Geoptimaliseerde workflow voor gistoppervlakteweergave voor gerichte evolutie van proteasen

Samenvatting

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde workflow voor de gerichte evolutie van virale proteasen in Saccharomyces cerevisiae met behulp van een selectiesysteem gebaseerd op oppervlakteweergaven. Het beschrijft het ontwerp van DNA-insert-bibliotheek en substraatcassettes, elektroporatie geoptimaliseerd voor hoge transformatie-efficiëntie, fluorescentie-geactiveerde celsortering voor protease-splitsing en sequencing van verrijkte varianten.

Samenvatting

Gerichte evolutie bootst het natuurlijke evolutionaire proces na in een snelle, gecontroleerde laboratoriumomgeving om eiwitten met gewenste functies of eigenschappen te laten evolueren. Het screenen van een grote pool mutante eiwit-coderende genen maakt functionele selectie van gewenste varianten mogelijk voor toepassingen in biotechnologie, geneeskunde en synthetische biologie. Met dit protocol voeren we gerichte evolutie uit in Saccharomyces cerevisiae om proteasevarianten met hoge specificiteit te ontwikkelen voor een niet-inheemse substraatsequentie. We tonen deze proteasevarianten op het oppervlak van de gistcel om de selectie van gewenste varianten te vergemakkelijken via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) over meerdere verrijkingsrondes. Vier belangrijke elementen van de substraatcassette worden gezamenlijk uitgedrukt met de proteasebibliotheek: een fusie-eiwit bestaande uit (i) de gistadhesiereceptorsubunit Aga2, (ii) selectie- en (iii) tegenselectie-substraatsequenties, (iv) epitoop-tagsequenties en een optionele endoplasmatisch reticulum (ER) terughaalsignaalsequentie. Gistcellen waarin alleen de selectiesubstraatsequentie wordt gesplitst, worden geïsoleerd met behulp van meerkleurige FACS via fluorescerende (fycoerythrin/fluorescein isothiocyanaat-gelabelde) anti-epitoopantilichamen. Hier geven we details van het geoptimaliseerde, stapsgewijze protocol om een protease-evolutiecampagne uit te voeren, inclusief ontwerp van DNA-insertbibliotheek en ontwerp van substraatcassettes, gistcelelektroporatie met hoge transformatie-efficiëntie (tot 10 à9^{transformanten} per microgram DNA), FACS-gebaseerde selectie, verrijking en sequencing van geëvolueerde varianten. We demonstreren ons gerichte evolutieprotocol door de tabaks-etchvirus nucleaire inklusie A protease (TEVp) te laten evolueren van het splijten van zijn natuurlijke substraatsequentie, ENLYFQ↓S, naar het splijten van een nieuwe sequentie, ENLYFE↓S.

Inleiding

Cysteinproteasen van de familie Potyviridae, specifiek de nucleaire inclusie A (NIa) proteasen, vormen een grotendeels onbenutte bron van sequentiespecifieke endopeptidasen. Met meer dan 3.800 gekarakteriseerde familieleden kloven NIa-proteasen een onderscheidende substraatsequentie van zeven aminozuren. De potoveralfamilie biedt een diverse set proteasen voor het ontwerpen van programmeerbare eiwitcontrolesystemen, het construeren van orthogonale protease-gebaseerde genetische circuits en het ontwikkelen van sequentie-specifieke biotechnologische tools ^1,2. Ondanks deze natuurlijke diversiteit zijn slechts twee NIa-proteasen, TEVp en tabaksvenenmottling virusprotease (TVMVp), grondig gekarakteriseerd en ontwikkeld voor breed laboratorium- en biotechnologisch gebruik ^3,4. Deze beperkte proteasetoolkit beperkt de ontwerpruimte voor multicomponent-schakelingen die orthogonale protease-activiteiten^{vereisen 5}, en motiveert zo inspanningen om Nia-proteasen verder uit te breiden en te karakteriseren via gerichte evolutie ^6,7.

Gistoppervlakteweergave is uitgegroeid tot een van de krachtigste platforms voor gerichte evolutie, waardoor high-throughput eiwitbibliotheekscreening mogelijk is via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)^6,7. Zo koppelt het gistendoplasmatisch reticulum sequestratiescreeningssysteem (YESS) proteaseactiviteit aan oppervlaktepresentatie via de secretorische route van S. cerevisiae ^6,7. Het YESS-systeem is toegepast om nieuwe protease-substraatspecificiteiten te ontwikkelen en heeft bruikbaarheid aangetoond voor meerronde gerichte evolutiecampagnes. In dit systeem worden proteasevarianten geco-expresseerd met een fusie-eiwit dat een splijtingssubstraatcassette met epitoopmarkers bevat, en het Aga1p-oppervlakteanker wordt tot expressie gebracht in de EBY100-giststam. Differentiële labeling met fluorescerende antilichamen onderscheidt gespleten van niet-gespleten substraatcassettes die op het celoppervlak worden weergegeven. Dit activiteitsafhankelijke weergavemechanisme is direct compatibel met iteratieve, FACS-gebaseerde selectie voor bibliotheken van 10,⁷ of meer varianten ^6,7.

Een fundamentele voorwaarde voor gerichte evolutie is het vermogen om variantbibliotheken op voldoende schaal te introduceren om voldoende dekking van de beoogde sequentieruimte te bereiken. Voor site-saturation mutagenesebibliotheken die meerdere aminozuurposities beslaan, zijn transformatie-opbrengsten van 10⁸ tot 10^{9 unieke} transformanten nodig om ervoor te zorgen dat de diversiteit die in de bibliotheek wordt geïntroduceerd goed vertegenwoordigd is in de gesorteerde populatie. Er bestaan verschillende methoden om exogeen DNA in S. cerevisiae te introduceren, elk met een eigen doorvoerplafond. De conventionele chemische transformatiemethode gebruikt lithiumacetaat/enkelstrengs drager-DNA/polyethyleenglycol (LiAc/ssDNA/PEG) vanwege de eenvoud en toegankelijkheid. Het bereikt echter doorgaans transformatie-efficiëntie van slechts 10⁴–10⁶ kolonievormende eenheden (CFU) per microgram DNA, wat tekortschiet aan de sequentievariatie die nodig is voor grote bibliotheekcampagnes⁸. Daarentegen past de elektroporatiemethode een hoogspanningsveld toe om het celmembraan tijdelijk te permeabiliseren en de opname van DNA te vergemakkelijken. Elektroporatie behaalt consequent de hoogste transformatie-efficiënties onder de beschikbare transformatiemethoden, met geoptimaliseerde protocollen die opbrengsten van 10⁸–10⁹ CFU⁹ rapporteren. Er is waargenomen dat de elektroporatie-efficiëntie in S. cerevisiae kritisch gevoelig is voor celgroeifase, DNA-massa en buffersamenstelling, wat een kader biedt dat sindsdien breed is aangepast voor bibliotheekschaal gerichte evolutie⁹.

Het hier beschreven protocol gebruikt S. cerevisiae-stam EBY100, een veelgebruikte gastheerstam voor het vertoon van gistoppervlakken. EBY100 werd ontwikkeld door Boder en Wittrup door een AGA1-expressiecassette te integreren onder controle van de galactose-induceerbare GAL1-promotor in het chromosomale AGA1-locus van de protease-deficiënte moederstam BJ5465¹⁰. De stam is commercieel verkrijgbaar bij de ATCC (catalogusnummer MYA-4941; deponeerder K.D. Wittrup), met het genotype MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Als gevolg hiervan worden zowel Aga1p als de Aga2p-substraat cassettefusie tot expressie gebracht vanuit dezelfde galactose-induceerbare promotor, waardoor ervoor wordt gezorgd dat de twee subunits gecoïnduceerd worden en samenkomen tot het disulfide-gekoppelde Aga1p–Aga2p-complex dat de getoonde fusie aan de celwand verankert.

Ondanks het wijdverbreide gebruik van EBY100 in gistdisplaytoepassingen, is er geen enkel gepubliceerd protocol systematisch geoptimaliseerd voor het elektroporeren van deze stam op bibliotheekschaal-opbrengsten. EBY100-specifieke parameters, zoals de optimale groeifase bij oogst, de media-samenstelling tijdens subcultuur, en de kwantitatieve relatie tussen initiële optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) en transformatie-efficiëntie, moeten nog rigoureus worden gekarakteriseerd en geoptimaliseerd. Hier rapporteren we dat de transformatie-efficiëntie in EBY100 monotoon toeneemt met de OD₆₀₀ van de kweek bij oogst, waarbij cellen in de late logaritmische fase aanzienlijk hogere transformatiesnelheden opleveren dan die in de vroege logaritmische fase. We evalueerden kritieke protocolparameters, waaronder initiële OD_600-waarden bij inoculatie, het gebruik van 2 × Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) medium voor subculturen, elektroporatiebufferformuleringen en post-elektroporatie uitgroeicondities. Het hier gepresenteerde protocol biedt een geoptimaliseerde, stapsgewijze workflow (Figuur 1A–C, Figuur 2, Figuur 3A–D, Figuur 4A–E) voor het voorbereiden van elektrocompetente EBY100-cellen en het uitvoeren van hoogefficiënte DNA-bibliotheekelektroporatie, wat transformatiesnelheden consequent boven 10⁹ oplevert CFU. Om dit protocol te valideren, voerden we een uitgebreide gerichte evolutiecampagne uit om TEVp te ontwikkelen met gewijzigde cleavagespecificiteit gedurende vier rondes van FACS-gebaseerde selectie en verrijking. Sequencing van verrijkte proteasevarianten bevestigde aanzienlijke diversificatie bij gerichte residuen binnen de substraatbindingspocket van de protease, wat aantoont dat het protocol voldoende bibliotheekdekking van sequentieruimte biedt om productieve evolutiecampagnes te ondersteunen. Dit protocol zal van brede waarde zijn voor onderzoekers die EBY100 gebruiken voor gistoppervlaktedisplay-gebaseerde gerichte evolutie en FACS-compatibele, high-throughput screening van proteasen, antilichamen⁹, kinasen¹¹ en receptoren¹², naast andere eiwitten.

Protocol

Alle experimenten met recombinante S. cerevisiae werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid en de procedures van het Institutional Biosafety and Chemical Safety Committee aan de University of Texas in Dallas. Recombinante giststammen werden behandeld onder Biosafety Level 1 (BSL-1) containment volgens gevestigde institutionele microbiologische praktijken. Elektroporatie, kweek en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) werden uitgevoerd volgens goedgekeurde institutionele bioveiligheidsprocedures. Gistculturen en besmette verbruiksmaterialen werden gedesinfecteerd en als biologisch gevaarlijk afval verwijderd volgens de institutionele richtlijnen.

1. Vector- en insertvoorbereiding

1. Generatie van potoverale proteasebibliotheken via site-saturatie mutagenese
   1. Ontwerp met sequentieontwerpsoftware die 30- tot 50-mer, voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden overlapt om een mutante bibliotheek van proteasen te genereren. Vervang het wildtype-codon in de bijbehorende oligonucleotide door een NNS-gedegenereerd codon, waarbij N A, T, G of C vertegenwoordigt, en S G of C, voor posities die gericht zijn op mutagenese.
   2. Ontwerp de 3′-overlap tussen elk voor- en omgekeerd oligonucleotidepaar met een smelttemperatuur (Tm) van 55–60 °C. Ontwerp de eerste en laatste oligonucleotiden zo dat ze een overlap van 50 nt bevatten met de gistoppervlak-displayvector buiten de restrictieplaatsen.
   3. Zorg ervoor dat ten minste één uiteinde van de insert exact overlapt met één uiteinde van de lineaire vector om homologe recombinatie¹³ te faciliteren. Vermijd gaten tussen aangrenzende oligonucleotiden¹⁴.
   4. Suspensieer oligos opnieuw tot 100 μM met gedeïoniseerde_{H2 O.} In een steriele 1,5 mL buis wordt 0,5 μL van elke oligo gecombineerd tot een eindvolume van 200 μL (eindconcentratie van 250 nM per oligo).
   5. Stel een PCR-reactie op met de componenten die in Tabel 1 zijn vermeld om de proteasebibliotheek samen te stellen, met behulp van de thermocyclische condities in Tabel 2.
   6. Stel een tweede PCR-reactie op met de buitenste voor- en achteruit-oligo's (Tabel 3) met het eerste geassembleerde PCR-product als sjabloon. Versterk het product zoals weergegeven in Tabel 4.
   7. Voer het tweede PCR-product uit op een 1% agarosegel met ethidiumbromide (0,5 μg/mL) op 240 V gedurende 30 minuten. Verwijder de band die overeenkomt met de verwachte DNA-lengte.
      OPMERKING: VOORZICHTIG: Ethidiumbromide is een mutageen en moet worden behandeld met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbril. Vermijd huidcontact en inademing. Verwijder gels, buffers en verbruiksartikelen met ethidiumbromide als gevaarlijk chemisch afval volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen.
   8. Zuiver met een gelextractiekit. Eluut in 50 μL gedeïoniseerd H2_O.
   9. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. Bewaar het DNA bij −20 °C.
      OPMERKING: Elke 50 μL reactie van de^{tweede PCR} levert ongeveer 0,5–1,0 μg totaal DNA op. Aangezien elke elektroporatie 12 μg van de proteasebibliotheek vereist (d.w.z. insert), schaal reacties dienovereenkomstig op.
2. Substraatcassette-assemblage
   1. Bereid LB-agarplaten en LB-chloramfenicol-vloeibare media voor. Zie recepten in Tabel 5.
   2. Ontwerp een set overlappende oligonucleotiden van 30 meer in voorwaartse en achteruitrichting voor de assemblage van substraatcassettes. Ontwerp de 5′-uiteinden van elk omgekeerd oligonucleotide en de voorste oligonucleotide van het volgende fragment zodat ze overeenkomen met 4 nucleotiden.
   3. Suspensieer gelyofilieerde oligo's tot 100 μM met behulp van gedeïoniseerde H2_O.
   4. Meng reagentia zoals in Tabel 6.
   5. Gebruik het cyclusprogramma in Tabel 7 om het oligomengsel te annealen en fosforyleren.
   6. Verdunde geannealeerde oligos 4-voudig in gedeïoniseerd H₂O om een uiteindelijke concentratie van 1,25 μM te bereiken.
   7. Combineer de geannealed oligo-mix met de vector (bijv. pDD1523), volgens Tabel 8.
   8. Voer Golden Gate-assemblage uit, volgens het fietsprogramma in Tabel 9.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, het pDD1523-plasmide heeft een type IIS restrictieplaats (BsmBI) stroomafwaarts van de GAL1/10-promotor. Succesvolle assemblage maakt galactose-inductie van de substraatcassette⁷ mogelijk.
   9. Transformeer het resulterende plasmide in E. coli.
   10. Plaatcellen op LB-agar met het bijbehorende antibioticum. Broed 16–18 uur bij 37 °C.
   11. Kies geïsoleerde kolonies en inoculeer ze in 5 ml LB-media. Broed 's nachts (16–18 uur) bij 37 °C met schudden (220 rpm).
   12. Haal plasmiden uit nachtelijke kweek met een plasmid miniprep-kit.
   13. Meet de plasmidconcentratie met een spectrofotometer en stuur daarna sequencing.
3. Linearisatie van gistdisplayvector
   1. Lineariseer het gistdisplayplasmide, bijvoorbeeld door pDD1524 te verteren met SphI- en PstI-restrictie-enzymen om de gistdisplayvector met de substraatcassette voor elektroporatie voor te bereiden. Meng de reagentia die in Tabel 10 staan en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
   2. Laat het restrictiedigestproduct 30 minuten draaien op een 1% agarosegel op 240 V. Verwijder de band die overeenkomt met de verwachte DNA-lengte en zuiver met een gelextractiekit.
      OPMERKING: Elke 50 μL restrictiedigest levert ongeveer 0,5–1,0 μg totaal DNA op. Aangezien elke elektroporatie 4 μg lineaire vector vereist, schaal je de digestreacties dienovereenkomstig op.

2. Elektroporatie

Opmerking: Volg de institutionele veiligheidsprocedures voor het omgaan met biologische materialen en reagentia, draag geschikte PBM en voer biologisch en chemisch afval af volgens de institutionele richtlijnen.

1. Voorbereiding van buffers, platen en media (2 dagen voor elektroporatie)
   1. Bereid groeimedia voor (1 × YPD; 2 × YPD; Synthetische dextrose casaminozuren, SDCAA+; en synthetische galactosecasaminozuren, SGCAA+), platen (YPD en SDCAA), elektroporatiebuffer en steriel water volgens de recepten in Tabel 5. Bewaar op 4 °C.
2. Voorbereiding van een gestreepte plaat van EBY100.
   1. Smeer EBY100-gist uit op YPD-agar van een glycerolbouillon. Kweek op 30 °C gedurende 2 dagen.
   2. Bewaar de plaat na groei op 4 °C.
      OPMERKING: Een gestreepte plaat blijft tot 1 maand bruikbaar; Noteer de datum van de streak op het plaatje.
3. Voorbereiding van EBY100 pre-kweek (1 dag voor elektroporatie)
   1. Bereid 125 mL van 1 × YPD voor in een 500 mL Erlenmeyer-fles.
   2. Bereid 25 mL van 1 × YPD voor in een 50 mL conische buis. Met een micropipettip verzamel je EBY100-cellen van de plaat die gedurende 2 dagen is gekweekt. Vervolgens breng je de gistcellen van de pipettip over in de kegelvormige buis met 1 × YPD.
      OPMERKING: De streep cellen moet een uitstrijkje vormen van ongeveer 1–2 mm lang.
   3. Verwijder de micropipettip en laat de kegelvormige buis vortexen om voldoende menging te garanderen.
   4. Bereid een 150 mL pre-cultuur voor door 25 mL van 1 × YPD met gistcellen over te brengen in de 500 mL kolf met 125 mL 1 × YPD. Draai om te mengen.
   5. Meet met een spectrofotometer de OD₆₀₀ door twee microcuvetten met een padlengte van 1 cm te bereiden: één met 1 mL van 1 × YPD als blanke controle en een andere met 1 mL van de pre-cultuur
   6. Kweek 150 mL pre-cultuur 's nachts (16–20 uur) bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm.
4. Voorbereiding van subcultuur bij de gewenste initiële OD₆₀₀ (op de dag van elektroporatie)
   1. Bereid de conditioneringsbuffer en uitgroeimedia voor, zoals beschreven in Tabel 5.
   2. Meet de OD₆₀₀ van de nachtelijke pre-cultuur (verwachte OD₆₀₀ is 17–22). Om binnen het lineaire bereik van de spectrofotometer te blijven, meet je een verdunning van 1:20 van de pre-cultuur.
   3. Bereken het volume pre-cultuur dat nodig is om een 100 mL subcultuur te inoculeren. Een initiële subcultuur OD₆₀₀ van 3,0–4,0 wordt aanbevolen.
   4. Verdun de kweek tot de gewenste initiële OD₆₀₀ in 100 mL van 2 × YPD in een 500 mL Erlenmeyer-kolf.
   5. Incubeer de 100 mL subcultuur bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm gedurende 4 uur.
5. Bereiding van media tijdens 4 uur incubatie
   1. Houd ijskoude elektroporatiebuffer en steriel water paraat (vanaf stap 2.1.1).
   2. Bereid conditioneringsbuffer (100 mL) voor, volgens het recept in Tabel 5. Gebruik 20 mL conditioneringsbuffer per transformatie; Schaal dienovereenkomstig op. Bewaren op kamertemperatuur (20–23 °C).
      OPMERKING: WAARSCHUWING: De conditioneringsbuffer bevat dithiothreitol (DTT) en lithiumacetat (LiAc), chemische irriterende stoffen die huid- en oogirritatie kunnen veroorzaken. Draag geschikte PBM, waaronder een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbrillen, en behandel deze reagentia volgens de institutionele chemische veiligheidsprocedures. Verwijder ongebruikte oplossingen en gebruikte buffers als chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen.
   3. Bereid uitgroeimedia voor (50 mL): Meng 25 mL 2 × YPD en 25 mL 1 m sorbitol samen. Gebruik 8 ml uitgroeimedium per transformatie. Bewaren op kamertemperatuur (20–23 °C).
6. Bereiding van elektrocompetente gistcellen na 4 uur incubatie.
   1. Splits de 100 mL subcultuur in twee 50 mL conische buizen. Verzamel cellen door centrifugatie bij 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en dokanteer het medium dan. Houd cellen op ijs tot stap 2.6.4 is voltooid.
   2. Suss elke celpellet voorzichtig opnieuw met 25 ml ijskoud steriel water. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en giet daarna het medium over.
   3. Herhaal stap 2.6.2.
   4. Suss elke celpellet voorzichtig opnieuw met 25 mL ijskoude elektroporatiebuffer. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en giet daarna het medium over.
   5. Haal de cellen uit het ijs en suspendeer elke celpellet voorzichtig opnieuw met 10 mL conditioneringsbuffer bij kamertemperatuur (20–23 °C). Vervolgens wordt het gepoold in een enkele 125 mL Erlenmeyer-kolf en incubeer bij 30 °C met orbitale schudding op 270 rpm gedurende 30 minuten.
   6. Giet de cellen in een buis van 50 mL. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten. Laat de media decanteren.
   7. Suspendeer de celpellet voorzichtig opnieuw met 50 mL ijskoude elektroporatiebuffer. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en giet daarna het medium over.
   8. Suspenseer de celpellet opnieuw tot een eindvolume van 1 mL door ongeveer 100–200 μL elektroporatiebuffer toe te voegen. Houd cellen op ijs tot elektroporatie.
      OPMERKING: Elektrocompetente cellen kunnen worden ingevroren (d.w.z. geplaatst in een –80 °C vriezer) en later worden gebruikt zonder significant verlies aan elektroporatie-efficiëntie.
7. Elektroporatie, uitgroei en plating
   1. Pre-chill elektroporatiecuvette(s) met een opening van 0,2 cm op ijs.
   2. Breng 380 μL van de opnieuw suspendeerde pellet over in een steriele 1,5 mL buis. Meng met 4 μg plasmide-DNA of met 4 μg lineair plasmidevector en 12 μg insert. Meng voorzichtig door te pipetteren.
      OPMERKING: Om het aantal elektroporatieve cellen te maximaliseren, zouden de DNA-concentraties van vectoren en inserts idealiter 700–800 ng/μL moeten zijn. Als de concentraties lager zijn dan dat, gebruik dan een vacuümconcentrator.
   3. Breng de suspensie over in de voorgekoelde elektroporatiecuvette(s). Laat het 5 minuten op het ijs staan.
   4. Veeg na 5 minuten de zijkanten van de cuvette af met een pluisvrij laboratoriumdoekje om restvocht te verwijderen, wat kan leiden tot vonken tijdens elektroporatie. Vermijd belletjes of cellen boven de metalen platen in de cuvet, omdat deze ook tot vonken kunnen leiden. Om de koude temperatuur van de cuvette te behouden, raak je de elektroden van de plaat niet aan.
   5. Bereid 8 ml uitgroeimedium voor in een 50 ml conische buis.
   6. Elektroporate de cellen met de volgende instellingen: een spanning van 2,5 kV, capaciteit van 25 μF en weerstand van 200 Ω⁹. Het acceptabele tijdconstantbereik is 2,8–4,5 ms.
      OPMERKING: WAARSCHUWING: Elektroporatie omvat hoogspanningselektrische pulsen. Zorg dat cuvetten goed zitten en volg de gebruiksaanwijzingen van de fabrikant. Voer gebruikte elektroporatiecuvetten als biologisch gevaarlijk afval af volgens de richtlijnen van de instelling.
   7. Overspoel de cuvette onmiddellijk met ongeveer 200 μL uitgroeimedium uit de conische buis en breng de elektroporatieve cellen over in de 50 mL conische buis. Voeg nog eens 200–350 μL uitgroeimedium toe totdat er geen zichtbare vloeistof meer in de cuvette overblijft.
   8. Incubeer de 50 mL conische buis van elektroporatieve cellen in 8 mL uitgroeimedium bij 30 °C zonder te schudden gedurende 1 uur. Draai de buis elke 15 minuten om te mixen.
   9. Verzamel cellen door centrifugatie bij 1.500 × g, 25 °C gedurende 3 minuten. Decanteren dan de media.
   10. Susselt cellen opnieuw in het juiste gistdropoutmedium om selectie voor getransformeerde cellen te behouden. Voor plasmiden die de TRP1-selectiemarker bevatten, hersuspendeer je cellen in 250 mL SDCAA+ (dat tryptofaan mist) om selectief gist terug te winnen die het plasmide vasthield.
   11. Incubeer 's nachts (16–20 uur) bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm.

3. Inductie, kleuring en flowcytometrische sortering van gistcellen

1. Inductie van proteasebibliotheek en substraatcassette (1 dag voor sortering)
   1. Meet OD₆₀₀ zoals in stap 2.4.2 na een nachtelijke groei van transformanten in dropout-media.
   2. Aliquot 12 mL gisttransformanten en centrifugeren op 3.200 × g gedurende 5 minuten.
   3. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in SGCAA+ inductiemedium tot een OD₆₀₀ van 0,5. Bereken het benodigde ophangingsvolume met behulp van de verdunningsvergelijking, C₁V₁ = C₂V₂.
   4. Overbrengen naar een 125 mL Erlenmeyer-kolf en 's nachts 18–24 uur laten groeien bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm.
2. Fluorescerende antilichaamkleuring (op de dag van sortering)
   1. Meet OD₆₀₀ van cellen na inductie. Gebruik twee cuvetten: één met 1 mL SGCAA+, en de andere met 950 μL SGCAA+ gemengd met 50 μL cellen. Vermenigvuldig de gemeten OD_600-waarde met 20 om de werkelijke OD₆₀₀ van post-inductiecellen te krijgen.
   2. Normaliseer elk monster tot 3 × 10 à⁷ cellen voor antistofkleuring en FACS-sortering. Gebruik C₁V₁ = C₂V_{2 om} het volume cellen te berekenen dat van de inductiekolf moet worden overgebracht.
      OPMERKING: Voor vier-site NNS-saturatiemutagenese is de theoretische bibliotheekgrootte 10^{à 6} varianten. Om de bibliotheek voldoende te samplen, schermt u minstens 10 keer de bibliotheekgrootte, of 10 à⁷ cellen. Voorbeeld: als gewenst C₁V₁ = 3 × 10⁷ cellen en C₂ = post-inductie OD₆₀₀ van 6 (d.w.z. 6 × 10⁷ cellen/mL), dan aliquot 500 μL geïnduceerde cellen (d.w.z. V₂ = 3 × 10⁷ cellen / 6 × 10⁷ cellen/mL = 500 μL).
   3. Breng het berekende volume cellen over naar een buis van 1,5 mL en centrifugeer op 5.000 × g gedurende 5 minuten.
   4. Verwijder het supernatant en suspensieer opnieuw in 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% rundserumalbumine (BSA).
   5. Centrifugeer op 5.000 × g gedurende 5 minuten en herhaal stap 3.2.4.
   6. Centrifugeer op 5.000 × g gedurende 5 minuten, en voltooi ondertussen stap 3.2.7.
   7. Bereid een antilichaamkleuringsmengsel voor in een 1,5 mL buis met anti-HA-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) (0,5 μg/10⁷ cellen), anti-FLAG phycoerythrine (PE) (0,05 μg/10⁷ cellen) en PBS + 0,5% BSA (100 μL/10⁷ cellen). Houd de buis op ijs.
   8. Verwijder het supernatant en susseer opnieuw met het kleurmengsel. Gebruik 300 μL van het kleurmengsel per 3 × 10^{7 cellen} . Draai de buis niet in vortex; Alleen omkeren of flicken.
   9. Houd cellen 1 uur in het donker op ijs na de re-suspensie.
3. Na-beitsingswash
   1. Centrifuge-gekleurde cellen op 5.000 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in PBS met 0,5% BSA met 0,5 mL per 1 × 107^cellen (bijv. 500 μL voor 1 × 107^cellen of 1,5 mL voor 3 × 107^cellen ).
   2. Centrifuge op 5.000 × g, 5 min. Verwijder supernatant, hersuspensie in 750 μL PBS + 0,5% BSA.
   3. Breng nog eens 750 μL PBS + 0,5% BSA over in een 10 mL verzamelbuis.
4. FACS
   1. Voer de noodzakelijke opstart en voorbereiding van de cytometer uit voor een nieuw experiment.
   2. Maak drie puntdiagrammen. Selecteer bij de eerste dotplot de naam van de X-as om het kanaal van voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) weer te geven en de naam Y-as om het zijkanaal van verstrooiingsgebied (SSC-A) weer te geven.
      OPMERKING: Dit zal de selectie van levende cellen vergemakkelijken.
   3. Houd de naam X-as om het FSC-A-kanaal weer te geven, terwijl het Y-askanaal wordt aangepast om de voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) op de tweede dot-plot weer te geven.
      OPMERKING: Dit vergemakkelijkt het selecteren van singlets.
   4. Selecteer de naam van de X-as om het PE-kanaal weer te geven en de naam van de Y-as om het FITC-kanaal op de derde dot-plot weer te geven.
   5. Voer negatieve controle uit op de cytometer met behulp van de 530/30 nm (FITC) en 585/42 nm (PE) kanalen. Voer sortering uit met een 70 μm nozzle bij 70 psi manteldruk. Verzamel samples met een snelheid van 4000–5000 gebeurtenissen/s.
   6. Teken een polygonpoort rond de hoofdpopulatie van intacte gistcellen om afval en kleine deeltjes met lage FSC-A- en SSC-A-signalen uit te sluiten op de eerste dot-plot (FSC-A versus SSC-A).
   7. Gate-singlets op een FSC-H versus FSC-A-plot binnen deze gate, door de lineaire populatie te selecteren die een proportionele relatie vertoont tussen FSC-H en FSC-A. Sluit gebeurtenissen uit die afwijken van de lineaire verdeling en overeenkomen met doublets en celaggregaten.
      OPMERKING: De derde dot-plot voor PE versus FITC toont een diagonale cluster van stippen voor de negatieve controle (d.w.z. gistcellen die de intacte substraatcassette tot expressie brengen).
   8. Voer monsters uit en sorteer gistcellen op basis van gewenste PE/FITC-waarden in een verzamelbuis(en). Analyseer een totaal aantal cellen dat overeenkomt met minstens 10 keer de theoretische bibliotheekgrootte om een adequate representatie van alle varianten te garanderen (bijvoorbeeld analyseren van ~1 × 10⁷ cellen voor een bibliotheek met een theoretische diversiteit van ~1 × 10,6 varianten).
   9. Plaats de sorteerpoort onder de PE/FITC-diagonaal van de negatieve controlepopulatie.
      OPMERKING: Strengere poorten verbeteren de verrijking van gewenste varianten, maar verminderen het celherstel.
5. Na FACS
   1. Centrifuge-verzamelbuis(en) op 3.200 × g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant, laat 1 ml over, en breng het opnieuw in 5 mL PBS.
      OPMERKING: Laat 1 mL supernatant over, want de celpellet onderaan zal na centrifugatie niet zichtbaar zijn.
   2. Centrifugeer opnieuw cellen op 3.200 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, laat 1 ml over. Heropsussen met 4 mL SDCAA+.
   3. Voeg in een 250 mL Erlenmeyer-kolf 15 mL SDCAA+ toe. Breng de hersuspendeerde cellen van stap 3.5.2 over in deze kolf.
   4. Incubeer 's nachts gedurende 18–24 uur bij 30 °C met orbitale schuddingen bij 270 rpm.
   5. Herhaal stappen 3.1, 3.2, 3.3 en 3.4 voor elke ronde van gerichte evolutie.

4. Plasmideherstel en sequencing van individuele klonen

1. Individuele kolonies laten groeien
   1. Maak een glycerolbouillon door 500 μL van de vloeibare cultuur te mengen na stap 3.5.4 en 500 μL steriel 50% glycerol, wat resulteert in een glycerolvoorraadoplossing van 25%. Vortex om de cellen grondig te mengen.
   2. Bewaar het een nacht in de vries van –80 °C. Voor langdurige opslag overbrengen in vloeibare stikstof.
   3. Schraap de glycerolkolf met een steriele 1000 μL tip en meng het door 100 μL SDCAA+. Leg dit mengsel op een SDCAA-plaat en broed het ondersteboven uit bij 30 °C.
   4. Kies kolonies na 3 dagen en kweek ze 's nachts in 1,5 ml SDCAA+ in 14 mL buizen.
2. Voer gist miniprep uit om plasmiden te extraheren
   1. Pellet de nachtcultuur door 1 minuut te centrifugeren op 16.000 × g en opnieuw te suspenderen in 200 μL Oplossing 1 uit een gistplasmide-zuiveringsset.
   2. Voeg 5 μL lytisch enzymoplossing toe (5 U/μL).
   3. Incubeer 4 uur in een incubator van 37 °C op een end-to-end mixer.
   4. Voer een vries-dooicyclus uit door 20 minuten bij -80 °C in te vriezen en 10 minuten in een waterbad te ontdooien bij 42 °C.
   5. Voeg 200 μL Oplossing 2 toe uit een gistplasmide-zuiveringsset, meng door 2–3 keer om te keren en laat het 5 minuten intrekken.
   6. Voeg 400 μL Oplossing 3 toe uit een gistplasmide-zuiveringskit en meng door 2–3 keer te inverteren. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 5 minuten.
   7. Zuiver plasmide-DNA met een zuiveringskit met een kolom met een hoge DNA-bindingscapaciteit.
      OPMERKING: Vanwege de grote hoeveelheid geschorte genomische gist-DNA afkomstig van de gelyseerde cellen, moet een silica-gebaseerde kolom met een hogere DNA-bindingscapaciteit (35 μg) worden gebruikt in plaats van een laag-capaciteit gistplasmide-DNA-zuiveringskolom (5 μg)¹⁵.
   8. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. De DNA-opbrengsten bedragen 10–30 ng/μL.
3. Transformeer gezuiverde plasmiden tot chemisch competente E. coli-cellen
   1. Bereid SOC-media voor, volgens het recept in Tabel 5, en LB-chloramfenicol-borden. Verwarm ook een waterbad voor tot 42 °C.
   2. Verwarm een LB-chloramfenicolplaat voor elk plasmide op 37 °C gedurende 20 minuten.
   3. Haal een buis met chemisch competente cellen uit de –80 °C vriezer en ontdooi op ijs.
   4. Voer 30 μL competente cellen per plasmide in een 1,5 mL buis op ijs.
   5. Pipette 3 μL plasmide in competente cellen. Knip om te mengen en laat het 5 minuten op ijs staan.
   6. Voer een hitteshock uit door de cellen kort te incuberen in het waterbad bij 42 °C gedurende 40 seconden.
   7. Incubeer op ijs gedurende 2 minuten.
   8. Voeg 300 μL SOC-medium toe aan de cellen en incubeer 15 minuten bij 37 °C bij 220 rpm.
   9. Plaat 50–100 μL getransformeerde competente cellen op voorverwarmde platen.
   10. Breng de platen ondersteboven op 37 °C gedurende 18 uur.
4. Kolonieplukken
   1. Voeg 5 ml vloeibare LB-chloramfenicol-media toe aan 14 mL ronde kweekbuizen.
   2. Kies een kolonie met een steriele 1000 μL tip en laat die in een kweekbuis vallen.
   3. Plaats buizen in een shaker (220 rpm, hoek 30°–45° om de beluchting te maximaliseren) op 37 °C gedurende 18 uur.
5. Plasmide-extractie uit bacteriële vloeistofkweek
   1. Centrifugeer de vloeistofculturen op 3.200 × g gedurende 4 minuten. Giet het supernatant over.
   2. Haal plasmiden uit nachtelijke culturen met behulp van een plasmide-zuiveringsset.
   3. Meet de concentratie van gezuiverde plasmiden met een spectrofotometer.
6. Dien plasmiden in voor sequencing
   OPMERKING: Gebruik diensten zoals whole-plasmid nanopore sequencing, of alternatieve Sanger-sequencing met een primer die het gemutageniseerde gebied flankert.

Resultaten

Efficiënte bibliotheekconstructie is cruciaal om voldoende dekking van de mutatieruimte te garanderen. Om verlies van zeldzame functionele varianten te voorkomen, moet het aantal transformanten minstens 10× tot 100× de theoretische bibliotheekgrootte bereiken. Omdat de transformatie-efficiëntie in S. cerevisiae wordt beïnvloed door celconcentratie en het hoogst is in cellen¹⁶ in de vroege tot midden-logaritmische fase, hebben we de initiële celdichtheid vóór elektroporatie geoptimaliseerd. Gistculturen werden subgekweekt bij initiële OD_600-waarden variërend van 1,0–4,0 en 4 uur geïncubeerd (n = 2–4 onafhankelijke biologische experimenten), waarna de definitieve OD_600-waarden werden afgebeeld op de groeicurve van S. cerevisiae om te bevestigen dat cellen binnen de midden-log groeifase bleven (Figuur 5A, Aanvullende Figuur 1).

Elektroporatie van deze culturen met 4 μg plasmide-DNA (n = 2 onafhankelijke biologische experimenten) toonde aan dat de transformatie-efficiëntie significant verschilde tussen de initiële OD_{600-condities} (eenrichtings-ANOVA, p = 8,92 × 10⁻⁷). Ten opzichte van culturen gestart bij OD₆₀₀ = 1,0 leverden alle hogere startceldichtheden significant grotere transformatie-efficiënties op (Dunnett's meervoudige vergelijkingstest; OD₆₀₀ = 1,5, aangepast p = 0,0020; OD₆₀₀ ≥ 2,0, gecorrigeerd p < 0,0001), met de hoogste transformatie-efficiëntie waargenomen bij een initiële OD₆₀₀ van 4,0. Om te profiteren van het natuurlijke vermogen van gistcellen om homologe recombinatie uit te voeren, hebben we ook 4 μg van de lineaire plasmidevector en 12 μg van de insert (d.w.z. proteasebibliotheek) elektroporeerd in gistcellen (n = 2 onafhankelijke biologische experimenten). De transformatie-efficiëntie verschilde significant tussen de geteste initiële OD_{600-condities} (eenrichtings-ANOVA, p = 0,0023). In vergelijking met culturen gestart bij OD₆₀₀ = 1,0 waren de transformatie-efficiënties significant hoger bij OD₆₀₀ = 3,0 (aangepast p = 0,0018), 3,5 (aangepast p = 0,0062) en 4,0 (aangepast p = 0,0024) (Dunnett's meervoudige vergelijkingstest). We observeerden de hoogste transformatie-efficiëntie bij een matige initiële subcultuurdichtheid (OD₆₀₀ = 3,0), wat wijst op een optimale balans tussen celbekwaamheid en recombinatie-efficiëntie onder deze omstandigheden (Figuur 5B). In vergelijking met plasmide-only transformatie leverde co-elektroporatie van een gelineariseerde vector en proteasebibliotheek-insert (n = 2 onafhankelijke biologische replica's) significant hogere transformatie-efficiënties op over de geteste initiële OD_{600-condities} (tweerichtings-ANOVA op log10-getransformeerde transformatie-efficiënties, p = 9,40 × 10⁻¹²). Gemiddeld produceerde co-elektroporatie een gemiddelde 121-voudige toename in transformatie-efficiëntie (95% BI, 63–233-voudig) ten opzichte van plasmide-only transformatie (Figuur 5B).

Tijdens een FACS-run van gistcellen met de mutante proteasebibliotheek en de substraatselectiecassette (Figuur 6A), zullen cellen ofwel een afgeknotte cassette of een protease tonen die nog steeds het tegenselectiesubstraat (Q1) spleet, niet-functionele proteasevarianten (Q2) uitdrukt, of proteasevarianten uitdrukken die alleen het selectiesubstraat succesvol splijten (Q3). Gistcellen die niet-functionele varianten uitdrukken, verschenen als een dominante populatie die diagonaal is verdeeld in PE- versus FITC-grafieken, wat de co-retention van beide signalen weerspiegelt (Figuur 6A, Q2). Daarentegen vormden functionele varianten die het selectiesubstraat spleten terwijl het oorspronkelijke (tegenselectie) substraat werden gespaard een onderscheidende off-diagonale populatie gekenmerkt door hoge PE en middelmatige tot lage FITC-signaalintensiteit (Figuur 6A, Q3). Het toepassen van een strenge gatingstrategie om deze off-diagonale populatie te isoleren, resulteerde in geleidelijke verrijking van functionele varianten over opeenvolgende rondes van sortering¹⁰. Deze verrijking wordt visueel waargenomen als een steeds duidelijker gedefinieerde cluster cellen die loskomen van de diagonale cluster (Figuur 6B, van links naar rechts). Als er geen duidelijke off-diagonale populatie wordt waargenomen, kan dit wijzen op een lage bibliotheekkwaliteit, onvoldoende expressie of suboptimale kleuringsomstandigheden. Als negatieve controle toont Figuur 6C,D elektroporatie, geïnduceerde, ongekleurde gistcellen en de bijbehorende FITC- en PE-fluorescentiehistogrammen.

Binnen de verrijkte off-diagonale populatie kunnen subpopulaties verder worden opgelost op basis van FITC-intensiteit. Cellen met een gemiddeld FITC-signaal kunnen apart worden gesorteerd van cellen met een laag FITC-signaal. Het sequencen van deze verschillende populaties toonde unieke mutatieprofielen (Tabel 11), wat aangeeft dat verschillende splijtingsefficiënties geassocieerd zijn met verschillende proteasevarianten.

Figuur 1: Vector- en inzetvoorbereiding. (A) Generatie van potoverale proteasebibliotheken via site-saturatiemutagenese. (B) Assemblage van substraatcassettes en integratie in gistdisplayvector (pDD1523). (C) Linearisatie van gistdisplayvector (pDD1524) via restrictiedigestie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Elektroporatie van de substraatcassette en de PCR-versterkte gemuteerde proteasebibliotheek in competente EBY100-cellen. (Gestreepte doos) In vivo circularisatie van het plasmide dat zowel protease als substraatcassette bevat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Inductie, kleuring en flowcytometrische sortering van gistcellen. (A) Inductie van proteasebibliotheek en substraatcassette. (B) Fluorescerende antilichaamkleuring: Kleuring met anti-HA fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) en anti-FLAG phycoerythrine (PE) antilichamen. (C) Gekleurde cellen worden gesorteerd met behulp van Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS). (D) Terugwinning van FACS-gesorteerde cellen in selectiemedia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Plasmideherstel en sequencing van gesorteerde gistcellen. (A) Platering van gesorteerde gistcellen. (B) Plasmide-extractie uit individuele gistkolonies. (C) E. coli-transformatie van geëxtraheerde plasmiden. (D) Plasmide-extractie uit individuele E. coli-kolonies. (E) Nanopore-sequencing van geëxtraheerde plasmiden. Fles- en buisiconen zijn respectievelijk gebaseerd op DBCLS en Helicase 11, via Bioicons (https://bioicons.com) en aangepast onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC BY 4.0). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Gistgroeicurves in verschillende groeimedia en de invloed van de initiële optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) van de subcultuur op de efficiëntie van gistelektroporatie. (A) Groeicurves van gist in 1 × gistextract pepton dextrose (YPD), 2 × YPD, synthetische dextrose casaminozuren agar zonder antibiotica (SDCAA-), en synthetische dextrose casaminozuren agar met antibiotica (SDCAA+). (B) Transformatie-efficiëntie van gist elektroporeerd met 4 μg plasmidevector bij verschillende subculturen initiële OD₆₀₀, en de transformatie-efficiëntie met linearized vector (4 μg) en proteasebibliotheek-insert (12 μg) bij dezelfde initiële OD_600-waarden . Gegevens in (A) worden gepresenteerd als OD₆₀₀ ± SD uit twee onafhankelijke biologische experimenten (n = 2). Data in (B) wordt gepresenteerd als het gemiddelde aantal transformanten per elektroporatie op een logaritmische y-as, waarbij individuele biologische replicaten worden weergegeven als cirkels (n = 2). De statistische significantie voor de plasmide- en vector-plus-insert elektroporatie-optimalisatie-experimenten werd bepaald met eenrichtings-ANOVA op log10-getransformeerde elektroporatie-efficiënties, gevolgd door Dunnetts meervoudige vergelijkingstest met OD₆₀₀ = 1,0 als controle. NS, niet significant; p < 0,01 (**); p < 0,0001 (****). De statistische significantie van het verschil tussen plasmide-only en vector-plus-insert transformatie-efficiënties werd bepaald met tweerichtings-ANOVA op log10-getransformeerde transformatie-efficiënties. p < 0,0001 (****). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)-gebaseerde verrijking van gistklonen. (A) Schematische weergave van de gatingstrategie. Cellen werden verdeeld in drie regio's: Q1, phycoerythrine (PE)-lage cellen; Q2, PE-hoog/fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-hoge cellen; en Q3, PE-hoge cellen met lage tot intermediaire FITC-fluorescentie. Cellen binnen Q3 werden verzameld voor verrijking. (B) Representatieve FACS-grafieken van één onafhankelijke evolutionaire campagne die opeenvolgende sorteringsrondes tonen met toenemende FITC-gatingstrengheid. Cellen met midden- en lage FITC werden afzonderlijk verzameld voor sequencing. Percentages geven het aandeel levende, enkele gistcellen aan binnen de afgesloten populatie. (C) Representatief FACS-plot dat elektroporeerde, ongekleurde gistcellen als negatieve controle toont. (D) Histogrammen van FITC-A (links) en PE-A (rechts) fluorescentieintensiteiten die overeenkomen met de gegevens getoond in (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Reactiemengsel voor de eerste ronde PCR-amplificatie van de proteasebibliotheek. Samenstelling van de PCR-reactie die wordt gebruikt voor de eerste ronde amplificatie van de proteasebibliotheek, inclusief de uiteindelijke concentraties en hoeveelheden van elk reagens in een 50 μL-reactie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Cyclische condities voor de PCR-amplificatie van de proteasebibliotheek in de eerste ronde. Het thermische cyclusprogramma werd gebruikt voor de eerste ronde PCR-versterking van de proteasebibliotheek. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Reactiemengsel voor tweede ronde PCR-amplificatie van de proteasebibliotheek. Samenstelling van de PCR-reactie die wordt gebruikt voor de tweede ronde versterking van de proteasebibliotheek, inclusief de uiteindelijke concentraties en hoeveelheden van elk reagens in een 50 μL reactie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Cyclische condities voor PCR-amplificatie van de proteasebibliotheek in de tweede ronde. Het thermische cyclusprogramma werd gebruikt voor de PCR-versterking van de proteasebibliotheek in de tweede ronde. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Media en reagentia voor gistelektroporatie en -groei. Tabulaire beschrijving van de benodigde massa van elk chemisch bestanddeel om specifieke hoeveelheden van 1 × en 2 × Gistextract Pepton Dextrose (YPD), elektroporatiebuffer, conditioneringsbuffer, uitgroeimedia, synthetische dextrose casaminozuren met antibiotica (SDCAA+), synthetische galactose casaminozuren met antibiotica (SGCAA+), lysogeny bouillon (LB) media, LB-chloramfenicolmedia, Super Optimal Bouillon (SOB) media en Super Optimal Bouillon met catabolietrepressie (SOC) media te formuleren. Instructies voor het bereiden van standaardoplossingen, zoals 2 M Sorbitol, 1 M dithiothreitol (DTT) en 2 M lithiumacetat (LiAc), zijn inbegrepen. Aanvullende instructies voor het voorbereiden van SDCAA-, LB- en YPD-agarplaten worden verstrekt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Reactiemengsel voor annealing en fosforylering van oligo's. Samenstelling van het reactiemengsel dat wordt gebruikt voor gelijktijdige annealing en fosforylering van oligonucleotiden voor de assemblage van substraatcassettes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7: Cyclische condities voor annealing en fosforylering van oligos. Temperatuurprogramma gebruikt voor oligonucleotide-annealing en fosforylering voor de assemblage van substraatcassettes. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 8: Reactiemengsel voor Golden Gate-assemblage van substraatcassette en vectorplasmide. Samenstelling van de Golden Gate-assemblagereactie die wordt gebruikt om de substraatcassette in het vectorplasmide te ligateren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 9: Cyclische condities voor Golden Gate-assemblage van substraatcassette en vectorplasmide. Thermisch cyclusprogramma gebruikt voor Golden Gate-assemblage. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 10: Reactiemengsel voor linearisatie van vectorplasmide. Samenstelling van de restrictiedigestie-reactie die wordt gebruikt om het vectorplasmide te lineariseren vóór de bibliotheekconstructie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 11: Resultaten van nanoporesequencing van TEVp-varianten die ENLYFES splijten. Plasmiden werden uit gistcellen geëxtraheerd na de vierde en laatste FACS-sessie. Mutaties in elke kloon worden getoond ten opzichte van de wildtypesequentie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Relatie tussen de initiële en uiteindelijke EBY100-cultuurdichtheid tijdens de subcultuur. EBY100-culturen werden subgekweekt bij variërende initiële OD_600-waarden , en de uiteindelijke OD₆₀₀ werd gemeten na incubatie onder identieke groeiomstandigheden (30 °C, 220 rpm). De definitieve kweekdichtheid nam lineair toe met toenemende initiële OD₆₀₀ (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). Gegevenspunten vertegenwoordigen de gemiddelde ±SD van (n = 2–4) onafhankelijke biologische replicata. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Rationeel ontwerp van de TEVp-mutagenesebibliotheek. Cartoonweergave van TEVp (PDB ID: 1LVB) met de vier residuen (goud) <5 Å verwijderd van het P1-residu (paars) dat is gericht op site-saturatiemutagenese. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Gerichte evolutie is een methode met hoge doorvoer die iteratieve cycli van diversificatie en selectie gebruikt om eiwitten met een verbeterde of nieuwe biochemische functie te identificeren¹⁷. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde workflow om protease-substraatherkenning te ontwikkelen met behulp van een celoppervlakweergavesysteem in S. cerevisiae. Het oppervlakteweergavesysteem brengt de proteaseactiviteit in kaart naar een detecteerbaar fluorescentie-gebaseerd fenotype, waardoor FACS-gebaseerde verrijking van gewenste klonen mogelijk is. Wij bieden de gedetailleerde stappen voor de assemblage van de proteasebibliotheek en het substraatcassette, hoogefficiënte elektroporatie, FACS-gating en -sortering, en de uiteindelijke sequencing van proteasevarianten.

Een van de belangrijkste stappen in gerichte evolutie is het waarborgen van voldoende bibliotheekdiversiteit en dekking van potentiële mutaties¹⁷. Onze elektroporatie-efficiëntieexperimenten tonen aan dat een initiële subcultuur OD₆₀₀ van 3,0 de hoogste transformatie-efficiëntie oplevert, met meer dan^10-9 CFU. Deze schaal, bereikt met geoptimaliseerde gistelektroporatie, overtreft aanzienlijk die van conventionele chemische transformatiemethoden en maakt voldoende dekking mogelijk van grote combinatorische bibliotheken ^8,9. Nauwkeurige FACS-gating en -sortering zijn essentieel om cellen die de gewenste splijtingseigenschappen vertonen te scheiden van cellen met niet-specifieke splijting. Tijdens meerdere rondes van FACS-gebaseerde selectie wordt de gatingstrategie steeds strenger om selectief te verrijken voor gewenste proteasevarianten. Als gating te breed is, kunnen ongewenste cellen samen met de gewenste varianten worden gesorteerd. Strenge gating (bijvoorbeeld steeds lagere drempels voor het FITC-signaal over rondes) maakt het mogelijk dat de celpopulatie verrijkt wordt voor proteasevarianten met hogere specificiteit en activiteit richting de nieuwe doelsubstraatsequentie¹⁰. In overeenstemming met eerdere campagnes ^7,18 voerden we NNS-codonmutagenese uit van vier residuen in de substraatbindende pocket van TEVp die interageren met het substraat P1-residu, Q (T146, D148, H167, S170) (Aanvullende Figuur 2). De FACS-grafieken in Figuur 6B vertegenwoordigen een enkel representatief sorteerexperiment dat de gatingstrategie en verrijkingsworkflow illustreert. Opmerkelijk genoeg leverden onze campagneresultaten TEVp-varianten op met een andere set aminozuurmutaties (Tabel 11). Deze resultaten ondersteunen een belangrijk kenmerk van protease-evolutie: meerdere evolutionaire paden kunnen tot hetzelfde doel leiden.

Aanpassingen en probleemoplossingsstrategieën kunnen nodig zijn bij het uitvoeren van de experimenten. Tijdens elektroporatie bijvoorbeeld zorgt het werken op ijs wanneer dat aangeeft en het zorgvuldig opnieuw ophangen van de celpellets bij elke stap ervoor dat de cellen levend en gezond zijn vóór de elektroporatie. Gistcellen zijn kwetsbaar gedurende de elektroporatiestappen tot aan de uitgroeiherstelfase. Daarnaast kan aanpassing van de FACS-mantelvloeistof nodig zijn om gistcelfloculatie te voorkomen. Mantelvloeistof wordt vaak gebruikt in FACS-machines en kan conserveermiddelen bevatten die de groei van bacteriën en schimmels remmen. Daarom kan de mantelvloeistof worden vervangen door puur PBS om celdood tijdens sortering te voorkomen.

Het gistoppervlak displaysysteem vereist correct gevouwen eiwitten om succesvol het secretorische pad te doorlopen. Sommige proteasevarianten kunnen activiteit verliezen door misfolding, wat leidt tot vals-positieven tijdens FACS-selectie veroorzaakt door niet-specifieke splijting of achtergrondfluorescentie. Goed gekarakteriseerde bronnen van valse positieven zijn het vermelden waard voor plasmide-gebaseerde campagnes zoals deze. Omdat splijting wordt gelezen als verlies van het C-terminale epitoop-tag, levert elke mutatie die dat tag verstoort hetzelfde low-FITC-fenotype op als een echte splijtingsgebeurtenis; Dergelijke tagmutaties ontstaan tijdens de grootschalige homologe recombinatie en kunnen verrijken over opeenvolgende sorteerrondes. Chromosomale integratie van de constante substraatcassette is recent aangetoond^{dit probleem te} verzachten. Het protocol is afhankelijk van het gebruik van een insert-bibliotheek terwijl de vector (met de substraatcassette) constant blijft. Daarom is dit protocol niet geschikt voor degenen die zowel protease- als substraatbibliotheken willen evolueren.

Het YESS-platform was pionier in een algemene route om protease-substraatspecificiteit¹⁸ te herprogrammeren. Recente verbeteringen zijn onder meer: het toevoegen van titratbare enzym-/substraatcontrole in YESS2.0⁷, koppeling aan next-generation sequencing, het mogelijk maken van high-resolution specificity profiling²⁰, en chromosomale integratie van de reporters om expressieruis en vals-positieven te verminderen¹⁹. Andere orthogonale strategieën, zoals faagge-ondersteunde continue evolutie, zijn ook toegepast bij het ontwerpen van proteasespecificiteit voor therapeutische doelen²¹. Deze tools hebben toepassingen gevonden buiten TEV-protease-engineering, zoals hoogresolutieprofilering van de SARS-CoV-2 hoofdprotease om het inhibitorontwerp²² te sturen. Een cruciale factor voor zo'n campagne is het genereren van voldoende transformanten om grote combinatorische bibliotheken (>10⁹) te dekken, die niet systematisch waren geoptimaliseerd in de EBY100 S. cerevisiae-stam . Door de groeifase- en elektroporatiecondities te definiëren die de EBY100-transformatie boven^10,9 CFU aansturen, verwijdert dit protocol die bottleneck, waardoor uitgebreide FACS-gebaseerde screening van miljoenen varianten mogelijk is.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reacties (Tabellen 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Kleurstofbasisbuffer (Stappen 3.2–3.3)
5X Q5 Reactiebuffer	NEB	B9027S	Wordt apart verkocht; ook inbegrepen bij Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA-agarplaten (Tabel 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gelelektroforese
Anti-FLAG PE Antilichaam	BioLegend	637309	FACS-kleuring; PE-geconjugeerd anti-FLAG
Anti-HA Tag Antilichaam [FITC]	GenScript	A01621	FACS-kleuring; FITC-geconjugeerd anti-HA
Bacto Casaminozuren	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA-media (Tabel 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB-mediavoorbereiding; 20 g/L in YPD (Tabel 5)
BSA, bovien serumalbumine, fractie V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0,5% in PBS; kleurstofbuffer (Stappen 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate-assemblage van substraatcassette (Tabel 8)
Calciumchlorideoplossing (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Elektroporatiebuffer: 1 mM eindconcentratie (Tabel 5)
ColiRollers® Beplatingskralen	Sigma-Aldrich	71013-3	Steriliseren door te plaatsen in reagentenflessen en autoclaven bij 121ºC, 15 psi, gedurende 15 minuten.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v-voorraad voor SGCAA+-inductie (Tabel 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Elektroporatiebuffer (1 M) en uitgroeimedia (Tabel 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v-dextrosevoorraad (Tabel 5)
Difco Giststikstofbasis zonder aminozuren	Sigma	Y0626-250G	6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabel 5)
Difco YPD-bouillon (voorgemengd)	BD	242820-500g	Voorbereide YPD-alternatief; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditiebuffer: 10 mM eindconcentratie; doseer 250 μL, bewaar -20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR-zuiveringsuitrusting	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR-productopruiming
E.Z.N.A. Gelextractiekit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gelzuivering na PCR en restrictiedigest (Stappen 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmide DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmide-zuivering (Stap 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v-voorraad voor glycerolvoorraden (Stap 4.1.1)
Kanamycinesulfaat	Fisher	BP906-5	SDCAA+ en SGCAA+: 50 μg/mL eindconcentratie; vervangt Sigma K0879-5G
KLD-enzymmix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; plaatsgerichte mutagenese
KLD-reactiebuffer	NEB	B0554A	Wordt gebruikt met KLD-enzymmix
LB-bouillon (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli vloeibare kweek
Lithiumacetaatdihydraat (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditiebuffer: 0,1 M eindconcentratie; toevoegen voor DTT (Tabel 5)
Luria-agar (Luria-Bertani-agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli-beplating; vervangt Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casaminozuren	Sigma	2240-500GM	Alternatieve casaminozuurbron
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicilline-streptomycineoplossing, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X eindconcentratie
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vectorlinearisatie (Tabel 10); gebruik HF-versie
Q5 HF DNA-polymerase	NEB	M0492S	Hoge-fidelity-polymerase; alternatief voor Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	Voor PCR-reacties met hoog GC-gehalte
Q5 Hot Start DNA-polymerase	NEB	M0491L	PCR-samenstelling en -amplificatie (Tabellen 1, 3)
rCutSmart-buffer (10X)	NEB	B6004S	Meegeleverd met PstI-HF en SphI-HF (Tabel 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Aan