Retrospectieve cohortstudie naar de spiegels van miR-486-3p in perifeer bloed bij patiënten met een acuut cerebraal infarct en obstructief slaapapneusyndroom

Samenvatting

miR‑486‑3p is downgereguleerd bij patiënten met een acuut cerebraal infarct en obstructief slaapapneu-syndroom, correleert negatief met de ernst van de ziekte en inflammatoire markers, en voorspelt een slechte prognose op 1‑jaars termijn, wat het potentieel ervan als diagnostische en prognostische biomarker ondersteunt.

Samenvatting

Acuut cerebraal infarct (ACI) gecompliceerd door obstructief slaapapneu syndroom (OSAS) brengt een hoog risico op recidiverend beroerte en overlijden met zich mee, maar effectieve biomarkers voor deze comorbide aandoening blijven beperkt. In deze retrospectieve cohortstudie werden tussen november 2020 en december 2023 270 patiënten met ACI geïncludeerd, die werden ingedeeld in de ACI-groep (n = 100, apnea-hypopnea index [AHI] < 5) en de ACI-met-OSAS-groep (n = 170, AHI ≥ 5), waarbij de laatste verder werd gestratificeerd in subgroepen met mild (5 ≤ AHI < 15, n = 60), matig (15 ≤ AHI < 30, n = 75) en ernstig (AHI ≥ 30, n = 35) OSAS. De expressie van serum miR-486-3p werd gemeten via RT-qPCR, en ontstekingsmarkers, waaronder tumornecrosefactor-α (TNF-α), C-reactief proteïne (CRP) en hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α), werden gekwantificeerd via ELISA. De diagnostische waarde van miR-486-3p werd geëvalueerd met behulp van receiver operating characteristic curve-analyse, en de prognostische significantie werd beoordeeld via Kaplan-Meier-overlevingsanalyse en Cox-regressiemodellen. miR-486-3p was merkbaar lager in de comorbide groep en vertoonde een sterke diagnostische capaciteit (AUC = 0,927). Opvallend was dat er een duidelijke dosisafhankelijke trend werd waargenomen over de OSAS-ernstsubgroepen, waarbij miR-486-3p progressief afnam en TNF-α en CRP stapsgewijs toenamen van mild naar ernstig OSAS. Spearman-correlatieanalyses toonden aan dat miR-486-3p negatief correleerde met AHI, de NIHSS-score, TNF-α en CRP. Bij een follow-up van 1 jaar hadden patiënten met een lage miR-486-3p-expressie significant slechtere functionele uitkomsten vergeleken met patiënten met een hoge expressie. Multivariate Cox-regressie bevestigde miR-486-3p als een onafhankelijke beschermende factor voor de prognose na 1 jaar. Deze bevindingen suggereren dat miR-486-3p kan dienen als een nieuwe diagnostische en prognostische biomarker voor ACI-patiënten met OSAS, potentieel via de regulerende rol in systemische inflammatie, en rechtvaardigen verdere validatie in grotere prospectieve cohorten.

Inleiding

Het obstructieve slaapapneu-syndroom (OSAS) is een veelvoorkomende aandoening die wordt gekenmerkt door herhaalde onderbrekingen van de ademhaling tijdens de slaap¹. OSAS wordt vaak geassocieerd met comorbiditeiten zoals metabole, cardiovasculaire, renale, pulmonale en neuropsychiatrische stoornissen². Naast de algemene associaties met cardiovasculaire en metabole ziekten vormt OSAS een specifieke en ernstige bedreiging bij een acuut ischemisch infarct, waarbij het tot 70% van de gevallen compliceert en de risico's op neurologische achteruitgang, mortaliteit en recidiverende beroertes verhoogt^3,4,5. Een acuut cerebraal infarct (ACI) is de meest prevalente vorm van een beroerte. Hoewel er de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de behandeling van ACI, lijden de meeste patiënten nog steeds aan ernstige beperkingen of overlijden zij zelfs⁶. De synergetische interactie tussen ACI in combinatie met OSAS verergert de ischemische schade en systemische inflammatie, waardoor de risico's op recidieven van beroertes, invaliditeit en mortaliteit aanzienlijk toenemen. Bijgevolg is het identificeren van betrouwbare biomarkers voor de vroege diagnose en het management van deze risicovolle comorbiditeit van cruciaal belang.

Micro-RNA's (miRNA's) hebben de afgelopen jaren veel potentie getoond als biomarkers. Hiervan is miR-486-3p van groot belang bij neurovasculaire aandoeningen. Voorgaand onderzoek heeft aangetoond dat de expressie van miR-486-3p wordt geremd bij obstructief slaapapneu (OSA)⁷. Daarnaast kan een behandeling met rabiesvirus-glycoproteïne-miR-486-3p-exosomen neurobehaviorale stoornissen, hersenoedeem, beschadiging van de bloed-hersenbarrière en neurodegeneratie verlichten⁸, wat erop wijst dat miR-486-3p een rol speelt bij hersenletsel. Na een ACI worden microglia in het beschadigde hersenweefsel geactiveerd, wat de secretie van inflammatoire cytokinen bevordert⁵. OSAS veroorzaakt symptomen van intermitterende hypoxie, wat leidt tot activatie van het sympathische zenuwstelsel en oxidatieve stress, waardoor een systemische inflammatoire cascade-reactie wordt getriggerd⁹. miR-486-3p is nauw verbonden met inflammatie¹⁰. Deze bewijslast suggereert dat miR-486-3p kan dienen als een moleculaire schakel tussen OSAS-gerelateerde hypoxie, systemische inflammatie en herstel na een beroerte.

Het expressieprofiel, de diagnostische nauwkeurigheid en de prognostische betekenis bij ACI-patiënten met OSAS zijn echter nog niet systematisch onderzocht, en het blijft onbekend of er een dosisafhankelijke correlatie bestaat met de ernst van OSAS of met inflammatoire mediatoren. Om deze leemtes op te vullen, evalueerde deze studie de diagnostische waarde van miR-486-3p voor OSAS bij ACI-patiënten, onderzocht de dosisafhankelijke relatie met de ernst van OSAS en inflammatoire markers (TNF-α, CRP en HIF-1α), en beoordeelde de prognostische bruikbaarheid voor functionele uitkomsten na 1 jaar. Naar ons weten is dit de eerste uitgebreide studie die aantoont dat miR-486-3p kan dienen als een nieuwe diagnostische en prognostische biomarker voor de comorbiditeit ACI-OSAS, mogelijk via de regulatie van systemische inflammatie.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University (goedkeuringsnummer: XYFY2024-KL238-01) en was vrijgesteld van de vereiste om aanvullende geïnformeerde toestemming van patiënten te verkrijgen. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

Patiënten en specimens
Deze studie was een retrospectieve cohortstudie. Van november 2020 tot december 2023 werden in totaal 270 patiënten die een ACI ondergingen in het Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University opeenvolgend gerekruteerd. Het proces van patiëntselectie is samengevat in Aanvullende figuur 1. In aanmerking komende patiënten werden geïdentificeerd via dagelijkse screening van alle nieuwe opnames op de beroeneenheid. Het begin van de symptomen binnen 72 u vóór opname werd geverifieerd door het inzien van de spoedmedische dossiers en bevestigd door een gecertificeerde neuroloog via de patiëntanamnese en interviews met familieleden. De steekproefomvang werd berekend op basis van het vermogen om een significant verschil in miR-486-3p-niveaus tussen groepen aan te tonen. Uitgaande van een effectgrootte van 0,5, een tweezijdige α van 0,05 en een power (1-β) van 0,80, waren minimaal 64 patiënten per groep vereist. De uiteindelijke groepsgroottes weerspiegelen de feitelijke rekrutering en de hogere prevalentie van OSAS binnen de beroenpopulatie, en geen vooraf bepaalde toewijzing. Patiënten met ACI in combinatie met OSAS werden gedurende 1 jaar gevolgd op hun prognose.

De inclusiecriteria waren: (1) Acut ischemisch stroke met symptoomonset binnen 72 u vóór opname, bevestigd door magnetic resonance imaging. (2) Het vermogen om de vragenlijsten van het onderzoek en de neurologische beoordelingen te begrijpen en te voltooien. (3) De ernst van de ACI werd bij opname beoordeeld met de National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS). Wanneer de NIHSS-score <5 is, wordt dit geclassificeerd als milde ACI; wanneer de NIHSS-score tussen 5 en 20 ligt, wordt dit beschouwd als matige ACI. Belangrijke exclusiecriteria omvatten een voorgeschiedenis van maligne tumoren, reeds bestaande ernstige fysieke beperking of psychiatrische stoornissen, ernstige cardiale, pulmonale of renale insufficiëntie, en grote chirurgische ingrepen of trauma's in de voorafgaande 3 maanden, actieve infecties of auto-immuunziekten; een eerdere beroerte binnen 6 maanden; immunosuppressieve therapie; en een eerdere diagnose of behandeling van OSAS (inclusief continuous positive airway pressure therapie).

Voor MRI-bevestiging ondergingen alle patiënten een standaard MRI van de hersenen op een 3,0-T systeem, inclusief de volgende sequenties: T1-gewogen, T2-gewogen, fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR), diffusie-gewogen beeldvorming (DWI) en apparent diffusion coefficient (ADC) mapping. Acuut infarct werd gedefinieerd als de aanwezigheid van een hyperintense signaal op DWI met een overeenkomstig hypointense signaal op ADC. Alle MRI-scans werden geïnterpreteerd door twee ervaren neuroradiologen die blind waren voor de klinische gegevens, waarbij discrepanties via consensus werden opgelost. De NIHSS-score werd bij opname bepaald door gecertificeerde neurologen voorafgaand aan elke trombolytische of endovasculaire behandeling.

Nuchtere veneuze bloedmonsters werden afgenomen tussen 24 u en 48 u na het begin van het beroerte, na een nachtvasten van ten minste 8 u. Bloedafnames vonden plaats tussen 6:00 uur en 8:00 uur om circadiane variaties te minimaliseren. In totaal werd 5 mL perifeer veneus bloed verzameld in vacuümbuizen gecoat met EDTA. Binnen 2 u na afname werden de bloedmonsters gecentrifugeerd bij 1.500 × g gedurende 15 min bij 4 °C met een gekoelde centrifuge. Het serumsupernatans werd zorgvuldig verdeeld in RNase-vrije microcentrifugebuisjes van 1,5 mL en onmiddellijk bewaard bij −80 °C tot de RNA-extractie. Herhaalde vries-dooi-cycli werden strikt vermeden; alle aliquots werden voorafgaand aan de analyse onderworpen aan maximaal één vries-dooi-cyclus.

Groepering van patiënten
Deelnemers werden gegroepeerd op basis van hun AHI-scores uit polysomnografie. Alle registraties werden uitgevoerd in het slaaplaboratorium van het ziekenhuis tussen 22:00 en 06:00 uur gedurende een minimale duur van 7 h. De gemonitorde fysiologische kanalen omvatten: elektro-encefalografie (EEG; zes kanalen), elektro-oculografie (EOG; twee kanalen), elektro-myografie (EMG; kin en bilaterale musculus tibialis anterior), elektro-cardiografie (ECG; enkele afleiding), nasale luchtstroom (thermistor en druktransducer), thoracale en abdominale ademhalingsinspanning (respiratoire inductieplethysmografie) en pulsoximetrie (SpO2). De slaapstudietechnicus berekende de AHI. De score van slaapstadia en respiratoire gebeurtenissen werd handmatig uitgevoerd door een gecertificeerde slaaptechnicus volgens de scorehandleiding uit 2012 van de American Academy of Sleep Medicine (AASM), met gebruik van de Somnolyzer 24×7 software. Volgens de algemeen aanvaarde diagnostische criteria van de American Academy of Sleep Medicine is een AHI van 5 of meer gebeurtenissen per uur de standaarddrempel voor het diagnosticeren van OSA. Daarom werden deelnemers met een AHI < 5 geclassificeerd als de ACI-groep (n = 100), terwijl deelnemers met een AHI ≥ 5 werden geclassificeerd als de ACI gecombineerde OSAS-groep (n = 170). Onder degenen met een AHI ≥ 5 (ACI gecombineerde OSAS-groep, n = 170) werden patiënten verder gestratificeerd in drie ernst-subgroepen op basis van vastgestelde criteria: mild OSAS (5 ≤ AHI < 15, n = 60), matig OSAS (15 ≤ AHI < 30, n = 75) en ernstig OSAS (AHI ≥ 30, n = 35). Deze stratificatie maakte evaluatie mogelijk van de dosisafhankelijke relatie tussen hypoxische belasting, miR‑486‑3p expressie en inflammatoire markers. Patiënten met een eerdere OSAS-behandeling (bijv. CPAP) werden niet in de studie opgenomen om confounding van de baseline AHI-meting te voorkomen.

Beoordeling van de prognose
Het tijdstip van 1 jaar laat acute effecten wegebben en de cumulatieve hypoxische belasting van OSAS manifesteren, wat een robuust venster biedt om de prognostische impact ervan te beoordelen. De klinische prognose van patiënten met ACI in combinatie met OSAS werd geëvalueerd aan de hand van de modified Rankin Scale (mRS) na het begin van de ziekte. Alle mRS-beoordelingen werden uitgevoerd door gecertificeerde neurologen die voorafgaand aan de studie een gestandaardiseerde training hadden gevolgd, met gebruik van het gestructureerde mRS-interviewformulier. De inter-beoordelaarsbetrouwbaarheid werd getoetst met een kappacoëfficiënt >0,85. De follow-upbeoordeling vond plaats tijdens een geplande polikliniekbezoek. Voor patiënten die niet persoonlijk aanwezig konden zijn, werd een gestructureerd telefonisch interview afgenomen door een getrainde researchverpleegkundige aan de hand van een gestandaardiseerd script. Alle beoordelaars waren geblindiseerd voor de miR-486-3p-spiegels en de OSAS-status van de patiënten. Om consistentie tussen de poliklinische en telefonische beoordelingen te waarborgen, werd in beide formaten dezelfde gestructureerde vragenlijst gebruikt en voltooiden alle beoordelaars een kalibratie-oefening voorafgaand aan de studie. Patiënten met scores van 0–2 werden in de groep met een goede prognose geplaatst, en patiënten met scores van 3–6 in de groep met een slechte prognose. Geen enkele patiënt ging verloren tijdens de follow-up. De SAQLI, ESS, TNF-α en HIF-1α werden geëvalueerd als prognostische variabelen in plaats van te worden gebruikt voor het definiëren van de prognosegroepen. De NIHSS, SAQLI en ESS werden afgenomen door getraind onderzoekspersoneel. De SAQLI en ESS werden afgenomen als door de interviewer toegediende vragenlijsten in een rustige kamer.

Score-index
NIHSS is een kwantitatieve schaal voor beroertes¹¹, waarbij hogere scores duiden op een grotere ernst van ACI. SAQLI is een vragenlijst over de kwaliteit van leven bij OSA op een schaal van 1–7, waarbij hogere scores duiden op een slechtere kwaliteit van leven, met betrekking tot dagelijkse activiteiten, sociale interacties, emotionele toestanden, symptomen en behandelingsgerelateerde symptomen¹². ESS wordt gebruikt om de door patiënten gerapporteerde slaperigheid overdag te onderzoeken, met een scorebereik van 0 tot 24, waarbij een score > 10 duidt op slaperigheid overdag¹³.

RNA-extractie en reverse transcriptie
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit 200 µL serum met behulp van TRIzol-reagens. Kort samengevat werden serummonsters gemengd met 800 µL TRIzol, 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur en 15 min gecentrifugeerd bij 12,000 × g bij 4 °C. Er werd chloroform (200 µL) toegevoegd, waarna het mengsel 15 s krachtig werd geschud, 3 min geïncubeerd en 15 min gecentrifugeerd bij 12,000 × g bij 4 °C. De waterige fase werd overgebracht naar een nieuw buisje en het RNA werd geprecipiteerd met 500 µL isopropanol, 1 u geïncubeerd bij −20 °C en 10 min gecentrifugeerd bij 12,000 × g bij 4 °C. De RNA-pellet werd gewassen met 75% ethanol, aan de lucht gedroogd en opgelost in 20 µL RNase-vrij water. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden bepaald met een microvolume-spectrofotometer, waarbij een A260/A280-ratio tussen 1,8 en 2,0 werd geaccepteerd voor verdere analyse. De RNA-integriteit werd geverifieerd via agarosegelelektroforese.

Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met 500 ng totaal RNA met de Reverse Transcription Kit in een totaal reactievolume van 20 µL, waarbij random hexamer primers werden gebruikt volgens het protocol van de fabrikant. De omgekeerde transcriptiereactie werd uitgevoerd bij 25 °C gedurende 10 min, 42 °C gedurende 60 min en 70 °C gedurende 5 min. Het resulterende cDNA werd bewaard bij −20 °C tot gebruik.

RT-qPCR
De expressie van miR-486-3p werd gedetecteerd met een SYBR Green-gebaseerde real-time PCR-kit voor microRNA-kwantificering op een real-time kwantitatief PCR (qPCR)-systeem. Het reactiemengsel bevatte 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 2 µL cDNA-template (verdund 1:5), 1 µL van elke primer (10 µM) en nucleasevrij water tot een eindvolume van 20 µL. De primersequenties zijn als volgt (van 5'-3'): miR-486-3p-forward: TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU, reverse: CTCAACTGGTGTCGTGGA; en U6-forward: CTCGCTTCGGCAGCACA, reverse: AACGCTTCACGAATTTGCGT. De qPCR-cycluscondities waren: 95 °C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 60 s. Elk monster werd in triplicaat uitgevoerd, en in elke run werd een controle zonder template meegenomen. De specificiteit van de amplificatie werd bevestigd via smeltcurve-analyse van 60 °C tot 95 °C. De drempelcyclus (Ct) werd automatisch bepaald door de QuantStudio 6 Pro-software (v1.5) met de standaard drempelinstelling. Het miR-486-3p-niveau werd berekend met de 2^-ΔΔCT-methode en genormaliseerd ten opzichte van U6. U6 werd gevalideerd als een stabiel referentiegen in onze serummonsters met behulp van het NormFinder-algoritme om consistentie tussen de groepen te waarborgen. De inter-assay en intra-assay variatiecoëfficiënten waren <5%.

ELISA
De serumconcentraties van C-reactief proteïne (CRP), TNF-α en HIF-1α werden bepaald met behulp van de ELISA-kit. De experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat werden serummonsters op ijs ontdooid en 1:2 verdund met de meegeleverde verdunningsbuffer. Monsters en standaarden werden toegevoegd aan vooraf gecoate 96-well platen (100 µL/well) en gedurende 2 u bij 37°C geïncubeerd. Na vier keer wassen met 300 µL wasbuffer werd 100 µL biotin-geconjugeerd detectie-antilichaam toegevoegd en gedurende 1 u bij 37°C geïncubeerd. Na een volgende wasstap werd 100 µL horseradishperoxidase-geconjugeerd streptavidine toegevoegd en gedurende 30 min bij 37°C in het donker geïncubeerd. Het chromogene substraat (tetramethylbenzidine, 100 µL) werd toegevoegd en gedurende 15 min bij 37°C beschermd tegen licht geïncubeerd. De reactie werd gestopt met 50 µL stopoplossing en de absorbentie werd gemeten bij 450 nm met een microplate-reader. De concentraties werden berekend aan de hand van standaardcurves die waren gegenereerd met bekende concentraties van recombinante eiwitten. Elk monster werd in dubbeltoestage gemeten en de gemiddelde waarde werd gebruikt voor de analyse. Kwaliteitscontrolemonsters van de fabrikant werden in elke plaat opgenomen; resultaten werden alleen geaccepteerd wanneer de QC-waarden binnen het door de fabrikant gespecificeerde bereik vielen.

Kwaliteitscontrole en reproduceerbaarheid
Alle laboratoriumassays werden uitgevoerd in overeenstemming met de MIQE-richtlijnen (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) voor RT-qPCR en de toepasselijke rapportagestandaarden voor ELISA. Belangrijke instrumenten werden gekalibreerd volgens de schema's van de fabrikanten. Negatieve en positieve controlemonsters werden opgenomen in elke batch RT-qPCR- en ELISA-runs om de variabiliteit tussen platen te bewaken. Alle gegevens werden geregistreerd en beheerd met Microsoft Excel, en de corresponderende auteur zal gedetailleerde experimentele protocollen en ruwe gegevens verstrekken op redelijk verzoek.

Statistische analyse
Gegevens werden geanalyseerd met SPSS 23.0 en statistische en grafische software. De normale verdeling werd beoordeeld met de Shapiro–Wilk-toets. Continue variabelen worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD of mediaan (IQR), en werden vergeleken met de t‑toets of de Mann–Whitney U-toets, afhankelijk van de situatie. Categorische variabelen werden vergeleken met de χ²-toets. Correlaties werden onderzocht met Pearson- of Spearman-analyses op basis van de gegevensverdeling. De voorspellende waarde werd bepaald met de ROC-curve en geverifieerd met 5-voudige kruisvalidatie. De optimale afkapwaarde voor miR-486-3p werd bepaald door de Youden-index te maximaliseren. Pearson- en Spearman-correlatieanalyses werden gebruikt om correlaties te beoordelen. Voor de prognostische analyse werden patiënten gestratificeerd op basis van de mediaan van de miR‑486‑3p-expressie; Kaplan–Meier-curves met de log‑rank-toets werden gebruikt om overlevingsuitkomsten tussen groepen te vergelijken. Variabelen met P < 0,1 in de univariate Cox-regressie werden ingevoerd in het multivariate Cox-model. P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Baselinekenmerken in de ACI-groep en de gecombineerde ACI-OSAS-groep
Zoals weergegeven in Tabel 1, bestond de ACI-groep uit 68 mannen en 32 vrouwen, met een gemiddelde leeftijd van 62,84 ± 12,65 jaar, en de gecombineerde ACI-OSAS-groep omvatte 16 mannen en 54 vrouwen, met een gemiddelde leeftijd van 61,31 ± 11,25 jaar. De gecombineerde ACI-OSAS-groep had significant hogere AHI, NIHSS-scores en CRP-waarden. De twee groepen vertoonden echter vergelijkbare distributies van leeftijd, ges...

Discussie

Patiënten met OSAS ondervinden herhaaldelijke collaps en obstructie van de luchtwegen, wat leidt tot intermitterende hypoxie (IH) en overmatige slaperigheid overdag (EDS), hetgeen neuronale schade kan veroorzaken¹⁴OSAS komt zeer veelvuldig voor na een ACI, waarbij ongeveer 72% van de patiënten wordt getroffen, en verergert het cardiovasculaire risico aanzienlijk.¹⁵ACI vormt een spectrum van neurologische uitval als gevolg van gelokaliseerde cerebrale ischemie en hypoxie sec...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3.0T MRI-scanner	Siemens Healthineers, Germany	MAGNETOM Skyra	Hersencan voor bevestiging van acuut cerebraal infarct
ELISA-microplaten met 96 putjes	Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., China	XBS-PLATE	Antigeen-antilichaamreactie voor ELISA-detectie
AASM Clinical Practice Guidelines for Sleep-Disordered Breathing	American Academy of Sleep Medicine	2020 full guideline	Gestandaardiseerde AHI-diagnostische en OSAS-ernststratificatiecriteria
Calgary Sleep Apnea Quality of Life Index (SAQLI) Chinees gevalideerde versie	University of Calgary	2021 translated edition	Kwaliteit-van-levenbeoordeling voor ACI-patiënten gecompliceerd door OSAS
EDTA-K2 5 mL vacuüm bloedafnamebuizen	BD Biosciences, USA	367863	Perifere veneuze bloedafname voor serumscheiding
Epworth Sleepiness Scale (ESS) Chinees gevalideerde versie	Johns Hopkins University	2018 revised edition	Evaluatie van slaperigheid overdag bij beroertepatiënten
GraphPad Prism 9	GraphPad Software, USA	Version 9.4.1	Spreidingsdiagrammen, boxplots, visualisatie van ROC-curven
Human CRP ELISA Kit	Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, China	XBS-H001	Kwantitatieve detectie van serum C-reactief proteïne
Human HIF-1α ELISA Kit	Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, China	XBS-H007	Kwantitatieve detectie van serum hypoxia-induceerbare factor-1α
Human TNF-α ELISA Kit	Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, China	XBS-H003	Kwantitatieve detectie van serum TNF-α inflammatoire factor
IBM SPSS Statistics 23.0	IBM, Armonk, NY, USA	Version 23.0	Alle statistische analyses (t-test, correlatie, ROC, Kaplan–Meier, Cox-regressie)
Microplaat-spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	Multiskan FC	Absorptiemeting voor ELISA-platen bij 450 nm
miR-486-3p & U6 qPCR-primers	Sangon Biotech, Shanghai, China	Custom synthesis	Amplificatie van target- en referentiegenen voor qPCR
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen GmbH, Hilden, Germany	218073	Real-time kwantitatieve PCR-amplificatie van miR-486-3p en U6
NIH Stroke Scale (NIHSS) Chinees gevalideerde versie	National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), USA	Standard clinical edition	Basisbeoordeling van neurologische ernst voor ACI-patiënten
PSG-slaapscore-software	BMC Medical Co., Ltd., China	v3.2	Geautomatiseerde voorlopige score van slaapademhalingsgebeurtenissen
QuantStudio 6 Pro Real-Time PCR-systeem	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	QuantStudio 6 Pro	RT-qPCR-amplificatie, acquisitie van smeltcurve, registratie van Ct-waarde
QuantStudio Real-Time PCR-software	Applied Biosystems, USA	v1.7	Export van qPCR-ruwe data, analyse van Ct-waarde
Gekoelde tafelcentrifuge	Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., Hunan, China	TDZ5-WS	Serumscheiding uit volbloed (2700 × g, 4 °C)
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	K1691	Reverse transcriptie van serum-miRNA naar cDNA
RNase-vrije 1,5 mL microcentrifugebuisjes	Axygen, USA	MCT-150-C	Aliquoteren en bewaren van gescheiden serum
TRIzol RNA-isolatiereagens	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15596026	Totale RNA-extractie uit menselijke serummonsters
Ultra-lage temperatuurvriezer	Haier Biomedical, Shandong, China	DW-86L388	Langetermijnbewaring van serummonsters bij −80 °C
YH-600B Polysomnografie-monitor	BMC Medical Co., Ltd., Beijing, China	YH-600B	Overnight slaapmonitoring en AHI-berekening voor OSAS-diagnose