Methodenartikel

Muismodel van vaginale co-kolonisatie door Candida albicans en Streptococcus agalactiae

59 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72557

⸱

21 augustus 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om muizen vaginaal te co-koloniseren met Candida albicans and Streptococcus agalactiae. Het kan worden gebruikt om polymicrobiële interacties, gastheer-microbe-interacties en gastheerresponsen op deze organismen te bestuderen.

Samenvatting

Diverse microben worden geïsoleerd uit het menselijke vaginale tractus, en veel van de organismen die deze niche bewonen kunnen wisselen tussen commensale en pathogene levenswijzen. Factoren, waaronder de samenstelling van de gemeenschap en de gastheeromgeving, beïnvloeden de ziekteuitkomsten; de mechanismen die deze uitkomsten bepalen zijn echter niet goed begrepen. In dit manuscript beschrijven wij een muismodel om interkoninkrijk-interacties en de gastheerrespons op Candida albicans en Streptococcus agalactiae (Groep B Streptococcus, GBS) te onderzoeken, pathobionten die het vrouwelijke genitaliantractus (FGT) koloniseren. Opkomend bewijs suggereert dat C. albicans-kolonisatie een risicofactor is voor GBS-dragerschap vanwege hun frequente co-isolatie. Tijdens de zwangerschap kan GBS-kolonisatie leiden tot ongunstige uitkomsten waaronder chorioamnionitis en doodgeboorte. GBS kan ook in utero aan een foetus of tijdens de geboorte aan een pasgeborene worden overgedragen en is een belangrijke oorzaak van neonatale meningitis. Kolonisatie van het vaginale tractus is een kritische voorloper van GBS-ziekte, en deze niche oefent talrijke selectieve druk uit, waarvan sommige beïnvloed kunnen worden door C. albicans-kolonisatie. Dit protocol beschrijft een model van gelijktijdige vaginale co-kolonisatie door C. albicans-GBS met behulp van antibioticabehandeling en een enkele dosis 17β-estradiol om C. albicans-kolonisatie te vestigen, gevolgd door het staken van de antibiotica en inoculatie met GBS. Microbiële belastingen in het vaginale lumen worden gedurende het experiment gekwantificeerd door middel van lavage, en belastingen in het gehele FGT worden gekwantificeerd door dissectie, homogenisatie en uitplaten van de vagina, cervix en uterus. Deze methode maakt onderzoek mogelijk naar de mechanismen waarmee directe en indirecte polymicrobiële interacties de levenswijzen en pathogenese van deze twee organismen beïnvloeden, evenals het immuunlandschap van de gastheer in het FGT.

Inleiding

Streptococcus agalactiae (Groep B Streptococcus, GBS) is een Gram-positieve bacteriële pathobiont die meerdere polymicrobiële locaties koloniseert, waaronder het maagdarmstelsel en het vaginale kanaal. Hoewel vaginale kolonisatie gewoonlijk asymptomatisch is, kan GBS tijdens de zwangerschap vanuit het vaginale kanaal naar de baarmoeder stijgen en intacte membranen passeren, wat leidt tot infectie van het vruchtwater en de placenta. Daarom is het een primaire risicofactor voor ongunstige zwangerschapsuitkomsten, foetale infectie en neonatale ziekte1,2. Aangezien het een belangrijke oorzaak is van invasieve infecties bij pasgeborenen, is het cruciaal om de factoren te karakteriseren die het risico op transmissie en infectie beïnvloeden. Antibioticaprofylaxe tijdens de bevalling kan de verticale transmissie en vroegtijdige GBS-ziekte bij pasgeborenen verminderen3,4; dit is echter geassocieerd met stijgende percentages antibioticaresistentie en mogelijke langetermijneffecten gerelateerd aan antibioticatoediening prenataal of in de vroege levensfase5,6,7,8. Deze factoren maken de ontwikkeling van meer gerichte preventieve en therapeutische interventies noodzakelijk.

Opkomend bewijs heeft aangetoond dat de samenstelling van het microbioom en polymicrobiële interacties de homeostase en de kans op ziekten beïnvloeden9. De dominantie van GBS in het menselijke vaginale microbioom is geassocieerd met een afname van de abundantie van Lactobacillus, en er zijn soort- en stam-specifieke interacties waargenomen die diverse effecten kunnen hebben op kolonisatie in vitro en in vivo10,11. Voorheen heeft onze onderzoeksgroep een muismodel voor vaginale kolonisatie door GBS ontwikkeld om gastheer- en bacteriële correlaten van de fitness van GBS te bestuderen12. Dit omvat het behandelen van muizen met een enkelvoudige dosis 17β-estradiol, gevolgd door intravaginale inoculatie met GBS op de volgende dag. Dit model is gebruikt om het belang van GBS-oppervlakte-eiwitten, regulatoire signaleringsnetwerken en toxine-secretie bij het behoud van kolonisatie en het binnendringen van FGT-weefsels te karakteriseren. Verder hebben we vastgesteld dat GBS complexe interacties vertoont met andere bacteriën in het vaginale tract, waaronder Akkermansia muciniphila and Enterococcus faecalis13,14,15, wat aantoont hoe de levensstijl en persistentie van GBS worden beïnvloed door de aanwezigheid van naburige microben.

Hoewel dit bestaande model is aangepast om interbacteriële interacties te bestuderen, waren aanvullende modificaties nodig om andere microben te bestuderen. Schimmels zijn een onderbelichte component van het vaginale microbioom, en met het hier gepresenteerde model streefden we ernaar een instrument te ontwikkelen om schimmelkolonisatie samen met schimmel-bacterie-interacties in vivo te bestuderen. De meest geïsoleerde schimmel uit het menselijke vaginale tractus is Candida albicans, die bij meer dan 70% van de individuen voorkomt16. C. albicans is polymorf en kan morfogenese ondergaan om te wisselen tussen gistcellen en filamenteuze morfotypes. Filamentatie is geassocieerd met een specifiek repertoire van genexpressie17,18. Recentelijk is gerapporteerd dat sommige van deze hyfespecifieke genen een fitnessvoordeel bieden in de context van polymicrobiële kolonisatie19,20,21.

Verschillende studies hebben de co-isolatie van C. albicans en GBS in menselijke vaginale swabs gerapporteerd, en onze onderzoeksgroep heeft onlangs vastgesteld dat personen die gekoloniseerd zijn met C. albicans significant hogere percentages van GBS-dragers vertonen22. We hebben een in vivo systeem ontwikkeld om de tripartite interacties tussen commensale schimmels, bacteriën en de gastheer te bestuderen. Schimmelstudies bij conventionele muizen vereisen doorgaans een antibioticabehandeling om de door bacteriën gemedieerde kolonisatieresistentie te overwinnen en een persistente kolonisatie te vestigen23. Om dit te bereiken zonder het vermogen van GBS om te koloniseren te verstoren, behandelen we muizen met een antibioticencocktail, inoculeren we hen met C. albicans, en zodra de kolonisatie is gevestigd, stoppen we de blootstelling aan antibiotica om GBS vervolgens te laten koloniseren. Dit is geoptimaliseerd zodat zowel C. albicans als GBS het vaginale tract koloniseren met vergelijkbare belastingen en op vergelijkbare tijdstippen, waardoor directe interacties binnen het vaginale tract kunnen plaatsvinden. Dit protocol beschrijft een methode om muizen voor te behandelen met antibiotica, 17β-estradiol toe te dienen, kolonisatie door zowel schimmels als bacteriën te vestigen, en lavage- en weefselmonsters te verzamelen voor nadere analyse.

Protocol

Het dieronderzoek dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, is goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Colorado Anschutz onder protocol #00316. In de onderstaande tijdlijn verwijst dag 0 naar de dag van de S. agalactiae-inoculatie.

1. Dien antibiotica toe vóór de inoculatie.

  1. Maak een geconcentreerde oplossing van elk 50 mg/mL ampicilline, neomycine en gentamycine, opgelost in drinkwater voor muizen. Gebruik een 0,22 µm filter om de antibioticumoplossing te steriliseren.
  2. Voeg de antibioticumoplossing in een verdunning van 1:100 toe aan het drinkwater voor de muizen door 1 mL van de oplossing per 99 g water toe te voegen.
  3. Vervang na 7 dagen het water door stap 1.1 en 1.2 te herhalen.
  4. Houd de antibiotica gedurende ten minste 7–10 dagen vóór de start van het experiment in stand, maar overschrijd een totale behandelingsduur van 14 dagen met antibiotica niet.

2. Synchroniseer de oestruscycli van de muizen (dag -3).

  1. Voeg 0,5 mg 17β-estradiol per muis toe aan een steriele conische buis van 50 mL, plus een kleine overmaat om rekening te houden met het kleven van de suspensie aan de wanden van de buis. Sluit de conische buis stevig af en vortex kort om klonten op te lossen.
    WAARSCHUWING: Omdat 17β-estradiol het lichaam kan binnendringen via dermaal of mucosaal contact, dient dit reagens voorzichtig te worden gehanteerd en moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt.
  2. Steriliseer 100 µL sesamolie per 0,5 mg 17β-estradiol met een 0,45 µm filter en breng dit direct over in de conische buis die 17β-estradiol bevat. De concentratie is 5 mg/mL. Sluit de buis stevig af en vortex de oplossing grondig om een homogene suspensie te creëren.
  3. Bereid steriele spuiten van 1 mL voor (één per muis) door de zuiger naar de markering van 0,15 mL te trekken en ze zodanig neer te zetten dat de zuiger naar beneden wijst en de luer-lock tip naar boven.
  4. Zuig de 17β-estradiol suspensie op in een nieuwe steriele spuit van 10 mL met een steriele 18G 1,5” naald en gebruik deze om de voorbereide spuiten van 1 mL te vullen met 100 µL van de suspensie.
  5. Sluit elke spuit van 1 mL af met een steriele 26G 0,5” naald.
  6. Bereid een suspensie van 100 µL sesamolie die 0,5 mg 17β-estradiol bevat, en dien één dosis toe aan elke muis via intraperitoneale injectie één dag vóór de inoculatie met C. albicans.

3. Inoculeer muizen met C. albicans (dag -2).

  1. Kweek één dag vóór de inoculatie (dezelfde dag als de toediening van 17β-estradiol) een nachtcultuur van 5 mL C. albicans in Yeast Peptone Dextrose Broth in een incubator op 30 °C bij een schudkracht van 250 rpm.
  2. Breng op de dag van inoculatie een aliquot van de nachtcultuur over in een steriele microcentrifugebuis en centrifugeer bij ≤10.000 × g gedurende 7–8 s of tot er een pellet is gevormd.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Gebruik een hemocytometer om de concentratie van de suspensie te bepalen.
  5. Breng een aliquot van de suspensie over naar een nieuwe steriele microcentrifugebuis, centrifugeer opnieuw tot een pellet en suspendeer in verse steriele PBS om een uiteindelijke concentratie van 109 C. albicans cellen/mL te bereiken in een eindvolume van ten minste 10 µL per muis. Als de concentratie bijvoorbeeld 2 × 108 cellen/mL is en er zijn 10 muizen, centrifugeer dan 500 µL tot een pellet en resuspendeer dit in 100 µL.
  6. Inoculeer elke muis intravaginaal met 10 µL C. albicans gesuspendeerd in PBS bij 109 cellen/mL (107 cellen/muis).
    1. Fixeer elke muis door de huid in de nekvel tussen de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand vast te pakken en de pols te draaien zodat de rug van de muis in de palm van de hand rust. Gebruik de ringvinger en pink om de staart te immobiliseren.
    2. Neem 10 µL van de C. albicans suspensie op in een steriele pipetpunt. Voer de punt ongeveer 5–10 mm in het vaginale lumen in, waarbij de diepte wordt aangepast aan de anatomie van de muis.
    3. Dispenseer het C. albicans inoculum in de vagina en trek de pipetpunt terug.
    4. Nadat de nek is losgelaten, houdt u de muis bij de staart vast om de achterhand op te tillen. Laat de muis ongeveer 1 min op zijn twee voorpoten lopen of totdat het C. albicans inoculum niet meer zichtbaar is.

4. Vervang het drinkwater (dag -1).

  1. Verplaats de muizen één dag na de inoculatie met C. albicans, wat samenvalt met de dag vóór de inoculatie met S. agalactiae, naar schone kooien.
  2. Zorg ervoor dat de muizen vers water zonder antibiotica krijgen.

5. Kwantificeer de C. albicans-belasting in het vaginale lumen (dag -1).

  1. Bereid op dag -1 één steriele microcentrifugebuis en 100 µL steriele PBS per muis voor.
  2. Houd elke muis vast zoals beschreven in stap 3.6.1.
  3. Zuig 50 µL PBS op in een steriele pipetpunt. Voer de punt ongeveer 1–5 mm in het vaginale lumen in en pipetteer het volledige volume PBS 3–5 keer op en neer. Breng de PBS over in een steriele microcentrifugebuis.
  4. Herhaal stap 5.3 om in totaal 100 µL spoelvloeistof te verkrijgen.
  5. Vortex de microcentrifugebuis en voer vervolgens 10-voudige seriële verdunningen uit tot een verdunning van 1:10.000 in steriele PBS.
  6. Plateer 10 µL van de verdunde suspensies en 25 µL van de onverdunde spoelvloeistof op Candida-selectieve chromogene agarpetrischalen.
  7. Incubeer de platen 48 u bij 30 °C. C. albicans-kolonies zullen er glad uitzien en blauwgroen of groen van kleur zijn.

6. Inoculeer muizen met S. agalactiae (dag 0).

  1. Kweek één dag vóór de inoculatie (op dezelfde dag als de vervanging van het drinkwater) een overnight-cultuur van 3 mL S. agalactiae in Todd Hewitt Broth (THB) in een statische incubator bij 37 °C.
  2. Verdun op de dag van inoculatie de overnight-cultuur 1:10 in 4 mL THB en incubeer deze in een statische incubator bij 37 °C tot de mid-log-fase is bereikt (optische dichtheid bij 600 nm [OD600] van 0,4–0,5) in ongeveer 1,5–2 u.
  3. Overbreng de mid-log-cultuur naar een steriele conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 3.000 × g gedurende 5 min of tot er een pellet is gevormd.
  4. Verwijder het supernatant door aspiratie en resuspendeer vervolgens de pellet in 300 µL steriele PBS.
  5. Gebruik de geresuspendeerde pellet om ten minste 100 µL S. agalactiae-suspensie per muis voor te bereiden, plus een extra 500 µL, in steriele PBS bij een OD600 van 0,4 (ongeveer 108 colony-forming units [CFU]/mL; in totaal ≥1,5 mL voor 10 muizen).
    OPMERKING: Sommige S. agalactiae-stammen kunnen verschillen in hun OD600-tot-CFU/mL-ratio. Bepaal vooraf welke OD600 correspondeert met 108 CFU/mL.
  6. Overbreng de suspensie naar een nieuwe steriele conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 3.000 × g gedurende 5 min of tot er een pellet is gevormd.
  7. Aspireer het supernatant en resuspendeer de pellet in 1/10e van het oorspronkelijke volume steriele PBS (als 1,5 mL van de suspensie is gepellet, resuspendeer dan in 150 µL). Deze suspensie zal een concentratie hebben van 109 CFU/mL en dienen als het bacteriële inoculum.
  8. Maak seriële verdunningen en zaai 50 µL van het inoculum uit op Todd Hewitt Agar; incubeer de platen vervolgens 24 u bij 37 °C om de exacte concentratie van het inoculum te bepalen.
  9. Inoculeer elke muis intravaginaal met 10 µL S. agalactiae gesuspendeerd in PBS bij 109 CFU/mL (107 CFU/muis), gebruikmakend van dezelfde techniek als in stappen 3.6.1–3.6.4.

7. Kwantificeer de C. albicans en S. agalactiae belastingen in het vaginale lumen (beginnend op dag +1).

  1. Verzamel beginnend één dag na inoculatie met S. agalactiae 100 µL vaginale spoelvloeistof en verdun deze serieel met dezelfde techniek als in stappen 5.1–5.5.
  2. Plat in dubbeltoets 10 µL van de verdunde suspensies en 25 µL van de onverdunde spoelvloeistof uit op zowel Candida-selectieve als StrepB-selectieve chromogene agarplaatjes.
  3. Incubeer de Candida-plaatjes 48 h bij 30 °C. C. albicans-kolonies zullen er glad uitzien en teal of groen van kleur zijn.
  4. Incubeer de StrepB-plaatjes 24 h bij 37 °C. S. agalactiae-kolonies zullen er glad uitzien en roze of mauve van kleur zijn.
  5. Herhaal stappen 7.1–7.4 dagelijks, of met een passend tijdsinterval, om de microbiële belasting in het vaginale lumen te monitoren.

8. Kwantificeer de hoeveelheid C. albicans en S. agalactiae in de weefsels van het vrouwelijke genitaliënstelsel (experimenteel eindpunt).

  1. Bereid drie schroefdoppenbuisjes van 2 mL voor, gevuld met ongeveer 0,4–0,5 g zirconia-beads van 1 mm en 500 µL steriele PBS per muis om weefsels (vagina, cervix en uterus) te verzamelen. Bereid daarnaast één steriele microcentrifugebuis en 100 µL steriele PBS per muis voor om het spoelingsvocht te verzamelen. Noteer het gewicht van elk schroefdoppenbuisje om als referentie te gebruiken bij het berekenen van de weefelgewichten.
  2. Euthanaseer de muis met een door de instelling goedgekeurde methode, zoals CO2-asfixie en cervicale dislocatie. Gebruik 70% ethanol om de scharen en pincetten te steriliseren.
  3. Til het achterlijf van de muis bij de staart op en verzamel het vaginale spoelingsvocht met de techniek uit stappen 5.3–5.4.
  4. Spray de buik van de muis in met 70% ethanol en gebruik de gesteriliseerde scharen om de buikholte te openen. Gebruik een pincet om de huid terug te trekken en het maag-darmkanaal te verschuiven om de weefsels van het genitaliënstelsel bloot te leggen.
  5. Gebruik de gesteriliseerde scharen om de blaas, evenals het visceraal vet en de membranen die de uterus aan het zicht onttrekken, te verwijderen. Scheid de uterushoorns van de eierstokken door te knippen tussen het uteruslichaam en elke eierstok.
  6. Pak met gesteriliseerde pincetten het vaginale kanaal vast op het punt onder de cervix. Til op tot het gehele vaginale kanaal zichtbaar is en maak met gesteriliseerde scharen een transversale snede zo dicht mogelijk bij de vulva, waarbij huidweefsel wordt vermeden. Verwijder het volledige genitaliënstelsel en plaats dit in een steriele Petrischaal van 10 cm.
  7. Gebruik een steriel scheermesje om twee transversale sneden onder en boven de cervix te maken, waardoor de vagina, cervix en uterus worden gescheiden. Hak elk van de weefsels fijn door nog 2–5 sagittale en transversale sneden door elk weefsel te maken. Plaats elk weefsel in het respectievelijke voorbereide schroefdoppenbuisje.
  8. Weeg elk schroefdoppenbuisje en bereken het gewicht van elk weefsel door de waarde uit stap 8.1 af te trekken. Sluit elk buisje stevig af, homogeniseer met beads (bead-beating) op 3.450 rpm gedurende 1 min, plaats de buisjes 1 min op ijs en homogeniseer vervolgens opnieuw op 3.450 rpm gedurende 1 min.
  9. Verdun elk weefselhomogenaat en spoelingsmonster serieel en plaatse deze volgens de methode beschreven in stappen 5.5–5.6. Incubeer de platen zoals beschreven in stappen 7.3–7.4.

Resultaten

Om de vaginale kolonisatie door GBS en C. albicans te karakteriseren, werden muizen intravaginaal geïnoculeerd met C. albicans stam SC5314 of een PBS-controlesuspensie, gevolgd door inoculatie met GBS stam COH1. Deze stam vertegenwoordigt hypervirulente capsulaire serotype III, sequence type 17 isolaten, die het meest frequent geassocieerd zijn met neonatale invasieve ziekten en meningitis1. Muizen die één dag na inoculatie niet gekoloniseerd waren met GBS, werden uitgesloten van de analyse. Gedurende een experimentele tijdlijn van vier dagen klaren muizen die enkel met GBS waren gekoloniseerd de GBS geleidelijk uit het vaginale lumen. De meeste muizen die co-gekoloniseerd waren met C. albicans behouden hoge GBS-lasten (Figuur 1A,B). C. albicans koloniseert het vaginale lumen van de muis ook gedurende ongeveer vier dagen voordat het wordt geklaard (Figuur 1C). Eerder werk met dit model heeft aangetoond dat de GBS-lasten in de weefsels van het vrouwelijke voortplantingsstelsel (FGT), inclusief de vagina, cervix en uterus, eveneens hoger zijn bij co-gekoloniseerde muizen vergeleken met mono-gekoloniseerde dieren2.

GBS-kolonisatiegrafieken; statistische vergelijking, overlevingscurve, CFU/ml logaritmische schaal data-analyse.
Figuur 1Kwantificering van Groep B Streptococcus kolonisatie. CD-1-muizen werden gekoloniseerd met *C. albicans* (SC5314) of behandeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing als controle, gevolgd door vaginale inoculatie met GBS (COH1).A) GBS-belasting in vaginaal spoelvocht, medianen getoond. (B) Percentage van de gekoloniseerde muizen in de loop van de tijd, bepaald door GBS-detectie in vaginaal spoelvocht. (C) C. albicans belastingen in vaginaal spoelvocht, medianen worden getoond. Drie onafhankelijke experimenten. n = 26-27 muizen per groep. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,01 via meerdere t-testen met de toets voor meervoudige vergelijkingen van Holm-Sidak (A) of logrank-toets (B). Afkortingen: GBS = Groep B Streptococcus, Ca = Candida albicans, CFU = colony-vormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Vaginale kolonisatie door GBS vormt een kritiek risico voor de materno-foetale en neonatale gezondheid. In vivo modellen zijn essentieel om de determinanten van kolonisatie te begrijpen en om preventieve therapieën te ontwikkelen. In dit manuscript beschrijven we een muismodel om muizen vaginaal co-te koloniseren met GBS en C. albicans, om de microbiële last in het vaginale lumen en het FGT te beoordelen en om relevante weefsels te verzamelen voor verdere downstream-analyses. Dit model is ontwikkeld om schimmel-bacterie- en gastheer-microbe-interacties te bestuderen in de context van polymicrobiële vaginale kolonisatie. Onze onderzoeksgroep heeft dit model gebruikt om de mechanismen te ontrafelen die bijdragen aan de wijze waarop C. albicans vaginale kolonisatie door GBS en opstijgende infecties bevordert22.

Diermodellen zijn succesvol gebruikt om interacties tussen gastheer en microben te begrijpen; het integreren van polymicrobiële gemeenschappen in deze modellen kan echter verschillende unieke uitdagingen opleveren. De primaire doelstellingen bij de ontwikkeling van dit model waren het vestigen van schimmelkolonisatie, het bieden van voldoende tijd voor C. albicans om hyfen te vormen en het inoculeren met GBS om de kolonisatiedynamiek te monitoren voordat een van de microben door de gastheer werd geëlimineerd. Als polymorfe schimmel kan C. albicans reageren op een aantal gastheer-gerelateerde omgevingssignalen door hyfale morfogenese te initiëren17. Filamentatie in vivo kreeg in dit model voorrang vanwege toenemend bewijs dat hyfespecifieke interacties met GBS symbiose in de FGT stimuleren. Met behulp van een C. albicans-stam die NRG1 tot expressie brengt onder controle van de repressible TetO-promotor, heeft onze onderzoeksgroep eerder aangetoond dat GBS een hogere co-aggregatie en hogere epitheliale adhesie vertoont bij hyfe-locked vergeleken met gist-locked C. albicans22. Co-aggregatie met C. albicans en associatie met menselijke vaginale epitheelcellen zijn belangrijke determinanten voor de fitness van GBS in deze gastheeromgeving. Aanvullende bacteriën , waaronder Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa en diverse Streptococcus-soorten , blijken de morfogenese-geassocieerde genexpressie in C. albicans te moduleren en bovendien bij voorkeur met hyfen te interageren24. In de toekomst kunnen de implicaties van filamentatie in vivo worden onderzocht door dit model te gebruiken om muizen te koloniseren met hyfe- of gist-locked C. albicans-stammen.

Bestaande muizenmodellen met intravaginale inoculatie van C. albicans hebben zich voornamelijk gericht op vulvovaginale candidiasis (VVC)25 en zijn gebruikt om de hyperinflammatoire toestand die geassocieerd is met symptomatische infectie te karakteriseren26. Ons model, beschreven in dit manuscript, representeert nauwer een toestand van kolonisatie. Eerder werk van onze onderzoeksgroep heeft aangetoond dat, bij gebruik van dit model, co-kolonisatie met C. albicans de abundantie van de pro-inflammatoire cytokines IL-6, CXCL1, CXCL2 en TNFα verlaagt in vergelijking met kolonisatie met GBS alleen, en dat de spiegels van deze eiwitten bij co-gekoloniseerde muizen vergelijkbaar zijn met die bij naïeve dieren22. Dit geeft aan dat wij het hyperinflammatoire milieu dat kenmerkend is voor VVC niet observeren, ondanks schimmelfilamentatie in het vaginale lumen. Er is gerapporteerd dat outbred CD-1 muizen resistent zijn voor VVC, mogelijk door adequate immuun-gemedieerde controle van schimmelgroei27. Bovendien initiëren CD-1 muizen na intravaginale GBS-inoculatie een robuuste immuunsignalering die voldoende is om de bacteriële populatie binnen ongeveer één week te controleren in afwezigheid van C. albicans28,29,30, hoewel wij eerder GBS-vaginale kolonisatie in andere muizenstammen hebben onderzocht12. Het in dit manuscript beschreven model weerspiegelt het transiënte karakter van zowel C. albicans als GBS-kolonisatie zoals dat bij mensen wordt waargenomen. Daarnaast is er bij mensen een hoge variabiliteit in zowel de pH als de samenstelling van het microbioom. Dit model heeft bijna-neutrale pH-condities (~6,5)31. Het vaginale microbioom van de CD-1 muis wordt gedomineerd door Enterobacteriaceae en Proteus soorten13, welke geassocieerd zijn met dezelfde typen vaginale microbiële gemeenschapstoestanden als GBS9,32.

Door muizen vóór de schimmelinoculatie te behandelen met antibiotica en een enkele dosis 17β-estradiol, maken we de omgeving ontvankelijk voor C. albicans, wat de kolonisatie vergemakkelijkt. De estradiolbehandeling bevordert daarnaast de reproduceerbaarheid tussen experimenten door het oestrusstadium en daarmee de lokale immuunomgeving op het moment van inoculatie te synchroniseren. We synchroniseren de muizen naar het proestrusstadium bij de inoculatie van C. albicans, wat samenvalt met een verminderde hoeveelheid neutrofielen en waarvan is aangetoond dat het de schimmellast in het FGT bevordert33,34. Het vroeg in de experimentele tijdlijn verwijderen van de antibiotica en het vervangen daarvan door vers drinkwater vergemakkelijkt niet alleen de GBS-kolonisatie, maar stelt ook inheemse microben in staat om het vaginale kanaal opnieuw te koloniseren. Bovendien stelt het beperken van de estradiolbehandeling tot een enkele vroege dosis de muizen in staat om de typische dynamiek van de oestruscyclus te hervatten, hoewel is aangetoond dat continue toediening van estradiol de kolonisatie bevordert12. De samenstelling van immuuncellen in het murine FGT varieert gedurende de oestruscyclus, en mucosale immuunresponsen reageren sterk op geslachtshormonen35,36,37. Zo omzeilen we de storende variabele van herhaalde estradioltoediening om specifiek de effecten van microbiële kolonisatie op de gastheeromgeving te onderzoeken.

De gegevens in deze studie hebben betrekking op de C. albicans-stam SC5314 en de GBS-stam COH1. We hebben SC5314 gekozen voor het opzetten van het model vanwege het frequente gebruik in de mycologie, de overvloed aan beschikbare genetische instrumenten voor deze achtergrond en de gevestigde kennis over de biologie en dynamiek in vitro en in vivo. Onze onderzoeksgroep heeft daarnaast aangetoond dat de C. albicans-stam 529L de GBS-last in het FGT kan bevorderen22. GBS-stam COH1 werd gebruikt als vertegenwoordiger van de serotype III sequence type 17-lijn, die geassocieerd wordt met antimicrobiële resistentie en neonatale invasieve ziekten1,2. Dit model maakt gebruik van selectieve en differentiële media om de abundantie van GBS en C. albicans in vaginale spoelingen en weefsels te kwantificeren. Om dit model aan te passen voor gebruik met andere bacteriële en schimmelsoorten, zouden de passende selectieve groeicondities geoptimaliseerd moeten worden.

Interacties tussen schimmels en bacteriën blijken belangrijke mediatoren te zijn van microbiële levenswijzen38,39. Verschillende studies hebben aangetoond dat interacties het commensalisme en het virulentiepotentieel aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Daarnaast legt de gastheeromgeving unieke druk op en kan deze factoren beïnvloeden zoals metabole programmering, regulonen van transcriptiefactoren en antimicrobiële resistentieprofielen. Daarom is het essentieel om representatieve in vivo modellen te gebruiken om te karakteriseren hoe microben met elkaar interageren. Het muismodel dat in dit manuscript wordt beschreven, kan worden gebruikt om te bestuderen hoe vaginale kolonisatie met bacteriën en schimmels van belang de microbiële last, genexpressie en de respons van de gastheer kunnen beïnvloeden.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Wij danken het Office of Laboratory Animal Resources aan de University of Colorado Anschutz, inclusief de facility manager en het toegewijde personeel van het vivarium. Dit werk wordt ondersteund door NIH-beurzen R01AI153332 en R21AI188719 toegekend aan K.S.D.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,22 µm filterSigma-AldrichSLGSR33SB
0,45 µm filterSigma-AldrichSLHAR33SB
1 mL luer lock spuitMcKesson16-S1C
1,0 mm zirkonia kralenResearch Products International9835
10 mL luer lock spuitMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875WAARSCHUWING: 17β-estradiol kan worden opgenomen via de huid en slijmvliezen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en wees voorzichtig bij gebruik.
18G 1,5" naaldBD305196
2 mL buis met schroefdopFisher Scientific02-681-374
26G 0,5" naaldMcKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicillineResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamycineVWR Life Science0304
NeomycineResearch Products InternationalN20040
Fosfaatgebufferde zoutoplossingFisher ScientificBP2944
SesamolieSigma-AldrichS3547
Todd Hewitt-bouillonResearch Products InternationalT47500
Yeast Peptone Dextrose-bouillonBD242810

Referenties

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Groep B Streptococcusvrouwelijk genitale tractusinterkingdom interactiesantibioticabehandelingkwantificering van microbi le belastingimmuunrespons van de gastheer
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.