Deze studie suggereert dat dimethylsulfoxide (DMSO) silica-geïnduceerde pulmonale inflammatie en fibrose bij muizen kan verlichten. Transcriptomische en experimentele analyses suggereren dat de beschermende effecten mogelijk verband houden met de onderdrukking van de IL-6/STAT3-signaleringsroute en de downregulatie van de MMP12-expressie, wat potentiële therapeutische inzichten biedt voor de behandeling van silicose.
Snelverslag
Potentiële betrokkenheid van de IL-6/STAT3/MMP12-signaleringsas bij DMSO-gemedieerde antifibrotische effecten bij experimentele silicose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie heeft tot doel de ontstekingsremmende en antifibrotische effecten van dimethylsulfoxide (DMSO) te onderzoeken in een muismodel voor silicose, om zo de potentiële therapeutische waarde ervan te verkennen.
Een muismodel voor silicose werd vastgesteld door intranasale instillatie, en DMSO-behandeling werd toegediend via intraperitonele injectie. Het experiment werd uitgevoerd over een periode van 1 maand. Longweefsels werden verzameld van alle muizen; een subset werd onderworpen aan transcriptomische analyse, en differentieel tot expressie gebrachte genen werden geïdentificeerd met behulp van het limma-pakket. Gene ontology (GO) en Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met ClusterProfiler om genfuncties en geassocieerde pathways te onderzoeken. De overige monsters werden onderworpen aan histopathologische beoordeling door hematoxyline- en eosinekleuring (HE) en Masson's trichroomkleuring, terwijl Western blot-analyse werd uitgevoerd om de transcriptomische resultaten te valideren.
Deze studie suggereert dat DMSO het fibrotische proces bij silicose kan verlichten door de IL-6/STAT3-MMP12-signaleringsas te moduleren. In het silica-geïnduceerde muismodel voor silicose verminderde DMSO het ziekte-geassocieerde gewichtsverlies en reduceerde het de collageendepositie. Transcriptomanalyse wees uit dat DMSO de activiteit van meerdere fibrose-gerelateerde routes onderdrukte en identificeerde 51 sleutelgenen, waaronder MMP12, dat significant downgereguleerd was. Western blot-analyse bevestigde verder een verminderde expressie van MMP12, gepaard gaande met merkbaar verlaagde niveaus van IL-6 en p-STAT3, wat suggereert dat de IL-6/STAT3-route een cruciale rol kan spelen bij het reguleren van de MMP12-expressie.
DMSO kan inflammatoire reacties en longfibrose bij silicose verminderen door de activering van de IL-6/STAT3-signaleringsroute te remmen, waardoor de MMP12-expressie wordt verlaagd.
Inleiding
Silicose is een van de belangrijkste vormen van beroepsmatige pneumoconiose1, gekenmerkt door aanhoudende pulmonale ontsteking en onomkeerbare pulmonale fibrose als gevolg van langdurige blootstelling aan silicastof2,3. De pathogenese van deze silicose is zeer complex. Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat aberrante macrofaagactivatie4, overmatige proliferatie van fibroblasten, epitheliale-mesenchymale transitie en abnormale depositie van extracellulaire matrix (ECM)-componenten kritische bijdragers zijn aan de fibrotische ontwikkeling5,6. De kern van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontstekings-fibrotische vicieuze cirkel is nog onvolledig begrepen. In het bijzonder speelt de matrixmetalloproteïnase (MMP)-familie een cruciale rol bij de ECM-remodellering en de progressie van pathologische fibrose7. Hiervan is matrixmetalloproteïnase 12 (MMP12), dat specifiek door macrofagen wordt uitgescheiden, verantwoordelijk voor de afbraak van belangrijke ECM-componenten zoals elastine, fibronectine en collageen type IV, en speelt het een belangrijke rol in de pathogenese van fibrotische ziekten, waaronder chronisch obstructieve longziekte8. Recente studies suggereren verder dat MMP12 afkomstig van macrofagen de fibrose mogelijk verder kan bevorderen door endotheelcellen te beschadigen tijdens het proces van pulmonale fibrose9.
Dimethylsulfoxide (DMSO), een verbinding met een laag molecuulgewicht en diverse biologische activiteiten10, heeft ontstekingsremmende effecten aangetoond bij verschillende inflammatoire aandoeningen, waaronder cystitis, en is door de U.S. Food and Drug Administration goedgekeurd voor de behandeling van interstitiële cystitis11. Recente studies suggereren dat DMSO de progressie van fibrose tot op zekere hoogte kan vertragen door de afgifte van inflammatoire factoren te remmen en oxidatieve stressresponsen te verminderen12. Onderzoek uitgevoerd door Ingrid Elisia et al. rapporteerde dat DMSO specifiek de activatie van de ERK1/2-, p38 MAPK-, JNK- en PI3K/Akt-signaleringsroutes in menselijke monocyten in全bloedmodellen remt, waardoor het zijn ontstekingsremmende effecten uitoefent13.
Hoewel is aangetoond dat de MMP-familie een kritieke rol speelt in het fibroseproces bij silicose, hebben geen enkele studie definitief aangetoond of DMSO de pathologische progressie van silicose kan beïnvloeden via de regulatie van MMP-expressie. Daarom richt deze studie zich op het onderzoeken van de ontstekingsremmende en antifibrotische effecten van DMSO in een muismodel voor silicose, met als doel het belangrijkste regulerende gennetwerk en het moleculaire mechanisme van DMSO-interventie te onthullen en theoretische ondersteuning te bieden voor innovatieve behandelstrategieën op basis van MMP.
Protocol
Alle dierproeven die in deze studie zijn uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Science and Technology Ethics Committee van de Anhui University of Science and Technology (goedkeuringsnummer GZ2025-048) en voldeden strikt aan de nationale normen voor het welzijn van laboratoriumdieren (GB/T 35892-2018) van China. Figuur 1 toont het studieontwerp.
Bereiding van oplossingen
Bereiding van de silica-suspensie:
Kristallijn silica (SiO₂, 80%, deeltjesgrootte 1–5 µm) werd gesteriliseerd door middel van autoclaveren. Het steriele silicapoeder werd vervolgens gedispergeerd in steriele zoutoplossing om een eindconcentratie van 10 mg/mL te verkrijgen, waarna de suspensie vlak voor toediening grondig werd gehomogeniseerd met een ultrasone homogenisator om een uniforme deeltjessuspensie te waarborgen.
Bereiding van DMSO-oplossing:
Onder aseptische omstandigheden werd DMSO (≥99,9%) verdund met steriele fysiologische zoutoplossing om een DMSO-oplossing van ongeveer 10% (v/v) te bereiden, die werd gehomogeniseerd door middel van ultrasone agitatie. Elke muis kreeg een injectie met de DMSO-oplossing in een dosis van 0,9 g/kg, zoals eerder beschreven14,15.
Experimentele dieren
Voor deze studie werden tweeendertig gezonde mannelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van 8–12 weken gebruikt, die gedurende 1 week werden geacclimatiseerd voorafgaand aan de experimenten. De muizen werden met behulp van een door de computer gegenereerde randomisatiemethode willekeurig toegewezen aan vier experimentele groepen (n = 8 per groep): de controlegroep, de DMSO-groep, de silica-groep en de silica+DMSO-groep. De steekproefomvang werd bepaald op basis van eerdere studies met hetzelfde muismodel voor silicose en onze eigen voorlopige experimentele ervaring, waaruit bleek dat 8 dieren per groep voldoende waren om histopathologische en moleculaire verschillen tussen de groepen te detecteren. De dieren werden gehuisvest onder standaard laboratoriumcondities met een gecontroleerde temperatuur, een licht/donkercyclus van 12 u en vrije toegang tot voedsel en water. Voorafgaand aan de studie werden humane eindpunten vastgesteld; geen enkel dier voldeed aan de vooraf gedefinieerde criteria voor vroegtijdige euthanasie.
Vestiging van een silicosemodel en medicamenteuze interventie
Silicose werd geïnduceerd door een enkele intranasale instillatie van 60 µL steriele kristallijne silica-suspensie (10 mg/mL). Na het induceren van anesthesie werden de muizen in rugligging geplaatst. Zodra een diepe en trage ademhaling werd waargenomen, werd 60 µL van de silica-suspensie voorzichtig druppelgewijs in de neusgaten geïnstilleerd, waardoor de suspensie spontaan in de longen werd geïnhaleerd16. Muizen in de DMSO-administratiegroep ontvingen tweemaal per week intraperitoneale injecties van een DMSO-oplossing in een vaste dosis, met een interval van 3–4 dagen tussen de injecties, gedurende één opeenvolgende maand. Muizen in de overige groepen werden op identieke wijze behandeld met een gelijk volume steriele zoutoplossing. Gedurende het gehele experiment werd het lichaamsgewicht dagelijks gemonitord. Op de 30ste dag na het modelleren werden alle muizen geëuthanaseerd en werden longweefsels onder steriele omstandigheden verzameld. Euthanasie werd uitgevoerd door cervicale dislocatie na intraperitonele toediening van tribromethanol (0,2 mL/10 g) om anesthesie te induceren. Delen van het longweefsel werden bewaard in vloeibare stikstof voor transcriptoomsequencing. Een deel van de weefsels werd gedurende 48 u gefixeerd in 4% paraformaldehyde voorafgaand aan pathologische kleuring, en de resterende weefsels werden bewaard bij -80 °C voor daaropvolgende moleculaire experimenten. Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen voor dieren.
De histopathologische evaluatie, inclusief de Ashcroft-fibrosescore, werd onafhankelijk uitgevoerd door twee onderzoekers die blind waren voor de toewijzing aan de experimentele groepen.
Pathologisch onderzoek van de longen
Gefixeerde longweefsels werden gedehydrateerd, transparant gemaakt en ingebed in paraffineblokken, waarna ze in coupes van 5 µm dik werden gesneden.
hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring: De coupes werden 3–5 min gekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd in een zure oplossing, blauw gemaakt onder stromend water en 5 min tegengekleurd met eosine. Na dehydratatie via een reeks ethanolconcentraties werden de coupes ontkleurd in xyleen en verzegeld met neutrale hars17.
Trichroomkleuring van Masson: De coupes werden opeenvolgend gekleurd met hematoxyline, Lichun Red–zuurfuchsine, fosfomolybdeenzuur en Bright Green. Na zure differentiatie werden de coupes gedehydrateerd, ontkleurd in xyleen en ingebed in neutrale hars18,19.
Transcriptoomsequencing
Longweefsels van muizen uit de vier experimentele groepen werden direct na opoffering verzameld en gesnapfrozen in vloeibare stikstof. Totaal RNA werd geëxtraheerd met TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden bepaald, en de RNA-integriteit werd geëvalueerd met een Bioanalyzer met ingebouwde software. Monsters met RIN-waarden groter dan 8,0 werden als acceptabel beschouwd. De bibliotheekpreparatie omvatte poly(A) mRNA-verrijking met Oligo(dT)-beads, RNA-fragmentatie, cDNA-synthese, adapterligatie en PCR-amplificatie. Sequencing werd uitgevoerd op een Illumina-platform, waarbij ongeveer 6,2–6,4 Gb aan schone data per monster werd gegenereerd. Alle in deze studie gegenereerde ruwe sequencingdata zijn gedeponeerd in de Gene Expression Omnibus (GEO)-database onder toegangsnummer GSE311671.
Schone reads werden uitgelijnd op het referentiegenoom van Mus musculus (mm8) met behulp van de STAR aligner. Genexpressieniveaus werden gekwantificeerd als ruwe read counts. De analyse van differentiële expressie werd uitgevoerd met het limma-pakket in R. Voorafgaand aan de lineaire modellering werden de ruwe count-gegevens getransformeerd met de voom-functie om de gemiddelde-variantie-relatie te schatten en precisiegewichten te genereren. Ruwe P-waarden werden gecorrigeerd voor meervoudig testen met de Benjamini-Hochberg (BH)-methode, en genen met |log₂FoldChange| > 1,5 en een false discovery rate (FDR) < 0,05 werden beschouwd als differentieel tot expressie gebracht. Functionele verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met het clusterProfiler-pakket in R. Een Gene Ontology (GO)-verrijkingsanalyse werd uitgevoerd om significant verrijkte categorieën voor biologische processen (BP), cellulaire componenten (CC) en moleculaire functies (MF) te identificeren, terwijl een Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-pathwayverrijkingsanalyse werd uitgevoerd om significant verrijkte signaleringspaden te identificeren. De significantie van de verrijking werd beoordeeld met een hypergeometrische test, en P-waarden werden gecorrigeerd voor meervoudige vergelijkingen met de Benjamini-Hochberg-methode. GO-termen en KEGG-paden met een gecorrigeerde P-waarde (padj) < 0,05 werden als significant verrijkt beschouwd20,21,22,23.
Western blot-detectie
Vers longweefsel van muizen werd verzameld en gehomogeniseerd met een geschikt volume radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer. Na centrifugatie werd het supernatant verzameld en werd de proteïneconcentratie bepaald met behulp van de BCA proteïne-assaykit. De monsters werden vervolgens gemengd met loadingbuffer en 10 min gedurende 100 °C verhit. Proteïnescheiding werd uitgevoerd op 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gels bij een stroomsterkte van 200 V gedurende 30 min. Vervolgens werden de proteïnen elektrotransfergeactiveerd naar polyvinylidefluoride (PVDF) membranen met een constante stroom van 300 mA gedurende 30 min. Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk en daarna overnight bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) en MMP12 (1:800). De volgende dag werd het membraan gewassen met TBST en gedurende 1 h bij kamertemperatuur geïncubeerd met een secundair antilichaam, gevolgd door aanvullende wasbeurten met TBST. Proteïnebanden werden gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescent substraat, en de proteïnekwantificatie werd uitgevoerd met ImageJ software.
Western blot-analyse werd uitgevoerd met drie onafhankelijke biologische replica's per experimentele groep. Eiwitmonsters werden bereid uit individuele longweefsels van muizen, waarbij elke biologische replica één onafhankelijk dier vertegenwoordigde.
Statistische analyse
Alle experimentele gegevens werden geanalyseerd met GraphPad Prism 9.5. Voorafgaand werden tests voor normaliteit en homogeniteit van variantie uitgevoerd. De t-toets van Student werd gebruikt voor de vergelijking tussen twee groepen, en een eenweg-ANOVA in combinatie met de post-hoc toets van Tukey werd toegepast voor vergelijkingen tussen meerdere groepen. P ≤ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
DMSO verlicht silica-geïnduceerde pulmonale fibrose bij muizen (Figuur 2)
Om de effecten van DMSO op pathologische processen en veranderingen in het longweefsel in een silicosemodel te evalueren, werden vier experimentele groepen vastgesteld (Figuur 2A). Veranderingen in het lichaamsgewicht werden gedurende een periode van 1 maand gemonitord.
De resultaten toonden aan dat muizen in de silicosegroep een voortdurende afname van het lichaamsgewicht vertoonden, terwijl de Silica+DMSO-groep een aanvankelijk gewichtsverlies liet zien, gevolgd door herstel na DMSO-interventie (Figuur 2F). Na 30 dagen silica-blootstelling werden longweefsels verzameld en beoordeeld op ontstekings- en fibroseveranderingen met behulp van HE-kleuring (Figuur 2B) en Masson's trichroomkleuring (Figuur 2C). Longfibrose werd gescoord op HE-gekleurde coupes met de Ashcroft-methode24, waarbij een lagere fibrosescore in de Silica+DMSO-groep werd vastgesteld vergeleken met de silicagroep (Figuur 2D). Masson-kleuring gaf verder aan dat de depositie van collageenvezels in de silicagroep uitgebreid en dens was en ongeveer 40% van het longweefseloppervlak besloeg, wat hoger was dan de 10% waargenomen in de controlegroep (Figuur 2E), wat suggereert dat silica-blootstelling ernstige longfibrose induceerde. In tegenstelling hiermee was de collageendepositie in de Silica+DMSO-groep verminderd tot 20%, wat aangeeft dat DMSO silica-geïnduceerde longfibrose kan verlichten door overmatige collageenaccumulatie te remmen.
Transcriptoomanalyse identificeert differentieel tot expressie gebrachte genen geassocieerd met DMSO-behandeling in met silica blootgestelde muizen
Om de ontstekingsremmende en antifibrotische effecten van dimethylsulfoxide (DMSO) in een silicosemodel te onderzoeken, werd transcriptomische sequencing uitgevoerd op longweefselmonsters die waren verzameld van experimentele muizen (Figuur 3). DEGs werden geïdentificeerd met behulp van het limma-algoritme, waarbij de selectiecriteria waren gedefinieerd als |log2(fold change)| > 1,5 en een gecorrigeerde P-waarde (false discovery rate [FDR]) < 0,05.
Transcriptomanalyse toonde aan dat de silica-groep, in vergelijking met de controlegroep, 132 significant differentieel tot expressie gekomen genen vertoonde (Figuur 3A), waaronder 117 die upregulated waren en 15 die downregulated waren. Opvallend was dat genen zoals Saa3 en MMP12 sterk upregulated waren. Dit expressiepatroon werd verder ondersteund door hiërarchische clustering-heatmapanalyse (Figuur 3C), waaruit consistente genexpressieprofielen tussen de individuele monsters bleken.
In de vergelijking tussen de Silica+DMSO- en Silica-groepen werden in totaal 3.054 significant differentieel tot expressie gebrachte genen geïdentificeerd (Figuur 3B), bestaande uit 1.39 upgereguleerde en 1.65 downgereguleerde genen. De bijbehorende heatmap (Figuur 3D) onthulde aanzienlijke transcriptomische veranderingen na DMSO-behandeling, met een prominente downregulatie van genen waaronder Lcn2 en MMP12. Specifiek vertoonden sleutelgenen die in de Silica-groep upgereguleerd waren, zoals MMP12, Saa3 en Spp1, een uitgesproken downregulatie in de Silica+DMSO-groep. Deze bevindingen suggereren dat DMSO de met silicose samenhangende pathologie kan verzachten door de expressie van pro-inflammatoire en pro-fibrotische mediatoren te onderdrukken.
De IL-6/STAT3/MMP12-signaleringsas kan betrokken zijn bij de beschermende effecten van DMSO bij silica-geïnduceerde pulmonale fibrose
Om de relaties tussen differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) te onderzoeken, werd een geninteractienetwerk geconstrueerd op basis van de transcriptomische gegevens (Figuur 4A). MMP12 leek een centrale positie in het netwerk te bekleden. Om potentiële associaties op eiwitniveau verder te onderzoeken, werd een voorspeld eiwit-eiwitinteractienetwerk (PPI) gegenereerd met behulp van de STRING-database (Figuur 4B). De STRING-analyse suggereerde potentiële functionele associaties tussen MMP12 en verschillende belangrijke DEGs, waaronder IL-6, STAT3, SPP1 en MMP19. Omdat STRING bewijs uit verschillende bronnen integreert, zijn deze associaties voorspelde functionele relaties.
Western blot-analyse werd uitgevoerd om de eiwitexpressieniveaus van IL-6, STAT3, p-STAT3 en MMP12 te kwantificeren (Figuur 4C–F). De resultaten lieten zien dat, vergeleken met de controlegroep, de eiwitexpressieniveaus van IL-6 en p-STAT3 significant verhoogd waren in de silica-groep, en dat de eiwitexpressie van MMP12 ook een trend naar verhoogde expressie vertoonde. Na behandeling met DMSO waren de expressieniveaus van deze drie eiwitten significant verminderd. Opmerkelijk was dat de totale STAT3-eiwitexpressie relatief constant bleef in alle experimentele groepen.
DATABESCHIKBAARHEID:
Alle ruwe sequencinggegevens die in deze studie zijn gegenereerd, zijn gedeponeerd in de Gene Expression Omnibus (GEO)-database onder accretienummer GSE31671. De ruwe afbeeldingen van de studie zijn beschikbaar in een aanvullende map (Aanvullend bestand 1).
Figuur 1Schema van het studiedesign. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2DMSO vermindert longfibrose bij muizen met silicose. (A) Schematisch diagram van het experimentele ontwerp. Pijlen van verschillende kleuren vertegenwoordigen verschillende toedieningsregimes. (B) Hematoxyline- en eosinekleuring van longweefsel. Bij een vergroting van 20× is de schaalbalk 50 µm; bij een vergroting van 40× is de schaalbalk 20 µm. (C) Masson-kleuring van longweefsel (blauw: collageenvezels; rood: spiervezels). Bij een vergroting van 20× is de schaalbalk 50 µm; bij een vergroting van 40× is de schaalbalk 20 µm. (D). Fibrosescores van verschillende groepen op basis van HE-kleuringsresultaten. n = 8, P ≤ 0,001. (E) Relatief collageenoppervlak van Masson-kleuring in het longweefsel van verschillende groepen. n = 8, P ≤ 0,01. (F) Veranderingen in het lichaamsgewicht van muizen binnen 30 dagen. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De vergelijking van meerdere gegevenssets werd uitgevoerd met behulp van een eenweg-variantieanalyse (ANOVA) en post-hoc tests werden uitgevoerd met de Tukey-methode. n = 8, P(tijd) ≤ 0,001, P(groep) ≤ 0,01. N: controlegroep; S: siliciumgroep; SD: silicium + DMSO-groep; D: DMSO-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3Transcriptoomsequencing onthult de genregulatie van DMSO bij het verlichten van silicose. (A,B) Volcano plot van differentieel tot expressie gebrachte genen tussen de silica-groep (S) en de controlegroep (N), de silica + DMSO-groep (SD) en de silica-groep (S). (C,D) Heatmap van de silica-groep (S) vergeleken met de controlegroep (N), en de silica + DMSO-groep (SD) vergeleken met de silica-groep (S). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4DMSO vermindert de eiwitexpressie van IL-6 en STAT3. (A) Netwerkdiagram van significant differentieel tot expressie gekomen genen. (B) STRING-netwerkdiagram van de interacties tussen MMP12 en gerelateerde genen. (C–F) Western blot-analyse van de eiwitexpressie van β-actine, IL-6, MMP12, STAT3 en p-STAT3. Grijswaardeanalyse van β-actine, IL-6 (*P = 0,0257, *P = 0,0195), MMP12 (**P = 0,0013, *P = 0,0318), STAT3 (P = 0,3205, P = 0,2347) en p-STAT3 (*P = 0,0123, **P = 0,096) eiwitten via Western blotting. De immunoblotting-analyse werd in triplikaat uitgevoerd (n = 3). N: Controlegroep; S: Silicagroep; SD: Silica + DMSO-groep; D: DMSO-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Ruwe gegevens van deze studie.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Silicose blijft wereldwijd een van de meest ernstige beroepsziekten van de longen, gekenmerkt door aanhoudende ontsteking en progressieve pulmonale fibrose, wat de longfunctie en de levenskwaliteit van de patiënt aanzienlijk verslechtert25. In deze studie onderzoeken we systematisch, gebruikmakend van een door silica geïnduceerd muismodel, de potentiële beschermende effecten van dimethylsulfoxide (DMSO) tijdens de vroege fase. De resultaten suggereren dat DMSO-behandeling de infiltratie van ontstekingscellen vermindert en fibrotische pathologische veranderingen verzacht, wat erop wijst dat DMSO een modulerende rol kan spelen in de vroege fasen van silicose. Eerdere experimentele studies hebben aangetoond dat DMSO beschermende effecten uitoefent tegen pulmonale fibrose in zowel ratten als muizen. Haschek et al. rapporteerden dat DMSO pulmonale fibrotische veranderingen verminderde in experimentele diermodellen, hoewel de onderliggende moleculaire mechanismen onduidelijk bleven26. In overeenstemming met deze bevindingen suggereren onze transcriptomische en eiwitexpressie-analyses verder dat DMSO door silica geïnduceerde pulmonale fibrose kan verlichten via modulatie van ontstekingssignaleringspaden, waardoor aanvullend mechanisch inzicht wordt verkregen in de potentiële antifibrotische activiteit ervan.
DMSO is een polair aprotisch oplosmiddel met een hoge weefselpermeabiliteit27 en heeft goed gedocumenteerde ontstekingsremmende en pijnstillende eigenschappen, waardoor het is toegepast bij diverse ontstekingsgerelateerde aandoeningen, waaronder interstitiële cystitis, reumatoïde artritis en artrose28,29,30. Daarnaast hebben eerdere studies aangetoond dat DMSO pulmonale fibrose en longschade in experimentele diermodellen vermindert, wat suggereert dat DMSO beschermende effecten heeft tegen fibrotische longziekten, mogelijk via zijn ontstekingsremmende eigenschappen en het wegvangen van vrije radicalen26. Op moleculair niveau is gerapporteerd dat DMSO de NF-κB- en MAPK-signaleringspaden onderdrukt, wat leidt tot een verminderde IL-6-expressie in LPS-gestimuleerde RAW264.7-macrofagen31. Opmerkelijk is dat hoge doses DMSO systemische toxiciteit kunnen veroorzaken, waarbij schade aan meerdere organen is gerapporteerd bij doses boven de 8 g/kg14; daarom is een protocol met herhaalde toediening van een lage dosis gehanteerd om therapeutische effecten en toxiciteit te evalueren.
Door transcriptomische en histopathologische analyses te integreren, observeerden we dat DMSO-behandeling de pulmonale ontsteking en fibrose bij silica-blootgestelde muizen verminderde, vergezeld door een downregulatie van de IL-6 expressie. Transcriptomische profilering wees verder op een afname van de MMP12 expressie na DMSO-behandeling. MMP12, dat voornamelijk door macrofagen wordt uitgescheiden32, is betrokken bij de fibrotische progressie van silicose, COPD en bleomycine-geïnduceerde longschade, via regulatie van profibrotische routes waaronder TGF-β1, EGR1 en CYR6133,34,35. In de huidige studie suggereert de waargenomen downregulatie van MMP12 de potentiële betrokkenheid ervan bij de ontstekingsremmende en antifibrotische effecten geassocieerd met DMSO-behandeling. Belangrijk is dat MMP12 de afbraak van overmatige extracellulaire matrixafzettingen tijdens de resolutie van fibrose faciliteert, waardoor weefselremodellering en littekenklaring worden bevorderd36.
Macrofagen zijn belangrijke drijvers van de productie van pro-inflammatoire cytokinen bij silica-geïnduceerde silicose37. Geactiveerde macrofagen scheiden IL-6 en TNF-α uit, die bijdragen aan ontsteking en fibrose38. IL-6 bindt aan het gp130-receptorcomplex om de JAK–STAT-route te activeren, in het bijzonder STAT3, waardoor het fenotype van de macrofaag wordt beïnvloed en profibrotische processen worden bevorderd39,40,41,42. In deze studie verminderde behandeling met DMSO de expressieniveaus van IL-6, STAT3 en MMP12 significant, wat erop wijst dat DMSO de IL-6/STAT3-as kan moduleren en MMP12 indirect kan downreguleren. Eerdere studies hebben aangetoond dat de IL-6–STAT3-as een cruciale regulerende rol speelt in diverse modellen van pulmonale fibrose, en dat de aanhoudende activatie ervan nauw verbonden is met de ernst van de fibrose en de progressie van de ziekte43,44. STAT3 is voorgesteld als een belangrijk signaleringsknooppunt dat inflammatoire responsen koppelt aan fibrotische remodellering, en de activatie ervan kan MMP12 reguleren, waardoor de transcriptionele activiteit ervan wordt verhoogd45. Daarnaast is STAT3-signalering betrokken bij de polarisatie van macrofagen, waarbij de overgang van macrofagen van het pro-inflammatoire M1-fenotype naar het profibrotische M2-fenotype wordt gestuurd46,47, terwijl M2-macrofagen een van de primaire cellulaire bronnen van MMP12 vormen48. Daarom suggereert de gelijktijdige downregulatie van STAT3 en MMP12 die in de huidige studie is waargenomen, dat DMSO de expressie van MMP12 mogelijk vermindert, ten minste gedeeltelijk, via modulatie van de STAT3-signalering. Er moet echter worden opgemerkt dat de huidige studie primair was ontworpen om potentiële moleculaire mechanismen te identificeren op basis van transcriptoomprofilering gecombineerd met in vivo validatie. Hoewel de gecoördineerde veranderingen in IL-6, STAT3 en MMP12 de betrokkenheid van de IL-6/STAT3/MMP12-signaleringsas bij de antifibrotische effecten van DMSO ondersteunen, stelt het huidige bewijs geen directe causale relatie vast tussen STAT3-activatie en MMP12-regulatie. Aanvullende mechanistische studies zijn daarom vereist om de directe regulerende interacties binnen deze signaleringsroute verder te verduidelijken.
Deze studie heeft verschillende beperkingen. Ten eerste zijn de conclusies van deze studie gebaseerd op transcriptomische profilering in combinatie met histopathologische en eiwitexpressie-analyses in een muismodel voor silicose. Hoewel deze bevindingen de betrokkenheid van de IL-6/STAT3/MMP12-signaleringsas ondersteunen, vestigen ze geen direct causaal verband tussen STAT3-activering en de regulatie van MMP12. Ten tweede is er geen mechanische validatie uitgevoerd, waaronder in vitro studies met macrofagen en rescue-experimenten middels genetische of farmacologische manipulatie van de IL-6/STAT3-route en MMP12. Bovendien is er geen positieve antifibrotische controle opgenomen, wat een directe vergelijking van DMSO met gevestigde therapieën beperkt. Toekomstige studies waarin mechanische validatie en klinisch relevante antifibrotische geneesmiddelen, zoals pirfenidon of nintedanib, worden opgenomen, zullen het moleculaire mechanisme en het therapeutische potentieel van DMSO bij silicose verder verduidelijken.
Concluderend suggereren de bevindingen dat DMSO macrophage-gemedieerde ontsteking en fibrose bij silica-geïnduceerde silicose vermindert, mogelijk door de IL-6/STAT3/MMP12-signaleringsas te moduleren. Deze resultaten bieden preliminair bewijs dat de IL-6/STAT3/MMP12-signaleringsas mogelijk betrokken is bij de antifibrotische effecten van DMSO en benadrukken MMP12 als een potentieel moleculair doelwit voor toekomstig onderzoek.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs danken het platform van Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd., en professor Deyong Ge en Lei Xu hartelijk voor hun technische ondersteuning.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| BCA-eiwitanalysekit | Servicebio | G2026 | |
| C57BL/6J-muizen | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Kristallijne silica | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| laadbuffer | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| RIPA-lysisbuffer | Servicebio | G2002 | |
| Secundair antilichaam | Servicebio | GB23303 | |
| magere melk | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-Actine | Servicebio | GB11001 |
Referenties
- Leung, C. C., Yu, I. T. S., Chen, W. Silicosis. Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).
- Fazio, J. C., et al. Silicosis among immigrant engineered stone (quartz) countertop fabrication workers in California. JAMA Intern Med. 183 (9), 991-998 (2023).
- Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Control Release. 364, 618-631 (2023).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
- Zhou, Q., et al. Activation of Sirtuin3 by honokiol ameliorates alveolar epithelial cell senescence in experimental silicosis via the cGAS-STING pathway. Redox Biol. 74, 103224 (2024).
- Yang, S., et al. Single-cell transcriptome sequencing–based analysis: Probing the mechanisms of glycoprotein NMB regulation of epithelial cells involved in silicosis. Part Fibre Toxicol. 20, 29 (2023).
- Robert, S., et al. Involvement of matrix metalloproteinases (MMPs) and inflammasome pathway in molecular mechanisms of fibrosis. Biosci Rep. 36 (4), e00360 (2016).
- Dorjay Tamang, J. S., et al. An overview of matrix metalloproteinase-12 in multiple disease conditions, potential selective inhibitors, and drug designing strategies. Eur J Med Chem. 283, 117154 (2025).
- Zhou, X., et al. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733 (2024).
- De Abreu Costa, L., et al. Dimethyl sulfoxide (DMSO) decreases cell proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 cytokine production in cultures of peripheral blood lymphocytes. Molecules. 22 (11), 1789 (2017).
- Kawasaki, Y., Katayama, H., Kato, S. Effectiveness of DMSO intravesical therapy for lower urinary symptoms of primary amyloidosis localized in the urinary bladder: A case report. Hinyokika Kiyo. 59 (7), 453-456 (2013).
- Taghavi, S., et al. Dimethyl sulfoxide as a novel therapy in a murine model of acute lung injury. J Trauma Acute Care Surg. 97, 32-38 (2024).
- Elisia, I., et al. DMSO represses inflammatory cytokine production from human blood cells and reduces autoimmune arthritis. PLoS One. 11 (3), e0152538 (2016).
- Aita, K., et al. Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitoneal administration of dimethyl sulfoxide (DMSO). Exp Mol Pathol. 79 (3), 265-271 (2005).
- Gad, S. C., et al. Tolerable levels of nonclinical vehicles and formulations used in studies by multiple routes in multiple species with notes on methods to improve utility. Int J Toxicol. 35 (2), 95-178 (2016).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicol Lett. 353, 1-12 (2021).
- Zhou, X., et al. ANXA9 facilitates S100A4 and promotes breast cancer progression through modulating STAT3 pathway. Cell Death Dis. 15 (4), 260 (2024).
- Dong, L., et al. Hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles attenuate allergic airway inflammation and airway remodeling in chronic asthma mice. Stem Cell Res Ther. 12, 4 (2021).
- Gentile, G., Tambuzzi, S., Boracchi, M., Andreola, S., Zoja, R. Paradoxal dyeing affinity's inversion of the connective tissue at Goldner's Masson trichrome staining as a peculiar characteristic of compressed and exsiccated cadaveric skin. Leg Med (Tokyo). 52, 101905 (2021).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
- Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2 (3), 100141 (2021).
- Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: Enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D325-D334 (2021).
- Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Inoshiguro-Watanabe, M. KEGG: Integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D545-D551 (2021).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Liu, T., et al. Whole transcriptome sequencing identifies key lncRNAs, circRNAs, and mRNAs for exploring the pathogenesis and therapeutic target of mouse pneumoconiosis. Gene. 901, 148169 (2024).
- Haschek, W. M., Baer, K. E., Rutherford, J. E. Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on pulmonary fibrosis in rats and mice. Toxicology. 54 (2), 197-205 (1989).
- Reimer, L., et al. Low-dose DMSO treatment induces oligomerization and accelerates aggregation of α-synuclein. Sci Rep. 12, 3737 (2022).
- Colucci, M., et al. New insights into dimethyl sulfoxide (DMSO) effects on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacol Res. 57 (6), 419-425 (2008).
- Obara, K., et al. Dimethyl sulfoxide enhances acetylcholine-induced contractions in rat urinary bladder smooth muscle by inhibiting acetylcholinesterase activities. Biol Pharm Bull. 46 (2), 354-358 (2023).
- Moss, N. P., et al. A prospective, randomized trial comparing intravesical dimethyl sulfoxide (DMSO) to bupivacaine, triamcinolone, and heparin (BTH) for newly diagnosed interstitial cystitis/painful bladder syndrome (IC/PBS). Neurourol Urodyn. 42 (3), 615-622 (2023).
- Han, H., Kang, J. K., Ahn, K. J., Hyun, C. DMSO alleviates LPS-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPK activation. BioChem. 3 (2), 91-101 (2023).
- Shapiro, S. D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: Biological consequences. Curr Opin Cell Biol. 10 (5), 602-608 (1998).
- Kang, H. R., et al. Transforming growth factor (TGF)-β1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent, Bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12. J Biol Chem. 282 (10), 7723-7732 (2007).
- Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37 (2), 210-221 (2007).
- Niu, H., et al. Matrix metalloproteinase 12 modulates high-fat diet-induced glomerular fibrogenesis and inflammation in a mouse model of obesity. Sci Rep. 6, 20171 (2016).
- Huang, Q., et al. Regulation of liver fibrosis by matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase and research advances in related therapeutic drugs. J Clin Hepatol. 38 (6), 1420-1425 (2022).
- Cao, Z., et al. A novel pathophysiological classification of silicosis models provides some new insights into the progression of the disease. Ecotoxicol Environ Saf. 202, 110834 (2020).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. Int J Mol Sci. 22 (18), 10063 (2021).
- Pedroza, M., et al. Interleukin-6 contributes to inflammation and remodeling in a model of adenosine-mediated lung injury. PLoS One. 6 (7), e22667 (2011).
- Ataie-Kachoie, P., Pourgholami, M. H., Morris, D. L. Inhibition of the IL-6 signaling pathway: A strategy to combat chronic inflammatory diseases and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 24 (2), 163-173 (2013).
- Robinson, M. B., et al. IL-6 trans-signaling increases expression of airways disease genes in airway smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (2), L129-L138 (2015).
- Garbers, C., Rose-John, S. Dissecting interleukin-6 classic and trans-signaling in inflammation and cancer. Methods Mol Biol. 2691, 207-224 (2023).
- Chakraborty, D., et al. Author correction: Activation of STAT3 integrates common profibrotic pathways to promote fibroblast activation and tissue fibrosis. Nat Commun. 12, 7259 (2021).
- O'Donoghue, R. J. J., et al. Genetic partitioning of interleukin-6 signalling in mice dissociates Stat3 from Smad3-mediated lung fibrosis. EMBO Mol Med. 4 (9), 939-951 (2012).
- Gao, Y., Zhou, X., Zhou, Y., Zhao, L. IL-9 and its receptor promote the progression of chronic obstructive pulmonary disease by activating macrophages through the STAT3 pathway. J China Med Univ. 52, 921-927 (2023).
- Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701 (2022).
- Liu, T., Zhang, Z., Shen, W., Wu, Y., Bian, T. MicroRNA let-7 induces M2 macrophage polarization in COPD emphysema through the IL-6/STAT3 pathway. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 18, 575-591 (2023).
- Guo, X., et al. Involvement of M2 macrophage polarization in PM2.5-induced COPD by upregulating MMP12 via IL4/STAT6 pathway. Ecotoxicol Environ Saf. 283, 116793 (2024).