Methodenartikel

3D-geprint offerinktplatform voor hoge-resolutie beeldvorming van endotheelceluncties in kronkelige vaten en aneurysma's

80 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72574

⸱

29 september 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Morphodynamics, Cell Biology and Physiology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Biomedical Engineering and Physical Science Shared Resource, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Center for Biomedical Engineering Technology Acceleration, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 4Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol beschrijft hoe bloedvaten in vitro kunnen worden ontworpen en geassembleerd met kronkelige segmenten of aneurysma's, gebruikmakend van een extrusieprinter of handmatige applicatie van gepasteuriseerde offerinkt, en hoe hemodynamische stroming en endotheliale celresponsen kunnen worden geanalyseerd.

Samenvatting

Vasculaire tortuositeit en aneurysma's vormen aanzienlijke gezondheidsrisico's in diverse menselijke weefsels en bloedvattypen. Deze veranderingen in de vaatvorm veroorzaken anomalieën in de bloedstroomdynamiek, wat een significante impact heeft op de endotheelfunctie. Diermodellen van deze vasculaire ziektebeelden zijn in sommige gevallen illustratief geweest, maar zijn zowel kostbaar om op te zetten als beperkt tot de fysiologie van de betreffende diersoort. Als reactie hierop zijn in vitro 3D organ-on-a-chip (OOC) modellen een krachtige set instrumenten geworden voor het beoordelen van de vasculaire functie en endotheelresponsen in menselijke cellen. Hoewel elk van de OOC-modellen eigen sterktes heeft, is er een toegankelijk systeem nodig om de vaatpermeabiliteit te bestuderen, een belangrijke indicator van de vasculaire functie in gekromde vaten en aneurysma's onder fysiologische afschuifsnelheid en druk. Hier maakt de gepresenteerde methodologie de bestudering van menselijke endotheelcelresponsen op stroomanomalieën mogelijk in een economisch gekromd-vatmodelsysteem met gebruik van een instapbioprinter, die vaten produceert die compatibel zijn met fysiologische vloeistofstroomsnelheden, permeabiliteitsstudies, hoge-resolutie lichtmicroscopie en extracellulaire matrixondersteuning met fysiologische stijfheid.

Inleiding

De morfologie van bloedvaten is een belangrijke indicator voor de vasculaire functie, aangezien vaattortuositeit en aneurysma's belangrijke kenmerken zijn van diverse ziekten en gezondheidsrisico's. Vasculaire tortuositeit kan congenitaal zijn, zoals bij syndromen als Marfan1, Turner2 en Loeys-Dietz3, of later in het leven ontstaan als een kenmerk van verschillende ziekten, waaronder hypertensie, diabetes, kanker en mogelijk atherosclerose4,5,6. Aneurysma's van arterieel weefsel, waaronder de arteriae carotis7, coronaria8, femoralis9, aorta10 en cerebrale arteriën11, worden geassocieerd met morbiditeit en gezondheidsrisico's als gevolg van spontane dissectie of ruptuur. Naast het veroorzaken van stromingsonregelmatigheden en daarmee samenhangende endotheelontsteking, kunnen vasculaire tortuositeit en aneurysma's wijzen op onderliggende weefseldisfunctie en inflammatie. Bij pasgeborenen en kinderen is het arterieel tortuositeitsyndroom bijvoorbeeld klinisch voorspellend voor een beroerte in de kindertijd12, persistente pulmonale hypertensie en aortadissectie4,13. Bij volwassenen presenteert retinale vasculitis zich met tortueuze retinale vaten die minder uitgesproken worden naarmate de onderliggende ontsteking afneemt14. De wijze waarop tortuositeit wordt waargenomen en vertaald naar aberrante signalen die de ziekteprogressie stimuleren, blijft een actief onderzoeksgebied. Er wordt aangenomen dat endotheelcellen die de bloedvaten bekleden, fungeren als primaire sensoren in dit proces. Verstoorde of trage stroming, veroorzaakt door vasculaire tortuositeit of aneurysma's, verandert de schuifspanning, wat leidt tot endotheelveranderingen in inflammatoire signalering15 en barrièrefunctie16. Endotheelcellen zijn zeer gevoelig voor vloeistofstroming via mechanismen waarbij primaire cilia17, mechanosensitieve adhesie-eiwitten18,19 en ionkanalen20,21 betrokken zijn, welke signalering aansturen die lekkage, inflammatie en endotheelherprogrammering kan activeren22,23,24. Methoden voor het bestuderen van endotheelresponsen op tortueuze vasculaire geometrie zijn daarom belangrijk voor de ontwikkeling van vasculaire therapieën.

Endotheelfuncties bij vasculaire ziektebeelden zijn gemodelleerd met behulp van in vivo diermodellen, organ-on-a-chip (OOC)-systemen en bioprintingbenaderingen. Muismodellen maken controle over bekende ziekte-genexpressie mogelijk en bevatten de complexiteit van de weefselarchitectuur en fysiologie, inclusief de betrokkenheid van murale cellen en immuuncellen. Muismodellen voor atherosclerose25, het syndroom van Marfan26 en diverse aneurysma's27,28,29 bieden inzicht in pathologieën die geassocieerd zijn met vasculaire dysfunctie. Ondanks deze voordelen zijn directe observatie, experimentele manipulatie en kwantificering van endotheelcellen moeilijk te realiseren, afgezien van bulkmethoden zoals RNA-sequencing. Bovendien brengen diermodellen ethische overwegingen en kosten met zich mee en worden ze beperkt door soortspecifieke fysiologie.

Verschillende in vitro OOC-benaderingen zijn ontwikkeld om menselijke endotheliale reacties op laminaire en verstoorde stroming te bestuderen30,31,32 in zowel 2D33,34 als 3D-systemen35,36,37. De uitgebreide OOC-literatuur38 is grotendeels aangestuurd door biomedische technologie, waarbij ontwerpparameters gericht zijn op specifieke biomedische vraagstukken. Veel vasculaire OOC-modellen maken gebruik van polydimethylsiloxaan (PDMS)-ondersteuningen om de vaatarchitectuur te controleren38. Deze modellen maken een resolutiecontrole van complexe geometrieën mogelijk en maken het modelleren van orgaan-vasculaire interacties mogelijk, waaronder die met de lever39, hersenen40 en longen41. Er blijven echter beperkingen bestaan. De lage permeabiliteit van PDMS en soortgelijke polymeren voor macromoleculen kan studies naar de vasculaire barrièrefunctie beperken. Bovendien heeft de meeste uitgeharde PDMS een stijfheid van ongeveer 0,8–10 MPa42, hoewel alternatieve formuleringen meer fysiologische bereiken van 8–200 kPa kunnen bereiken43. Schattingen van de stijfheid van het vasculaire basaalmembraan variëren van ~350 Pa44 tot ~70 kPa45, afhankelijk van het vaattype en de meetmethodologie, waarbij de meeste gezonde vasculaire basaalmembranen in het bereik van 2–3 kPa liggen46. Omdat vasculaire aandoeningen zoals atherosclerose en hypertensie gedeeltelijk geassocieerd zijn met een verhoogde stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM)47,48,49,50,51, en endotheliale cellen reageren op ECM-stijfheid, is het beheersen van de stijfheid binnen fysiologische bereiken belangrijk in in vitro modellen. Recentere OOC-benaderingen maken gebruik van fysiologische substraten die complexe geometrieën mogelijk maken52,53, meerdere celtypen integreren om orgaanfuncties39,54,55,56,57 of immuun-vasculaire interacties na te bootsen58, patiëntspecifieke vasculaire structuren modelleren59,60 en preklinische geneesmiddelenontwikkeling ondersteunen61,62. In veel microvasculaire modellen met interacties met andere celtypen vormen endotheliale cellen spontaan vaten met relatief ongecontroleerde geometrieën63. Omgekeerd vereisen OOC-systemen die gedefinieerde vaatgeometrieën onder gecontroleerde stroming mogelijk maken vaak aanzienlijke technische infrastructuur, materialen en expertise53,64. Robuuste methoden die toegankelijk zijn voor niet-experts zijn daarom nodig om studies naar vasculaire celgedragingen onder fysiologisch relevante omstandigheden te faciliteren.

Bioprintplatformen die compatibel zijn met fysiologische ECM-hydrogels bieden veelzijdige in vitro modellen voor het bestuderen van de endotheelfunctie in verschillende vasculaire geometrieën65. Deze benaderingen maken gebruik van ofwel de gerichte depositie van gels die endotheelcellen bevatten in de vorm van een bloedvat66, ofwel van opofferingsinkt om open tubulaire lumina te genereren die ingebed zijn in ECM, die vervolgens kunnen worden opgelost, waardoor een lumen overblijft dat kan worden gezaaid met endotheelcellen54. Biologisch compatibele ECM-substraten, waaronder gelatine, collageen en fibrine, kunnen worden afgestemd op stijfheden die benaderen die van het vasculaire basaalmembraan (1–3 kPa67) en maken vasculaire permeabiliteitstests mogelijk die vergelijkbaar zijn met die welke in vivo worden gebruikt. Hoewel deze benaderingen niet dezelfde vorm- en grootteresolutie bereiken als PDMS-fabricage, kunnen gebogen, vertakte en stenotische vaten worden gegenereerd52,66,68. Dergelijke platformen zijn daarom zeer geschikt voor het modelleren van vasculaire geometrieën, inclusief tortueuze en aneurysmatische vaten.

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van een 3D-printbenadering gebaseerd op pneumatische extrusie, driedimensionale positionering op micronschaal, temperatuurregeling van het printbed en de inktbevattende printhoofd, en een offerinkt die eerder is ontwikkeld voor renale-vasculaire interacties op een chip67,69. De offerinkt wordt geprint in de gewenste vasculaire geometrie en direct ingebed in de ECM. Een temperatuurverschuiving verwijdert vervolgens de inkt, waardoor een open ECM-lumen overblijft dat wordt gezaaid met menselijke endotheelcellen. De basis-ECM bestaat uit gelatine en fibrine, wat snelle gelering en trombine-gemedieerde fibrinepolymerisatie mogelijk maakt, terwijl het een mechanische stijfheid biedt die geschikt is voor veel vasculaire basaalmembranen. Aanvullende ECM-componenten, waaronder laminine of fibronectine, kunnen worden ingebouwd om de samenstelling van het vasculaire basaalmembraan beter na te bootsen70,71,72 en endotheeladhesie te bevorderen. Het systeem wordt geassembleerd in herbruikbare Rose-kamers73 die metalen steunen, siliconen rubberen afdichtingen en microscoopdekglas met een hoge resolutie bevatten, wat verbinding met een vloeistofpomp via Luer-lock-naalden mogelijk maakt. Alternatief kunnen de boven- en onderplaten worden gefabriceerd door 3D-printen met behulp van polymelkzuur of koolstofvezelversterkt materiaal. Het geassembleerde systeem is bestand tegen drukken die worden gegenereerd door fysiologische vloeistofstroomsnelheden. Een pasteurisatieprocedure verbetert daarnaast de steriliteit van de offerinkt zonder de fysische eigenschappen ervan te veranderen. Bovendien maakt een naaldtemplate- en bioinktbenadering de fabricage van rechte vaten met een aneurysma mogelijk zonder bioprinter. De resulterende geendotheliseerde kronkelige of aneurysmatische vaten kunnen onder fysiologische flow worden onderzocht met behulp van lichtmicroscopie met een hoge resolutie gedurende ongeveer één week, wat onderzoek naar acute endotheelresponsen op gewijzigde vasculaire geometrie mogelijk maakt.

Een belangrijk voordeel van dit systeem is de compatibiliteit met lichtmicroscopie. In vitro vaten die met dit protocol zijn gegenereerd, zijn geschikt voor verschillende beeldgevingsmodaliteiten en zijn bijzonder geschikt voor spinning-disk of laser-scanning confocale fluorescentiemicroscopie. Bij het selecteren van de beeldgevingscondities moeten de ruimtelijke en temporele resolutie, de gevoeligheid en de werkafstand van het objectief in overweging worden genomen. Voor de meeste vaten die met dit systeem zijn gegenereerd, moet het objectief een voldoende werkafstand hebben om ongeveer 100–300 µm vanaf het dekglas te bereiken en door het midden van het vat te beelden. Objectieven met een hoge numerieke apertuur  zijn vereist voor hogeresolutie-beeldvorming van endotheliale structuren, waaronder organellen en celadhesies, en voor live-imaging die een hoge temporele resolutie vereist, zoals het volgen van fiduciale beads onder stroming. Sommige assays waarbij een minder efficiënte fotonvangst volstaat, zoals fluorescentie-gebaseerde metingen van de endotheliale barrière, kunnen worden uitgevoerd met objectieven met een lagere numerieke apertuur, zoals 10–20× luchtobjectieven.

Het protocol beschrijft de generatie van kronkelige en aneurysmale vaten bestaande uit menselijke endotheelcellen in een in vitro systeem dat fysiologische vloeistofstroom en hoge-resolutie microscopie ondersteunt. De workflow omvat het ontwerp van de vaten, de fabricage van de kamer, de bereiding van opofferingsinkt en 3D-printen, de bereiding van de ECM en het verwijderen van de inkt, het zaaien van endotheelcellen en kweek onder stroom, de beoordeling van vasculaire lekkage, stroommapping en immunofluorescentiekleuring (Figuur 1).

Protocol

1. Ontwerp het vat

  1. Selecteer een vatsegment dat in de microscoopcompatibele kamer past. Houd voor een Rose-kamer een afstand van maximaal 1.6cm aan tussen de inlaat- en uitlaatreservoirs.
  2. Importeer het contrast-CT-angiografiebeeld (Figuur 2A), magnetische resonantie-angiografiebeeld of fluoroscopisch angiografiebeeld in ImageJ/FIJI of een ander beeldanalyseprogramma.
  3. Gebruik de puntmetingstool om de XY-coördinaten langs het axiale centrum van het vat te bepalen. Exporteer de coördinaten naar een spreadsheetprogramma (Figuur 2B).
    OPMERKING: Uit CT-angiografie afgeleide STL-bestanden kunnen rechtstreeks worden geïmporteerd in de meeste printersoftware; polygoongebaseerd printen kan echter meerdere passes vereisen en gevlochten vaten produceren (Supplemental Figure 1). Gebruik directe G-code voor single-pass printing. Om deze reden geniet coördinatenmapping en ontwerp in G-code de voorkeur. Zie het voorbeeld van G-code in de Supplemental Files.
  4. Pas de XY-coördinaten in de spreadsheet aan om het centrum van het vat op de grafische oorsprong te positioneren. Importeer indien nodig de kamerbegrenzing om te bevestigen dat de uiteindelijke print in de kamer past.
  5. Gebruik de XY-coördinaten van het vat om het vat in de eerste printlaag te ontwerpen (Figuur 2C). Stel de hoogte van de eerste laag, inclusief het vat en de aangrenzende inlaat- en uitlaatreservoirs, in op 200µm.
  6. Creëer inlaat- en uitlaatreservoirs die een gemakkelijke naaldinsertie mogelijk maken. Gebruik waar gepast ruitvormige reservoirs om vloeistof efficiënt naar de vatinlaat te leiden, waardoor turbulentie bij de ingang wordt geminimaliseerd (Figuur 2).
  7. Neem de reservoirs op in de eerste printlaag zodat ze aansluitend blijven op het vat. Voeg 5–9 lagen boven de basislaag toe om voldoende volume te bieden voor het plaatsen van de inlaat- en uitlaatnaalden. Voor het G-code-ontwerp zijn de volgende details belangrijk:
    1. Stel de printkop en het printbed, indien temperatuurregeling beschikbaar is, in op 37°C met behulp van de printersoftware of geschikte G-code-commando's aan het begin van het printbestand.
    2. Specificeer de printkop of extruder in de G-code wanneer meerdere printkoppen beschikbaar zijn. Configureer de G-code om absolute coördinaten en extrusieafstanden te gebruiken.
    3. Pas de laagdikte aan op basis van de grootte en vorm van de naald, de inktstroomdruk en de snelheid van de printkop. Gebruik voor de hier beschreven voorbeelden een laagdikte van 200µm voor elke reservoirlaag boven de eerste laag.
    4. Gebruik een tegendruk van 14–17psi en een printkopsnelheid van 6mm/s (G-code: F360) voor de reservoirs. Verhoog de printkopsnelheid naar 15mm/s (G-code: F900) voor het vat.
  8. Test elk nieuw vatontwerp op een glazen objectglas zonder kamer voordat het definitieve vat wordt geprint.

2. Bereid de offerinkt voor

  1. Voeg 2,1g polyethyleenoxide (PEO) toe aan 60mL koud steriel water om een 3,5% w/v oplossing te bereiden in een steriele afgesloten container met een steriele roerstang. Roer gedurende ten minste 48u bij 4°C en controleer periodiek of al het poeder is opgelost.
    OPMERKING: Bewaar de PEO-oplossing in een luchtdichte container bij 4°C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Voeg 17,5g Pluronic F-127 toe aan 50mL koud steriel water om een 35% oplossing te bereiden in een steriele afgesloten container met een steriele roerstang. Roer gedurende ten minste 48u bij 4°C en controleer periodiek of het poeder volledig is opgenomen.
  3. Combineer 11,4mL koude 3,5% PEO met 28,6mL koude 35% Pluronic F-127 in een steriele conische buis van 50mL. Meng gedurende ten minste 24u bij 4°C op een rotatiemixer.
  4. Plaats de buis rechtop bij 4°C gedurende de nacht om luchtbellen uit de oplossing te laten ontsnappen.
  5. Plaats de conische buis met de inkt in een waterbad en incubeer bij 63°C gedurende 3u. Laat de dop tijdens het verwarmen enigszins openstaan zodat uitzettende lucht kan ontsnappen.
  6. Haal de buis uit het waterbad en laat deze geleidelijk afkoelen tot kamertemperatuur. Draai de dop stevig vast nadat de oplossing is afgekoeld.
  7. Plaats de gepasteuriseerde inkt gedurende 2u op ijs, terwijl er af en toe voorzichtig wordt geschud zonder luchtbellen te introduceren.
  8. Verwijder de zuiger van de spuit, sluit de naaldpoort af en vul de spuit tot 60%–70% van de capaciteit. Plaats de zuiger, keer de spuit om, verwijder de dop van de naaldpoort en verwijder alle ingesloten lucht.
    OPMERKING: Bewaar gevulde spuiten bij kamertemperatuur gedurende maximaal 1 maand.

3. De Rose-kamer vervaardigen en de leidingen voorbereiden

  1. Vervaardig de bovenste en onderste klemplaten uit aluminium of print de platen in 3D met behulp van de meegeleverde CAD/STL-bestanden (Figuur 2). Voorzie de platen van een voldoende grote, afgeschuinde onderste poort voor toegang met een objectief met een hoge numerieke apertuur en een steunrand voor schroeven die de dekglasjes stevig tegen de pakking drukken.
    OPMERKING: Aluminium zorgt voor een betere warmteoverdracht tijdens microscopie op een verwarmde tafel. 3D-geprinte onderdelen van PLA of met koolstofvezel versterkte onderdelen zijn geschikt voor prototyping, maar kunnen een slechtere warmteoverdracht bieden en kunnen vervormen bij herhaaldelijk verhitten.
  2. Snijd de siliconenplaat op maat zodat deze overeenkomt met de klemplaten van 38mm × 51mm. Maak het centrale kijkvenster met een pons van 18mm.
  3. Boor gaten die geschikt zijn voor de gekozen schroefdiameter. Spoel de voltooide pakking uitgebreid met water om resten van siliconenafval te verwijderen.
  4. Autoclaveer de metalen klemplaten, schroeven, moeren en siliconen pakkingen in een gesloten zakje van aluminiumfolie met een droogcycle van 20min.
  5. Dompel 3D-geprinte platen 1min in 70% ethanol. Droog de platen in een steriel veld.
  6. Bereid slangstukken van 10–30cm voor, voorzien van Luer-lock connectoren en inline slangklemmen, geschikte slang voor peristaltische pompen, een driewegkraan, een pulsdemper en een mediumreservoir met twee poorten (Figuur 3).
  7. Steriliseer hittebestendige slang- en reservoircomponenten door middel van autoclavering. Steriliseer componenten die niet geautoclaveerd kunnen worden door blootstelling aan ethanol.

4. Bereid de reagentia voor de extracellulaire matrix voor

  1. Voeg 12,5mL warme PBS bij 37°C toe aan 1g menselijk plasmafibrinogeen om een voorraadoplossing van 80mg/mL te bereiden. Incubeer bij 37°C en agiteer af en toe voorzichtig zonder te vortexen.
  2. Laat het fibrinogeen 1–2u oplossen, waarbij een troebele oplossing ontstaat. Verdeel de oplossing in aliquoten in steriele buisjes en bewaar deze bij −20°C gedurende maximaal 3 maanden.
  3. Voeg 22,5g gelatine toe aan 135mL steriele PBS in een steriele fles met een magnetische roerstaaf. Roer 16u bij 70°C en agiteer de fles periodiek om volledige oplossingsvorming te garanderen.
  4. Stel de pH van de gelatineloplossing in op 7,5 met behulp van 1M NaOH. Filtreer de oplossing terwijl deze warm is via vacuümfiltratie, verdeel deze in aliquoten en bewaar bij 4°C gedurende maximaal 6 maanden.
    OPMERKING: Laat de gelatine minimaal 16u weken (blooming) voor filtratie. Houd de oplossing en de filtratieapparatuur tijdens de vacuümfiltratie op 37°C om verstopping van het filter te minimaliseren.
  5. Los menselijke plasmatrombine op in steriele PBS tot 1.000 U/mL. Meng voorzichtig, verdeel in aliquoten en bewaar bij −20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  6. Los 300mg transglutaminase op in 5 mL PBS en incubeer 1 u bij 37°C met af en toe mengen. Filtreer de oplossing steriel in een nieuw buisje en bewaar deze bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Bereid de transglutaminaseloplossing elke dag vers. Bewaar transglutaminase in poedervorm gedroogd bij 4°C.
  7. Los calciumchloride op in water om een 1M oplossing te bereiden. Filtreer de oplossing steriel en bewaar deze bij kamertemperatuur gedurende maximaal 1 jaar.

5. De dekglasjes voorbereiden en activeren

  1. Doop schone dekglasjes in ethanol en haal ze vervolgens voorzichtig door de vlam van een Bunsenbrander om de ethanol te laten verdampen.
    WAARSCHUWING: Ethanol is brandbaar. Houd bulkhoeveelheden ethanol uit de buurt van de open vlam en voer de vlamsterilisatie uit volgens de geldende laboratoriumprocedures voor brandveiligheid.
  2. Plaats de dekglasjes in een rek van roestvrij staal zonder het glas te doen barsten of splinteren.
  3. Dompel de dekglasjes 30–60 min bij kamertemperatuur onder in 0,5% (3-aminopropyl) trimethoxysilaan verdund in water. Pas tijdens de incubatie een zachte agitatie toe.
    WAARSCHUWING: Hanteer (3-aminopropyl) trimethoxysilaan met gebruikmaking van geschikte chemische beschermingsmiddelen en technische maatregelen.
  4. Was de dekglasjes door zes opeenvolgende spoelingen met water onder zachte agitatie. Voorkom dat de dekglasjes verschuiven tijdens het verplaatsen van het rek.
  5. Haal het rek uit het water, dep het overtollige water weg en droog het 30 min bij 50°C.
  6. Laat de dekglasjes afkoelen tot kamertemperatuur terwijl u 0,5% glutaraldehyde in PBS bereidt.
    WAARSCHUWING: Glutaraldehyde is toxisch en irriterend. Bereid en hanteer de oplossing in een geschikte chemische zuurkast terwijl u passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
  7. Incubeer de dekglasjes 60 min in 0,5% glutaraldehyde met zachte agitatie om beluchting te minimaliseren en een uniforme activering te bevorderen.
  8. Spoel de dekglasjes drie keer met steriel water en laat ze aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Bewaar geactiveerde dekglasjes onder vacuümdesiccatie gedurende maximaal 2 maanden.

6. Coat de dekglasjes met de basislaag van de extracellulaire matrix

  1. Warm 1× PBS, gelatin-stock en fibrinogeen-stock 30–60 min lang op tot 37°C.
  2. Bekleed een steriele Petrischaal van 15 cm met schone parafilm, bespuit het oppervlak met 70% ethanol, laat het teveel weglopen en laat het oppervlak aan de lucht drogen in een veiligheidskast.
  3. Voeg opeenvolgend 1,68 mL warme PBS, 2,5 mL gelatin-stock, 12,5 µL 1M CaCl₂, 625 µL fibrinogeen-stock en 167 µL transglutaminase-oplossing toe aan een conische buis van 15 mL.
  4. Plaats het ECM-mengsel gedurende 30 min in een waterbad van 37°C.
  5. Bereid voor elk dekglas één 1,7 mL buisje met 5 µL thrombin-stock.
  6. Voeg 400 µL van de ECM-preparatie toe aan het thrombin-buisje en meng door één keer te pipetteren, waarbij belvorming tot een minimum wordt beperkt.
  7. Dispenseer onmiddellijk 200 µL van het mengsel op de steriele parafilm en plaats met een pincet één geactiveerd dekglas op de druppel. Druk voorzichtig aan om volledige bedekking te verkrijgen.
    OPMERKING: Voltooi deze stap binnen ongeveer 20 s na het mengen van het ECM-mengsel met thrombin.
  8. Dek de Petrischaal af en incubeer de gecoate dekglazen 10 min bij kamertemperatuur, gevolgd door 2 u bij 37°C in een bevochtigde incubator.
  9. Pel elk dekglas voorzichtig van de parafilm door de parafilm van het dekglas af te buigen.
  10. Plaats de vers gecoate dekglazen met de gelzijde naar boven in een schone Petrischaal in een bevochtigde incubator en gebruik deze binnen 1 dag.
  11. Incubeer de gecoate dekglazen alternatief overnacht in een niet-bevochtigde incubator en gebruik deze binnen 2 dagen.

7. Bioprint de opofferingsinkt en inkapselen deze in ECM

  1. Voer testprints uit voordat u het vat print om te bevestigen dat de inkt en de printparameters de gewenste afmetingen van het vat opleveren. Laad het printbestand in de printersoftware.
    OPMERKING: Een taps toelopende doseernaald van 32 G met de 25% Pluronic F127/1% PEO-inkt produceert onder de hier beschreven omstandigheden betrouwbaar vatafmetingen tot ongeveer 150µm. Optimaliseer de snelheid van de printkop en de tegendruk met behulp van eenvoudige lijnprints op glas.
  2. Assembleer de onderste klemplaat, het met ECM gecoate onderste dekglas, de siliconen afdichting, de bovenste klemplaat zonder bovenste dekglas en twee schroeven. Plaats de assemblage in een afgedekte Petrischaal van 100 mm en houd deze op 37 °C tot gebruik op dezelfde dag.
  3. Bevestig de printnaald aan de inktspuit en installeer de spuit in de pneumatische extrusieprinter. Warm het printplatform, de printkop en een aangrenzende warmteplaat voor tot 37 °C.
  4. Bereid de ECM-matrix voor zoals beschreven in sectie 6 en houd deze in een waterbad van 37 °C. Bereid 1,5 mL matrix per Rose-kamer voor in batches van 5 mL.
  5. Plaats 5 µL trombine-stockoplossing in een steriele buis van 1,7 of 2 mL voor elke kamer. Houd extra geactiveerde, ongecoate dekglazen beschikbaar in de veiligheidskabinet.
  6. Plaats de kamer met het ECM-gecoate dekglas op het printplatform en centreer deze op de XY-origine. Laat de naald zakken tot deze het ECM- of glasoppervlak in het centrum van het kamerraam raakt, en definieer deze positie als de XYZ-origine.
  7. Til de naald op en breng maximale druk toe om deze volledig met inkt te vullen en eventuele zichtbare luchtbellen te verwijderen. Veeg de naaldpunt af met een steriel laboratoriumdoekje.
  8. Print de geometrie van het vat en het reservoir met behulp van het geüploade G-codebestand. Til de naald onmiddellijk op en verwijder de kamer na het printen.
  9. Inspecteer het geprinte vat op luchtbellen en discontinuïteiten. Verwerp en print elke structuur die een van deze defecten bevat opnieuw.
  10. Plaats de kamer op de warmteplaat van 37 °C, verwijder de schroeven en de bovenste klemplaat, en meng 1 mL van de bereide ECM-matrix met de trombine-aliquot door één keer te pipetteren.
  11. Overbreng het geactiveerde ECM-mengsel in de vatkamer zonder luchtbellen te introduceren en plaats onmiddellijk een geactiveerd dekglas met de zijde naar beneden over het ECM. Plaats de bovenste klemplaat terug en draai de schroeven aan tot ze stevig vastzitten zonder ze overmatig aan te draaien.
  12. Plaats de voltooide kamer in een afgedekte Petrischaal van 100 mm en incubeer deze gedurende 2 u op 37 °C.

8. Genereer een aneurysma met behulp van een draadsjabloon

  1. Steek 21-gauge naalden door de tegenovergestelde zijden van de siliconen pakking en lijn deze uit.
  2. Sonicate een 304 roestvrijstalen medische mandrel-draad met een diameter van 0,0190 inch in PBS met 1% BSA in een conische buis van 15 mL. Verwijder de draad en laat deze aan de lucht drogen in een steriele Petrischaal in een veiligheidskast.
  3. Haal de met BSA gecoate draad door beide naalden in de pakking (Figuur 2). Buig één uitstekend uiteinde lichtjes om een latere rotatie te vergemakkelijken.
  4. Autoclaveer de assemblage van de pakking, naald, draad en klemplaat in een foliezakje.
  5. Plaats de naald/pakking-assemblage bovenop een geactiveerd, met ECM gecoat dekglas.
  6. Bevestig een 21 G naald aan een spuit met gepasteuriseerde Pluronic/PEO-inkt.
  7. Breng een kleine druppel opofferingsinkt aan op de zijkant van de draad in het midden van de kamer. Breng een kleine druppel inkt aan bij elke naald-draadverbinding om een afdichting te creëren.
  8. Bereid het ECM-mengsel voor en assembleer de kamer zoals beschreven in secties 7.10–7.12.
  9. Nadat het ECM is gegelled, wordt het gebogen uiteinde van de draad voorzichtig gedraaid om deze los te maken van het ECM en de opofferingsinkt. Trek de draad langzaam uit het apparaat.
  10. Vul de inlaatnaald met PBS met een 200 µL pipet en laat het PBS door het lumen weglopen. Herhaal dit eenmaal en ga verder naar sectie 9.

9. Spoel de offerinkt uit de vatenkamer

  1. Sluit de slang aan op een reservoir met koude (4 °C) PBS aangevuld met antibiotica, breng een driewegkraan aan en sluit de slang af met een mannelijke Luer-lockkoppeling en een steriele 23 G naald.
  2. Vul de toevoerslang met koude PBS met behulp van de spuit bij de kraan totdat de PBS uit de naaldopening stroomt. Klem de slang af.
  3. Vul een tweede stuk slang met PBS en sluit dit af met een 23 G naald. Klem de slang af en verwijder de vulspuit.
  4. Steek de toevoernaald door de pakking in het inlaatreservoir en de afvoer-naald in het uitlaatreservoir. Bevestig de juiste plaatsing met een omgekeerde microscoop of stereomicroscoop.
  5. Plaats de gehele opstelling bij 4 °C en positioneer het toevoerreservoir 30 cm boven de inlaat. Positioneer de uitlaat 5–10 cm onder de uitlaatnaald van het vat boven een afvalbak.
  6. Zet de klemmen open en spoel ten minste 250 mL koude PBS door de kamer. Controleer het systeem op lekken en bellen tijdens het spoelen.

10. Bekleed en voorbehandel het lumen van het vat met aanvullende ECM-componenten

  1. Verdun fibronectine tot 20 µg/mL, laminine tot 10 µg/mL, of basement membrane matrix tot een verdunning van 1:30 in 3 mL PBS.
  2. Voeg vers bereid transglutaminase toe aan het verdunde ECM-reagens.
  3. Laat de slang direct proximaal van het vat verbonden blijven met de inlaat en uitlaat.
  4. Injecteer de ECM/transglutaminase-oplossing langzaam door het vat met behulp van een spuit van 1 mL. Herhaal dit totdat alle 3 mL door het vat is gegaan.
  5. Klem de connectoren af, sluit de inlaat en uitlaat af met steriele Luer-doppen en incubeer bij 37 °C gedurende 1 u tot overnacht.
  6. Spoel het vat door met 100 mL compleet endotheliaal medium dat penicilline/streptomycine bevat. Klem de slangconnectoren af en sluit de uitlaten af.
    OPMERKING: Bewaar het met medium gevulde vat bij 4 °C gedurende maximaal 1 week. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het lumen achterblijven.

11. Cellulariseer het vat

  1. Incubeer de kamer die het ECM-vatmodel bevat gedurende 2 u bij 37 °C. Warm het complete endotheliale medium dat penicilline/streptomycine bevat op tot 37 °C.
  2. Trypsiniseer endotheliale cellen uit één kweekschaal van 10 cm of één T75-fles, en neutraliseer de trypsine met compleet medium. Breng de suspensie over naar een conische buis van 15 mL en neem een aliquot af voor het tellen van de cellen.
  3. Centrifugeer de cellen bij 1.000 × g gedurende 5 min. Resuspendeer de pellet om 150 µL celsuspensie voor te bereiden met een concentratie van 5 × 106 cellen/mL.
  4. Sluit de uitlaatslang aan op een steriel afvalreservoir en houd de slangclamp gesloten.
  5. Koppel de inlaatslang los en verwijder resterend medium uit de naaf van de inlaatnaald. Houd het vat verticaal en pipetteer de celsuspensie in de naaf van de naald.
  6. Open de uitlaatclamp om de celsuspensie het vat te laten binnengaan. Sluit de uitlaat opnieuw nadat de gehele suspensie het lumen is binnengegaan.
  7. Voeg warm, compleet medium toe aan de naaf van de inlaatnaald en sluit deze vervolgens af met een steriele Luer-dop. Koppel de uitlaat los en sluit deze af met een dop.
  8. Incubeer de kamer rechtopstaand gedurende 3 u bij 37 °C.
  9. Herhaal secties 11.5–11.8 en incubeer de kamer ondersteboven gedurende 3 u bij 37 °C.
  10. Spoel het vat voorzichtig door met 1 mL compleet medium en incubeer gedurende 3 u bij 37 °C.
  11. Bevestig de endotheliale hechting via microscopie, spoel resterende niet-gehechte cellen voorzichtig weg met vers medium en incubeer gedurende 12–24 u bij 37 °C.

12. Cultuur het vat onder stroming

  1. Warm 200 mL compleet medium gedurende 1 h op en ontgas dit onder vacuüm met behulp van een steriele filtereenheid. Warm het medium opnieuw op in een bevochtigde CO₂-incubator.
  2. Verbind in een steriele biosafety cabinet de uitlaat van het mediumreservoir en de driewegkraan, pompslangen, pulsdemper, optionele bellenvanger, inlaatslangen, vatkamer, uitlaatslangen en retourslangen opeenvolgend met het mediumreservoir (Figuur 3).
  3. Ontlucht het gehele stroomcircuit met medium en bevestig dat er geen bellen of luchtzakken achterblijven.
    OPMERKING: Vul de connectoren en naaldhouders met vloeistof vóór herverbinding. Luchtbellen die een gecellulariseerd vat binnendringen, kunnen leiden tot verlies van endotheelcellen door abrupte schuifkrachten.
  4. Plaats de assemblage in een incubator van 37 °C en start een stroomsnelheid van 1 dyn/cm2 in het vat. Handhaaf deze stroming gedurende 12 h.
  5. Verhoog de stroming tot 12–16 dyn/cm2 en handhaaf dit gedurende 18–24 h voordat de downstream assays worden uitgevoerd. Om de benodigde stroomsnelheid voor uw vat te berekenen, bepaalt u de geprinte vatlengte en de gemiddelde diameter. Gebruik een online calculator, voer de bepaalde parameters in en selecteer een cirkelvormige dwarsdoorsnede, medium met 10% serum en verwaarloosbare slangweerstand (de slang heeft een veel grotere diameter dan het geprinte vat).
    OPMERKING: Gebruik het vat zo snel mogelijk na de stroomconditionering. Cultuur langer dan 1 week kan resulteren in openingen tussen de endotheelcellen, mogelijk geassocieerd met celverlies of ECM-modificatie door endotheelproteasen.

13. Voer de vasculaire lek-assay uit

  1. Voeg Alexa 647-gelabeld BSA of 10 kDa Alexa 647 dextraan toe aan 35 mL compleet medium om een eindconcentratie van 5 mg/mL te verkrijgen. Warm de oplossing op tot 37 °C.
  2. Preincubeer het vat met het testagens, zoals 250 ng/mL TNFα, gedurende 1–2 u en voeg hetzelfde agens toe aan het assaymedium.
  3. Maak een waterbad van 37 °C klaar en positioneer de pomp nabij de microscoop. Start de microscoop, de acquisitiesoftware en het tafelverwarmingssysteem, en laat de tafel 30 min equilibreren op 37 °C vóór de beeldvorming.
  4. Stop de flow in de incubator, koppel het reservoir met cultuurmedium los en breng de kamer en de bijbehorende slang over naar de voorverwarmde microscooptafel.
  5. Verbind de pomp met ongeveer 20 cm slang voorzien van een glazen micropipet met ongelabeld medium. Steek de micropipetslang in het fluorescentie-reportermedium en plaats de uitlaatslang in een opvangsysteem.
  6. Stel de pomp in op een flowsnelheid van 0,2 mL/min, maar start de flow pas wanneer de beeldvorming gereed is.
  7. Focus op de middellijn van het vat met behulp van fasecontrastbeeldvorming en schakel over naar het 647-fluorescentiekanaal. Start de flow tegen de snelheid zoals vastgesteld in Sectie 13.6 en neem elke 1–5 min beelden op, afhankelijk van de verwachte responstijd.
  8. Genereer kymografen uit de verkregen beelden en pas een lineaire helling toe op de drempelwaarde-intensiteitswaarden. Rapporteer lekkage als de afstand in µm die de reporter per min aflegt vanaf het buitenste vatoppervlak.

14. Vloeistofstroom in kaart brengen

  1. Vortex de 10 µm fluorescente beads gedurende 1 min, en sonicize ze vervolgens in een badsonicator gedurende 1 min. Verdun de beads tot 1.8 × 105beads/mL in 10 mL compleet medium.
  2. Configureer het flowsysteem op de microscooptafel zoals beschreven in Sectie 13 voor de vascular leak assay. Voeg een opvangsysteem voor de uitstroom toe en stel de stroomsnelheid in op 0.2 mL/min.
  3. Focus op het centrale vlak van het vat met behulp van een objectief met een passende werkafstand. Neem beelden op met de maximaal haalbare frequentie die is toegestaan door de belichtingstijd, detectorsensitiviteit, excitatie-intensiteit en lichtopvang-efficiëntie.
  4. Analyseer de time-lapse beeldsequentie met software voor particle image velocimetry.

15. Fixeer en kleur het geendothelialiseerde vat immunohistorisch

  1. Bereid 40 mL 4% paraformaldehyde in PBS voor, bevattende 10 mM CaCl₂ en 10 mM MgCl₂.
    WAARSCHUWING: Paraformaldehyde is toxisch. Bereid en hanteer oplossingen die paraformaldehyde bevatten in een geschikte chemische zuurkast terwijl u passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
  2. Stop de doorstroming, klem de inlaatslang af, koppel deze los van de pomp en verbind deze met de zuigbuis die wordt gebruikt voor de vascular leak assay. Steek de zuigbuis in het fixatief en laat 35 mL door het vat stromen via zwaartekracht.
  3. Klem de slang af en incubeer het vat in fixatief bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  4. Spoel het vat via zwaartekracht met 25 mL permeabilisatiebuffer bevattende 0,4% Triton, 20 mM PIPES bij pH 6,1, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA en 5,5 mM glucose. Klem de slang af en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  5. Spoel het vat met blokkeringsbuffer bevattende 1% BSA, 0,05% Tween 20, 20 mM Tris bij pH 7,4, 140 mM NaCl en 5 mM KCl. Incubeer gedurende 2 u bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C.
  6. Verdun het geselecteerde primaire antilichaam 1:50–1:500 in 100–500 µL blokkeringsbuffer. Verwijder de inlaatslang en breng de antilichaamoplossing in volgens de procedure beschreven in Sectie 11 voor celzaaien.
  7. Incubeer het vat overnacht bij 4 °C.
  8. Sluit de inlaatslang opnieuw aan en spoel het vat met 20 mL PBS.
  9. Verdun de geschikte secundaire antilichamen 1:200–1:1.000 in blokkeringsbuffer en voeg, indien nodig, fluorescerende phalloïdine toe in een verhouding van 1:250. Breng de oplossing in volgens de procedure beschreven in Sectie 15.6 en incubeer gedurende 2 u bij kamertemperatuur.
  10. Spoel het vat met 40 mL PBS, sluit de slangklemmen en sluit de slang af met een dopje.
    OPMERKING: Bewaar het gekleurde vat bij 4 °C en maak beelden binnen 2 weken.
  11. Kleur F-actine met fluorescerende phalloïdine, het Golgi-apparaat met anti-GM130 en kernen met DAPI.
  12. Analyseer de phalloïdine-beelden met FibrilTool74 om de gemiddelde oriëntatie van F-actine stressfibers te bepalen.
  13. Bepaal de as tussen de massamiddelpunt van elke kern en het Golgi-apparaat. Analyseer en plot de resulterende oriëntaties in numerieke rekensoftware zoals eerder beschreven75.

Resultaten

Het gebruik van offerinkt voor het printen van diverse tubulaire weefsels is goed vastgesteld door verschillende groepen, in het bijzonder het Lewis-laboratorium, dat niertubuli samen met bloedvaten heeft gefabriceerd67,76Vergelijkbare benaderingen zijn gebruikt voor het printen van alveolaire structuren77 en gevasculariseerde tumoren78Hier werden deze benaderingen aangepast om vasculaire geometrieën te genereren voor het onderzoeken van endotheelresponsen onder fysiologische vloeistofstroom (Figuur 2). Vaatgeometrieën werden vanuit een vasculair beeld omgezet in een coördinaatkaart en vervolgens in G-code om het printpad te definiëren (Figuur 2A–C). De resulterende aanpak maakte de fabricage mogelijk van vaattemplates om te bestuderen hoe de endotheelfunctie en cytoskeletorganisatie worden beïnvloed door kronkelige vaten en aneurysma's (Figuur 2D–G). Er werd tevens een 3D-printbaar ontwerp van een Rose-kamer geïntegreerd om de noodzaak van toegang tot verspaningsdiensten weg te nemen (Figuur 2H). Een voorbeeld van een G-codebestand voor het printen van vaten is opgenomen in Aanvullend bestand 1, en de bijbehorende CAD-bestanden voor de Rose-kamer en de tafelbevestiging zijn beschikbaar in Aanvullend bestand 2 en Aanvullend bestand 3ownbeurtelingse. STL-gebaseerd printen kan meerdere passes van de printkop vereisen, wat resulteert in gevlochten vaatgeometrieën met gescheiden lumina (Aanvullende figuur 1). Het resulterende platform is ontworpen om toegankelijk te zijn voor vasculair celbiologen met minimale expertise in bio-engineering, terwijl het fysiologische druk- en stroomsnelheden ondersteunt en toegang biedt tot hogeresolutiemicroscopie (Figuur 2I).

Na de fabricage en cellularisatie van het vat werd het vatapparaat geïntegreerd in een gesloten perfusiesysteem om gecontroleerde circulatie van het medium mogelijk te maken (Figuur 3). Het systeem bestond uit een peristaltische pomp, een driewegkraan verbonden met een priming-spuit, een belletjesvanger, een pulsdemper, het vatapparaat en een mediumreservoir, sequentieel gerangschikt binnen het stroomcircuit (Figuur 3A). Deze configuratie maakte het mogelijk dat het medium continu circuleerde door het engineered vat, terwijl componenten voor het primen van het systeem, het verwijderen van bellen en het dempen van pulsaties gegenereerd door de peristaltische pomp waren opgenomen. Het geassembleerde systeem kon worden bediend met het vatapparaat gepositioneerd binnen de experimentele opstelling, zoals getoond in Figuur 3B, wat een praktische configuratie bood voor de daaropvolgende perfusie van gecellulariseerde vaten onder gecontroleerde stroomcondities.

Eén aanpassing aan de eerder beschreven methoden met offerinkt was de pasteurisatie van de inkt vóór het printen. Deze aanpassing was noodzakelijk omdat het toepassen van gepubliceerde protocollen voor de bereiding van de inkt leidde tot met schimmel besmette culturen. Net als andere Pluronic-gebaseerde inkten die voor deze toepassing worden gebruikt, blijft de 25% Pluronic F127/1% PEO-inkt vloeibaar bij lage temperaturen en gaat deze over in een compacte micellaire gel naarmate de temperatuur stijgt. Deze formulering heeft een overgangstemperatuur van 15°C, wat handig is voor het maken van structurele templates bij incubatortemperaturen en het verwijderen van de inkt bij 4°C. Vergelijkbaar met pure Pluronic vertoont dit materiaal ook aanzienlijke shear thinning bij de printtemperatuur (Figuur 4A). Echter, zelfs bij lage temperaturen is de inkt te viskeus voor filtersterilisatie met behulp van standaard weefselkweekfilters en vacuüm. Hoewel de inkt gesteriliseerd kan worden door pasteurisatie bij 70°C of hoger gedurende 20s, veranderen deze temperaturen de inkt onomkeerbaar en verminderen ze de viscositeit bij de printtemperatuur (gegevens niet getoond). Pasteurisatie bij een lagere temperatuur gedurende een langere periode (63°C gedurende >1 h) vermindert contaminatie door schimmels en andere micro-organismen zonder de complexe viscositeit van de inkt bij printgeschikte temperaturen te beïnvloeden. Rheologische karakterisering met een rheometer uitgerust met een 25 mm cone-and-plate geometrie toonde aan dat onbewerkte en gepasteuriseerde inkt vergelijkbare viscositeiten hadden over een reeks vervormingssnelheden bij printtemperaturen (Figuur 4B), wat aantoont dat pasteurisatie de printbaarheid niet in gevaar brengt. Gepasteuriseerde inkt maakt bovendien langdurigere vaatkweek mogelijk zonder de noodzaak van antimycotica, die de endotheelfunctie kunnen beïnvloeden.

Zodra het vat is gecellulariseerd, moeten confluente endotheelcellen het gehele vat bekleden, zoals weergegeven in Figuur 5, met de maximum-intensiteitsprojectie in Figuur 5A en de dwarsdoorsnede in Figuur 5B. De mediastroom kan vervolgens worden verhoogd naar fysiologische schuifspanningen, die voor nagenoeg cirkelvormige vaten kunnen worden geschat met behulp van de Hagen-Poiseuille-vergelijking79. In de praktijk kan de stroomsnelheid die nodig is om een gewenste schuifspanning te bereiken, worden geschat door rekening te houden met de viscositeit van het medium en de microfluïdische weerstand. In een typische 2D-cultuur in vitro zorgt een mediastroom bij 12 dyn/cm2 ervoor dat de meeste endotheelceltypen zich oriënteren langs de stroomas. Deze respons kan worden gevisualiseerd door fluorescente phalloïdine-kleuring van F-actine (Figuur 5D,E) of door analyse van de Golgi-nucleaire as (Figuur 5D,F), welke beide een anisotrope oriëntatie vertonen die consistent is met endotheelpolarisatie, zoals eerder beschreven18. Hoewel schuifspanningen boven de 40 dyn/cm2 in vivo voorkomen, zijn dergelijke condities hier niet gemodelleerd.

Een belangrijk gevolg van een gewijzigde vatgeometrie is een gewijzigde vloeistofstroom, waarop endotheelcellen reageren via verschillende signaleringsroutes80,81. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de bloedstroomsnelheid te monitoren, waaronder 4D Doppler-echografie82, 4D flow MRI83 en laser speckle imaging84. Hoewel deze technieken belangrijke in vivo voordelen bieden, kan het oplossen van lokale stroomverschillen over een enkel vat uitdagend zijn. De beeldvormingsmogelijkheid met een hoge numerieke apertuur van dit platform maakt directe fluorescentie-deeltjestracking mogelijk (Figuur 6B) en mapping met een hoge ruimtelijke resolutie van stroomanomalieën geïnduceerd door vatkromming met behulp van particle image velocimetry (Figuur 6C). Zo wordt bijvoorbeeld een tragere stroom waargenomen langs de binnenkromming van het vat dan langs de buitenkromming (Figuur 6C), wat kan bijdragen aan gewijzigde endotheelresponsen85.

Zodra een confluent vat is gevestigd, kunnen de openheid en de barrièrefunctie worden beoordeeld door fluorescent gelabelde macromoleculen, zoals dextranen of eiwitten, door het lumen te perfunderen. Open vaten bekleed met HUVECs weerstaan de passage van fluorescent gelabelde dextranen (Figuur 6D,F). In contrast hiermee verhoogt blootstelling aan barrière-verstorende stimuli, zoals TNFα, de lekkage van het vat (Figuur 6H, J). Lokale lekkagesnelheden kunnen worden gevisualiseerd met behulp van kymograafanalyse (Figuur 6E,G,I,K). Omdat de kymograaf de afstand op de X-as en de tijd op de Y-as weergeeft, kunnen relatieve lekkagesnelheden worden vergeleken door de hellingen van lijnen te kwantificeren die zijn aangepast aan gesegmenteerde fluorescentie-intensiteiten (Figuur 6E,G,I,K). Deze analyses maken het mogelijk om te evalueren hoe de lokale vatgeometrie de endotheliale barrièrefunctie beïnvloedt als reactie op gedefinieerde stimuli.

Een belangrijk voordeel van dit platform is de verbeterde microscopische toegankelijkheid in vergelijking met wat in vivo mogelijk is. Het systeem faciliteert daarnaast immunohistochemische analyse van de moleculaire organisatie van het endotheel, in het bijzonder het actine-cytoskelet. Endotheelcellen zijn zeer dun en worden in vivo omringd door gladde spiercellen, wat de lokalisatie van cytoskeletstructuren specifiek binnen het endotheel kan bemoeilijken. Dit platform maakt eenvoudige kleuring en beeldvorming van adhesiemoleculen en filamenteus actine in endotheelcellen mogelijk (Figuur 5) en ondersteunt multicomponent-analyses die in vivo moeilijk uit te voeren zijn, waaronder de beoordeling van endotheelpolarisatie en -deling onder fysiologische flow (Figuur 5D–F). Door deze assays op een enkel platform te combineren, is direct onderzoek mogelijk naar de relaties tussen vaatgeometrie, gewijzigde flow, barrièrefunctie, moleculaire organisatie van het endotheel en intercellulaire adhesie.

figure-results-1
Figuur 1: Workflow voor het printen en gebruiken van 3D-bloedvaten op een chip. Stroomdiagram van de protocollen voor het genereren en gebruiken van 3D-bloedvaten op een chip. Zwarte cirkels geven de overeenkomstige protocolnummers aan. De kleuren van de vakken geven de temperatuur aan waarop elk protocol wordt uitgevoerd of het monster wordt geïncubeerd. De workflow omvat modellering van de vatenvorm, bereiding van de inkt, bereiding van de extracellulaire matrix (ECM), voorbereiding van de kamer, printen van vaten, spoelen en coaten van vaten, cellularisatie, flowcultuur, functionele assays en histologische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Printen van vaten en ontwerp van de kamer. Vaten kunnen worden ontworpen op basis van in vivo vasculaire beelden om patiëntspecifieke vasculaire geometrieën te reproduceren. (A) Klein coronair vat in beeld gebracht via contrast-versterkte computertomografie (CT), gereproduceerd met toestemming van Parekh et al.86 Schaalbalk = 2 mm. (B) Coördinaatkaart van referentiepunten van een deel van het vat getoond in paneel A, gegenereerd door puntenregistratie in FIJI. (C) G-code output gegenereerd vanuit de coördinaatkaart met behulp van printerbesturingssoftware. X-, Y- en Z-coördinaten zijn rechtsonder aangegeven. (D) Schema van een Rose-kamer met een biogeprint vat. Het ontwerp met bovenste vleugelmoeren is compatibel met de 3D-geprinte polymelkzuur (PLA) kamer. (E) Rose-kamer met een vat en reservoirs geprint met opofferings-bio-inkt op een ECM-gecoate dekglasplaat. Schaalbalk = 9 mm. (F) Schema van een Rose-kamer geconfigureerd voor het aneurysmamodel. Een draad die door de inlaat- en uitlaatnaalden is geregen dient als vaatsjabloon, en opofferings-bio-inkt die op de draad is aangebracht dient als aneurysmasjabloon. (G) Rose-kamer met het draad- en opofferings-bio-inktsjabloon op een ECM-gecoate dekglasplaat. (H) 3D-geprinte PLA microscooptafeladapter (links) en Rose-kamer (rechts), die alternatieven bieden voor gefreesde aluminium componenten. Metalen klemmen op de tafeladapter zijn bevestigd aan de adapterplaat. Schaalbalk = 30 mm. (I) Geprint en gespoeld vat in een aluminium Rose-kamer gemonteerd op een microscooptafel met bevestigde inlaat- en uitlaatnaalden en slangetjes. Schaalbalk = 20 mm. Afkortingen: CT = computertomografie; ECM = extracellulaire matrix; PLA = polymelkzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Vloeistofstroomsysteem voor een gecellulariseerd vat in een Rose-kamer. (A) Schema van de slangconfiguratie die wordt gebruikt om een vloeistofstroom te vestigen door een Rose-kamer met een gecellulariseerd vat. De pijlen geven de stroomrichting aan. De genummerde componenten zijn (1) peristaltische pomp, (2) driewegkraan met primingspuit, (3) belvanger, (4) pulsdemper, (5) vat-apparaat en (6) mediumreservoir. Alle componenten die in contact komen met het kweekmedium worden voor gebruik gesteriliseerd. (B) Vloeistofstroomsysteem met een gecellulariseerd vat in een Rose-kamer in een weefselkweekincubator. De nummers komen overeen met de componenten die in paneel A worden getoond. Inlaat- en uitlaatnaalden zijn voor de stabiliteit met tape vastgezet. Schaalbalk = 40 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Reologische karakterisering van de opofferings-bio-inkt. (A) Afschuifviscositeit van ongepasteuriseerde 25% Pluronic F127/1% polyethyleenoxide (PEO) inkt als functie van de afschuifsnelheid bij 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C en 23 °C. (B) Complexe viscositeit als functie van de hoekfrequentie voor ongepasteuriseerde en gepasteuriseerde Pluronic F127/PEO inkt bij 25 °C en 37 °C. Afkorting: PEO = polyethyleenoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Beeldvorming en kwantitatieve analyse van gefixeerde en gekleurde endotheliale vaten. (A) Maximum-intensiteitsprojectie van spinning-disk confocale fluorescentiebeelden van een volledig gecellulariseerd vat na initiële seeding en cultuur onder lage schuifspanning (1 dyn/cm2). Het vat werd gekleurd voor VE-cadherin (groen), F-actine (rood) en DNA met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 µm. (B) Gereconstrueerde xz-dwarsdoorsnede van een z-stack van spinning-disk confocale fluorescentiebeelden van een volledig gecellulariseerd vat, gekleurd met fluorescerende phalloïdine om F-actine te labelen (rood). Schaalbalk = 50 µm. (C) Maximum-intensiteitsprojectie van een z-stack van spinning-disk confocale fluorescentiebeelden van een volledig gecellulariseerd vat na 24 u flow bij 12 dyn/cm2. F-actine werd gelabeld met fluorescerende phalloïdine (rood). Schaalbalk = 100 µm. (D) Spinning-disk confocaal fluorescentiebeeld van een vatregio na 24 u cultuur onder een schuifspanning van 16 dyn/cm2. Het vat werd gekleurd voor VE-cadherin (geel), F-actine (magenta), de Golgi-marker GM130 (groen) en DNA met DAPI (blauw). De pijl geeft de stroomrichting aan. Schaalbalk = 30 µm. (E) Representatieve kwantificering van de gemiddelde oriëntatie van stressfibers uit het F-actinekanaal in paneel D met behulp van FibrilTool74. Een raster van 45 regio's, elk met een oppervlakte van 1.600 µm2, werd geanalyseerd, en de gemiddelde fiberoriëntaties worden weergegeven als een radiaal histogram ten opzichte van de stroomrichting. (F) Representatieve kwantificering van de nucleus-Golgi-as uit paneel D als maat voor de polarisatie van endotheliale cellen. Vectoren van het centrum van elke nucleus naar het centrum van het overeenkomstige Golgi-apparaat zijn uitgezet als een radiaal histogram ten opzichte van de stroomrichting; n = 75 vectoren. Afkorting: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Analyse van vloeistofstroom en vasculaire lekkage. (A) Schema van de vatengeometrie die is gebruikt voor de analyses in panelen B–K. Letters geven de benaderde vaatregio's aan die overeenkomen met de respectievelijke panelen. (B) Kleurgecodeerde temporele projectie van een time-lapse spinning-disk confocale fluorescentiebeeldreeks die fluorescerende beads laat zien die onder stroming door een gebogen vaatregio bewegen. Kleur geeft het framenummer van 1 tot 100 aan; de buiten- en binnenbochten zijn aangegeven. (C) Particle image velocimetry (PIV)-analyse die de relatieve stroomsnelheid over de gebogen vaatregio laat zien. Kleuren representeren de relatieve snelheid en pijlen geven de stroomrichting en grootte aan. Schaalbalk = 50 µm. (D–G) Representatieve vasculaire barrière-assay van een onbehandeld vat geperfundeerd met Alexa 647-gelabeld 10 kDa dextran. (D,D′,D″) Beelden van een recht vaatgedeelte verkregen op respectievelijk 0, 70 en 150 min. De witte lijn geeft de regio aan die is gebruikt voor de kymograaf in paneel E. (E) Kymograaf van het rechte gedeelte in paneel D die een lekkagesnelheid van 0,39 µm/min laat zien, wat de helling van de stippellijn is. (F,F′,F″) Beelden van de gebogen vaatregio verkregen op 0, 70 en 150 min. De witte lijn geeft de regio aan die is gebruikt voor de kymograaf in paneel G. Schaalbalk = 150 µm. (G) Kymograaf van de gebogen regio in paneel F die een lekkagesnelheid van 1,01 µm/min laat zien, wat de helling van de stippellijn is. (H–K) Representatieve vasculaire barrière-assay na pre-incubatie met 250 ng/mL tumornecrosestactor alfa (TNFα). (H,H′,H″) Beelden van een recht vaatgedeelte verkregen op respectievelijk 0, 200 en 400 min. De witte lijn geeft de regio aan die is gebruikt voor de kymograaf in paneel I. Schaalbalk = 250 µm. (I) Kymograafanalyse van het rechte vaatgedeelte in paneel H laat een lekkagesnelheid van 2,1 µm/min zien, wat de helling van de stippellijn is. (J,J′,J″) Beelden van de gebogen vaatregio verkregen op 0, 200 en 400 min. De witte lijn geeft de regio aan die is gebruikt voor de kymograaf in paneel K. Schaalbalk = 250 µm. (K) Kymograafanalyse van de gebogen vaatregio in paneel J laat een lekkagesnelheid van 6,7 µm/min zien, wat de helling van de stippellijn is. Asterisken in panelen D–K identificeren de overeenkomstige uiteinden van de lijnen die zijn gebruikt om de kymografen te genereren. Afkortingen: PIV = particle image velocimetry; TNFα = tumornecrosestactor alfa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Printen van vaten met STL-gebaseerde printerprogrammering. (A) Differential interference contrast-afbeelding van een geprint vat gegenereerd met STL-gebaseerde printerprogrammering, waarbij de printerkop wordt aangestuurd om twee passes te maken, wat resulteert in een gevlochten vatstructuur. Schaalbalk = 250 µm. (B) 3D-rendering van het gespoelde gevlochten vat gevuld met Alexa 647-gelabeld bovien serumalbumine (BSA). Er is een opening zichtbaar tussen de lumina van de twee gevlochten strengen. Schaalbalk = 100 µm. Afkortingen: BSA = bovine serum albumin; STL = standard tessellation language. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: G-code voor het printen van het vat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: CAD-tekening van de Rose-kamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: CAD-tekening van de adapter voor de objecttafelbevestiging. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Er wordt een robuust systeem beschreven voor het modelleren van vasculaire geometrieën geassocieerd met verstoorde stroming, waaronder kronkelige vaten, aneurysma's en vertakkingspunten. De methode ondersteunt beeldvorming met hoge resolutie, stroommapping en beoordeling van de vasculaire barrièrefunctie binnen een platform dat toegankelijk is voor celbiologen met beperkte ervaring in bio-engineering. Hoewel de primaire aanpak een bioprinter vereist, variëren commercieel beschikbare extrusiegebaseerde printers van opensourcesystemen tot geavanceerdere platforms met meerdere printkoppen. Belangrijke printermogelijkheden omvatten controle over de temperatuur van de printkop en de inkt, nauwkeurige drukregeling en de temperatuur van het printbed. Naast biogeprinte kronkelige en vertakte vaten omvat de methode ook een aneurysmamodel dat zonder bioprinter kan worden gegenereerd. Samen faciliteren deze benaderingen het onderzoek naar de functie van endotheelcellen in kronkelige vaten met behulp van microscopiemethoden die gangbaar zijn in celbiologische laboratoria.

Er zijn talrijke in vitro modelsystemen beschikbaar voor het bestuderen van de vasculaire functie87,88, elk met eigen sterktes en beperkingen. Het hier beschreven systeem, aangepast op basis van eerder werk54,67,69, is bijzonder geschikt voor het onderzoeken van de effecten van vasculaire tortuositeit op de endotheliale functie, omdat het directe modellering van patiënt-afgeleide vaatgeometrieën en systematische variatie van de vasculaire kromming binnen één enkel apparaat mogelijk maakt. Andere benaderingen hebben coronaire vaten van patiënten gemodelleerd met behulp van fotopolymeerbare gelatine-methacrylaat om geschaalde vaatstructuren onder fysiologische stroming te genereren60. Dergelijke systemen bieden nauwkeurige vaatmodellering, stromingsanalyse en de mogelijkheid om tunica media-lagen te integreren. Echter, hun totale omvang en de vereisten voor glazen ondersteuning kunnen beeldvorming met een hoge resolutie en gelokaliseerde lektesten beperken. Omgekeerd maken kleinere systemen, gebaseerd op de zelfassemblage van uit iPSC afgeleide endotheliale cellen, beeldvorming met een hoge resolutie mogelijk en kunnen ze zowel endotheliale cellen als vasculaire gladde spiercellen bevatten89. Deze modellen bieden echter minder controle over de vaatgeometrie, en het realiseren van hoge stromings- en schuifspanningen kan uitdagend zijn. Het huidige systeem vormt daarom een praktische tussenoplossing die een gedefinieerde vaatgeometrie combineert met hoge-resolutie beeldvorming van vasculaire tortuositeit.

Een belangrijk voordeel van dit platform is de mogelijkheid om vaten te genereren die zowel gebogen als rechte segmenten bevatten, waardoor een directe vergelijking van de lokale vatgeometrie binnen hetzelfde monster mogelijk is terwijl andere experimentele variabelen constant blijven, zoals getoond in Figuur 6. Een ander voordeel is de mogelijkheid om patiëntafgeleide vaatbeelden te gebruiken die zijn verkregen via angiografie of contrastversterkte CT. De belangrijkste beperking bij het reproduceren van patiëntvaten is de grootte. Vaten met een diameter kleiner dan 150µm zijn moeilijk reproduceerbaar te printen, terwijl vatesegmenten die zich over meerdere centimeters uitstrekken grotere montagekamers vereisen. Vatesegmenten moeten bovendien relatief plat blijven in de derde dimensie, zodat ze op de basismatrixlaag kunnen worden geprint en binnen de werkafstand van de objectieflens kunnen worden gehouden tijdens microscopische beeldvorming.

In toekomstig onderzoek kan het hier beschreven systeem verder worden aangepast om ziekten zoals atherosclerose te modelleren, waarbij de vaatgeometrie kan bijdragen aan de pathofysiologie. Genetisch gemodificeerde endotheelcellen of aanvullende celtypen, waaronder gladde spiercellen en immuuncellen, kunnen worden geïntegreerd om de fysiologische complexiteit te verhogen. Het incorporeren van gladde spiercellen onder de endotheellaag, zoals aangetoond in eenvoudigere systemen, zou aanvullend inzicht kunnen verschaffen in interacties tussen glad spierweefsel en endotheel bij vasculaire tortuositeit en ziekte90. Aanvullende modificaties zouden tumorcellen kunnen omvatten om intravasatie te onderzoeken68,91, en de invloed van tortuositeit op dit proces. Het platform zou ook kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe verstoorde stroming inflammatoire reacties beïnvloedt92,93 en potentieel bijdraagt aan vasculaire complicaties geassocieerd met infecties zoals COVID-1994. Gezien de brede betrokkenheid van de vasculatuur bij de menselijke gezondheid en ziekte, kunnen toegankelijke systemen zoals dit verdere onderzoek naar de endotheelfunctie in diverse ziektecontexten faciliteren.

Openbaarmakingen

De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de leden van het Jennifer Lewis-lab aan de Harvard University bedanken voor hun advies tijdens de vroege verkennende fase van dit werk, en de leden van het Waterman Lab voor hun feedback en advies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(3-Aminopropyl)trimethoxysilaan (APTMS), 97%Sigma-Aldrich281778Gebruikt voor silanisering en activering van glazen dekglasplaatjes vóór ECM-bevestiging.
1 mL steriele spuitFisher Scientific14-823-434Gebruikt voor het toedienen van reagentia, het coaten van vaten en vloeistofverwerking.
1x Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)Thermo Fisher ScientificJ61196.APGebruikt voor de bereiding van reagentia, het wassen en het doorspoelen van vaten.
10 mL steriele spuitFisher Scientific14-955-459Gebruikt voor de bereiding van reagentia en vloeistofoverdracht.
15 mL conische buizen met dopFisher Scientific05-538-59AGebruikt voor de bereiding van reagentia, celverwerking en opslag van oplossingen.
150 mm polystyreen PetrischaalFisher ScientificFB0875714Gebruikt als steriele werk- of incubatiecontainer.
21G naaldFisher Scientific14-817-227Gebruikt voor de bereiding van vaat-templates en toegang tot de kamer.
23G naaldFisher Scientific14-817-237Gebruikt voor inlaat- en uitlaatverbindingen van het vat tijdens het doorspoelen en perfusie.
27G heldere taps toedieningsnaaldNordson7018417Gebruikt voor extrusie van offerinkt en visualisatie van luchtbellen tijdens het printen.
3 mL steriele spuitFisher Scientific14-955-459Gebruikt voor vloeistofoverdracht en toediening van reagentia. Controleer het catalogusnummer, aangezien het verstrekte nummer ook wordt vermeld voor de 10 mL spuit.
304 roestvrijstalen medische mandrel-draad, 0,0190 inch diameterComponent SupplyGWX-0190-36Gebruikt als verwijderbaar template voor het rechte lumen in het draadgebaseerde aneurysmamodel.
50 mL conische buizen met dopFisher Scientific05-526BGebruikt voor bereiding, menging, pasteurisatie en opslag van reagentia.
Alexa 488 anti-muis secundair antilichaamThermo Fisher ScientificA32723TRFluorescerend secundair antilichaam gebruikt voor immunokleuring.
Alexa 555 anti-konijn secundair antilichaamThermo Fisher ScientificA-21428Fluorescerend secundair antilichaam gebruikt voor immunokleuring.
Alexa 647-gelabeld bovien serumalbumineThermo Fisher ScientificA34785Fluorescerende macromoleculaire tracer gebruikt voor assays voor vasculaire barrière/lekkage.
Alexa 647-gelabelde dextran, 10 kDaThermo Fisher ScientificD22914Fluorescerende tracer gebruikt om de endotheelbarrièrefunctie en vasculaire lekkage te beoordelen.
Alexa 647-phalloïdineThermo Fisher ScientificA22287Gebruikt om F-actine fluorescentie te labelen voor cytoskelet-imaging en oriëntatieanalyse.
Albumine, bovien serum, Fractie V, vetzuurvrijSigma-Aldrich126575-10GMGebruikt voor blokkeren en bereiding van eiwitbevattende oplossingen.
Antibioticum-antimycoticum, 100xThermo Fisher Scientific15240062Optionele antimicrobiële supplement voor ECM en cultuurmedium.
Anti-GM130 antilichaam, kloon 4A3Sigma-AldrichMABT1363Primair antilichaam gebruikt om het Golgi-apparaat te labelen voor analyse van de endotheelpolariteit.
Anti-VE-cadherine konijn monoklonaal antilichaam, D87F2Abcam65707Primair antilichaam gebruikt om endotheel cel-cel juncties te visualiseren.
CalciumchlorideSigma-AldrichC7902Gebruikt in ECM-bereiding en fixatiebuffers. Controleer of het beoogde reagens anhydrisch of gehydrateerd calciumchloride is.
Connector kitWorld Precision Instruments504954Luer-naar-slang connectoren gebruikt om het microfluïdische perfusiecircuit te assembleren.
Kleurrek voor dekglasplaatjesElectron Microscopy Sciences72240Gebruikt om dekglasplaatjes vast te houden tijdens het reinigen, silaniseren, activeren en wassen.
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-100GComponent van de permeabilisatiebuffer gebruikt tijdens immunokleuring.
DAPIThermo Fisher Scientific62248Fluorescerende kernkleuring gebruikt voor cel-imaging en polariteitsanalyse.
Digitale warmteplaatFisher Scientific11-475-028Gebruikt om de vatenkamer en reagentia op ongeveer 37 °C te houden tijdens assemblage.
EGTA tetranatriumzoutSigma-AldrichE8145-10GChelatingsmiddel gebruikt in de permeabilisatiebuffer.
Female barbed Luer connector voor 1/16 inch ID slangScientific Commodities Inc.BB330AGebruikt om slangen binnen het microfluïdische circuit te verbinden.
Female Luer met 1/16 inch ID barb, CrystalVu QCFisher Scientific01-000-123Gebruikt voor slang- en vatenkamerverbindingen.
FibrinogeenSigma-AldrichF8630ECM-component gebruikt met gelatine en trombine om de vaatondersteunende hydrogel te vormen. Controleer bron: manuscript beschrijft menselijk plasma-fibrinogeen, terwijl de verstrekte tabel bovien plasma vermeldt.
VloeistofpulsdemperDarwin MicrofluidicsSE-D1606-3NB-PC-31Gebruikt om pulserende fluctuaties gegenereerd door de peristaltische pomp te verminderen.
Hoogtemperatuur silicone rubberstrip voor voedingsindustrieMcMaster-Carr8417K51Gebruikt voor het vervaardigen van de pakking voor de Rose-kamer.
Gelatine uit varkenshuid, gelsterkte 300, Type ASigma-AldrichG2500Belangrijke ECM-component gebruikt om de hydrogel rond het vaatlumen te vormen.
Glazen dekglasplaatje, Nr. 1,5VWREN-MAS-25X25-1-5-CSSubstraat voor hoge-resolutie microscopie en kameroppervlak.
Glutaraldehyde, 25%Electron Microscopy Sciences16220Verdund voor activering van dekglasplaatjes vóór ECM-bevestiging.
Growth Kit-BBEATCCPCS-100-040Supplementkit gebruikt met vasculair celbasaal medium voor endotheelcelkweek.
Growth Kit-VEGFATCCPCS-100-041Endotheelgroeisupplement gebruikt met vasculair celbasaal medium indien vereist.
Menselijke plasma fibronectineSigma-AldrichFC010Optionele luminale ECM-coating gebruikt om endotheelhechting te bevorderen.
Inline slangkenmerSigma-AldrichZ503371-1PAKGebruikt om de stroom door slangen tijdens kamermanipulatie en incubatie te stoppen en te reguleren.
Ismatec Reglo digitale peristaltische pompMasterflex78018-12Gebruikt om gecontroleerde vloeistofstroom door gecelulariseerde vaten te genereren.
LaminineSigma-AldrichL2020-1MGOptionele luminale ECM-coating voor modificatie van endotheeladhesie en polarisatie.
Luer-naar-slang koppelaar assortimentsetWorld Precision Instruments504954Gebruikt om slangen, spuiten en inlaat-/uitlaatcomponenten van de kamer te verbinden. Duplicaat van het catalogusnummer van de connector-kit; behoud één vermelding indien identiek.
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-AldrichM2393-100GComponent van fixatie- en permeabilisatiebuffers.
Male barbed slip Luer connector voor 1/16 inch ID slangScientific Commodities Inc.BB329AGebruikt voor microfluïdische slangverbindingen.
Male Luer fitting, 1/16 inch IDWorld Precision Instruments13160-100Gebruikt om slangen te verbinden met spuiten en kamercomponenten.
MatrigelSigma-AldrichCLS356234-1EAOptionele luminale ECM-coating gebruikt voor endotheelhechting.
Doppen voor mediumflessenFisher Scientific05-719-310Twee-poorts doppen gebruikt om steriele cultuurmediumreservoirs voor het stroomcircuit te construeren.
Nalgene Pharma-Grade silicone slang, 1/16 inch IDThermo Fisher Scientific8600-0020Flexibele slang gebruikt in de microfluïdische perfusie- en spoelcircuits.
ParafilmElectron Microscopy Sciences70990-125Gebruikt als niet-adhesief oppervlak tijdens polymerisatie van ECM-coatings op dekglasplaatjes.
PBS, 10x, pH 7,4Thermo Fisher Scientific70011044Geconcentreerde buffer gebruikt voor het bereiden van werk-PBS-oplossingen.
Penicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122Antibioticasupplement gebruikt in endotheelcultuurmedium en spoeloplossingen.
PIPESSigma-AldrichP1851-25GBuffercomponent van de permeabilisatie-oplossing.
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Thermoresponsieve component van de offerinkt.
Polycarbonaat drieweg-stopkraan met male LuerFisher ScientificNC9593742Gebruikt voor het primen, schakelen en beheersen van vloeistofpaden in het perfusiecircuit.
Polyethyleenoxide (PEO)Sigma-Aldrich372781Polymeercomponent van de offerinktformulering.
RotatiemixerFisher Scientific88861050Gebruikt om PEO/Pluronic offerinkt te mengen bij 4 °C.
Kleur-schaalbak voor objectglazenMSE SuppliesDWK90020Gebruikt voor het wassen, kleuren of incuberen van dekglasplaatjes met reagentia.
Vierkant dekglas, Nr. 2, 25 mm x 25 mmSigma-AldrichCLS285525-1000EAKamerdekglas; dikker Nr. 2 glas biedt verhoogde breukweerstand en is compatibel met geschikte lucht- of waterobjectieven.
Roestvrijstalen stompe toedieningsnaald, 21 G, 1 inchComponent SupplyNE-212PLGebruikt voor vloeistoftoediening of constructie van het vaatmodel met draad-template.
Steriflip vacuümfiltereenhedenMilliporeSigmaSE1M179M6Gebruikt om warme gelatine en andere compatibele oplossingen steriel te filteren.
Steriele plastic 5 mL spuitenAlleviPSYR5-SGebruikt om offerinkt te laden voor pneumatische extrusieprinting.
Trombine, menselijk plasma, hoge activiteitSigma-Aldrich605195Gebruikt om fibrinpolymerisatie te initiëren tijdens ECM-gelvorming.
TransglutaminaseMoo Gloo1201Crosslinking-enzym gebruikt tijdens de bereiding en modificatie van de gelatine/fibrine ECM.
Triton X-100Sigma-Aldrich648466Detergens gebruikt voor permeabilisatie van endotheelcellen vóór immunokleuring.
TrypLE Express Enzyme, 1x, fenolroodThermo Fisher Scientific12605010Cel-dissociatiereagens gebruikt om endotheelcellen te oogsten vóór vaatzaaien.
Tween 20Sigma-Aldrich11332465001Detergenscomponent van de blokkeringsbuffer voor immunokleuring.
Vascular Cell Basal MediumATCCPCS-100-030Basaal medium gebruikt voor endotheelcelkweek en perfusie-experimenten.

Referenties

  1. Franken R, et al. Increased aortic tortuosity indicates a more severe aortic phenotype in adults with Marfan syndrome. Int J Cardiol. 2015;194:7-12.
  2. Morris SA, et al. Vertebral artery tortuosity in Turner syndrome: is tortuosity a component of the aortopathy phenotype J Cardiovasc Magn Reson. 2014;16(Suppl 1):P115.
  3. Morris SA. Arterial tortuosity in genetic arteriopathies. Curr Opin Cardiol. 2015;30(6):587-593.
  4. Ciurică S, et al. Arterial tortuosity. Hypertension. 2019;73(5):951-960.
  5. Penta R, Ambrosi D. The role of the microvascular tortuosity in tumor transport phenomena. J Theor Biol. 2015;364:80-97.
  6. Bullitt E, et al. Abnormal vessel tortuosity as a marker of treatment response of malignant gliomas: preliminary report. Technol Cancer Res Treat. 2004;3(6):577-584.
  7. Fattahi M, et al. Influence of parent vessel feature on the risk of internal carotid artery aneurysm rupture via computational method. Sci Rep. 2023;13(1):1-12.
  8. Kawsara A, et al. Management of coronary artery aneurysms. JACC Cardiovasc Interv. 2018;11(13):1211-1223.
  9. Sokhal BS, Ma Y, Rajagopalan S. Femoral artery aneurysms. Br J Hosp Med. 2022;83(12).
  10. Golledge J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nat Rev Cardiol. 2019;16(4):225-242.
  11. Toader C, et al. Cerebral aneurysm: filling the gap between pathophysiology and nanocarriers. Int J Mol Sci. 2024;25(22):11874.
  12. Wei F, et al. Arterial tortuosity: an imaging biomarker of childhood stroke pathogenesis Stroke. 2016;47(5):1265-1270.
  13. Moceri P, et al. Arterial tortuosity syndrome: early diagnosis and association with venous tortuosity. J Am Coll Cardiol. 2013;61(7):783.
  14. Zhang X, et al. The relationship between retinal vascular tortuosity and retinal vasculitis. J Ophthalmic Inflamm Infect. 2025;15:65.
  15. Cuhlmann S, et al. Disturbed blood flow induces RelA expression via c-Jun N-terminal kinase 1: a novel mode of NF-κB regulation that promotes arterial inflammation. Circ Res. 2011;108(8):950-959.
  16. Sunderland K, Jiang J, Zhao F. Disturbed flow's impact on cellular changes indicative of vascular aneurysm initiation, expansion, and rupture: a pathological and methodological review. J Cell Physiol. 2022;237(1):278-300.
  17. Luu V, et al. Role of endothelial primary cilia as fluid mechanosensors on vascular health. Atherosclerosis. 2018;275.
  18. Vion AC, et al. Endothelial cell orientation and polarity are controlled by shear stress and VEGF through distinct signaling pathways. Front Physiol. 2021;11:623769.
  19. Petzold T, et al. Focal adhesion kinase modulates activation of NF-kappaB by flow in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2009;297(4):C814-C822.
  20. Thodeti CK, et al. TRPV4 channels mediate cyclic strain-induced endothelial cell reorientation through integrin-to-integrin signaling. Circ Res. 2009;104(9):1123-1130.
  21. Beech DJ. PIEZO force sensing in vascular biology: an explosion of new knowledge, concepts and opportunity. Adv Sci (Weinh). 2025;12(41):e11774.
  22. Tamargo IA, et al. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023;20(11):738-753.
  23. Chiu JJ, Chien S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol Rev. 2011;91(1):327-387.
  24. Nakajima H, Mochizuki N. Flow pattern-dependent endothelial cell responses through transcriptional regulation. Cell Cycle. 2017;16(20):1893-1901.
  25. Zhao Y, et al. Small rodent models of atherosclerosis. Biomed Pharmacother. 2020;129:110426.
  26. Curry-Koski T, Curtin LP, Esfandiarei M, Thomas TC. Cerebral microvascular density, blood-brain barrier permeability, and support for neuroinflammation indicate early aging in a Marfan syndrome mouse model. Front Physiol. 2024;15:1457034.
  27. Thompson JW, et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurg Focus. 2019;47(1).
  28. Golledge J, Krishna SM, Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br J Pharmacol. 2022;179(5):792-810.
  29. Noval Rivas M, Arditi M. Kawasaki disease: pathophysiology and insights from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 2020;16(7):391-405.
  30. He L, et al. Endothelial shear stress signal transduction and atherogenesis: from mechanisms to therapeutics. Pharmacol Ther. 2022;235:108152.
  31. Wang X, et al. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675.
  32. Humphrey JD, Schwartz MA. Vascular mechanobiology: homeostasis, adaptation, and disease. Annu Rev Biomed Eng. 2021;23:1-27.
  33. Wang C, Lu H, Schwartz MA. A novel in vitro flow system for changing flow direction on endothelial cells. J Biomech. 2012;45(7):1212-1218.
  34. Sedlak J, Clyne A. Application of shear stress to endothelial cells using a parallel plate flow chamber. Methods Mol Biol. 2023;2600:81-90.
  35. Zhu J, et al. Advances in tissue engineering of vasculature through three-dimensional bioprinting. Dev Dyn. 2021;250(12):1717-1738.
  36. Kinstlinger IS, Miller JS. 3D-printed fluidic networks as vasculature for engineered tissue. Lab Chip. 2016;16(11):2025-2043.
  37. Werschler N, Quintard C, Nguyen S, Penninger J. Engineering next generation vascularized organoids. Atherosclerosis. 2024;398:118529.
  38. Shakeri A, et al. Engineering organ-on-a-chip systems for vascular diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(12):2241-2255.
  39. Xie X, et al. Customizable microfluidic origami liver-on-a-chip (oLOC). Adv Mater Technol. 2022;7(5):2100677.
  40. Kawakita S, et al. Organ-on-a-chip models of the blood-brain barrier: recent advances and future prospects. Small. 2022;18(39):e2201401.
  41. Bai H, Ingber DE. What can an organ-on-a-chip teach us about human lung pathophysiology Physiology. 2022;37(5).
  42. Seghir R, Arscott S. Extended PDMS stiffness range for flexible systems. Sens Actuators A Phys. 2015;230:33-39.
  43. Hasler J, et al. Development and characterization of a tunable PDMS substrate model for investigating elastic properties and mechanical stretching in intervertebral disc cells. JOR Spine. 2025;8(4):e70140.
  44. Uroz M, et al. Differential stiffness between brain vasculature and parenchyma promotes metastatic infiltration through vessel co-option. Nat Cell Biol. 2024;26(12):2144-2153.
  45. Wood JA, Liliensiek SJ, Russell P, Nealey PF, Murphy CJ. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 2010;3(3):1620-1639.
  46. Peloquin J, Huynh J, Williams RM, Reinhart-King CA. Indentation measurements of the subendothelial matrix in bovine carotid arteries. J Biomech. 2011;44(5):815-821.
  47. McQueen A, Warboys CM. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213.
  48. Hahn C, Orr AW, Sanders JM, Jhaveri KA, Schwartz MA. The subendothelial extracellular matrix modulates JNK activation by flow. Circ Res. 2009;104(8):995-1003.
  49. Xu Z, et al. Matrix stiffness, endothelial dysfunction and atherosclerosis. Mol Biol Rep. 2023;50(8):7027-7041.
  50. Lemarié CA, Tharaux PL, Lehoux S. Extracellular matrix alterations in hypertensive vascular remodeling. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(3):433-439.
  51. Huveneers S, Daemen MJAP, Hordijk PL. Between Rho(k) and a hard place: the relation between vessel wall stiffness, endothelial contractility, and cardiovascular disease. Circ Res. 2015;116(5):895-908.
  52. Stankey PP, et al. Embedding biomimetic vascular networks via coaxial sacrificial writing into functional tissue. Adv Mater. 2024;36(36):e2401528.
  53. Sundaram S, et al. Sacrificial capillary pumps to engineer multiscalar biological forms. Nature. 2024;636(8042):361-367.
  54. Kroll KT, et al. A perfusable, vascularized kidney organoid-on-chip model. Biofabrication. 2024;16(4).
  55. Strobel HA, Moss SM, Hoying JB. Vascularized tissue organoids. Bioengineering. 2023;10(2):124.
  56. Servais B, et al. Engineering brain-on-a-chip platforms. Nat Rev Bioeng. 2024;2(8):691-709.
  57. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):5168.
  58. Maharjan S, Cecen B, Zhang YS. 3D immunocompetent organ-on-a-chip models. Small Methods. 2020;4(9):2000235.
  59. Fang JS, et al. A microphysiological system HHT-on-a-chip platform recapitulates patient vascular lesions. Nat Commun. 2026.
  60. Catano JA, et al. A patient-specific 3D printed carotid artery model integrating vascular structure, flow, and endothelium responses. Adv Healthc Mater. 2026;15(4):e02478.
  61. Li Z, Hui J, Yang P, Mao H. Microfluidic organ-on-a-chip system for disease modeling and drug development. Biosensors. 2022;12(6):370.
  62. Leung CM, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2(1):33.
  63. Campisi M, et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  64. Miller JS, et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nat Mater. 2012;11(9):768-774.
  65. Kong Z, Wang X. Bioprinting technologies and bioinks for vascular model establishment. Int J Mol Sci. 2023;24(1):891.
  66. Kolesky DB, et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 2014;26(19):3124-3130.
  67. Lin NYC, et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(12):5399-5404.
  68. Park W, et al. 3D bioprinted multilayered cerebrovascular conduits to study cancer extravasation mechanism related with vascular geometry. Nat Commun. 2023;14(1):7696.
  69. Kolesky DB, Homan KA, Skylar-Scott MA, Lewis JA. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(12):3179-3184.
  70. Xiao Y, Liu Q, Han HC. Buckling reduces eNOS production and stimulates extracellular matrix remodeling in arteries in organ culture. Ann Biomed Eng. 2016;44(9):2840-2850.
  71. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 2009;12(3):267-274.
  72. Qiu Y, et al. Microvasculature-on-a-chip for the long-term study of endothelial barrier dysfunction and microvascular obstruction in disease. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):453-463.
  73. Rose GG, Pomerat CM, Shindler TO, Trunnell JB. A cellophane-strip technique for culturing tissue in multipurpose culture chambers. J Biophys Biochem Cytol. 1958;4(6):761-764.
  74. Boudaoud A, et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 2014;9(2):457-463.
  75. Fischer RS, et al. Contractility, focal adhesion orientation, and stress fiber orientation drive cancer cell polarity and migration along wavy ECM substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(22):e2021135118.
  76. Wolf KJ, et al. Perfusable 3D models of ureteric bud and collecting duct tubules. Cell Biomater. 2026;2(3):100297.
  77. Ren B, et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Appl Phys Rev. 2022;9(1).
  78. Hynes WF, et al. Examining metastatic behavior within 3D bioprinted vasculature for the validation of a 3D computational flow model. Sci Adv. 2020;6(35):eabb3308.
  79. Pisano A. From tubes and catheters to the basis of hemodynamics: viscosity and Hagen-Poiseuille equation. In: Physics for Anesthesiologists and Intensivists: From Daily Life to Clinical Practice. Springer; 2021:89-98.
  80. Gerhardt H, Betsholtz C. How do endothelial cells orientate EXS. 2005;(94):3-15.
  81. Baeyens N, et al. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. J Clin Invest. 2016;126(3):821-828.
  82. Lee J. Hemodynamics in Doppler ultrasonography. Ultrasonography. 2024;43(6):413.
  83. Kamada H, et al. Blood flow analysis with computational fluid dynamics and 4D-flow MRI for vascular diseases. J Cardiol. 2022;80(5):386-396.
  84. Postnov DD, Tuchin VV, Sosnovtseva O. Estimation of vessel diameter and blood flow dynamics from laser speckle images. Biomed Opt Express. 2016;7(7):2759.
  85. Dessalles CA, Leclech C, Castagnino A, Barakat AI. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 2021;4:764.
  86. Parekh P, Agrawal N, Vasavada A, Vinchurkar M. Extreme coronary artery tortuosity in association with tortuosity of the systemic arteries: a rare and challenging situation for the interventionist. BMJ Case Rep. 2014;2014:bcr2014204725.
  87. Vetter J, Palagi I, Waisman A, Blaeser A. Recent advances in blood-brain barrier-on-a-chip models. Acta Biomater. 2025;197:1-28.
  88. Liu Y, Lin L, Qiao L. Recent developments in organ-on-a-chip technology for cardiovascular disease research. Anal Bioanal Chem. 2023;415(18):3911-3925.
  89. Cuenca MV, et al. Engineered 3D vessel-on-chip using hiPSC-derived endothelial- and vascular smooth muscle cells. Stem Cell Reports. 2021;16(9):2159-2168.
  90. van Engeland NCA, et al. A biomimetic microfluidic model to study signalling between endothelial and vascular smooth muscle cells under hemodynamic conditions. Lab Chip. 2018;18(11):1607-1620.
  91. Sobrino A, et al. A tissue-engineered 3D microvessel model reveals the dynamics of mosaic vessel formation in breast cancer. Cancer Res. 2020;80(19).
  92. Riddle RB, Jennbacken K, Hansson KM, Harper MT. A multicellular vessel-on-a-chip model reveals context-dependent roles for platelets in inflammation and inflammatory hemostasis. Blood Vessels Thromb Hemost. 2024;1(2):100007.
  93. Rickman M, et al. Disturbed flow increases endothelial inflammation and permeability via a Frizzled-4-β-catenin-dependent pathway. J Cell Sci. 2023;136(6):jcs260449.
  94. Shevchuk O, et al. Vessel-on-a-chip: a powerful tool for investigating endothelial COVID-19 fingerprints. Cells. 2023;12(9):1297.

Herprints en machtigingen

Tags

3D-geprinte vatenvasculaire tortuositeitvaataneurysma'sorgan-on-a-chipvatpermeabiliteitfysiologische afschuifsnelheidlichtmicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.