Paradigma voor sociale herkenning bij muizen voor het onderscheiden van kortetermijn- en langetermijnrelaties

Samenvatting

Hier beschrijven we een grondige procedure voor het meten van sociale herkenning tussen nieuwe, kortlopende en langlopende relaties met behulp van een Four Cups gedragsexperimenteel paradigma. We beschrijven de voordelen en potentiële toepassingen van dit paradigma, samen met belangrijke informatie voor een nauwkeurige interpretatie van de resultaten. 

Samenvatting

Sociaal geheugen is het vermogen om soortgenoten te onthouden en te herkennen . Het is een fundamenteel aspect van het gedrag van zoogdieren, met aangetoonde overlevingsvoordelen bij zeer sociale zoogdieren zoals muizen en mensen. Knaagdieren, en in het bijzonder muizen, zijn een gevestigd diermodel dat uitgebreid wordt gebruikt om het sociaal geheugen en de onderliggende mechanismen ervan te bestuderen. De meeste bestaande paradigma's voor sociaal geheugen beoordelen primair de kortetermijnherkenning, waarbij de duur van de relatie en de mate van vertrouwdheid tussen het proefdier en een stimulusdier tussen de 5–15 min ligt. Daarom leggen bestaande paradigma's en eerdere studies geen sociale herinneringen uit langetermijnrelaties vast en focussen ze op de dichotomie tussen nieuwigheid versus kortetermijnvertrouwdheid, waardoor een grote kloof blijft bestaan in ons mechanistische begrip van sociale herinneringen. Om deze kloof te dichten, hebben we een eenvoudige assay ontworpen die de reacties van muizen op verschillende niveaus van vertrouwdheid vastlegt, waardoor complexe herinneringen aan sociale interacties in een observeerbare, kwantificeerbare context worden geplaatst. In het paradigma van de vier bekers verkent een proefmuis vrijelijk een arena waarin vier geperforeerde bekers in elke hoek zijn geplaatst. In deze bekers bevinden zich drie stimulusmuizen met verschillende niveaus van vertrouwdheid (sociale stimuli): een langetermijnvertrouwde (kootsmaat; 1 maand samenghuisvest), een kortetermijnvertrouwde (10 min voorafgaande blootstelling), een nieuwe soortgenoot, en een lege beker als controle. Mannelijke CD-1 muizen vertonen in dit paradigma een voorkeur voor het onderzoeken van de nieuwe en de langetermijnvertrouwde muis boven het onderzoeken van kortetermijnvertrouwde muizen. Deze taak demonstreert de herkenning van het vertrouwdheidsniveau en minimaliseert agressief gedrag, terwijl er nog steeds gecorrigeerd wordt voor de blootstellingsgeschiedenis. Deze nieuwe assay biedt een platform om de neurale mechanismen van het sociaal geheugen direct te vergelijken bij langetermijn, kortetermijn en nieuwe individuen. Het paradigma van de vier bekers dient als een nieuwe meetmethode voor de herkenning van langetermijnvertrouwdheid die bestaande assays voor kortetermijnherkenning zal aanvullen. 

Inleiding

Sociaal geheugen is een kernkenmerk van het sociale gedrag van zoogdieren en is bijzonder goed ontwikkeld bij zeer sociale soorten zoals muizen en mensen. Bij knaagdieren erkenning van anderen vormt de basis voor gedragsdynamiek die cruciaal is voor het overleven binnen familie- en soortgenoteneenheden, waaronder groepscohesie, dominantiehiërarchieën, paringsgedrag en ouderlijke zorg^1,2. Naast zijn evolutionair voordelige rol in het overleven van dieren, is de verstoring van het sociale geheugen bij mensen een alomtegenwoordig kenmerk van meerdere neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen, waaronder autismespectrumstoornissen, schizofrenie en de ziekte van Alzheimer.^3,4,5,6Omdat sociale herkenning fundamenteel is voor het dagelijks functioneren van sociale soorten en een duidelijk klinisch belang heeft, is de ontwikkeling van gedragsassays die de multidimensionale aard en de neurale basis hiervan nauwkeurig vastleggen van essentieel belang. Hoewel bestaande paradigma's bepaalde aspecten van sociale herkenning bij muizen meten, zijn de meeste assays ontworpen om beoordeel voorkeuren voor nieuwheid door nieuwe relaties te vergelijken met kortlopende relaties gevormd gedurende minuten of uren, in plaats van het kwantificeren van herkenning van langdurige sociale relaties.   

Bestaande benaderingen, zoals het drie-kamerparadigma of de habituatie-dehabituatieparadigma's, beoordelen de voorkeur voor nieuwheid na slechts een korte voorafgaande blootstelling, vaak beperkt tot 5–15 minuten^7,8,9,10,11. Deze methoden hebben aanzienlijk inzicht geboden in de neurale mechanismen van deze kortstondige sociale herinneringen bij muizen^12,13. Echter, naturalistische sociale herinneringen en sociale functies moeten de verschillende mechanismen omvatten die een rol spelen bij langetermijnrelaties, opgebouwd via cohabitatie, langetermijn sociale hiërarchieën of partnerkeuze. Hoewel sommige studies het drie-kamerparadigma gebruiken met nestgenoten¹⁴ of bekende muizen die tot 72 u^15,16 samen met het subject zijn gehuisvest, blijft het primaire gebruik van het paradigma gericht op de eenvoudige dichotomie nieuw versus bekend. Dit beperkt vergelijkingen tussen meerdere verschillende bekende muizen. Omdat bestaande paradigma's voor sociale herkenning bevooroordeeld zijn naar het bestuderen van kortstondige relaties, identificeren wij een duidelijk gat in onze kennis van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de sociale herkenning van langetermijnrelaties.   

Om deze beperking aan te pakken, we hebben het 'four cups'-paradigma ontwikkeld: een eenvoudige, flexibele assay ontworpen om te differentiëren herkenning van meerdere niveaus van sociale vertrouwdheid binnen één enkele testsessie. In dit paradigma verkent een proefmuis vier hoeken van een open arena, elk bevattende a geperforeerd beker vasthouden a conspecifiek of een controlebeker zonder inhoud. De bekers bevatten een langdurig bekende soortgenoot (kooigenoot), een kortstondige gewenning conspecifiek met beperkte voorafgaande ervaring (10 min), a nieuw muis, en een Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan er geen vertaling worden gegenereerd. Voer aub de tekst in die vertaald moet worden. controle. De onderzoekstijd dient als een kwantitatieve index voor sociale herkenning en sociale voorkeur. Deze configuratie maakt gelijktijdige vergelijkingen tussen verschillende familiariteitsniveaus mogelijk, terwijl directe fysieke interactie en potentiële agressieve ontmoetingen worden geminimaliseerd. 

Protocol

Alle procedures met dieren moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Florida. 

1. Voorbereiding en huisvesting van dieren  

1. Gebruik voor alle experimenten volwassen geslachtsgenoten die in groepen worden gehuisvest muizen.  Hanteer de muizen gedurende ten minste 2 dagen om hen te laten wennen aan hantering en om angst voor de experimentele tests te verminderen.
2. Huisvest de muizen in standaard laboratoriumkooien onder een omgekeerde licht-donkercyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. 
   OPMERKING: Volwassen CD-1 en C57BL/6 muizen (3–4 maanden oud) werden gebruikt voor representatieve experimenten. Muizen werden gehuisvest in groepen van 3–4 dieren per kooi. Representatieve datasets bevatten 10 mannelijke CD-1 muizen, 12 vrouwelijke CD-1 muizen en 31 mannelijke C57BL/6 muizen. Het gedrag moet worden getest tijdens de actieve fase van het proefdier (donkere fase). Muizen in deze studie werden getest tussen 9:00 en 18:00 uur en werden gehouden in een omgekeerde licht-donkercyclus (donkere fase van 8:00 tot 20:00 uur).
3. Definieer een langdurig bekende stimulus als een kooi genotype- en geslachtgenoot die gedurende minimaal 3–4 weken voorafgaand aan de tests samen met de proefmuis in dezelfde kooi heeft geleefd. 
4. Selecteer kortstondig bekende en nieuwe soortgenoten stimuli van hetzelfde genotype en geslacht als de proefmuis. 
5. Zorg ervoor dat de nieuwe muizen geen eerdere fysieke of olfactorische blootstelling aan de proefmuis hebben gehad. 
6. Selecteer een nieuwe stimulus en een kortstondig bekende stimulus uit verschillende thuiskooien om vergelijkbare olfactorische signalen bij deze twee stimuli te vermijden.
   OPMERKING: Noteer de geschatte leeftijd van alle gebruikte dieren en beperk het hergebruik van dezelfde nieuwe en kortstondig bekende stimuli meerdere keren per dag. Als de stimuli opnieuw worden gebruikt, las dan een pauze van >2 u in de thuiskooi in tussen de testruns om gestresste stimuli te voorkomen.

2. Inrichting van de arena 

1. Plaats een schone, vierkante open-field arena (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabel met Materialen) in een rustige kamer voor gedragstesten.
2. Verlicht het gebied met een enkele hoge lamp of een plafondlamp, ingesteld op ongeveer 8–20 lux.  
3. Plaats vier identiek gewogen geperforeerde plastic bekers in elke hoek van de arena (Figuur 1A).
   1. Gebruik indien mogelijk visueel identieke bekers. Als bekers van verschillende kleuren worden gebruikt, moeten de toewijzing en locaties van de bekers over de trials heen worden gebalanceerd.
   2. Druk twee zijden van elke beker strak tegen de wanden van de arena om de toegang te beperken, waardoor schuilgedrag wordt geminimaliseerd en de onderzoekshoeken worden gestandaardiseerd. 
   3. Gebruik bekers die zwaar genoeg zijn om ontsnapping te voorkomen en hoog genoeg om klimmen te voorkomen.
      OPMERKING: In deze studie werden de representatieve databekers en de locatie van de agent pseudorandomiseerd over de proefpersonen door de gekleurde plastic bekers met de klok mee te roteren, terwijl het type agent tegen de klok in werd verplaatst over de trials.
4. Plaats de camera hoog genoeg zodat de volledige assay box in beeld is om blinde vlekken tijdens de gedragscodering te vermijden. Zorg voor minimale schittering en een consistente verlichting over de bodem van de box (Figuur 1A).
5. Reinig de bodem van de arena en de bekers grondig tussen de trials door met een geschikt desinfectiemiddel, gevolgd door water om resterende geuren te verwijderen. 
6. Laat de arena volledig drogen voordat de dieren opnieuw worden geïntroduceerd. 

3. Habituatie aan de arena op dag 0

1. Plaats het proefdier en zijn kooigenoten in de arena die vier lege geperforeerde bekers bevat en sta vrije exploratie toe gedurende 20 min.
   OPMERKING: Habitueer proefdieren individueel voor experimenten met tethering. Aanvullende habituatiesessies kunnen nodig zijn. Het wordt aanbevolen om meerdere habituatiedagen in te plannen als muizen na één dag nog niet volledig de gehele arena hebben geëxploreerd.
2. Verwijder alle muizen uit de arena en plaats ze terug in de thuiskooi.
3. Plaats alle sociale agenten gedurende 10 min onder de bekers om hen te habitueren aan het vastgezet zijn. Habitueer agenten uit dezelfde thuiskooi gelijktijdig, één per beker (Figuur 1B).
4. Maak de arena en de bekers schoon voordat muizen uit een nieuwe thuiskooi worden geïntroduceerd.
   OPMERKING: Laat de muizen na transport naar de kamer ten minste 15 min rusten voordat de sessie begint.

4. Baseline 

1. Stel de arena op volgens sectie 2. Behoud dezelfde arenaconfiguratie gedurende alle experimentele dagen. 
2. Plaats het proefdier in de arena die vier lege bekers bevat en sta vrije exploratie toe gedurende 10 min.
   OPMERKING: Pauzeer de opname op geen enkel moment, zodat er continu wordt opgenomen tijdens alle fasen van de huidige trial.  

5. Kortetermijnacquisitie 

1. Gebruik een verzwaard geperforeerd bekertje om het proefdier te beperken terwijl u de aangewezen "kortstondig bekende" agent plaatst. Alternatief kan het proefdier worden blootgesteld aan de kortstondige agent in een schone kooi.
2. Indien u kiest voor blootstelling in de arena, beperk dan een aangewezen kortstondig bekende agent onder één geperforeerd bekertje in de arena, terwijl de andere drie bekertjes leeg blijven. 
3. Laat het proefdier vrij en sta vrije exploratie toe gedurende 10 min (Figuur 1B).
   OPMERKING: Indien de methode van blootstelling aan een kortstondige agent in een arena wordt gebruikt, varieer dan de gebruikte hoek voor de kortstondig bekende agent tussen de proefdieren om ruimtelijke bias te voorkomen. 

6. Inter-trial interval (ITI) 

1. Haal de kortstondige gewenning agens en plaats deze terug in de eigen kooi. Laat de proefmuis alleen in de arena achter en laat ze 10 min. vrij bewegen. 
2. Verzamelen nieuw en langdurige familiarisatie proefmuizen voor de test fase.  
   OPMERKING: Plaats de op korte termijn bekende stimulus terug in hetzelfde bekertje dat tijdens de kortstondige acquisitie (sectie 5) is gebruikt. Dit wordt aanbevolen om nieuwigheid in de ruimtelijke locatie te voorkomen indien de kortstondige acquisitie in een arena plaatsvindt.

7. Sociale herkenningsfase 

1. Plaats een extra verzwaarde geperforeerde beker over de proefmuis.
2. Plaats één muis onder elk van de drie verzwaarde geperforeerde bekers: een langdurig bekende (kooigenoot), een kortstondig bekende en een onbekende soortgenoot. Laat een aangewezen vierde beker leeg als controle.  
   OPMERKING: Label de bovenkanten van de bekers om de locaties van de agentia tijdens de gedragsscoring te kunnen identificeren.
3. Verwijder de geperforeerde beker van de proefmuis in het centrum van de arena en sta vrije exploratie toe gedurende 10 min (Figuur 1A).
4. Verwijder alle muizen aan het einde van het 10 min interval en stop de opname.
5. Plaats alle muizen terug in hun thuiskooien. 
6. Maak de arena en de bekers grondig schoon vóór de volgende trial.  
   OPMERKING: Houd reservebekers bij de hand in geval van beschadiging.

8. Gedragsscore

1. Importeer alle opgenomen video's in gedragsanalyse-software die geschikt is voor handmatige annotatie, zoals Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS).
   OPMERKING: De gedragsscore was niet geblindeerd voor de locatie van de kooigenoot, aangezien labels met het ID van het agens boven elke beker waren geplaatst en zichtbaar waren in de video's, en het kooigemmer kon worden afgeleid. Scorers letten niet actief op de zichtbare labels en waren geblindeerd voor de identiteit van het nieuwe en het kortstondige agens. Alle scorers volgden vooraf gedefinieerde operationele definities van onderzoekgedrag en gestandaardiseerde scorecriteria.
2. Definieer de gedragsmatrix vóór het scoren.
3. Definieer een onderzoeksepisode als het positioneren van de neus van de proefmuis binnen 1 cm van een beker terwijl er een aanhoudende onderzoekshouding wordt vertoond. 
   OPMERKING: Beschouw kauwen en knagen aan de beker als onderzoeksepisodes.
4. Annoteer handmatig de totale onderzoeksduur voor elke beker gedurende de 10-min fasen van de sociale recognitietest. Score de baseline en acquisitie naar behoefte.
   OPMERKING: Geautomatiseerde pose-tracking kan worden gebruikt met een halfcirkelvormig interessegebied van 1 cm rond elke beker.
5. Exporteer de geannoteerde gegevens voor verdere statistische analyse.

Resultaten

Volgens het protocol van het vier-bekerparadigma vertoonden mannelijke CD-1 muizen differentieel sociaal onderzoekgedrag tegenover langdurig bekende (kooi-genoten), kortstondig bekende en nieuwe soortgenoten (Figuur 2). Voor elke actor werd een discriminatie-index (DI) berekend op basis van de seconden die werden besteed aan het onderzoek van die actor versus de lege beker, berekend als (actor − leeg)/(actor + leeg) tijdens de 10-minuten durende fase van sociale herkenning. Deze index was no...

Discussie

Er zijn belangrijke overwegingen bij het toepassen van het paradigma met vier bekers om deze sociale dynamiek effectief en betrouwbaar te meten in andere laboratoriumomgevingen. Habituatie op Dag 0 vermindert niet-sociale, door nieuwsgierigheid gedreven exploratie van de arena en de bekers, wat anders sociale onderzoekstijd tijdens de tests kan maskeren^7,8,9. Precieze controle over de duur van de kortstondige familiarisatie is o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Software voor gedragsscore	Interactieve software voor gedragsobservatieonderzoek	Versie 9.12.7	Software voor handmatige annotatie van gebeurtenissen
Openveldarena	Rafferty Machine and Tool	Op maat gemaakt	Structurele FRP-glasvezelplaat, vierkante arena (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm); niet-transparante wanden; indien de arena transparant is, bedek de buitenwanden met papier om afleiding voor het dier te minimaliseren
Bovenkijker-camera	Logitech	Logitech C920x HD Pro PC Webcam	Camera geschikt voor continue videoregistratie; gemonteerd boven het centrum van de arena
Geperforeerde bekers	Chinco Store	ONG-Chinco-0279	afmetingen van de cups: 4,01"L x 4,01"W x 4,52"H; Geperforeerde plastic of metalen bekers, kunnen vierkant of cilindrisch zijn
Prism	GraphPad	Versie 10.6.0	Software voor data-analyse; kan ook met andere software worden uitgevoerd