test, en P-waarden werden gecorrigeerd voor meervoudige vergelijkingen met de Benjamini-Hochberg-methode. GO-termen en KEGG-paden met een gecorrigeerde P-waarde (padj) < 0,05 werden als significant verrijkt beschouwd20,21,22,23.
Western blot-detectie
Vers longweefsel van muizen werd verzameld en gehomogeniseerd met een geschikt volume radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer. Na centrifugatie werd het supernatant verzameld en werd de proteïneconcentratie bepaald met behulp van de BCA proteïne-assaykit. De monsters werden vervolgens gemengd met loadingbuffer en 10 min gedurende 100 °C verhit. Proteïnescheiding werd uitgevoerd op 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gels bij een stroomsterkte van 200 V gedurende 30 min. Vervolgens werden de proteïnen elektrotransfergeactiveerd naar polyvinylidefluoride (PVDF) membranen met een constante stroom van 300 mA gedurende 30 min. Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk en daarna overnight bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) en MMP12 (1:800). De volgende dag werd het membraan gewassen met TBST en gedurende 1 h bij kamertemperatuur geïncubeerd met een secundair antilichaam, gevolgd door aanvullende wasbeurten met TBST. Proteïnebanden werden gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescent substraat, en de proteïnekwantificatie werd uitgevoerd met ImageJ software.
Western blot-analyse werd uitgevoerd met drie onafhankelijke biologische replica's per experimentele groep. Eiwitmonsters werden bereid uit individuele longweefsels van muizen, waarbij elke biologische replica één onafhankelijk dier vertegenwoordigde.
Statistische analyse
Alle experimentele gegevens werden geanalyseerd met GraphPad Prism 9.5. Voorafgaand werden tests voor normaliteit en homogeniteit van variantie uitgevoerd. De t-toets van Student werd gebruikt voor de vergelijking tussen twee groepen, en een eenweg-ANOVA in combinatie met de post-hoc toets van Tukey werd toegepast voor vergelijkingen tussen meerdere groepen. P ≤ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
DMSO verlicht silica-geïnduceerde pulmonale fibrose bij muizen (Figuur 2)
Om de effecten van DMSO op pathologische processen en veranderingen in het longweefsel in een silicosemodel te evalueren, werden vier experimentele groepen vastgesteld (Figuur 2A). Veranderingen in het lichaamsgewicht werden gedurende een periode van 1 maand gemonitord.
De resultaten toonden aan dat m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Silicose blijft wereldwijd een van de meest ernstige beroepsziekten van de longen, gekenmerkt door aanhoudende ontsteking en progressieve pulmonale fibrose, wat de longfunctie en de levenskwaliteit van de patiënt aanzienlijk verslechtert25. In deze studie onderzoeken we systematisch, gebruikmakend van een door silica geïnduceerd muismodel, de potentiële beschermende effecten van dimethylsulfoxide (DMSO) tijdens de vroege fase. De resultaten suggereren dat DMSO-behandeling de infiltratie van ontste...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te melden.
De auteurs danken het platform van Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd., en professor Deyong Ge en Lei Xu hartelijk voor hun technische ondersteuning.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| BCA-eiwitanalysekit | Servicebio | G2026 | |
| C57BL/6J-muizen | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Kristallijne silica | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| laadbuffer | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| RIPA-lysisbuffer | Servicebio | G2002 | |
| Secundair antilichaam | Servicebio | GB23303 | |
| magere melk | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actine | Servicebio | GB11001 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.