Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Door peristaltiek geïnduceerde mechanische activatie van macrofagen

109 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72607

⸱

18 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de opstelling en bediening van een gepatenteerde bioreactor voor studies naar mechano-immunomodulatie. Hierin tonen we aan, met behulp van een op maat gemaakte bioreactor die fysiologische krachten reproduceert, dat macrofagen een duidelijk pro-inflammatoire respons vertonen op mechanische stimulatie.

Samenvatting

Ontsteking is een complex proces dat zowel acute als chronische ziekten aanstuurt. Het wordt gemoduleerd door cascades van biochemische en biofysische signalen die leiden tot activering van immuuncellen. Macrofagen zijn een primair immuunceltype dat betrokken is bij meerdere inflammatoire aandoeningen, waaronder kanker, fibrose en auto-immuunziekten. Traditionele methoden voor het onderzoeken van macrofaagactivering maken gebruik van biochemische stimulatie met gedefinieerde cytokine- of chemokine-signalen, waarbij macrofagen worden geactiveerd in de richting van een pro- of anti-inflammatoire status. Opkomend bewijs suggereert dat biofysische signalen, naast de biochemische signalen binnen weefsels, ook een rol spelen bij de activering van macrofagen. Eén zo'n veelvoorkomend mechanisch signaal is peristaltiek, bestaande uit multiaxiale rek en schuifspanning, die voorkomt in het maag-darmkanaal, de baarmoeder, ontwikkelende luchtwegen en de urineleiders. Hier testten we de hypothese dat peristaltiek macrofagen kan activeren. In dit protocol wordt het gebruik van een peristaltische bioreactor beschreven om de mechanische activering van macrofagen te onderzoeken. Polydimethylsiloxaan-membranen werden gecoat met fibronectine om de adhesie van macrofagen te verbeteren. Geïmmortaliseerde murine uit het beenmerg afgeleide macrofagen (iBMDM) werden gezaaid op fibronectine-gecoate membranen en gehouden als statische controles of gedurende 4 h blootgesteld aan peristaltiek. Peristaltiek activeerde de macrofagen, met significante verschillen in de genexpressie van Il6 (50,9 keer hoger dan statische controles; p < 0,0001, t-test) en Nos2 (19,8 keer hoger dan statische controles; p = 0,0046). Interessant genoeg werden er geen significante veranderingen waargenomen in Chil3 (1,22 keer hoger dan statische controles; p = 0,9726) of Mrc1 (1,16 keer hoger dan statische controles; p = 0,9810) vergeleken met statische controles, wat erop wijst dat mechanica primair pro-inflammatoire activering aanstuurden. De huidige bevindingen ondersteunen het concept van mechano-immunomodulatie van macrofagen, vooral in reactie op de mechanica van peristaltiek die veelvoorkomend zijn in veel weefsels op basis van glad spierweefsel.

Inleiding

Macrofagen zijn aangeboren immuuncellen die essentiële rollen spelen bij de gastheerdefensie, weefselremodellering en de regulatie van ontstekingen via fagocytose en cytokinesecretie1,2,3,4. Afhankelijk van stimuli binnen de in vivo micro-omgeving kunnen ongedifferentieerde macrofagen (M0) plastisch polariseren naar pro-inflammatoire (M1) of anti-inflammatoire/pro-regeneratieve (M2) fenotypes5,6. In vitro modellen worden doorgaans gebruikt om deze verschillende stimuli te isoleren, om de complexe mechanismen die macrofaagpolarisatie aansturen beter te begrijpen. Klassiek geactiveerde M1-macrofagen worden in vitro doorgaans geïnduceerd door biochemische stimuli zoals lipopolysacharide (LPS) en interferon gamma (IFN-γ), wat resulteert in een verhoogde expressie van inflammatoire mediatoren, waaronder induceerbaar stikstofoxidesynthase (iNOS), interleukine-6 (IL6) en tumornecrosefactor alfa (TNF-α)7,8. Alternatief geactiveerde M2-macrofagen worden gewoonlijk geïnduceerd door blootstelling aan interleukine-4 (IL-4) and interleukine-13 (IL-13), wat weefselremodellering en wondgenezingsreacties bevordert8,9. M2-macrofagen worden verder onderverdeeld in M2a-, M2b- en M2c-fenotypes op basis van verschillende activeringsroutes en expressieprofielen van oppervlaktemarkers10,1. Hoewel de biochemische regulatie van macrofaagpolarisatie uitgebreid is gekarakteriseerd in zowel in vivo als in vitro systemen, bevinden macrofagen zich in zeer dynamische micro-omgevingen die ook aanzienlijke biofysische stimuli bevatten12. Naast oplosbare cytokinen en chemokinen worden macrofagen blootgesteld aan de extracellulaire matrix en cel-celinteracties, substraatstijfheid, vloeistofschuifspanning, hydrostatische druk en cyclische weefeldeformatie12,13,14. Als mechanosensitieve cellen kunnen macrofagen hun inflammatoire fenotypes wijzigen als reactie op deze fysieke signalen, wat het belang van mechanobiologie bij immuunregulatie benadrukt.

Een groeiende hoeveelheid literatuur heeft aangetoond dat geïsoleerde mechanische stimuli in vitro de activatietoestanden van macrofagen significant kunnen beïnvloeden (Figuur 1). Blootstelling aan stijvere substraten verhoogde de M1-polarisatie en de productie van inflammatoire cytokinen in vergelijking met zachtere substraten, die een pro-regeneratief fenotype induceerden15,16,17,18,19,20. Op soortgelijke wijze moduleert vloeistofschuifspanning het macrofaagfenotype op een grootte-afhankelijke manier, waarbij lage niveaus van interstitiële vloeistofstroom vaak pro-regeneratieve activatie bevorderen21,2, terwijl hogere schuifspanningen, vergelijkbaar met waarden die in arteriën worden gezien, pro-inflammatoire responsen kunnen induceren23,24,25,26,27,28. In vitro modellen van cyclische rek, ontworpen om de mechanica van musculoskeletale, myocardiale, pulmonale en intestinale weefsels na te bootsen, hebben evenzo een verhoogde expressie van inflammatoire mediatoren aangetoond, hoewel de resultaten variëren afhankelijk van de grootte, duur, frequentie en dimensionaliteit van de uitgeoefende kracht29,30,31,32. Bovendien verschilt de mechanosensitiviteit van macrofagen per soort en celbron, wat het belang benadrukt van het selecteren van geschikte experimentele modellen voor mechanobiologische studies13,14.

Diagram van macrofaagactivatie; biochemische, biofysische stimuli; fenotypische veranderingen; stressfactoren.
Figuur 1Schema dat de in vitro biochemische en biofysische stimuli voor de activering van macrofagen tot respectievelijk pro-inflammatoire of pro-regeneratieve toestanden. Macrofagen kunnen worden gestimuleerd tot een proinflammatoire toestand in vitro door de toevoeging van chemische stimuli, lipopolysaccharide (LPS), interferon γ (IFN-γ), of blootstelling aan mechanische stimuli, waaronder schuifspanning, verhoogde stijfheid, hoge cyclische en statische uniaxial stretch-geïnduceerde rek, compressie en multiaxial compressie-geïnduceerde rek. Macrofagen kunnen worden gestimuleerd naar een pro-regeneratieve staat door in vitro toevoeging van chemische stimuli, Interleukine-13 (IL-13) en IL-4. Ze kunnen ook pro-regeneratief worden wanneer ze worden blootgesteld aan mechanische stimuli in de vorm van oscillerende schuifspanning, interstitiële vloeistofstroom, zachte substraten of lage niveaus van uniaxiale cyclische rek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast het onafhankelijk onderzoeken van geïsoleerde mechanische stimuli, is het belangrijk om voort te bouwen op dit werk om de impact van samengestelde fysieke krachten te bestuderen, aangezien macrofagen in vivo vaak worden blootgesteld aan combinaties van gelijktijdige krachten. Peristaltiek is een voorbeeld van zo'n complexe mechanische omgeving, bestaande uit gelijktijdige multiaxiale cyclische rek en vloeistofschuifspanning die wordt gegenereerd door gladdespiercontractie3. Deze mechanische processen komen voor in meerdere organsystemen, waaronder het maag-darmkanaal, ontwikkelende luchtwegen, het vaatstelsel, de baarmoeder en de ureters34,35,36. Belangrijk is dat de peristaltische functie vaak ontregeld is bij inflammatoire ziekten, waaronder fibrose, inflammatoire darmziekten, kanker en aandoeningen met remodeling van de luchtwegen, waarbij alle deze processen gepaard gaan met aanzienlijke door macrofagen gemedieerde ontsteking3,37,38,39. Ondanks de erkende rol van macrofagen bij deze ziekten, blijft er een kritieke kennishia bestaan over hoe peristaltische mechanische krachten de activatie van macrofagen direct beïnvloeden.

Dit protocol beschrijft het gebruik van een peristaltisch bioreactorsysteem om de mechano-immunomodulatie van macrofagen te onderzoeken onder fysiologisch relevante mechanische omstandigheden. In vergelijking met conventionele statische cultuursystemen of platforms voor mechanische stimulatie met een enkele kracht, maakt deze methode de gelijktijdige toepassing van cyclische multiaxiale rek en vloeistofschuifspanning mogelijk, waardoor de in vivo mechanische micro-omgeving van weefsels op basis van gladde spieren nauwkeuriger wordt nagebootst. In dit protocol vertoonden geïmmortaliseerde muizen-beenmerg-afgeleide macrofagen (iBMDMs), gekweekt in bioreactoren onder peristaltische omstandigheden, verhoogde markers voor M1-activatie, terwijl er geen trends naar M2-activatie werden waargenomen. Deze resultaten tonen aan dat peristaltische mechanica voldoende zijn om het inflammatoire gedrag van macrofagen te moduleren en ondersteunen het bredere concept van mechano-immunomodulatie in weefsels die worden blootgesteld aan dynamische krachten van gladde spieren. Deze methode is bijzonder toepasbaar voor onderzoekers die mechanobiologie, inflammatie, weefselengineering, gastro-intestinale fysiologie, pulmonale ontwikkeling, fibrose en andere ziekten bestuderen waarbij macrofagen worden blootgesteld aan complexe mechanische micro-omgevingen. Door zorgvuldige assemblage, consistente kalibratie en continue monitoring kunnen gebruikers zorgen voor reproduceerbare prestaties van de bioreactor en veelvoorkomende beperkingen van deze techniek vermijden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol beschrijft de assemblage en werking van een gepatenteerd40 bioreactorsysteem voor studies naar mechano-immunomodulatie. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Celkweek

  1. Kweek geïmmortaliseerde uit het murine beenmerg afgeleide macrofagen (iBMDMs) in compleet RPMI 1640 aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1% HEPES-buffer, 1% natiumpyruvaat en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C en 5% CO2.

2. Fabricage van polydimethylsiloxaan (PDMS)

  1. Weeg de basis en het uithardingsmiddel van de siliconen elastomer-kit af en meng deze in een verhouding van 10:1 (w/w).
  2. Roer het mengsel 5 min lang om een uniforme menging te garanderen.
  3. Giet de gemengde PDMS voorzichtig in een vierkante Petrischaal van 10 mm x 15 mm totdat de PDMS een hoogte van 3 mm bereikt.
  4. Plaats de Petrischalen met PDMS in een vacuümexsikkaator.
  5. Ontgas gedurende 1 h onder vacuüm om luchtbellen te verwijderen.
  6. Haal de PDMS uit de exsikkaator en controleer of er geen luchtbellen meer aanwezig zijn.
  7. Plaats de niet-uitgeharde PDMS-membranen in een voorverwarmde oven op 60 ˚ C en laat ze 4 h uitharden.
  8. Haal de PDMS-membranen uit de oven en laat ze overnight afkoelen op het aanrecht.
  9. Scheid na 18–24 h de uitgeharde PDMS-membranen voorzichtig van de Petrischalen en snijd deze op maat om PDMS-membranen van 70 mm x 40 mm x 3 mm te maken.

3. Sterilisatie van het PDMS-membraan

  1. Spoel de PDMS-membranen in een veiligheidskast voor biologische agentia af met 70% ethanol en plaats ze direct op het oppervlak van de veiligheidskast (BSC) (Aanvullende Figuur 1).
  2. Steriliseer gedurende 10 min met UV, breng vervolgens het PDMS-membraan over naar een niet-behandelde 90 mm kweekschaal voor weefselkweek, waarbij de UV-belichte zijde naar boven is gericht.
    OPMERKING: Zorg dat het PDMS aan de zijkanten wordt vastgepakt en breng de handen nooit boven het PDMS om het risico op contaminatie te verminderen.
  3. Gebruik voor peristaltiekexperimenten de PDMS-membranen in hun oorspronkelijke afmetingen.
  4. Snijd voor statische kweekcondities elk PDMS-membraan van 70 mm x 40 mm in twee gelijke helften van 35 mm x 40 mm.

4. Fibronectine-coating van PDMS-membranen

  1. Bereid in een BSC een voldoende volume steriele 0,5 mg/mL fibronectine-oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor om 100 µL per membraan toe te voegen.
  2. Breng 10 µL van deze coatingoplossing aan in het centrum van elk PDMS-membraan, waarbij u ervoor zorgt dat het gecoate gebied nauwkeurig samenvalt met het contactoppervlak van het membraan tussen het PDMS en de schroef.
    OPMERKING: Gebruik een pipetpunt om de oplossing voorzichtig uit te smeren tot een dunne, gelijkmatige laag.
  3. Laat de gecoate PDMS-membranen 45 min in de kweekschaal zonder deksel staan om adsorptie mogelijk te maken.
    OPMERKING: Houd het scherm van de BSC open om een continue luchtstroom te behouden.
  4. Zuig na 45 min de resterende fibronectine-oplossing van elk membraan af.
  5. Spoel de membranen voorzichtig met 1 mL steriele PBS.

5. Uitplaten van iBMDM-cellen op het PDMS-membraan

  1. Trypsiniseer de iBMDM-cellen die gekweekt zijn in een T25-fles bij een confluentie van 70%–80% om ze van het oppervlak los te maken.
  2. Bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer en bereid een celdichtheid van 100,0 cells/mL in medium voor.
  3. Zaai op elk met fibronectine gecoat PDMS-membraan 1 mL van de voorbereide celsuspensie uit.
  4. Zaai voor elk experiment ten minste één statisch membraan en één peristaltisch membraan uit om een parallelle vergelijking tussen de condities te waarborgen.
  5. Plaats de gezaaide PDMS-membranen gedurende ten minste 24 u in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 om celadhesie mogelijk te maken voor zowel de statische als de peristaltische condities (Aanvullende Figuur 1B).

6. Bioreactor

  1. Stel de bioreactor samen aan de hand van de computerondersteunde ontwerpbestanden (CAD) en specificaties die zijn beschreven in het bioreactorpatent (US1252795)40, of verkrijg een voormonteerde eenheid van de auteurs.

7. Assemblage en kalibratie van het Arduino-circuit

  1. Circuitconstructie
    1. Stel het regelcircuit samen op een breadboard met behulp van potentiometers, weerstanden, transistoren en geleidende bedrading, zoals getoond in Aanvullend Figuur 2.
    2. Installeer de Arduino IDE op de computer en open een nieuwe sketch.
    3. Stel de motorsnelheid in op 5 omwentelingen per minuut (RPM) en de peristaltische pomp op 28 mL/min.
    4. Sluit de Arduino-board aan op de computer via USB en upload de verstrekte code in Aanvullend bestand 1 via de Upload-knop in de IDE.
      OPMERKING: De LED van de Arduino wordt oranje tijdens het uploaden en keert terug naar groen zodra deze gereed is voor uitvoering. Nadat het uploaden is voltooid, zal de Arduino het programma automatisch uitvoeren zodra er spanning wordt aangelegd.
  2. Motorkalibratie
    1. Start de motor en tel gedurende 1 minuut de rotaties met behulp van een stopwatch.
      OPMERKING: Pas de parameters voor de motorsnelheid in de Arduino-code naar behoefte aan om 5 RPM te bereiken.
    2. Upload de code na elke aanpassing opnieuw totdat de gewenste snelheid is bereikt.
  3. Pomkkalibratie
    1. Laat de pomp 30 s draaien en meet de verzamelde massa om een stroomsnelheid van 28 mL/min te verifiëren (~14 g in 30 s)
    2. Stel de potentiometer bij en herhaal dit totdat de output over 30 s consistent nabij de 14 g ligt.
  4. Zodra zowel de motor als de pomp zijn gekalibreerd, koppelt u deze aan een bioreactoreenheid.
    OPMERKING: De gekalibreerde motor-pompsysteem-bioreactorassemblage is nu gereed voor experimenteel gebruik (Figuur 2).

Bioreactordiagram voor de opstelling van macrofaagculturen; beeldvorming en PCR-analyse voor de resultaten van de celstudie.
Figuur 2Schema van de assemblage van de peristaltische bioreactor en de daaropvolgende analyse. iBMDM-cellen worden gezaaid op een met fibronectine gecoate PDMS-membraan die zich in de bioreactor bevindt. Na een blootstelling van 4 uur aan peristaltiek, of handhaving als statische controles, worden de cellen geoogst voor verdere analyse, waaronder qPCR, immunofluorescentiekleuring en beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Assemblage en installatie van de peristaltische bioreactor

  1. Voorbereiding van componenten
    1. Verzamel alle benodigde componenten, waaronder een mediumfles, een mediumdop, een 3D-geprinte mediumflesdop, een 3D-geprinte bioreactortop, een 3D-geprinte bioreactorbodem, een 3D-geprinte schroefaandrijving, kabelbinders (drie per bioreactor), een waterpomptang, een zijkniptang, 150 mm weefselkweekschalen, siliconenvet en een 3D-geprinte motorsteun. Spray elk item met 70% ethanol voordat u het in de BSC plaatst.
    2. Plaats de DC-motor, de peristaltische pomp en een extra stuk pompslang in de BSC.
    3. Sluit het deksel van de BSC en schakel de UV-lamp 10 min in om alle componenten te steriliseren (Supplementary Figure 1C).
  2. Verificatie van celadhesie en viabiliteit
    1. Onderzoek zowel de gezaaide statische als de peristaltische PDMS-membranen onder de microscoop. Bevestig dat >80% van de cellen is gehecht aan de met fibronectine gecoate PDMS-oppervlakken en inspecteer de celmorfologie op viabiliteit.
    2. Maak indien nodig representatieve afbeeldingen van de cellen vóór de assemblage.
  3. Voorbereiding van statische controles
    1. Aspireer 1 mL compleet RPMI-medium uit elk statisch membraan.
    2. Voeg 1 mL vers compleet RPMI-medium toe aan elk membraan.
    3. Label de schalen als statisch en plaats ze terug in de incubator.
  4. Assemblage van de peristaltische bioreactor
    1. Voeg 15 mL medium toe aan elke mediumfles die voor gebruik in de bioreactor is bestemd.
    2. Bevestig de mediumdoppen, voorzien van de 3D-geprinte flesdoppen (met inlaat-/uitlaatpoorten), op de mediumflessen. Zet deze apart (Supplementary Figure 1D).
    3. Assembleer de basis van de bioreactor.
      1. Plaats de 3D-geprinte schroefaandrijving in de centrale houder van de bioreactorbodem.
      2. Plaats de DC-motor in de motorsleuf op de bioreactorbodem.
      3. Zorg ervoor dat de aandrijfassen van de motor stevig in het centrale gat van de 3D-geprinte schroefaandrijving passen.
      4. Schuif de motorhouder op zijn plaats om de motor te stabiliseren.
  5. Plaats de gedeeltelijk geassembleerde bioreactor in een 150 mm weefselkweekschaal om de overdracht van de BSC naar de incubator na assemblage te vergemakkelijken (Supplementary Figure 1E).
  6. Breng een dunne laag siliconenvet aan op de groeven van de schroefaandrijving waar het PDMS-membraan contact maakt met de schroefaandrijving. Dit zorgt ervoor dat de schroef gemakkelijk kan draaien, waardoor de wrijving wordt verminderd.
  7. Laden van het cel-gezaaide PDMS-membraan
    1. Breng de cel-gezaaide peristaltische PDMS-membranen voorzichtig over van de incubator naar de BSC.
    2. Aspireer het medium uit elk membraan en plaats het membraan in de bioreactor met het cel-gezaaide oppervlak naar boven, tegenover de vetgesmeerde interface van de schroefaandrijving.
    3. Positioneer de bioreactortop zodanig dat de inkeping van de celkamer is uitgelijnd met het PDMS-membraan. Schuif de top in de geleidergroeven van de bioreactorbodem.
  8. Vastzetten van de bioreactor
    1. Zet de bioreactortop en -bodem vast met kabelbinders en een zijkniptang.
    2. Knipt het overtollige deel van de kabelbinders af met de tang.
  9. Fluidische verbindingen en systeemopstelling
    1. Lijn de peristaltische pomp uit zodat de metalen connector in dezelfde richting wijst als de motorconnector.
    2. Verbind de pompslang die zich het dichtst bij de bioreactor bevindt met de inlaatpoort dichtst bij de motor op de bioreactortop. Duw de slang volledig over de inlaatnozzle.
    3. Dompel het tegenovergestelde uiteinde van deze slang onder in de mediumfles.
    4. Bevestig met het extra stuk pompslang één uiteinde aan de uitlaatnozzle van de bioreactortop en plaats het andere uiteinde in de mediumfles boven het mediumniveau om recirculatie zonder terugstroom mogelijk te maken (Supplementary Figure 1F).
  10. Incubatie en bediening
    1. Plaats de volledige bioreactorassemblage (in de 150 mm schaal) in de incubator (Supplementary Figure 1G) en houd de printplaat/Arduino buiten, aangesloten op de stroom.
    2. Sluit de krokodillenklemmen aan:
      1. Pomp: positief op positief, negatief op negatief.
      2. Motor: draai de polariteit om volgens het circuitschema.
    3. Plaats lege steriele Petrischalen in de incubator voor latere monstername.
    4. Laat het peristaltische bioreactorsysteem 4 u (of de gewenste tijdsduur) draaien (Supplementary Figure 1H) onder standaard kweekcondities in de incubator.

9. Demontage van de bioreactor

  1. Open de incubator en til de inlaatleiding uit de mediumfles om lucht in het systeem toe te laten en het resterende medium volledig uit de bioreactor te laten lopen.
  2. Zodra de mediastroom is gestopt, worden de motor- en/of pompleidingen van de printplaat losgekoppeld om de mechanische beweging te stoppen.
  3. Verplaats de volledige bioreactorassemblage naar de BSC, verwijder de leidingen, knip de kabelbinders door en til de bovenkant van de bioreactor eraf.
  4. Aspireer het resterende medium van het PDMS-membraan en breng het membraan terug in dezelfde petrischaal die tijdens de voorbereiding is gebruikt.
  5. Controleer de celhechting en levensvatbaarheid door de celmorfometrie onder een celcultuurmicroscoop te beoordelen, en ga vervolgens verder met de benodigde downstream-analyses.

10. Downstream-analyse

  1. qPCR-monstername
    1. Label in de BSC 1,5 mL microcentrifugebuisjes met monsteridentificaties, inclusief celtype en experimentele conditie.
    2. Verifieer met een celcultuurmicroscoop of er nog cellen op het PDMS aanwezig zijn, zowel voor de statische als de peristaltische condities.
    3. Aspireer het resterende medium van elk PDMS-membraan.
    4. Bereid vers RNA-lysebuffer voor door β‑mercaptoethanol toe te voegen aan Buffer RLT in een verhouding van 1:10.
    5. Voeg 370 µL Buffer RLT + β-mercaptoethanol toe aan elk PDMS-membraan om de cellen te lyseren.
    6. Schraap met een steriele celschraper stevig over het gebied van het PDMS waar cellen zijn gezaaid om alle cellen los te maken.
    7. Overbreng ~350 µL van het lysaat naar de betreffende 1,5 mL buis.
    8. Ga over tot RNA-extractie of bewaar de monsters bij -80 °C tot verder gebruik.
    9. Decontamineer de BSC.
      OPMERKING: Buffer RLT en β-mercaptoethanol moeten worden behandeld volgens hun respectievelijke SDS en worden afgevoerd in de juiste afvalcontainers.
  2. Immunofluorescentiekleuring
    1. Voeg 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan elk membraan en incubeer 20 min bij kamertemperatuur.
    2. Aspireer het PFA en voer dit af in de daarvoor bestemde container voor gevaarlijk afval.
    3. Voeg 1 mL PBS toe aan elk membraan om resterend fixatief te verwijderen.
    4. Zet voort met het immunofluorescentiekleuringsprotocol dat geschikt is voor de doelmarkers.

1. Reiniging van bioreactoren en bijbehorende componenten

  1. Spray alle bioreactorcomponenten die in contact komen met media, cellen of PDMS-membranen in met 70% ethanol, inclusief de inlaat- en uitlaatpoorten van de bioreactor.
  2. Aspireer alle resterende media uit de mediafles en spoel vervolgens het interieur door ruim 70% ethanol te sprayen en opnieuw te aspireren.
  3. Verwijder alle gesaneerde componenten uit de BSC en bewaar deze in een aangewezen schoon gebied.
  4. Voor mediaflessen:
    1. Reinig met 20% bleekmiddel, zwenk en gooi de inhoud in de gootsteen terwijl het water loopt.
    2. Schrob met 1:10 verdunde azijn en was met zeep en ultrapuur water, spoel vervolgens na met 70% ethanol en laat ondersteboven drogen.
    3. Reinig de mediadoppen en pompinserts met 70% ethanol.
  5. Reiniging van peristaltische pompen
    1. Zet 250 mL bekerglazen klaar met respectievelijk (1) 70% ethanol, (2) ultrapuur water of (3) een lege afvalcontainer.
    2. Sluit de pomp aan met slangjes in een gesloten stroompad en zet deze aan met behulp van de Arduino-bestuurde printplaat.
    3. laat de pomp 1 min lang draaien in 70% ethanol en vervolgens 1 min lang in ultrapuur water om door te spoelen naar het lege afvalbekerglas.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol was bedoeld om een reproduceerbare methode aan te tonen voor het bepalen hoe peristaltische mechanische krachten de activatie van macrofagen rechtstreeks moduleren. Voorafgaand aan de bioreactor-experimenten werd bevestigd dat iBMDMs correct polariseerden in reactie op standaard biochemische stimuleringscondities. Volgens dit protocol werden PDMS-membranen gecoat met fibronectine en gezaaid met iBMDMs. De cellen kregen 24 u de tijd om te hechten, waarna een visuele inspectie plaatsvond om succesvolle hechtin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De huidige kennis over hoe peristaltische krachten de functie van macrofagen beïnvloeden, blijft beperkt, ondanks de prevalentie van ontregelde peristaltiek bij inflammatoire ziekten. Hoewel bekend is dat individuele mechanische stimuli, zoals schuifspanning en cyclische rek, de activering van macrofagen moduleren, zijn de effecten van gelijktijdige multiaxiale rek en vloeistofstroom — die samen peristaltiek vormen — nog niet uitgebreid onderzocht in de context van de mechanobiologie van macrofagen. Het hier beschreven p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation onder subsidienummer 2440798. Figuur 1 en Figuur 2 zijn gemaakt met een gelicentieerde versie van BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,25% Trypsine-EDTAFisher25200056
1,5 mL microcentrifugebuisjesUSA Scientific1615-5510
Petrischalen van 100 mm x 15 mmFisher50-190-0276
150 mm kweekschalenFisherFB012925
4% paraformaldehydeSanta Cruzsc-281692
kweekschalen van 90 mmFisherFB012923
Alexa Fluor 488 Anti-F4/80 antilichaamAbcamab204266
Alexa Fluor 647 anti-CD40-antilichaamAbcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
BreadboardAmazon
Buffer RLTQiagen79216
CelscraperFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
ExsiccatorMilliporeSigmaZ119008
ZijkniptangAmazon
Foetaal runderserumInnovative Biosciences11-01-500
FibronectineMilliporeSigmaF1141-1MG
HEPES-bufferFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Motor RobotshopFT-SPARK16-360
PE Anti-Ym-1 + Ym-2 antilichaamAbcamab211621
Penicilline-streptomycineFisher15140122
Peristaltische pompDigiKey1150
Gefosfatteerde zoutbufferFisher14190250
PLA-filamentAmazonB0D7ZYCVTY
Potentiometer B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
SiliconenvetAmazonB000XBH9HI
CombinatietangAmazon
NatriumpyruvaatCytiva HycloneSH3023901
Sylgard 184 siliconen elastomer kitFisherNC9285739
T-25 kweekflesFisher229331
TransistorDigiKeyIRF520NPBF-ND
Bedrading/KrokodillenklemmenAmazon
Kabelbinders 18 inchAmazon
β-mercaptoethanolFisherAC125472500

Referenties

  1. Mass E, Nimmerjahn F, Kierdorf K, Schlitzer A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 2023;23(9):563-579.
  2. Kumar V, Kumar V. Macrophages: the potent immunoregulatory innate immune cells. In: Macrophage Activation - Biology and Disease. London: IntechOpen; 2019. doi:10.5772/intechopen.88013.
  3. Ross EA, Devitt A, Johnson JR. Macrophages: the good, the bad, and the gluttony. Front Immunol. 2021;12:708186.
  4. Sreejit G, Fleetwood AJ, Murphy AJ, Nagareddy PR. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 2020;9(12):e1222.
  5. Locati M, et al. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annu Rev Pathol. 2020;15:123-147.
  6. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958-969.
  7. Boutilier AJ, Elsawa SF. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6995.
  8. Orecchioni M, Ghosheh Y, Pramod AB, Ley K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) versus classically and M2 (LPS−) versus alternatively activated macrophages. Front Immunol. 2019;10:1084.
  9. Huang X, Li Y, Fu M, Xin HB. Polarizing macrophages in vitro. Methods Mol Biol. 2018;1784:119-126.
  10. Gharavi AT, et al. The role of macrophage subtypes and exosomes in immunomodulation. Cell Mol Biol Lett. 2022;27(1):83.
  11. Peng Y, et al. Regulatory mechanism of M1/M2 macrophage polarization in the development of autoimmune diseases. Mediators Inflamm. 2023;2023:8821610.
  12. Clevenger AJ, Jha A, Moore E, Raghavan SA. Manipulating immune activity of macrophages: a materials and mechanics perspective. Trends Biotechnol. 2025;43(1):33-49.
  13. Khanmohammadi M, Mirzaalikhan Y, Baratchi S. Immunity in motion: the role of mechanics in macrophage biology. Cell Chem Biol. 2025;32(12). doi:10.1016/j.chembiol.2025.11.004.
  14. Adams S, et al. Mechano-immunomodulation: mechanoresponsive changes in macrophage activity and polarization. Ann Biomed Eng. 2019;47(11):2213-2231.
  15. Meizlish ML, et al. Mechanosensing regulates tissue repair program in macrophages. Sci Adv. 2024;10(11):adk6906.
  16. Lee M, Du H, Winer DA, Clemente-Casares X, Tsai S. Mechanosensing in macrophages and dendritic cells in steady-state and disease. Front Cell Dev Biol. 2022;10:1044729.
  17. Chen M, et al. Substrate stiffness modulates bone marrow-derived macrophage polarization through NF-κB signaling pathway. Bioact Mater. 2020;5(4):880-890.
  18. Blakney AK, Swartzlander MD, Bryant SJ. The effects of substrate stiffness on the in vitro activation of macrophages and in vivo host response to poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J Biomed Mater Res A. 2012;100A(6):1375-1386.
  19. Sridharan R, Cavanagh B, Cameron AR, Kelly DJ, O'Brien FJ. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 2019;89:47-59.
  20. Previtera ML, Sengupta A. Substrate stiffness regulates proinflammatory mediator production through TLR4 activity in macrophages. PLoS One. 2015;10(12):e0145813.
  21. Song C, et al. Microfluidic three-dimensional biomimetic tumor model for studying breast cancer cell migration and invasion in the presence of interstitial flow. Chin Chem Lett. 2019;30(5):1038-1042.
  22. Li R, et al. Interstitial flow promotes macrophage polarization toward an M2 phenotype. Mol Biol Cell. 2018;29(16):1927-1940.
  23. Son H, et al. Shear stress induces monocyte/macrophage-mediated inflammation by upregulating cell-surface expression of heat shock proteins. Biomed Pharmacother. 2023;161:114566.
  24. Zhou H, Scatena M, Tu LN, Giachelli CM, Nigam V. Monocyte adhesion to and transmigration through endothelium following cardiopulmonary bypass shearing is mediated by IL-8 signaling. Front Cardiovasc Med. 2024;11:1454302.
  25. Jui E, et al. Shear stress induces a time-dependent inflammatory response in human monocyte-derived macrophages. Ann Biomed Eng. 2024;52(11):2690-2705.
  26. Castro-Núñez L, Dienava-Verdooold I, Herczenik E, Mertens K, Meijer AB. Shear stress is required for the endocytic uptake of the factor VIII-von Willebrand factor complex by macrophages. J Thromb Haemost. 2012;10(9):1929-1937.
  27. Cheng C, et al. Atherosclerotic lesion size and vulnerability are determined by patterns of fluid shear stress. Circulation. 2006;113(23):2744-2753.
  28. Seneviratne AN, et al. Low shear stress induces M1 macrophage polarization in murine thin-cap atherosclerotic plaques. J Mol Cell Cardiol. 2015;89(Pt B):168-172.
  29. Bonito V, de Kort BJ, Bouten CVC, Smits AIPM. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Eng Part A. 2019;25(17-18):1312-1325.
  30. Ballotta V, Driessen-Mol A, Bouten CVC, Baaijens FPT. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 2014;35(18):4919-4928.
  31. Dziki JL, et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Eng Part A. 2018;24(1-2):128-139.
  32. Wehner S, et al. Mechanical strain and TLR4 synergistically induce cell-specific inflammatory gene expression in intestinal smooth muscle cells and peritoneal macrophages. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;299(5):G1187-G1197.
  33. Clevenger AJ, et al. Rapid prototypable biomimetic peristalsis bioreactor capable of concurrent shear and multiaxial strain. Cells Tissues Organs. 2023;212(1):57-72.
  34. Huizinga JD. Gastrointestinal peristalsis: joint action of enteric nerves, smooth muscle, and interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech. 1999;47(4):239-247.
  35. Kunz G, Leyendecker G. Uterine peristaltic activity during the menstrual cycle: characterization, regulation, function and dysfunction. Reprod Biomed Online. 2002;4(Suppl 3):5-9.
  36. Hosseini G, et al. A computational model of ureteral peristalsis and an investigation into ureteral reflux. Biomed Eng Lett. 2018;8(1):91-101.
  37. Clevenger AJ, et al. Peristalsis-associated mechanotransduction drives malignant progression of colorectal cancer. Cell Mol Bioeng. 2023;16(4):315-330.
  38. Leyendecker G, Kunz G, Wildt L, Beil D, Deininger H. Uterine hyperperistalsis and dysperistalsis as dysfunctions of the mechanism of rapid sperm transport in patients with endometriosis and infertility. Hum Reprod. 1996;11(7):1542-1551.
  39. Iwakiri K, et al. Mechanisms underlying excessive esophageal acid exposure in patients with gastroesophageal reflux disease. Esophagus. 2017;14(3):213-218.
  40. Raghavan S, Crawford LZ. 3D rapid prototypable tunable peristalsis bioreactor. United States patent. 2022: US12522795.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

MacrofageactivatiePeristaltiekmechanicaImmuuncelactivatieBiofysische signalenPeristaltische bioreactorBeenmergmacrofagenFibronectinecoatingGenexpressieMechano-immunomodulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.