Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van het Shanghai Fourth People’s Hospital, School of Medicine, Tongji University, en is goedgekeurd door de Institutional Review Board (goedkeuringsnummer 2026013-01). De geëxtraheerde menselijke tanden die in deze studie zijn gebruikt, werden verzameld van patiënten bij wie tanden werden getrokken om orthodontische of periodontale redenen. Voorafgaand aan de monstername is van alle deelnemers schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Er zijn geen aanvullende klinische interventies uitgevoerd ten behoeve van deze studie. De studie is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele vereisten voor het gebruik van geëxtraheerde menselijke tanden.
Preparatie van de monsters en selectiecriteria
In totaal werden 141 recent geëxtraheerde eenwortelige permanente tanden (onderkaakincisieven en premolaren) ontvangen van de afdeling Stomatologie, verbonden aan de Tongji Universiteit in het Shanghai Fourth People’s Hospital. Alle tanden waren verwijderd om orthodontische of periodontale redenen. Van elke patiënt is geïnformeerde toestemming verkregen. In deze studie werden tanden opgenomen met wortels van ten minste 10 mm, vastgesteld met een periodontale sonde, intacte tanden zonder cariëslaesies of barsten, volledige wortelvorming en een wortelkromming van minder dan tien graden volgens de methode van Schneider. Tanden met meerdere kanalen, kanaalcalcificatie, interne resorptie of eerdere endodontische behandelingen werden uitgesloten van deze studie. Na extractie werd alle zichtbare tandsteen en weke weefselresten verwijderd met een periodontale schaler. De tanden werden vervolgens bewaard in een 0,9% zoutoplossing bij 4°C tot aan gebruik om dehydratatie te voorkomen, en alle experimenten werden uitgevoerd binnen drie maanden na extractie. De monsters werden aan de experimentele groepen toegewezen via een vooraf gedefinieerde alternerende allocatiesequentie. Specifiek werden de monsters sequentieel en afwisselend aan elke groep toegewezen totdat de vereiste steekproefomvang per groep was bereikt. Er is geen formele a priori powercalculatie uitgevoerd. De steekproefomvang is gekozen op basis van eerdere vergelijkbare ex vivo studies, het aantal geëvalueerde combinaties van bestralingsparameters en de beschikbaarheid van geschikte geëxtraheerde tanden.
Preparatie en sterilisatie van het wortelkanaal
Elke tandkroon werd verwijderd bij de cemento-emalkrans met een langzaam draaiende diamantzaag onder continue waterkoeling om een gestandaardiseerd wortelsegment van 10 mm te verkrijgen. De werklengte werd bepaald op 1 mm kort van het apicale foramen met behulp van een K-file maat 10. De wortelkanalen werden geprepareerd met het ProTaper Universal nikkel-titanium rotatiesysteem volgens de instructies van de fabrikant, in de volgorde S1, S2, F1, F2 en F3, totdat een apicale preparatiemaat van F3 was bereikt. Tijdens de instrumentatie werden de kanalen na het gebruik van elke rotatievijl geïrrigeerd met ongeveer 2 mL 5,25% natriumhypochloriet, wat resulteerde in een totaal irrigatievolume van ongeveer 10 mL per kanaal. Een laatste spoeling werd uitgevoerd met 5 mL 17% EDTA gedurende 1 min, gevolgd door 5 mL steriele zoutoplossing. Het apicale foramen werd afgesloten met vloeibaar composiet om een gesloten kanaalsysteem te creëren. Geprepareerde wortels werden gesteriliseerd door autoclaveren bij 121°C gedurende 20 min, bewaard in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4°C en binnen 24 u na sterilisatie geïnoculeerd met bacteriën.
Bacteriële stam en kweekcondities
E. faecalis ATCC 29212 werd gebruikt om het model van het geïnfecteerde wortelkanaal te vestigen. De stam werd gekweekt op brain heart infusion (BHI)-agar bij 37°C gedurende 24 u onder aerobe omstandigheden. Een enkele kolonie werd overgebracht naar BHI-bouillon en geïncubeerd bij 37°C gedurende 18–24 u. De bacteriële suspensie werd aangepast tot ongeveer 1,5 × 108 KVE/ml, gelijk aan een 0,5 McFarland-standaard, met behulp van de optische dichtheid bij 60 nm (OD600waarde van 0,08–0,10.
Vestiging van een met E. faecalis geïnfecteerd wortelkanaalmodel
Om een geïnfecteerd wortelkanaal-biofilmmodel te vestigen, werd het externe oppervlak van elke gesteriliseerde wortel voorzien van twee lagen transparante nagellak om bacteriële penetratie via het cementum te voorkomen. De apicale regio werd gecoat nadat het apicale foramen was afgedicht met vloeibaar resin-composiet, terwijl de kanaalopening onbehandeld bleef om bacteriële inoculatie mogelijk te maken. Met een steriele micropipet werd 10 µL van de E. faecalis-suspensie overgebracht naar elk individueel wortelkanaal om de gehele lengte van het kanaal te vullen zonder overloop. De geïnoculeerde monsters werden vervolgens individueel geplaatst in steriele 24-well kweekplaten, waarbij aan elke well 1,5 mL BHI-bouillon werd toegevoegd. De monsters werden gedurende 21 dagen gecultiveerd bij 37°C onder aerobe omstandigheden. Het groeimedium werd elke 2 dagen verwijderd en vervangen door verse steriele BHI-bouillon om voedingsstoffen te leveren voor voortgezette bacteriële groei en om opgehoopt cellulair debris te verwijderen. Tijdens de vervanging van het medium werd geen aanvullende inoculatie met E. faecalis uitgevoerd. Na voltooiing van de incubatieperiode werden alle levensvatbare monsters eenmaal gewassen met PBS om losjes gebonden planktonische bacteriën te verwijderen vóór de experimentele testen. Twee willekeurig geselecteerde monsters werden gebruikt om de vorming van een mature biofilm en de bacteriële penetratie in de dentineltubuli te visualiseren middels scanning elektronenmicroscopie (SEM). De preparaten werden gefixeerd in 2,5% glutaraldehyde bij 4°C gedurende 24 u, drie keer gespoeld met PBS, gedehydrateerd via een graduele ethanolreeks (30%, 50%, 70%, 80%, 90% en 10%), waarbij elke stap 10 min duurde, vervolgens longitudinaal gesplitst, aan de lucht gedroogd, gemonteerd op aluminium stubs, gesputtercoat met goud en onderzocht via SEM.
Experimentele groepen en laserbestralingsprotocollen
De 135 geïnfecteerde wortelsamples werden verdeeld over drie primaire experimentele groepen op basis van het gebruikte lasersysteem: de 808 nm diodelasergroep, de 1940 nm thuliumlasergroep en de 2940 nm erbiumlasergroep. Elke lasergroep bestond uit 45 samples, die verder werden onderverdeeld op basis van de bestralingsparameters. De diodelaser werd gebruikt bij gemiddelde vermogens van 1,0, 1,5 of 2,0 W, waarbij elke vermogensinstelling gedurende 10, 20 of 30 s werd toegepast, wat resulteerde in negen subgroepen met drie samples per subgroep. De thuliumlaser werd gebruikt bij gemiddelde vermogens van 1,5, 2,5 of 3,5 W, waarbij elke vermogensinstelling eveneens gedurende 10, 20 of 30 s werd toegepast, wat ook resulteerde in negen subgroepen met drie samples per subgroep. De erbiumlaser werkte in een superkorte pulsmodus bij een vaste frequentie van 15 Hz. Pulsenergiën van 10, 20 of 30 mJ werden toegepast gedurende 10, 20 of 30 s, wat negen subgroepen van drie samples per subgroep opleverde. Zowel de 808 nm diodelaser als de 1940 nm thuliumlaser werden gebruikt in continugolfmodus.
In totaal werden zes aanvullende monsters opgenomen, waarbij drie monsters aan respectievelijk de negatieve en positieve controlegroepen werden toegewezen. De negatieve controlegroep werd behandeld met steriele zoutoplossing, terwijl de positieve controlegroep gedurende 30 s werd behandeld met 5,25% natriumhypochloriet (NaOCl).
Voor de lasersgroepen werd een gestandaardiseerd bestralingsprotocol gevolgd. De optische vezel werd tot aan de werklengte in het wortelkanaal ingebracht en gedurende de bestralingsperiode in een langzame, continue spiraalvormige beweging van de apicale naar de coronale richting bewogen. Er werden laserspecifieke toedieningsvezels of tips gebruikt in plaats van één enkele uitwisselbare vezel. De 808 nm diodelaser werd toegediend via een 20 µm end-firing vezel, de 1940 nm thuliumlaser via een 20 µm end-firing vezel, en de 2940 nm erbiumlaser via een 40 µm radial-firing tip. De toedieningsvezel of tip werd teruggetrokken met een snelheid van ongeveer 1 mm/s. Na het bereiken van de kanaalopening werd deze teruggebracht naar de werklengte, waarna de apicale-naar-coronale spiraalbeweging werd herhaald totdat de vastgestelde bestralingsduur was voltooid.
Voor de thulium- en erbiumlasers bleven de kanalen tijdens de bestraling gevuld met steriele zoutoplossing om water-ondersteunde laseractivatie te simuleren. Voorafgaand aan de bestraling werd er ongeveer 10 µL steriele zoutoplossing in elk kanaal gebracht om het kanaal tot aan de opening van het kanaal te vullen. De zoutoplossing werd voor elke bestralingscyclus, indien nodig, aangevuld om gedurende de gehele behandeling een met vloeistof gevuld kanaal te behouden. Voor de groep met de diodelasers werden de kanalen voor de bestraling gedroogd met steriele papieren puntjes, omdat de 808 nm diodelasers een relatief lage absorptie in water hebben en werden gebruikt om een direct fotothermisch antibacterieel effect in het kanaal op te wekken. In tegenstelling hiermee hebben de 1940 nm thulium- en 2940 nm erbiumlasers een aanzienlijk grotere waterabsorptie en werden zij daarom toegepast in met zoutoplossing gevulde kanalen om water-gemediëerde fotothermische en fotomechanische effecten te faciliteren. De laserbehandeling werd gedurende drie opeenvolgende dagen één keer per dag herhaald.
Meting van de temperatuur van het externe worteloppervlak
Temperatuurveranderingen in real-time op het externe worteloppervlak werden gemeten tijdens de eerste dag van laserbestraling. Elk wortelspecimen werd verticaal gefixeerd op een statief bij kamertemperatuur (2°C ± 1°C). Een K-type thermokoppel, verbonden met een digitale thermometer, werd in stevig contact gebracht met het middelste derde deel van het externe worteloppervlak, loodrecht op de lange as van de wortel. De thermokoppelprobe werd gepositioneerd met een verstelbare klem en met hittebestendige plakband aan het worteloppervlak bevestigd om gedurende de hele meting een stevig en consistent contact te behouden. De thermokoppelprobe werd vóór elke meetsessie gekalibreerd met kokend water (10°C) en een ijs-watermengsel (0°C). Temperatuurmetingen werden geregistreerd met intervallen van 50 ms gedurende de bestralingsperiode (10, 20 of 30 s). Voor elk specimen werden zowel de basistemperatuur als de maximale temperatuur gemeten tijdens of direct na de laserbestraling. De temperatuurstijging van de basistemperatuur tot de piektemperatuur werd berekend als ΔT. Een ΔT van meer dan 10°C werd beschouwd als de drempelwaarde voor potentiële schade aan de periodontalweefsels.
Microbiologische evaluatie: kolonietelling en inhibitiegraad
Om het antibacteriële effect van de laserbehandelingen te bepalen, werden na elke behandeling monsters verzameld. Het kanaal werd gedroogd met steriele papierpuntjes. Voor elk monster werd een nieuwe steriele Hedström-vijl maat 40 gebruikt om dentinesplinters van de kanaalwanden te verkrijgen, om zo kruiscontaminatie tussen de monsters te voorkomen. Elke dentinesplinter werd overgebracht naar een aparte microcentrifugebuis met 1 mL steriele PBS. De buisjes werden 30 s krachtig gevortext om bacteriën van de dentinesplinters los te maken. Seriële 10-voudige verdunningen variërend van 10−1 tot 10−6 werden voorbereid door bij elke verdunningsstap 100 µL van de bacteriële suspensie over te brengen naar 90 µL steriele PBS. Aliquoten (30 µL) van elke verdunning werden uitgeplaat op afzonderlijke brain heart infusion agarplaten, die gedurende 24 h bij 37°C werden geïncubeerd. De kolonies werden geteld en geregistreerd als colony-forming units (CFU). Elke verdunning werd in triplo uitgeplaat, en het gemiddelde aantal kolonies van de drie platen werd gebruikt voor de analyse. De platen werden gecodeerd vóór het tellen, en de onderzoeker die de kolonietellingen uitvoerde, was geblindeerd voor de toewijzing van de behandelingen.

Hier is C het gemiddelde CFU-aantal van de negatieve controlegroep (zoutoplossing) en T het gemiddelde CFU-aantal van de experimentele groep.
Analyse van de bacteriële groeicurve
Het effect van verschillende laserbehandelingen op de bacteriële groeikinetiek werd onderzocht door groeicurves uit te zetten. Op dag 3 na de laatste laserbehandeling werden de kanalen gewassen met 5 ml steriele zoutoplossing. De inhoud van de kanalen werd verzameld met steriele papierpuntjes, die vervolgens werden overgebracht naar een centrifugebuis met 5 ml BHI-bouillon. De buis werd gevorutext om de bacteriën in de bouillon te suspenderen. De bacteriële suspensie werd aangepast naar 1 × 106 KVE/ml. De bacteriële concentratie werd aangepast op basis van de OD600 metingen met behulp van een eerder vastgestelde kalibratiecurve voor E. faecalis ATCC 29212 en werd vervolgens geverifieerd door middel van telling van levensvatbare koloniën. Een aliquot van 200 µL van de suspensie werd aan elke well van een steriele 96-wells microplaat toegevoegd. Daarnaast werd 20 µL van steriele minerale olie werd aan elke put toegevoegd om verdamping te minimaliseren. De microplaat werd geplaatst in een spectrofotometer/incubator die werd gehandhaafd op 37°C, en OD600 werd elke uur gedurende 24 uur gemeten. Voor elke OD60-meting werd de microplaat ongeveer 10 seconden bij circa 30 rpm orbitaal geschud om een homogene bacteriële suspensie te garanderen. Elk monster werd in vijf replica-wells getest.
Statistische Analyse
Alle numerieke gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS Versie 26.0. De datadistributie werd geëvalueerd met de Shapiro–Wilk-toets. Variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt om meer dan twee groepen te vergelijken, gevolgd door de Tukey's honestly significant difference (HSD)-toets voor paarsgewijze vergelijkingen. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met een t-toets voor onafhankelijke steekproeven. Homogeniteit van de variantie werd beoordeeld met de toets van Levene voordat parametrische toetsen werden toegepast. Wanneer de aanname van homogeniteit van de variantie werd geschonden, werd, indien van toepassing, de correctie van Welch toegepast. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05. Grafieken werden gegenereerd met GraphPad Prism Versie 9.0.