Methodenartikel

Het meten van het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken met behulp van de DR-white-assay in Drosophila melanogaster

58 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

14 augustus 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

In dit artikel

Samenvatting

De DR-white assay is een veelzijdige genetische reporter-assay voor het detecteren van de resultaten van het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken in het meercellige organisme Drosophila melanogaster.

Samenvatting

Traditionele studies naar het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB) zijn vaak beperkt tot biochemische onderzoeken of unicellulaire systemen (bijv. cellen, gist). Om studies naar DSB-herstel in een meercellig organisme te faciliteren, maken wij gebruik van de DR-white assay in Drosophila melanogaster. De DR-white assay is een eenvoudige maar veelzijdige reporterassay voor DSB-herstel die een enkele I-SceI-herkenningssequentie bevat, die kan worden gekliefd door expressie van het I-SceI meganuclease. Expressie van I-SceI kan constitutief worden geïnduceerd, via hittestress of onder andere promotoren, wat onderzoek naar weefsel- of ontwikkelingsspecifiek herstel mogelijk maakt. Een belangrijk voordeel van de assay is dat deze hersteluitkomsten kan onderscheiden die betrekking hebben op homologe recombinatie (HR), non-homologe eindverbinding (NHEJ) en single-strand annealing (SSA). Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de gevestigde DR-white assay, inclusief een stapsgewijze workflow voor het induceren van DSB's in de premeiotische kiemlijn en het fenotypisch analyseren van herstelgebeurtenissen door het scoren van nakomelingen. Daarnaast wordt de moleculaire analyse van herstelgebeurtenissen beschreven middels polymerasekettingreactie (PCR), sequencing en het Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE) R-script. Dit protocol biedt een nuttig instrument voor het onderzoeken van de genetische en moleculaire mechanismen van DNA-herstel in een organismisch model.

Inleiding

De genomische integriteit wordt vaak bedreigd door DNA-laesies, waaronder dubbelstrengse breuken (DSB's) bijzonder toxisch zijn. Indien deze breuken niet worden hersteld, kunnen ze leiden tot genetisch verlies, chromosomale herschikkingen en celdood1. Cellen hebben daarom meerdere paden ontwikkeld om DSB's te herstellen. Nonhomologe eindverbinding (NHEJ) ligatureert de twee uiteinden van de DSB direct, waarbij potentieel indels op de breukplaats worden geïntroduceerd; single-strand annealing (SSA) maakt gebruik van complementaire sequenties die de breukplaats flankeren voor herstel, wat resulteert in deleties op de breukplaats; terwijl homologe recombinatie (HR) een homologe sequentie als template voor herstel gebruikt2,3.

Historisch gezien waren studies naar DSB-herstel beperkt tot biochemische assays4 of enkelcel-systemen, zoals bacteriën5,6, gist7,8 en zoogdiercelculturen9,10. Hoewel deze modellen instrumenteel zijn geweest bij het identificeren van kernherstelproteïnen en hun mechanismen, missen ze de biologische complexiteit van een meercellig organisme. Drosophila melanogaster is een populair meercellig modelsysteem geworden voor het bestuderen van DNA-herstel. Veel huidige assays zijn echter toegesneden op specifieke herstelpaden11; maken gebruik van grote chromosomale aberraties, zoals P-element-excisie12; of vereisen tijdrovende moleculaire analyses13. De DR-white-assay pakt deze uitdagingen aan door een eenvoudige, genetische reporter van DNA-herstel in Drosophila te bieden14. Deze studie biedt een volledige, praktische en gedetailleerde stapsgewijze workflow voor het uitvoeren van genetische en moleculaire assays om DNA DSB-herstel te meten met behulp van de gevestigde DR-white-assay.

De assay maakt gebruik van twee directe herhalingen van het Drosophila white (w) gen, dat de wild-type rode oogkleur veroorzaakt (Figuur 1). Beide kopieën zijn niet-functioneel: de eerste, Sce.white, bevat een insertie met de herkenningssequentie voor het I-SceI meganuclease op een wild-type SacI-site en introduceert een prematuur stopcodon; de tweede, iwhite, is aan zowel het 5’- als het 3’-uiteinde getrunceerd en dient als template voor HR-herstel. Een Drosophila yellow transgeen (y+), dat de wild-type bruine lichaamskleur veroorzaakt, bevindt zich tussen de twee white-herhalingen. Aangezien de DR-white-cassette is geïntegreerd in een y w mutant-achtergrond, zijn DR-white-vliegen fenotypisch wild-type bruin van lichaam en mutant wit van oog.

DSB's kunnen worden geïnduceerd bij Sce.white door DR-white vliegen te kruisen met vliegen die een I-SceI transgen dragen. Herstel van DSB's in de premeiotische kiemlijn kan worden gemeten door het scoren van het nageslacht van een testerkruising. Herstel via NHEJ resulteert in het ouderlijke fenotype met een bruin lichaam en witte ogen (Figuur 1A), terwijl herstel via HR de wild-type white sequentie herstelt en resulteert in nageslacht met een bruin lichaam en rode ogen (Figuur 1B). SSA-herstel van de DSB of een mitotische crossover resulteert in het verlies van het tussenliggende yellow transgen, wat leidt tot vliegen met een geel lichaam en witte ogen (Figuur 1C). Om hersteluitkomsten in somatische cellen te analyseren, hebben we het Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) algoritme aangepast om specifiek NHEJ met processing en HR-herstel in de DR-white assay te detecteren15,16.

De DR-white assay biedt verschillende voordelen ten opzichte van eerder vastgestelde DNA-reparatieassays in Drosophila. Omdat breuken worden gegenereerd en gerepareerd in de kiemlijn, kunnen reparatie-uitkomsten eenvoudig worden gedetecteerd via fenotypische analyse. Tegelijkertijd is de assay uiterst veelzijdig. Hoewel de assay primair is ontworpen om HR-reparatie te meten, kan deze alle drie de reparatieroutes detecteren. We hebben daarnaast twee extra functionele reparatietemplates ontwikkeld (Figuur 2). Het iwhite.mu template bevat 28 stille enkelnucleotide-polymorfismen (SNP's) en produceert eveneens nakomelingen met rode ogen (Figuur 2A), wat studies naar de lengte van genconversietracten (GCT) en HR-reparatie tussen divergerende sequenties vergemakkelijkt14. Het iwhiteΔ9 template bevat een deletie van negen basenparen op de wild-type SacI-site en resulteert in nakomelingen met oranje ogen (Figuur 2B). Deze eigenschap stelt onderzoekers in staat om HR-reparatie vanuit verschillende templates te volgen, een kenmerk dat uniek is voor de DR-white assay15.

Protocol

1. DR-white assay

  1. Genetische kruisingen (Figuur 3A)
    OPMERKING: Raadpleeg voor standaardprotocollen voor de kweek en genetica van Drosophila "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" door Ralph J. Greenspan17. Informatie over het genotype van de stammen wordt verstrekt in de Table of Materials.
    1. Houd de vliegen bij 25 °C met licht-/donkercycli van 12 u op standaard Drosophila-voedsel, bestrooid met actieve gist.
    2. Stel vijf heat shock-vials op door 8–10 DR-white maagdelijke vrouwtjes te kruisen met 3–5 mannetjes die een I-SceI-transgen dragen (Kruising 1, Figuur 3A) per vial.
      OPMERKING: Afhankelijk van de toepassing kunnen verschillende I-SceI-transgenen worden gebruikt. In dit protocol werd het hsp70-I-SceI-transgen gebruikt voor heat shock-inductie11. Om lekke I-SceI-expressie in eerdere generaties te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat DR-white en I-SceI-transgenen alleen in deze generatie in dezelfde vlieg worden gecombineerd.
    3. Stel op dezelfde dag expansieflesjes op van een y w-stam. Dit zullen de testervliegen zijn. Drie expansieflesjes zijn voldoende voor ongeveer 60–80 testerkruisingen.
    4. Kweek de heat shock-vials en y w-expansieflesjes 3 dagen lang bij 25 °C.
    5. Verplaats op de derde dag de heat shock-vials en y w-expansieflesjes naar vers voedsel om als reserveset te dienen.
  2. Heat shock/DSB-inductie
    OPMERKING: Indien er geen gebruik wordt gemaakt van een heat-shock-induceerbaar I-SceI-transgen, ga dan direct naar stap 1.2.5, wat gewoonlijk 3 dagen na stap 1.1.5 gebeurt.
    1. Laat de heat shock-vials 3 u rijpen bij 25 °C om ervoor te zorgen dat alle nakomelingen de materno-zygotische transitie hebben doorlopen.
    2. Voer de heat shock uit op de oorspronkelijke vials in een waterbad van 38 °C gedurende 1 u. Zorg ervoor dat het waterniveau ten minste gelijk is aan de onderkant van het wattenpropje, zodat larven niet boven de waterlijn kruipen.
    3. Controleer elke 15 min de temperatuur van het waterbad en houd deze binnen 38 ± 0,5 °C, omdat de inductie- en herstelresultaten afhankelijk zijn van de duur en temperatuur van de heat shock.
    4. Plaats de vials terug bij 25 °C.
    5. Voeg de volgende dag 1/3 van een gevouwen laboratoriumdoekje toe aan het voedsel om overtollig vocht te absorberen. Als het voedsel droog is, voeg dan ongeveer 100 µL water toe aan het laboratoriumdoekje. Voeg een wattenpropje toe aan de y w-expansieflesjes.
    6. Kweek de heat-shocked vials nog 6 dagen bij 25 °C, of tot de vliegen beginnen uit te komen (eclosie).
    7. Maak de reservevials en expansieflesjes 3 dagen na het verplaatsen leeg. Voeg ongeveer 4 dagen na het leegmaken een wattenpropje toe aan de reserve y w-expansieflesjes.
      OPMERKING: Indien nodig kunnen reservevials worden onderworpen aan een heat shock zoals in stappen 1.2.1 tot en met 1.2.6 en worden verwerkt zoals hieronder beschreven.
  3. Testerkruisingen
    1. Verzamel de heat-shocked vliegen die de DR-white en I-SceI-transgenen dragen gedurende 4–5 dagen nadat de eclosie is begonnen, om bias door ontwikkelingsstadia te verminderen.
      OPMERKING: Succesvol heat-shocked vliegen die het DR-white en I-SceI-transgen dragen, vertonen mozaïekogen als gevolg van embryonale en larvale herstelevenissen die zich hebben ontwikkeld tot volwassen weefsels. De mate van mozaïekvorming correleert niet altijd met herstelevenissen in de kiemlijn en mag daarom geen bepalende factor zijn bij het selecteren van experimentele vliegen voor testerkruisingen (stap 1.3.3).
    2. Verzamel gedurende 5 dagen maagdelijke y w-vrouwtjes. Verzamel 5 maagdelijke vrouwtjes per verwacht aantal monsters. Verzamel uit de reserve-expansieflesjes zodra ze beginnen uit te komen.
    3. Stel testervials op door één heat-shocked mannetje te kruisen met 4–5 maagdelijke y w-vrouwtjes (Kruising 2; Figuur 3A). Selecteer de mannetjes willekeurig uit de gezamenlijke collectie van stap 1.3.1 om bias door ontwikkelingsstadia te verminderen. Kweek de testerkruisingen bij 25 °C.
      OPMERKING: Om overkruising van DR-white en I-SceI te voorkomen, worden meestal de mannelijke kiemlijnen geanalyseerd; vrouwelijke nakomelingen kunnen echter ook worden geanalyseerd. Bij analyse van vrouwelijke nakomelingen worden de Kruising 2 testervials opgesteld met een verhouding van 2:5 vrouwtje:y w mannetje en 5–6 dagen gekweekt (volgende stap) om de productiviteit te waarborgen.
    4. Controleer de productiviteit 4 dagen na het opstellen van de testervials om te bepalen wanneer ze leeggemaakt moeten worden.
      OPMERKING: Bevestig dat er voldoende eieren zijn gelegd om ten minste 20 scorebare nakomelingen te garanderen, maar laat de culturen niet overgroeien, anders kunnen de vliegen vast komen te zitten in het voedsel.
    5. Wanneer de testervials klaar zijn (tot 4–5 dagen nadat de testerkruisingen zijn opgezet), verwijder dan de vliegen en voeg 1/3 van een gevouwen laboratoriumdoekje toe aan het voedsel om overtollig vocht te absorberen.
      OPMERKING: Mannetjes kunnen op dit punt worden verzameld als verdere analyses (bijv. moleculaire genotypering) vereist zijn.
    6. Kweek de testervials nog 5–6 dagen bij 25 °C.
  4. Scoring
    OPMERKING: Voor elk genetisch experiment (bijv. homozygote mutanten en heterozygote controles) worden ongeveer 25 testervials per conditie opgezet. Elk genetisch experiment wordt 2–3 keer herhaald en de gegevens van individuele vials worden samengevoegd.
    1. Score de nakomelingen van Kruising 2 (Figuur 3A) gedurende ongeveer 9 dagen nadat de eerste vliegen zijn uitgekomen.
    2. Anestheseer de vliegen met CO2 of door de vliegen over te brengen naar een lege vial zonder voedsel en te bevriezen bij -20 °C gedurende ten minste 30 min.
      OPMERKING: Indien vliegen worden ingevroren, kunnen ze tot enkele dagen later worden gescoord.
    3. Plaats de vliegen op een vliegmatje en score op de juiste fenotypes (Figuur 3A). Neem alleen vials met ten minste 20 gescorede vliegen op in de dataset.
      1. Sorteer voor de scoring eerst de vliegen die de DR-white-cassette dragen (met gebruik van rood fluorescent eiwit-positieve [RFP+] fluorescentie als marker), en score vervolgens de oog- en lichaamskleur.
      2. Het y+-transgen gekoppeld aan de DR-white-cassette resulteert in een tussenliggende bruine lichaamskleur die niet volledig wild-type is. Om onderscheid te maken tussen No DSB/NHEJ (bruin lichaam; y+ w-) en SSA (geel lichaam; y- w-), vergelijk de vliegen met y w-nakomelingen die het DR-white-chromosoom niet hebben (RFP-). SSA-gebeurtenissen zullen dezelfde gele kleur hebben als deze vliegen. Score vliegen die donkerder (bruiner) zijn dan deze als No DSB/NHEJ.
        OPMERKING: Afwijkingen van de fenotypes beschreven in Figuur 3A  kunnen wijzen op contaminatie, en de vial moet dan niet worden gescoord. Hoewel intacte dode vliegen gescoord kunnen worden, moeten beschadigde vliegen worden weggegooid als de fenotypes niet kunnen worden vastgesteld.

2. TIDE-analyse (Figuur 4)

  1. Extractie van genomisch DNA (gDNA)18
    1. Verzamel hittestok-behandelde vliegen (of larven) die zowel het DR-white- als het I-SceI-transgeen dragen, zoals bij de nakomelingen van Kruising 1 (Figuur 3A).
    2. Plaats individuele vliegen in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en vries deze direct in (bijv. in een bad van droogijs/ethanol of vloeibare stikstof).
      WAARSCHUWING: Hanteer droogijs, vloeibare stikstof, ethanol, isopropanol en andere chemicaliën met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en institutionele veiligheidsprocedures.
      PAUSEERPUNT:  Monsters kunnen bij -80 °C worden bewaard en indien nodig later worden verwerkt. Gebruik bij de analyse van vliegen of larven één (1) vlieg of larve per monster. Pool bij de analyse van kleinere weefsels (bijv. hersenen, imaginale schijven) de monsters om de DNA-opbrengst te verhogen.
    3. Homogeniseer elk monster in 50 µL Buffer A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA]; 100 mM natriumchloride; 0,5% natriumdodecylsulfaat [SDS]) met een elektrische homogenisator.
    4. Incubeer de monsters in een waterbad bij 65 °C gedurende 30 min.
    5. Voeg 100 µL Buffer B (1,4 M kaliumacetaat, 4,3 M lithiumchloride) toe aan elk monster en meng kort door de buisjes om te keren.
      OPMERKING: Bij het gebruik van hele vliegen kunnen hogere volumes nodig zijn om de monsters volledig te homogeniseren. Indien dit het geval is, moet een volumetrische verhouding van 1:2 Buffer A:Buffer B worden aangehouden.
    6. Incubeer de monsters op ijs gedurende ten minste 30 min.
    7. Centrifugeer de monsters bij ongeveer 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
    8. Breng 125 µL van de heldere supernatant over in nieuwe microcentrifugebuisjes van 1,5 mL. Vermijd elk neerslag.
    9. Voeg per 125 µL supernatant 100 µL 100% isopropanol op kamertemperatuur toe en meng kort door de buisjes om te keren.
    10. Centrifugeer de monsters bij ongeveer 16.000 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    11. Aspireer de supernatant, waarbij u voorzichtig bent om het DNA-pellet niet te verstoren.
      OPMERKING: Het DNA-pellet is in dit stadium mogelijk niet zichtbaar. Noteer de oriëntatie van de buisjes bij het laden in de microcentrifuge en aspireer aan de tegenovergestelde zijde van waar het pellet wordt verwacht.
    12. Was de pellets met 250 µL ijskoud 70% ethanol en meng vervolgens kort door de buisjes voorzichtig om te keren.
    13. Centrifugeer de monsters bij ongeveer 16.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    14. Aspireer de supernatant, waarbij u voorzichtig bent om het pellet niet te verstoren.
      OPMERKING: Het pellet kan na de ethanolwas beter zichtbaar zijn. Indien niet, zie de Opmerking bij Stap 2.1.11.
    15. Laat de buisjes openstaan bij kamertemperatuur om het resterende ethanol te laten verdampen. Vermijd overdroging van het pellet, anders is volledige resuspensie mogelijk niet mogelijk.
    16. Voeg 20 µL nucleasevrij water toe en laat de pellets overnight resuspenderen bij 4 °C.
      PAUSEERPUNT: Als het DNA-pellet niet volledig is opgelost, kan er extra water worden toegevoegd.
    17. Keer de volgende dag de buisjes voorzichtig om en meet de DNA-concentratie. Bewaar monsters bij -20 °C als ze niet onmiddellijk worden verwerkt.
      OPMERKING: Voor extractie uit een enkele vlieg is de opbrengst doorgaans ongeveer 100 ng/µL. Monsters van hoge kwaliteit zijn belangrijk. Een A260/A280-absorbentie moet tussen 1,7 en 2,0 liggen. Waarden buiten dit bereik wijzen op contaminanten zoals eiwitten. A260/A230 moet tussen 2,0 en 2,2 liggen. Waarden buiten dit bereik wijzen op contaminanten zoals ethanol en buffersouten. Monsters met een lagere opbrengst en slechte kwaliteit kunnen leiden tot een gebrekkige PCR-amplificatie.
  2. Polymerasekettingreactie (PCR)
    1. Amplificeer over Sce.white via PCR met gebruik van 100 ng gDNA en de primers DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) en DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) volgens de instructies van de fabrikant. Voeg een controlemonster van een DR-white-vlieg toe (d.w.z. DR-white-ouderstok, zonder aanwezig I-SceI-transgeen). Gebruik de volgende cycluscondities: 94 °C gedurende 3 min; {94 °C gedurende 30 s; touchdown op 66 °C (-0,5 °C / cyclus) gedurende 30 s; 72 °C gedurende 30 s} x 16 cycli; {94 °C gedurende 30 s; 58 °C gedurende 30 s; 72 °C gedurende 30 s} x 20 cycli; 72 °C gedurende 5 min; vastgehouden op 12 °C.
      OPMERKING: Bij gebruik van een ander reagens moeten de cycluscondities mogelijk worden aangepast.
    2. Laad ongeveer 2 µL PCR-product op een diagnostische 1% tris-acetaat-EDTA (TAE)-agarosegel om de amplificatie van Sce.white te bevestigen. De verwachte amplicongrootte is ongeveer 1,7 kb.
    3. Zuiver de Sce.white-amplicons via PCR-zuivering en meet de DNA-concentratie.
    4. Sequence het gezuiverde PCR-product met behulp van primer DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      OPMERKING: Wij sequencen doorgaans 40 ng gezuiverd PCR-product, maar dit kan verschillen afhankelijk van de instructies van de sequencingdienst.
  3. TIDE-analyse
    OPMERKING: De meeste fouten als gevolg van het gebruik van het TIDE R-script zijn terug te voeren op een onjuiste code-opmaak.
    1. Download de vereiste R-pakketten (d.w.z. sangerseqR en Biostrings) van Bioconductor.org. Gebruik de zoekbalk om de nieuwste versie van elk pakket te vinden.
    2. Analyseer de sequence-chromatogrammen om te controleren of ze van goede kwaliteit zijn. Analyseer alleen chromatogrammen met weinig tot geen achtergrondruis voorafgaand aan de breekplaats.
    3. Download de sequence-tracebestanden (met .ab1-bestandsextensie) en plaats alle tracebestanden in één computermap. Vereenvoudig de namen van de sequence-bestanden zoveel mogelijk (bijv. F1, Het2, Hom3) om scriptaanpassingen in de volgende stappen te vergemakkelijken.
    4. Open het TIDE R-script (Supplement Bestand 1) in de RStudio integrated development environment (IDE; zie de Materialenlijst). Zoek in het Source-venster de regel die begint met Control <- (Supplement Bestand 2A) en voer de bestandsnaam van de controlesequens exact in zoals deze is opgeslagen, inclusief de .ab1-extensie, tussen aanhalingstekens.
      OPMERKING: De "controlesequens" is de sequens van de PCR uit de ouderlijke DR-white-stok zonder I-SceI-transgeen of inductie.
    5. Zoek de regel die begint met samplename <- c( en voer elke bestandsnaam van de monstersequens in tussen de haakjes (Supplement Bestand 2A). Voeg de .ab1-extensie toe, plaats elke bestandsnaam tussen afzonderlijke aanhalingstekens en scheid de bestandsnamen met komma's.
    6. Sla het bewerkte TIDE R-scriptbestand op in dezelfde map als de sequenses die geanalyseerd moeten worden. Houd de bestandsnaam eenvoudig om fouten in de volgende stappen te voorkomen.
    7. Navigeer in de IDE naar de TIDE-map met behulp van het Files-tabblad in het Output-venster (Supplement Bestand 2B).
    8. Klik op het More-uitklapmenu en selecteer Open New Terminal Here (Supplement Bestand 2C). Er wordt een nieuwe terminal geopend in het Console-venster (linksonder).
    9. Typ in de nieuw geopende Terminal “R” en druk op Enter (Supplement Bestand 2D).
    10. Zodra R in de terminal draait, voert u het TIDE R-script uit door source("TIDE_analysis.R") te typen en op Enter te drukken (Supplement Bestand 2E). De terminal voert het script uit en produceert een grafische weergave (Supplement Bestand 2F) en een .csv-bestand met de ruwe gegevens voor elk monster (Supplement Bestand 2G en Supplement Bestand 3). De outputbestanden worden opgeslagen in dezelfde map als het R-script en de sequence-bestanden.
      OPMERKING: Als hetzelfde R-script opnieuw wordt uitgevoerd, worden eventuele nieuwe .csv-bestanden over de oudere bestanden heen geschreven. Maak een kopie van de map als u meerdere analyses op dezelfde bestanden uitvoert.
    11. Analyseer de gegevens door elk .csv-bestand te openen.
      1. Interpreteer de ruwe gegevens als proporties indels in de monstersequens. Homologe recombinatie genconversie van de I-SceI-herkenningssequens naar de wild-type SacI-sequens produceert de canonieke deletie van 23 bp; het script rapporteert deze HR-waarde in een afzonderlijke rij onderaan de output (Supplement Bestand 2G). De 0-indel-waarde staat voor geen DSB of NHEJ zonder indels. Som alle andere indel-waarden op om NHEJ met processing te verkrijgen. De som van NHEJ met processing en HR is het totale aantal detecteerbare DSB-reparatiegebeurtenissen.
      2. Bereken de proporties van de reparatiepaden tussen de detecteerbare DSB-reparatiegebeurtenissen met behulp van de volgende vergelijkingen:
        Proportie NHEJ met processing = (NHEJ met processing) / (NHEJ met processing + HR)
        Proportie HR = (HR) / (NHEJ met processing + HR)
        OPMERKING: Voor elke conditie worden ongeveer 10–15 monsters gebruikt voor elk genetisch experiment (bijv. homozygote mutanten en heterozygote controles). Elk genetisch experiment wordt 2–3 keer herhaald en de individuele gegevens worden gepoold.

Resultaten

Drosophila Rad51-vereiste voor herstel via homologe recombinatie

Succesvolle kiemlijnexperimenten leveren de verwachte fenotypische klassen op zoals weergegeven in Figuur 3A en ten minste 20 scorebare nakomelingen per vial. Onverwachte fenotypes of minder dan 20 scorebare nakomelingen duiden op contaminatie of onvoldoende productiviteit en moeten worden uitgesloten zoals gespecificeerd in stap 1.4.3. Voor TIDE-analyse produceren succesvolle monsters een amplicon van ongeveer 1,7 kb en chromatogrammen met weinig achtergrondruis vóór de breeklocatie; DNA met een lage opbrengst of contaminatie en ruisende chromatogrammen zijn suboptimaal en mogen niet worden geanalyseerd.

Bij gebruik van de DR-white assay met een hittestok-induceerbare I-SceI-bron is de frequentie van HR-herstel in wild-type vliegen 38,5 ± 1,2% (gemiddelde ± SEM), terwijl SSA in ongeveer 3,2 ± 0,35% van de gevallen voorkomt (Figuur 3B en Aanvullend Bestand 4). Rad51 (gecodeerd door de homoloog spnA in Drosophila) is vereist voor de stap van strenginvasie bij homologe recombinatie14,19. Daarom zou het verlies van Rad51 moeten leiden tot een inefficiënt HR. Inderdaad, in een DmRad51-/- achtergrond is HR-herstel verminderd tot 1,3 ± 0,4%, met een gelijktijdige toename van SSA-herstel (34,5 ± 1,8%; Figuur 3B en Aanvullend Bestand 4)14. Dit is zeer waarschijnlijk te wijten aan herstelgebeurtenissen die bestemd waren voor homologe recombinatie, maar alternatief zijn hersteld door single-strand annealing van de white herhalingssequenties.

Drosophila CtIP-bijdrage aan efficiënte HR-reparatie in somatische weefsels

Het TIDE-algoritme maakt het mogelijk om de keuze van het herstelpad in somatische cellen te meten. In een niet-mutante achtergrond vindt NHEJ met processing plaats in 59,0% van de detecteerbare herstelgebeurtenissen, en HR vindt plaats in 41,0% (Figuur 4B en Aanvullend Bestand 4). CtIP speelt een belangrijke rol bij de initiatie van HR-herstel door DNA-uiteinde-resectie te bevorderen20. Overeenkomstig is in een DmCtIP-/- achtergrond de keuze voor het HR-pad in somatische cellen sterk verminderd, van 41,0% in heterozygote controles naar 10,9% in homozygote mutanten (Figuur 4B en Aanvullend Bestand 4)16. Dit suggereert dat CtIP in Drosophila bijdraagt aan, maar niet essentieel is voor HR-herstel.

DR-white assay-diagram dat de DNA-reparatiepaden toont; HR-, NHEJ- en SSA-methoden met Sce.white-genelementen.
Figuur 1DR-wwit DSB-reporterassay en reparatie-uitkomsten. De directe herhaling van wit de assay bevat twee niet-functionele kopieën van de wit gen: Sce.white (met een insertie van 23 bp die de I-SceI-herkenningsplaats bevat en een voortijdig stopcodon introduceert) en iwhite (5′- en 3′-getrunceerde donorsequentie). Kruisen van vliegen die DR- bevattenwit en een I-SceI transgeen produceert een site-specifieke DSB die fenotypisch of moleculair kan worden geanalyseerd. De resulterende fenotypen zijn (A) witogige nakomelingen (y+ w−), wat wijst op de afwezigheid van DSB, intersister HR of NHEJ; (B) roodgeoogde nakomelingen (y+ w+), wat wijst op intrachromosomale HR die het wildtype herstelt SacI sequentie van de iwhite donor; en (C) geelgelichaamde, witogige nakomelingen (y− w−), wat wijst op SSA of mitotische CO. Figuur aangepast naar Do et al.14. Afkortingen: CO = crossover; DR-wit = Direct Repeat van white; DSB = dubbelstrengs breuk; HR = homologe recombinatie; NHEJ = non-homologe end-joining; SSA = single-strand annealing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Diagram van genbewerking: homologe recombinatie, I-SceI-splitsing, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, SacI-plaatsen.
Figuur 2: Afgeleiden van de DR-wit analyse (A) De DR-wit.mu de assay bevat 28 stille SNP's in de iwhite.mu donorsequentie, wat resulteert in een sequentiedivergentie van 1,4% tussen de directe herhalingen. Genconversie van individuele polymorfismen varieert tussen HR-gebeurtenissen en kan worden bepaald door middel van sequencing. (B) DR-wit met de iwhiteΔ9 donor onderscheidt interhomologe van intrachromosomale recombinatie. HR vanuit de intrachromosomale iwhite donor herstelt het wildtype SacI sequentie en produceert nakomelingen met rode ogen. HR vanuit de interhomoloog iwhiteΔ9-donoren produceren nageslacht met oranje ogen omdat de deletie van 9 bp zorgt voor een afname van wit expressie. De figuur is aangepast naar Do et al.14 en Fernandez et al.15Afkortingen: DSB = dubbelstrengsbreuk; HR = homologe recombinatie; SNP = enkelnucleotidepolymorfisme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genherstelpaden van Drosophila, diagram van genetische kruisingen, analyse van staafdiagram van nakomelingenverdeling.
Figuur 3: Experimentele workflow voor het detecteren van DSB-reparatie-uitkomsten in de premeiotische kiemlijn. (A) Kruising 1 combineert de DR-wit reporter (of een derivaat daarvan) met een I-SceI transgeen (in dit voorbeeld op het tweede chromosoom). Nakomelingen die beide DR-wit assay en I-SceI transgene hersteldevenementen in hun kiemlijn en somatische weefsels. Om individuele hersteldevenementen in de premeiotische kiemlijn te analyseren, worden nakomelingen die beide transgenen dragen gekruist met y w testvliegen (Kruising 2), en de nakomelingen worden gescoord zoals beschreven in Figuur 1. (B) Individuele kiemlijn DSB-reparatiegebeurtenissen in wild-type vliegen (n = 106 kiemlijnen) en DmRad51 homozygoote mutanten (n = 46 kiemlijnen). **P < 0.01; ****P < 0,01 via twee-weg ANOVA, gevolgd door de multiple-comparisons-test van Sidak. Staven representeren gemiddelden; foutenbalken representeren de SEM. Gegevens zijn opnieuw geanalyseerd op basis van Do et al.14Afkortingen: ANOVA = analyse van variantie; CO = crossover; DSB = dubbelstrengsbreuk; HR = homologe recombinatie; NHEJ = non-homologe eindverbinding; SEM = standaardfout van het gemiddelde; SSA = single-strand annealing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genbewerkingsproces via Sanger-sequencing met TIDE-analyse; inclusief vergelijkingstabel van reparatiemethoden.
Figuur 4: Experimentele workflow voor het detecteren van DSB-reparatie-uitkomsten met behulp van Tracking of Indels by DEcomposition. (A) Vliegen die DR- dragenwit en een geïnduceerde I-SceI transgenen worden geanalyseerd door gDNA-extractie, PCR-amplificatie over de DSB-site, Sanger-sequencing en TIDE-analyse met het R-script.B) Representatieve gegevens van DmCtIP-/- mutanten (n = 23) en DmCtIP+/- heterozygoten controles (n = 31). Detecteerbare herstelgebeurtenissen worden berekend als HR plus NHEJ met processing, exclusief geen DSB/NHEJ zonder indels. ****P < 0,001 via tweewegs-ANOVA, gevolgd door de multiple-vergelijkingstest van Sidak. Staven representeren gemiddelden; foutenbalken representeren de SEM. Gegevens werden opnieuw geanalyseerd uit Thomas et al.16Afkortingen: ANOVA = variantieanalyse; DSB = dubbelstrengsbreuk; gDNA = genomisch DNA; HR = homologe recombinatie; NHEJ = non-homologe end-joining; PCR = polymerasekettenreactie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: TIDE R-script voor het identificeren van inserties en deleties in sequentiechromatogrammen ten opzichte van een controle zonder DSB. De door de gebruiker bewerkbare bestandsnaam van de controle, de bestandsnamen van de monsters en de I-SceI-doelsequentie zijn gemarkeerd aan het einde van het script. De vereiste inputs, outputbestanden en interpretatie worden beschreven in sectie 2.3. De pakketten sangerseqR en Biostrings zijn vereist.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Stapsgewijze screenshot-handleiding voor de TIDE R-script workflow. De panelen illustreren de softwareacties die worden beschreven in sectie 2.3.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Voorbeeld van TIDE-output en berekeningen van reparatie-events. De waarde 0-indel staat voor geen DSB of NHEJ zonder indels; de afzonderlijke HR-rij staat voor het canonieke deletieproduct van 23-bp; en alle overige indel-percentages worden opgeteld als NHEJ met processing. De totale detecteerbare reparatie wordt berekend als HR plus NHEJ met processing.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Ruwe gegevens ten grondslag aan Figuur 3B en Figuur 4B, georganiseerd in afzonderlijke bewerkbare werkbladen. Deze gegevens werden opnieuw geanalyseerd op basis van de eerder gepubliceerde studies die worden geciteerd in de bijbehorende figuurbijschriften.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De veelzijdigheid van het DR-white-systeem is een cruciale factor die bijdraagt aan de huidige en toekomstige impact binnen het veld van DNA-reparatie. Ten eerste stelt de attB-integratiesequentie binnen het DR-white-reporterconstruct onderzoekers in staat om de reporter op talrijke locaties binnen het Drosophila-genoom te richten21, waarbij er reeds verschillende getargete lijnen beschikbaar zijn22. Ten tweede biedt de beschikbaarheid van verschillende I-SceI-transgenen, zoals hitte-shockexpressie via de hsp70-promotor (deze studie), constitutieve expressie via de ubiquitine-promotor23, en premeiotische kiemlijnexpressie via de Bam-promotor24, talrijke ontwikkeling- en weefselspecifieke contexten om DSB-reparatie te onderzoeken. Ongeacht het gebruikte  I-SceI-transgeen moeten genetische kruisingen zorgvuldig worden gepland om te garanderen dat het I-SceI-transgeen pas in de laatste kruising wordt geïntroduceerd, zodat een correcte DSB-inductie gewaarborgd is. Het is belangrijk op te merken dat reparatiefrequenties aanzienlijk kunnen variëren afhankelijk van de genomische locatie van DR-white en/of het gebruikte I-SceI -transgeen. Toekomstige experimenten zouden genomische locaties en I-SceI-transgenen verder kunnen vergelijken om te bepalen of de genomische context of weefselspecificiteit de DSB-reparatie drijft.

Een specifiek voordeel van de DR-white assay en de derivaten daarvan is dat ze herstel van DSB's via homologe recombinatie, NHEJ met processing en, in de meeste gevallen, SSA kunnen identificeren. Hoewel het systeem is ontworpen om kiembaanherstelgebeurtenissen fenotypisch te detecteren, maakt het ook analyse van somatische weefsels mogelijk via TIDE-algoritmische analyse. Ondanks deze voordelen zijn er enkele beperkingen aan deze assay die in overweging moeten worden genomen. Opmerkelijk is dat de DR-white assay HR-frequenties kan onderschatten. Net als bij andere genetische reporterassays die gebruikmaken van nuclease-geïnduceerde DSB's, is herstel via HR vanuit een zustercromatide (intersister HR) niet te onderscheiden van een gebeurtenis zonder DSB of van NHEJ zonder processing. Hierdoor kan ten minste een deel van de No DSB/NHEJ-klasse bestaan uit HR-gebeurtenissen. Gezien deze beperking moeten resultaten die genetische factoren vergelijken (zoals mutante lijnen) met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Andere beperkingen van de assay omvatten het onvermogen om premeiotische gebeurtenissen te scoren die geen levensvatbare nakomelingen opleverden. Zo zullen DSB-gebeurtenissen die mogelijk niet zijn hersteld en tot celdood hebben geleid, niet worden gescoord in de nakomelingen. Hoewel de algehele fertiliteit een kwalitatieve maat voor celdood in de kiembaan kan zijn, kunnen celgebaseerde assays (zoals TUNEL) vereist zijn. Daarnaast biedt de TIDE R-scriptanalyse alleen de proportie detecteerbare gebeurtenissen in een celpopulatie. Om specifieke indel-sequentie-uitkomsten te bepalen, is sequenering van individuele herstelgebeurtenissen via multiplex DNA-sequenering nodig.

De DR-white assay heeft al een aanzienlijke impact gehad op het onderzoek naar DSB-reparatie. De toepassing ervan heeft factoren geïdentificeerd die bijdragen aan DSB-reparatie in meercellige organismen, waaronder leeftijd25, geslacht26, de locatie van de DSB22,26, de locatie van de donorsequentie15, de celcyclus en het weefseltype26. Daarnaast hebben we de assay gebruikt om verschillende eiwitten te identificeren die ook de keuze van het reparatiepad en/of de reparatie van gedivergeerde sequenties in Drosophila aansturen, waaronder Msh627, Blm28, Rif116 en CtIP16,29. De gevestigde toepassing van Drosophila als genetisch modelorganisme met geconserveerde DNA-reparatie-eiwitten biedt een eenvoudig, meercellig systeem voor het onderzoeken van de genetische, cellulaire en organismische factoren die bijdragen aan DSB-reparatie in complexe biologische contexten.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financiële of niet-financiële belangenverstrengelingen te melden.

Dankbetuigingen

Deze methode is ontwikkeld terwijl J.R.L. een ontvanger was van een AFAR Research Grant van de American Federation for Aging Research. Dit werk werd ook ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 en 1R15GM129628) aan J.R.L. De figuren zijn ontwikkeld met behulp van BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,5 mL RNAse/DNAse-vrije stamperFisher Scientific12141363Voor homogenisatie van monsters voor gDNA-extractie
WattenbollenGenesee Scientific51-101voor standaard Drosophila-kweek
Drosophila Peltier Gekoelde IncubatorShel LabSRI6PFvoor standaard Drosophila-kweek
Drosophila-stam: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stock CenterRRID:BDSC 1495
Drosophila-stam: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque LabN/Agecreëerd door het LaRocque lab via standaard recombinatie van stam RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) van het Bloomington Drosophila Stock Center; beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur
Drosophila-stam: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/ADR-white assay geïntegreerd in stam RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur
Drosophila-stam: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/ADR-white.mu assay geïntegreerd in stam RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur
Drosophila-stam: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque LabN/AiwhiteΔ9 donor geïntegreerd in stam RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur
Flugs Drosophila-flESDopjesGenesee Scientific49-100voor standaard Drosophila-kweek
Fluorescent stereomicroscoop (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLvoor standaard Drosophila "fly pushing" en sortering op basis van fluorescentie
FlyStuff Drosophila Fly PadGenesee Scientific59-172voor standaard Drosophila "fly pushing"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
MyBath 4 L WaterbadMidwest ScientificMB-2000-4voor  hitte-shock
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYvoor DNA-kwantificatie
Nutri-fly Bloomington Formulatie MediumGenesee Scientific66-121voor standaard Drosophila-kweek
Pellet Pestle Draadloze Motor homogenisatorDWK Life SciencesK749540-0000Voor homogenisatie van monsters voor gDNA-extractie
Polypropyleen flessenGenesee Scientific32-130voor standaard Drosophila-kweek
Polystyreen vialsGenesee Scientific32-116voor standaard Drosophila-kweek, inclusief hitte-shock
Primer/oligonucleotide DR-white_8fN/A; elke oligonucleotidesyntheseservice is voldoendeN/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Primer/oligonucleotide DR-white_8aN/A; elke oligonucleotidesyntheseservice is voldoendeN/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Primer/oligonucleotide DR-white_9fN/A; elke oligonucleotidesyntheseservice is voldoendeN/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositVersie 2023.06.1+524Gratis downloadbare versie; elke versie van R Studio is acceptabel, hoewel de gepresenteerde gegevens zijn geanalyseerd met  versie 2023.06.1+524
R Studio pakketten: BiostringsBioconductor.org (Versie 3.24)Versie 2.76.0R Script zal de gebruiker vragen dit pakket te installeren
R Studio pakketten: sangerseqRBioconductor.org (Versie 3.24)Versie 1.44.0R Script zal de gebruiker vragen dit pakket te installeren
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
StereomicroscoopLeicaM60voor standaard Drosophila "fly pushing"
Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Referenties

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DNA dubbelstrengsbreukenDSB herstelhomologe recombinatieniet homologe end joiningsingle strand annealingI SceI meganucleasePCR analyseTIDE analyse
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.