Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geoptimaliseerde workflow voor gistoppervlakteweergave voor gerichte evolutie van proteasen

331 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 augustus 2026

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde workflow voor de gerichte evolutie van virale proteasen in Saccharomyces cerevisiae met behulp van een selectiesysteem gebaseerd op oppervlakteweergaven. Het beschrijft het ontwerp van DNA-insert-bibliotheek en substraatcassettes, elektroporatie geoptimaliseerd voor hoge transformatie-efficiëntie, fluorescentie-geactiveerde celsortering voor protease-splitsing en sequencing van verrijkte varianten.

Samenvatting

Gerichte evolutie bootst het natuurlijke evolutionaire proces na in een snelle, gecontroleerde laboratoriumomgeving om eiwitten met gewenste functies of eigenschappen te laten evolueren. Het screenen van een grote pool mutante eiwit-coderende genen maakt functionele selectie van gewenste varianten mogelijk voor toepassingen in biotechnologie, geneeskunde en synthetische biologie. Met dit protocol voeren we gerichte evolutie uit in Saccharomyces cerevisiae om proteasevarianten met hoge specificiteit te ontwikkelen voor een niet-inheemse substraatsequentie. We tonen deze proteasevarianten op het oppervlak van de gistcel om de selectie van gewenste varianten te vergemakkelijken via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) over meerdere verrijkingsrondes. Vier belangrijke elementen van de substraatcassette worden gezamenlijk uitgedrukt met de proteasebibliotheek: een fusie-eiwit bestaande uit (i) de gistadhesiereceptorsubunit Aga2, (ii) selectie- en (iii) tegenselectie-substraatsequenties, (iv) epitoop-tagsequenties en een optionele endoplasmatisch reticulum (ER) terughaalsignaalsequentie. Gistcellen waarin alleen de selectiesubstraatsequentie wordt gesplitst, worden geïsoleerd met behulp van meerkleurige FACS via fluorescerende (fycoerythrin/fluorescein isothiocyanaat-gelabelde) anti-epitoopantilichamen. Hier geven we details van het geoptimaliseerde, stapsgewijze protocol om een protease-evolutiecampagne uit te voeren, inclusief ontwerp van DNA-insertbibliotheek en ontwerp van substraatcassettes, gistcelelektroporatie met hoge transformatie-efficiëntie (tot 10 à9transformanten per microgram DNA), FACS-gebaseerde selectie, verrijking en sequencing van geëvolueerde varianten. We demonstreren ons gerichte evolutieprotocol door de tabaks-etchvirus nucleaire inklusie A protease (TEVp) te laten evolueren van het splijten van zijn natuurlijke substraatsequentie, ENLYFQ↓S, naar het splijten van een nieuwe sequentie, ENLYFE↓S.

Inleiding

Cysteinproteasen van de familie Potyviridae, specifiek de nucleaire inclusie A (NIa) proteasen, vormen een grotendeels onbenutte bron van sequentiespecifieke endopeptidasen. Met meer dan 3.800 gekarakteriseerde familieleden kloven NIa-proteasen een onderscheidende substraatsequentie van zeven aminozuren. De potoveralfamilie biedt een diverse set proteasen voor het ontwerpen van programmeerbare eiwitcontrolesystemen, het construeren van orthogonale protease-gebaseerde genetische circuits en het ontwikkelen van sequentie-specifieke biotechnologische tools 1,2. Ondanks deze natuurlijke diversiteit zijn slechts twee NIa-proteasen, TEVp en tabaksvenenmottling virusprotease (TVMVp), grondig gekarakteriseerd en ontwikkeld voor breed laboratorium- en biotechnologisch gebruik 3,4. Deze beperkte proteasetoolkit beperkt de ontwerpruimte voor multicomponent-schakelingen die orthogonale protease-activiteitenvereisen 5, en motiveert zo inspanningen om Nia-proteasen verder uit te breiden en te karakteriseren via gerichte evolutie 6,7.

Gistoppervlakteweergave is uitgegroeid tot een van de krachtigste platforms voor gerichte evolutie, waardoor high-throughput eiwitbibliotheekscreening mogelijk is via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)6,7. Zo koppelt het gistendoplasmatisch reticulum sequestratiescreeningssysteem (YESS) proteaseactiviteit aan oppervlaktepresentatie via de secretorische route van S. cerevisiae 6,7. Het YESS-systeem is toegepast om nieuwe protease-substraatspecificiteiten te ontwikkelen en heeft bruikbaarheid aangetoond voor meerronde gerichte evolutiecampagnes. In dit systeem worden proteasevarianten geco-expresseerd met een fusie-eiwit dat een splijtingssubstraatcassette met epitoopmarkers bevat, en het Aga1p-oppervlakteanker wordt tot expressie gebracht in de EBY100-giststam. Differentiële labeling met fluorescerende antilichamen onderscheidt gespleten van niet-gespleten substraatcassettes die op het celoppervlak worden weergegeven. Dit activiteitsafhankelijke weergavemechanisme is direct compatibel met iteratieve, FACS-gebaseerde selectie voor bibliotheken van 10,7 of meer varianten 6,7.

Een fundamentele voorwaarde voor gerichte evolutie is het vermogen om variantbibliotheken op voldoende schaal te introduceren om voldoende dekking van de beoogde sequentieruimte te bereiken. Voor site-saturation mutagenesebibliotheken die meerdere aminozuurposities beslaan, zijn transformatie-opbrengsten van 108 tot 109 unieke transformanten nodig om ervoor te zorgen dat de diversiteit die in de bibliotheek wordt geïntroduceerd goed vertegenwoordigd is in de gesorteerde populatie. Er bestaan verschillende methoden om exogeen DNA in S. cerevisiae te introduceren, elk met een eigen doorvoerplafond. De conventionele chemische transformatiemethode gebruikt lithiumacetaat/enkelstrengs drager-DNA/polyethyleenglycol (LiAc/ssDNA/PEG) vanwege de eenvoud en toegankelijkheid. Het bereikt echter doorgaans transformatie-efficiëntie van slechts 104–106 kolonievormende eenheden (CFU) per microgram DNA, wat tekortschiet aan de sequentievariatie die nodig is voor grote bibliotheekcampagnes8. Daarentegen past de elektroporatiemethode een hoogspanningsveld toe om het celmembraan tijdelijk te permeabiliseren en de opname van DNA te vergemakkelijken. Elektroporatie behaalt consequent de hoogste transformatie-efficiënties onder de beschikbare transformatiemethoden, met geoptimaliseerde protocollen die opbrengsten van 108–109 CFU9 rapporteren. Er is waargenomen dat de elektroporatie-efficiëntie in S. cerevisiae kritisch gevoelig is voor celgroeifase, DNA-massa en buffersamenstelling, wat een kader biedt dat sindsdien breed is aangepast voor bibliotheekschaal gerichte evolutie9.

Het hier beschreven protocol gebruikt S. cerevisiae-stam EBY100, een veelgebruikte gastheerstam voor het vertoon van gistoppervlakken. EBY100 werd ontwikkeld door Boder en Wittrup door een AGA1-expressiecassette te integreren onder controle van de galactose-induceerbare GAL1-promotor in het chromosomale AGA1-locus van de protease-deficiënte moederstam BJ546510. De stam is commercieel verkrijgbaar bij de ATCC (catalogusnummer MYA-4941; deponeerder K.D. Wittrup), met het genotype MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Als gevolg hiervan worden zowel Aga1p als de Aga2p-substraat cassettefusie tot expressie gebracht vanuit dezelfde galactose-induceerbare promotor, waardoor ervoor wordt gezorgd dat de twee subunits gecoïnduceerd worden en samenkomen tot het disulfide-gekoppelde Aga1p–Aga2p-complex dat de getoonde fusie aan de celwand verankert.

Ondanks het wijdverbreide gebruik van EBY100 in gistdisplaytoepassingen, is er geen enkel gepubliceerd protocol systematisch geoptimaliseerd voor het elektroporeren van deze stam op bibliotheekschaal-opbrengsten. EBY100-specifieke parameters, zoals de optimale groeifase bij oogst, de media-samenstelling tijdens subcultuur, en de kwantitatieve relatie tussen initiële optische dichtheid bij 600 nm (OD600) en transformatie-efficiëntie, moeten nog rigoureus worden gekarakteriseerd en geoptimaliseerd. Hier rapporteren we dat de transformatie-efficiëntie in EBY100 monotoon toeneemt met de OD600 van de kweek bij oogst, waarbij cellen in de late logaritmische fase aanzienlijk hogere transformatiesnelheden opleveren dan die in de vroege logaritmische fase. We evalueerden kritieke protocolparameters, waaronder initiële OD600-waarden bij inoculatie, het gebruik van 2 × Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) medium voor subculturen, elektroporatiebufferformuleringen en post-elektroporatie uitgroeicondities. Het hier gepresenteerde protocol biedt een geoptimaliseerde, stapsgewijze workflow (Figuur 1A–C, Figuur 2, Figuur 3A–D, Figuur 4A–E) voor het voorbereiden van elektrocompetente EBY100-cellen en het uitvoeren van hoogefficiënte DNA-bibliotheekelektroporatie, wat transformatiesnelheden consequent boven 109 oplevert CFU. Om dit protocol te valideren, voerden we een uitgebreide gerichte evolutiecampagne uit om TEVp te ontwikkelen met gewijzigde cleavagespecificiteit gedurende vier rondes van FACS-gebaseerde selectie en verrijking. Sequencing van verrijkte proteasevarianten bevestigde aanzienlijke diversificatie bij gerichte residuen binnen de substraatbindingspocket van de protease, wat aantoont dat het protocol voldoende bibliotheekdekking van sequentieruimte biedt om productieve evolutiecampagnes te ondersteunen. Dit protocol zal van brede waarde zijn voor onderzoekers die EBY100 gebruiken voor gistoppervlaktedisplay-gebaseerde gerichte evolutie en FACS-compatibele, high-throughput screening van proteasen, antilichamen9, kinasen11 en receptoren12, naast andere eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met recombinante S. cerevisiae werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid en de procedures van het Institutional Biosafety and Chemical Safety Committee aan de University of Texas in Dallas. Recombinante giststammen werden behandeld onder Biosafety Level 1 (BSL-1) containment volgens gevestigde institutionele microbiologische praktijken. Elektroporatie, kweek en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) werden uitgevoerd volgens goedgekeurde institutionele bioveiligheidsprocedures. Gistculturen en besmette verbruiksmaterialen werden gedesinfecteerd en als biologisch gevaarlijk afval verwijderd volgens de institutionele richtlijnen.

1. Vector- en insertvoorbereiding

  1. Generatie van potoverale proteasebibliotheken via site-saturatie mutagenese
    1. Ontwerp met sequentieontwerpsoftware die 30- tot 50-mer, voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden overlapt om een mutante bibliotheek van proteasen te genereren. Vervang het wildtype-codon in de bijbehorende oligonucleotide door een NNS-gedegenereerd codon, waarbij N A, T, G of C vertegenwoordigt, en S G of C, voor posities die gericht zijn op mutagenese.
    2. Ontwerp de 3′-overlap tussen elk voor- en omgekeerd oligonucleotidepaar met een smelttemperatuur (Tm) van 55–60 °C. Ontwerp de eerste en laatste oligonucleotiden zo dat ze een overlap van 50 nt bevatten met de gistoppervlak-displayvector buiten de restrictieplaatsen.
    3. Zorg ervoor dat ten minste één uiteinde van de insert exact overlapt met één uiteinde van de lineaire vector om homologe recombinatie13 te faciliteren. Vermijd gaten tussen aangrenzende oligonucleotiden14.
    4. Suspensieer oligos opnieuw tot 100 μM met gedeïoniseerdeH2 O. In een steriele 1,5 mL buis wordt 0,5 μL van elke oligo gecombineerd tot een eindvolume van 200 μL (eindconcentratie van 250 nM per oligo).
    5. Stel een PCR-reactie op met de componenten die in Tabel 1 zijn vermeld om de proteasebibliotheek samen te stellen, met behulp van de thermocyclische condities in Tabel 2.
    6. Stel een tweede PCR-reactie op met de buitenste voor- en achteruit-oligo's (Tabel 3) met het eerste geassembleerde PCR-product als sjabloon. Versterk het product zoals weergegeven in Tabel 4.
    7. Voer het tweede PCR-product uit op een 1% agarosegel met ethidiumbromide (0,5 μg/mL) op 240 V gedurende 30 minuten. Verwijder de band die overeenkomt met de verwachte DNA-lengte.
      OPMERKING: VOORZICHTIG: Ethidiumbromide is een mutageen en moet worden behandeld met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbril. Vermijd huidcontact en inademing. Verwijder gels, buffers en verbruiksartikelen met ethidiumbromide als gevaarlijk chemisch afval volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen.
    8. Zuiver met een gelextractiekit. Eluut in 50 μL gedeïoniseerd H2O.
    9. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. Bewaar het DNA bij −20 °C.
      OPMERKING: Elke 50 μL reactie van detweede PCR levert ongeveer 0,5–1,0 μg totaal DNA op. Aangezien elke elektroporatie 12 μg van de proteasebibliotheek vereist (d.w.z. insert), schaal reacties dienovereenkomstig op.
  2. Substraatcassette-assemblage
    1. Bereid LB-agarplaten en LB-chloramfenicol-vloeibare media voor. Zie recepten in Tabel 5.
    2. Ontwerp een set overlappende oligonucleotiden van 30 meer in voorwaartse en achteruitrichting voor de assemblage van substraatcassettes. Ontwerp de 5′-uiteinden van elk omgekeerd oligonucleotide en de voorste oligonucleotide van het volgende fragment zodat ze overeenkomen met 4 nucleotiden.
    3. Suspensieer gelyofilieerde oligo's tot 100 μM met behulp van gedeïoniseerde H2O.
    4. Meng reagentia zoals in Tabel 6.
    5. Gebruik het cyclusprogramma in Tabel 7 om het oligomengsel te annealen en fosforyleren.
    6. Verdunde geannealeerde oligos 4-voudig in gedeïoniseerd H2O om een uiteindelijke concentratie van 1,25 μM te bereiken.
    7. Combineer de geannealed oligo-mix met de vector (bijv. pDD1523), volgens Tabel 8.
    8. Voer Golden Gate-assemblage uit, volgens het fietsprogramma in Tabel 9.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, het pDD1523-plasmide heeft een type IIS restrictieplaats (BsmBI) stroomafwaarts van de GAL1/10-promotor. Succesvolle assemblage maakt galactose-inductie van de substraatcassette7 mogelijk.
    9. Transformeer het resulterende plasmide in E. coli.
    10. Plaatcellen op LB-agar met het bijbehorende antibioticum. Broed 16–18 uur bij 37 °C.
    11. Kies geïsoleerde kolonies en inoculeer ze in 5 ml LB-media. Broed 's nachts (16–18 uur) bij 37 °C met schudden (220 rpm).
    12. Haal plasmiden uit nachtelijke kweek met een plasmid miniprep-kit.
    13. Meet de plasmidconcentratie met een spectrofotometer en stuur daarna sequencing.
  3. Linearisatie van gistdisplayvector
    1. Lineariseer het gistdisplayplasmide, bijvoorbeeld door pDD1524 te verteren met SphI- en PstI-restrictie-enzymen om de gistdisplayvector met de substraatcassette voor elektroporatie voor te bereiden. Meng de reagentia die in Tabel 10 staan en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
    2. Laat het restrictiedigestproduct 30 minuten draaien op een 1% agarosegel op 240 V. Verwijder de band die overeenkomt met de verwachte DNA-lengte en zuiver met een gelextractiekit.
      OPMERKING: Elke 50 μL restrictiedigest levert ongeveer 0,5–1,0 μg totaal DNA op. Aangezien elke elektroporatie 4 μg lineaire vector vereist, schaal je de digestreacties dienovereenkomstig op.

2. Elektroporatie

Opmerking: Volg de institutionele veiligheidsprocedures voor het omgaan met biologische materialen en reagentia, draag geschikte PBM en voer biologisch en chemisch afval af volgens de institutionele richtlijnen.

  1. Voorbereiding van buffers, platen en media (2 dagen voor elektroporatie)
    1. Bereid groeimedia voor (1 × YPD; 2 × YPD; Synthetische dextrose casaminozuren, SDCAA+; en synthetische galactosecasaminozuren, SGCAA+), platen (YPD en SDCAA), elektroporatiebuffer en steriel water volgens de recepten in Tabel 5. Bewaar op 4 °C.
  2. Voorbereiding van een gestreepte plaat van EBY100.
    1. Smeer EBY100-gist uit op YPD-agar van een glycerolbouillon. Kweek op 30 °C gedurende 2 dagen.
    2. Bewaar de plaat na groei op 4 °C.
      OPMERKING: Een gestreepte plaat blijft tot 1 maand bruikbaar; Noteer de datum van de streak op het plaatje.
  3. Voorbereiding van EBY100 pre-kweek (1 dag voor elektroporatie)
    1. Bereid 125 mL van 1 × YPD voor in een 500 mL Erlenmeyer-fles.
    2. Bereid 25 mL van 1 × YPD voor in een 50 mL conische buis. Met een micropipettip verzamel je EBY100-cellen van de plaat die gedurende 2 dagen is gekweekt. Vervolgens breng je de gistcellen van de pipettip over in de kegelvormige buis met 1 × YPD.
      OPMERKING: De streep cellen moet een uitstrijkje vormen van ongeveer 1–2 mm lang.
    3. Verwijder de micropipettip en laat de kegelvormige buis vortexen om voldoende menging te garanderen.
    4. Bereid een 150 mL pre-cultuur voor door 25 mL van 1 × YPD met gistcellen over te brengen in de 500 mL kolf met 125 mL 1 × YPD. Draai om te mengen.
    5. Meet met een spectrofotometer de OD600 door twee microcuvetten met een padlengte van 1 cm te bereiden: één met 1 mL van 1 × YPD als blanke controle en een andere met 1 mL van de pre-cultuur
    6. Kweek 150 mL pre-cultuur 's nachts (16–20 uur) bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm.
  4. Voorbereiding van subcultuur bij de gewenste initiële OD600 (op de dag van elektroporatie)
    1. Bereid de conditioneringsbuffer en uitgroeimedia voor, zoals beschreven in Tabel 5.
    2. Meet de OD600 van de nachtelijke pre-cultuur (verwachte OD₆₀₀ is 17–22). Om binnen het lineaire bereik van de spectrofotometer te blijven, meet je een verdunning van 1:20 van de pre-cultuur.
    3. Bereken het volume pre-cultuur dat nodig is om een 100 mL subcultuur te inoculeren. Een initiële subcultuur OD600 van 3,0–4,0 wordt aanbevolen.
    4. Verdun de kweek tot de gewenste initiële OD600 in 100 mL van 2 × YPD in een 500 mL Erlenmeyer-kolf.
    5. Incubeer de 100 mL subcultuur bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm gedurende 4 uur.
  5. Bereiding van media tijdens 4 uur incubatie
    1. Houd ijskoude elektroporatiebuffer en steriel water paraat (vanaf stap 2.1.1).
    2. Bereid conditioneringsbuffer (100 mL) voor, volgens het recept in Tabel 5. Gebruik 20 mL conditioneringsbuffer per transformatie; Schaal dienovereenkomstig op. Bewaren op kamertemperatuur (20–23 °C).
      OPMERKING: WAARSCHUWING: De conditioneringsbuffer bevat dithiothreitol (DTT) en lithiumacetat (LiAc), chemische irriterende stoffen die huid- en oogirritatie kunnen veroorzaken. Draag geschikte PBM, waaronder een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbrillen, en behandel deze reagentia volgens de institutionele chemische veiligheidsprocedures. Verwijder ongebruikte oplossingen en gebruikte buffers als chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen.
    3. Bereid uitgroeimedia voor (50 mL): Meng 25 mL 2 × YPD en 25 mL 1 m sorbitol samen. Gebruik 8 ml uitgroeimedium per transformatie. Bewaren op kamertemperatuur (20–23 °C).
  6. Bereiding van elektrocompetente gistcellen na 4 uur incubatie.
    1. Splits de 100 mL subcultuur in twee 50 mL conische buizen. Verzamel cellen door centrifugatie bij 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en dokanteer het medium dan. Houd cellen op ijs tot stap 2.6.4 is voltooid.
    2. Suss elke celpellet voorzichtig opnieuw met 25 ml ijskoud steriel water. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en giet daarna het medium over.
    3. Herhaal stap 2.6.2.
    4. Suss elke celpellet voorzichtig opnieuw met 25 mL ijskoude elektroporatiebuffer. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en giet daarna het medium over.
    5. Haal de cellen uit het ijs en suspendeer elke celpellet voorzichtig opnieuw met 10 mL conditioneringsbuffer bij kamertemperatuur (20–23 °C). Vervolgens wordt het gepoold in een enkele 125 mL Erlenmeyer-kolf en incubeer bij 30 °C met orbitale schudding op 270 rpm gedurende 30 minuten.
    6. Giet de cellen in een buis van 50 mL. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten. Laat de media decanteren.
    7. Suspendeer de celpellet voorzichtig opnieuw met 50 mL ijskoude elektroporatiebuffer. Centrifugeer op 4 °C en 1.500 × g gedurende 3 minuten, en giet daarna het medium over.
    8. Suspenseer de celpellet opnieuw tot een eindvolume van 1 mL door ongeveer 100–200 μL elektroporatiebuffer toe te voegen. Houd cellen op ijs tot elektroporatie.
      OPMERKING: Elektrocompetente cellen kunnen worden ingevroren (d.w.z. geplaatst in een –80 °C vriezer) en later worden gebruikt zonder significant verlies aan elektroporatie-efficiëntie.
  7. Elektroporatie, uitgroei en plating
    1. Pre-chill elektroporatiecuvette(s) met een opening van 0,2 cm op ijs.
    2. Breng 380 μL van de opnieuw suspendeerde pellet over in een steriele 1,5 mL buis. Meng met 4 μg plasmide-DNA of met 4 μg lineair plasmidevector en 12 μg insert. Meng voorzichtig door te pipetteren.
      OPMERKING: Om het aantal elektroporatieve cellen te maximaliseren, zouden de DNA-concentraties van vectoren en inserts idealiter 700–800 ng/μL moeten zijn. Als de concentraties lager zijn dan dat, gebruik dan een vacuümconcentrator.
    3. Breng de suspensie over in de voorgekoelde elektroporatiecuvette(s). Laat het 5 minuten op het ijs staan.
    4. Veeg na 5 minuten de zijkanten van de cuvette af met een pluisvrij laboratoriumdoekje om restvocht te verwijderen, wat kan leiden tot vonken tijdens elektroporatie. Vermijd belletjes of cellen boven de metalen platen in de cuvet, omdat deze ook tot vonken kunnen leiden. Om de koude temperatuur van de cuvette te behouden, raak je de elektroden van de plaat niet aan.
    5. Bereid 8 ml uitgroeimedium voor in een 50 ml conische buis.
    6. Elektroporate de cellen met de volgende instellingen: een spanning van 2,5 kV, capaciteit van 25 μF en weerstand van 200 Ω9. Het acceptabele tijdconstantbereik is 2,8–4,5 ms.
      OPMERKING: WAARSCHUWING: Elektroporatie omvat hoogspanningselektrische pulsen. Zorg dat cuvetten goed zitten en volg de gebruiksaanwijzingen van de fabrikant. Voer gebruikte elektroporatiecuvetten als biologisch gevaarlijk afval af volgens de richtlijnen van de instelling.
    7. Overspoel de cuvette onmiddellijk met ongeveer 200 μL uitgroeimedium uit de conische buis en breng de elektroporatieve cellen over in de 50 mL conische buis. Voeg nog eens 200–350 μL uitgroeimedium toe totdat er geen zichtbare vloeistof meer in de cuvette overblijft.
    8. Incubeer de 50 mL conische buis van elektroporatieve cellen in 8 mL uitgroeimedium bij 30 °C zonder te schudden gedurende 1 uur. Draai de buis elke 15 minuten om te mixen.
    9. Verzamel cellen door centrifugatie bij 1.500 × g, 25 °C gedurende 3 minuten. Decanteren dan de media.
    10. Susselt cellen opnieuw in het juiste gistdropoutmedium om selectie voor getransformeerde cellen te behouden. Voor plasmiden die de TRP1-selectiemarker bevatten, hersuspendeer je cellen in 250 mL SDCAA+ (dat tryptofaan mist) om selectief gist terug te winnen die het plasmide vasthield.
    11. Incubeer 's nachts (16–20 uur) bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm.

3. Inductie, kleuring en flowcytometrische sortering van gistcellen

  1. Inductie van proteasebibliotheek en substraatcassette (1 dag voor sortering)
    1. Meet OD600 zoals in stap 2.4.2 na een nachtelijke groei van transformanten in dropout-media.
    2. Aliquot 12 mL gisttransformanten en centrifugeren op 3.200 × g gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in SGCAA+ inductiemedium tot een OD600 van 0,5. Bereken het benodigde ophangingsvolume met behulp van de verdunningsvergelijking, C1V1 = C2V2.
    4. Overbrengen naar een 125 mL Erlenmeyer-kolf en 's nachts 18–24 uur laten groeien bij 30 °C met orbitale schudding bij 270 rpm.
  2. Fluorescerende antilichaamkleuring (op de dag van sortering)
    1. Meet OD600 van cellen na inductie. Gebruik twee cuvetten: één met 1 mL SGCAA+, en de andere met 950 μL SGCAA+ gemengd met 50 μL cellen. Vermenigvuldig de gemeten OD600-waarde met 20 om de werkelijke OD600 van post-inductiecellen te krijgen.
    2. Normaliseer elk monster tot 3 × 10 à7 cellen voor antistofkleuring en FACS-sortering. Gebruik C1V1 = C2V2 om het volume cellen te berekenen dat van de inductiekolf moet worden overgebracht.
      OPMERKING: Voor vier-site NNS-saturatiemutagenese is de theoretische bibliotheekgrootte 10à 6 varianten. Om de bibliotheek voldoende te samplen, schermt u minstens 10 keer de bibliotheekgrootte, of 10 à7 cellen. Voorbeeld: als gewenst C1V1 = 3 × 107 cellen en C2 = post-inductie OD600 van 6 (d.w.z. 6 × 107 cellen/mL), dan aliquot 500 μL geïnduceerde cellen (d.w.z. V2 = 3 × 107 cellen / 6 × 107 cellen/mL = 500 μL).
    3. Breng het berekende volume cellen over naar een buis van 1,5 mL en centrifugeer op 5.000 × g gedurende 5 minuten.
    4. Verwijder het supernatant en suspensieer opnieuw in 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 0,5% rundserumalbumine (BSA).
    5. Centrifugeer op 5.000 × g gedurende 5 minuten en herhaal stap 3.2.4.
    6. Centrifugeer op 5.000 × g gedurende 5 minuten, en voltooi ondertussen stap 3.2.7.
    7. Bereid een antilichaamkleuringsmengsel voor in een 1,5 mL buis met anti-HA-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) (0,5 μg/107 cellen), anti-FLAG phycoerythrine (PE) (0,05 μg/107 cellen) en PBS + 0,5% BSA (100 μL/107 cellen). Houd de buis op ijs.
    8. Verwijder het supernatant en susseer opnieuw met het kleurmengsel. Gebruik 300 μL van het kleurmengsel per 3 × 107 cellen . Draai de buis niet in vortex; Alleen omkeren of flicken.
    9. Houd cellen 1 uur in het donker op ijs na de re-suspensie.
  3. Na-beitsingswash
    1. Centrifuge-gekleurde cellen op 5.000 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in PBS met 0,5% BSA met 0,5 mL per 1 × 107cellen (bijv. 500 μL voor 1 × 107cellen of 1,5 mL voor 3 × 107cellen ).
    2. Centrifuge op 5.000 × g, 5 min. Verwijder supernatant, hersuspensie in 750 μL PBS + 0,5% BSA.
    3. Breng nog eens 750 μL PBS + 0,5% BSA over in een 10 mL verzamelbuis.
  4. FACS
    1. Voer de noodzakelijke opstart en voorbereiding van de cytometer uit voor een nieuw experiment.
    2. Maak drie puntdiagrammen. Selecteer bij de eerste dotplot de naam van de X-as om het kanaal van voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) weer te geven en de naam Y-as om het zijkanaal van verstrooiingsgebied (SSC-A) weer te geven.
      OPMERKING: Dit zal de selectie van levende cellen vergemakkelijken.
    3. Houd de naam X-as om het FSC-A-kanaal weer te geven, terwijl het Y-askanaal wordt aangepast om de voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) op de tweede dot-plot weer te geven.
      OPMERKING: Dit vergemakkelijkt het selecteren van singlets.
    4. Selecteer de naam van de X-as om het PE-kanaal weer te geven en de naam van de Y-as om het FITC-kanaal op de derde dot-plot weer te geven.
    5. Voer negatieve controle uit op de cytometer met behulp van de 530/30 nm (FITC) en 585/42 nm (PE) kanalen. Voer sortering uit met een 70 μm nozzle bij 70 psi manteldruk. Verzamel samples met een snelheid van 4000–5000 gebeurtenissen/s.
    6. Teken een polygonpoort rond de hoofdpopulatie van intacte gistcellen om afval en kleine deeltjes met lage FSC-A- en SSC-A-signalen uit te sluiten op de eerste dot-plot (FSC-A versus SSC-A).
    7. Gate-singlets op een FSC-H versus FSC-A-plot binnen deze gate, door de lineaire populatie te selecteren die een proportionele relatie vertoont tussen FSC-H en FSC-A. Sluit gebeurtenissen uit die afwijken van de lineaire verdeling en overeenkomen met doublets en celaggregaten.
      OPMERKING: De derde dot-plot voor PE versus FITC toont een diagonale cluster van stippen voor de negatieve controle (d.w.z. gistcellen die de intacte substraatcassette tot expressie brengen).
    8. Voer monsters uit en sorteer gistcellen op basis van gewenste PE/FITC-waarden in een verzamelbuis(en). Analyseer een totaal aantal cellen dat overeenkomt met minstens 10 keer de theoretische bibliotheekgrootte om een adequate representatie van alle varianten te garanderen (bijvoorbeeld analyseren van ~1 × 107 cellen voor een bibliotheek met een theoretische diversiteit van ~1 × 10,6 varianten).
    9. Plaats de sorteerpoort onder de PE/FITC-diagonaal van de negatieve controlepopulatie.
      OPMERKING: Strengere poorten verbeteren de verrijking van gewenste varianten, maar verminderen het celherstel.
  5. Na FACS
    1. Centrifuge-verzamelbuis(en) op 3.200 × g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant, laat 1 ml over, en breng het opnieuw in 5 mL PBS.
      OPMERKING: Laat 1 mL supernatant over, want de celpellet onderaan zal na centrifugatie niet zichtbaar zijn.
    2. Centrifugeer opnieuw cellen op 3.200 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, laat 1 ml over. Heropsussen met 4 mL SDCAA+.
    3. Voeg in een 250 mL Erlenmeyer-kolf 15 mL SDCAA+ toe. Breng de hersuspendeerde cellen van stap 3.5.2 over in deze kolf.
    4. Incubeer 's nachts gedurende 18–24 uur bij 30 °C met orbitale schuddingen bij 270 rpm.
    5. Herhaal stappen 3.1, 3.2, 3.3 en 3.4 voor elke ronde van gerichte evolutie.

4. Plasmideherstel en sequencing van individuele klonen

  1. Individuele kolonies laten groeien
    1. Maak een glycerolbouillon door 500 μL van de vloeibare cultuur te mengen na stap 3.5.4 en 500 μL steriel 50% glycerol, wat resulteert in een glycerolvoorraadoplossing van 25%. Vortex om de cellen grondig te mengen.
    2. Bewaar het een nacht in de vries van –80 °C. Voor langdurige opslag overbrengen in vloeibare stikstof.
    3. Schraap de glycerolkolf met een steriele 1000 μL tip en meng het door 100 μL SDCAA+. Leg dit mengsel op een SDCAA-plaat en broed het ondersteboven uit bij 30 °C.
    4. Kies kolonies na 3 dagen en kweek ze 's nachts in 1,5 ml SDCAA+ in 14 mL buizen.
  2. Voer gist miniprep uit om plasmiden te extraheren
    1. Pellet de nachtcultuur door 1 minuut te centrifugeren op 16.000 × g en opnieuw te suspenderen in 200 μL Oplossing 1 uit een gistplasmide-zuiveringsset.
    2. Voeg 5 μL lytisch enzymoplossing toe (5 U/μL).
    3. Incubeer 4 uur in een incubator van 37 °C op een end-to-end mixer.
    4. Voer een vries-dooicyclus uit door 20 minuten bij -80 °C in te vriezen en 10 minuten in een waterbad te ontdooien bij 42 °C.
    5. Voeg 200 μL Oplossing 2 toe uit een gistplasmide-zuiveringsset, meng door 2–3 keer om te keren en laat het 5 minuten intrekken.
    6. Voeg 400 μL Oplossing 3 toe uit een gistplasmide-zuiveringskit en meng door 2–3 keer te inverteren. Centrifugeer op 16.000 × g gedurende 5 minuten.
    7. Zuiver plasmide-DNA met een zuiveringskit met een kolom met een hoge DNA-bindingscapaciteit.
      OPMERKING: Vanwege de grote hoeveelheid geschorte genomische gist-DNA afkomstig van de gelyseerde cellen, moet een silica-gebaseerde kolom met een hogere DNA-bindingscapaciteit (35 μg) worden gebruikt in plaats van een laag-capaciteit gistplasmide-DNA-zuiveringskolom (5 μg)15.
    8. Meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer. De DNA-opbrengsten bedragen 10–30 ng/μL.
  3. Transformeer gezuiverde plasmiden tot chemisch competente E. coli-cellen
    1. Bereid SOC-media voor, volgens het recept in Tabel 5, en LB-chloramfenicol-borden. Verwarm ook een waterbad voor tot 42 °C.
    2. Verwarm een LB-chloramfenicolplaat voor elk plasmide op 37 °C gedurende 20 minuten.
    3. Haal een buis met chemisch competente cellen uit de –80 °C vriezer en ontdooi op ijs.
    4. Voer 30 μL competente cellen per plasmide in een 1,5 mL buis op ijs.
    5. Pipette 3 μL plasmide in competente cellen. Knip om te mengen en laat het 5 minuten op ijs staan.
    6. Voer een hitteshock uit door de cellen kort te incuberen in het waterbad bij 42 °C gedurende 40 seconden.
    7. Incubeer op ijs gedurende 2 minuten.
    8. Voeg 300 μL SOC-medium toe aan de cellen en incubeer 15 minuten bij 37 °C bij 220 rpm.
    9. Plaat 50–100 μL getransformeerde competente cellen op voorverwarmde platen.
    10. Breng de platen ondersteboven op 37 °C gedurende 18 uur.
  4. Kolonieplukken
    1. Voeg 5 ml vloeibare LB-chloramfenicol-media toe aan 14 mL ronde kweekbuizen.
    2. Kies een kolonie met een steriele 1000 μL tip en laat die in een kweekbuis vallen.
    3. Plaats buizen in een shaker (220 rpm, hoek 30°–45° om de beluchting te maximaliseren) op 37 °C gedurende 18 uur.
  5. Plasmide-extractie uit bacteriële vloeistofkweek
    1. Centrifugeer de vloeistofculturen op 3.200 × g gedurende 4 minuten. Giet het supernatant over.
    2. Haal plasmiden uit nachtelijke culturen met behulp van een plasmide-zuiveringsset.
    3. Meet de concentratie van gezuiverde plasmiden met een spectrofotometer.
  6. Dien plasmiden in voor sequencing
    OPMERKING: Gebruik diensten zoals whole-plasmid nanopore sequencing, of alternatieve Sanger-sequencing met een primer die het gemutageniseerde gebied flankert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Efficiënte bibliotheekconstructie is cruciaal om voldoende dekking van de mutatieruimte te garanderen. Om verlies van zeldzame functionele varianten te voorkomen, moet het aantal transformanten minstens 10× tot 100× de theoretische bibliotheekgrootte bereiken. Omdat de transformatie-efficiëntie in S. cerevisiae wordt beïnvloed door celconcentratie en het hoogst is in cellen16 in de vroege tot midden-logaritmische fase, hebben we de initiële celdichtheid v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gerichte evolutie is een methode met hoge doorvoer die iteratieve cycli van diversificatie en selectie gebruikt om eiwitten met een verbeterde of nieuwe biochemische functie te identificeren17. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde workflow om protease-substraatherkenning te ontwikkelen met behulp van een celoppervlakweergavesysteem in S. cerevisiae. Het oppervlakteweergavesysteem brengt de proteaseactiviteit in kaart naar een detecteerbaar ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. De ruwe data die dit protocol ondersteunt, waaronder Nanopore-sequencing FASTQ-bestanden, flowcytometrie (FCS)-bestanden en brongegevens die worden gebruikt om de figuren en tabellen te genereren, en plasmiden pDD1523 en pDD1524, zijn in Zenodo gedeponeerd en openbaar beschikbaar op 10.5281/zenodo.20746804

Dankbetuigingen

Wij danken alle leden van het Dingal laboratorium voor hun advies, expertise en discussies. We danken ook de UTD Flow Cytometry Core voor de infrastructuur en ondersteuning. M.B.L. wordt ondersteund door de UTD Eugene McDermott Graduate Fellowship. Dit onderzoek werd ondersteund door een UTD Startup Fund en National Institutes of Health-NIGMS-toekenningen voor het laboratorium van P.C.D.P.D. (R35GM150967).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
10 mM dNTP MixNEBN0447SPCR reacties (Tabellen 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Kleurstofbasisbuffer (Stappen 3.2–3.3)
5X Q5 ReactiebufferNEBB9027SWordt apart verkocht; ook inbegrepen bij Q5 polymerase
Agar, BactoBD Difco281230-500gSDCAA-agarplaten (Tabel 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Gelelektroforese
Anti-FLAG PE AntilichaamBioLegend637309FACS-kleuring; PE-geconjugeerd anti-FLAG
Anti-HA Tag Antilichaam [FITC]GenScriptA01621FACS-kleuring; FITC-geconjugeerd anti-HA
Bacto CasaminozurenBD Difco223120SDCAA+, SGCAA+, SCAA-media (Tabel 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0LB/SOB-mediavoorbereiding; 20 g/L in YPD (Tabel 5)
BSA, bovien serumalbumine, fractie VSigma-Aldrich126575-10GM0,5% in PBS; kleurstofbuffer (Stappen 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SGolden Gate-assemblage van substraatcassette (Tabel 8)
Calciumchlorideoplossing (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLElektroporatiebuffer: 1 mM eindconcentratie (Tabel 5)
ColiRollers® BeplatingskralenSigma-Aldrich71013-3Steriliseren door te plaatsen in reagentenflessen en autoclaven bij 121ºC, 15 psi, gedurende 15 minuten.
D-GalactoseThermo FisherA12813.30250 g; 20% w/v-voorraad voor SGCAA+-inductie (Tabel 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Elektroporatiebuffer (1 M) en uitgroeimedia (Tabel 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrousSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v-dextrosevoorraad (Tabel 5)
Difco Giststikstofbasis zonder aminozurenSigmaY0626-250G6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabel 5)
Difco YPD-bouillon (voorgemengd)BD242820-500gVoorbereide YPD-alternatief; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GConditiebuffer: 10 mM eindconcentratie; doseer 250 μL, bewaar -20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR-zuiveringsuitrustingOmega Bio-tekD6492-02PCR-productopruiming
E.Z.N.A. GelextractiekitOmega Bio-tekD2500-01Gelzuivering na PCR en restrictiedigest (Stappen 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmide DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Plasmide-zuivering (Stap 4.2)
Glycerol (≥99%)FisherBP229-450% v/v-voorraad voor glycerolvoorraden (Stap 4.1.1)
Kanamycinesulfaat FisherBP906-5SDCAA+ en SGCAA+: 50 μg/mL eindconcentratie; vervangt Sigma K0879-5G
KLD-enzymmixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI; plaatsgerichte mutagenese
KLD-reactiebufferNEBB0554AWordt gebruikt met KLD-enzymmix
LB-bouillon (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGE. coli vloeibare kweek
Lithiumacetaatdihydraat (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Conditiebuffer: 0,1 M eindconcentratie; toevoegen voor DTT (Tabel 5)
Luria-agar (Luria-Bertani-agar)RPIL24020-2000.0E. coli-beplating; vervangt Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur CasaminozurenSigma2240-500GMAlternatieve casaminozuurbron
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicilline-streptomycineoplossing, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X eindconcentratie
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SVectorlinearisatie (Tabel 10); gebruik HF-versie
Q5 HF DNA-polymeraseNEBM0492SHoge-fidelity-polymerase; alternatief voor Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028AVoor PCR-reacties met hoog GC-gehalte
Q5 Hot Start DNA-polymeraseNEBM0491LPCR-samenstelling en -amplificatie (Tabellen 1, 3)
rCutSmart-buffer (10X)NEBB6004SMeegeleverd met PstI-HF en SphI-HF (Tabel 10)
SalI-HFNEBR3138LAan

Referenties

  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

BioengineeringNummer 234Nummer 234Lege WaardeNummerproteasemutagenesePotyviridaeSaccharomyces cerevisiaeelektroporatieflowcytometrie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.