Silentie van LINC0707 verlicht ontsteking en oxidatieve stress in LPS-gestimuleerde BV2-microglia via de miR-145-5p/TRAF6-as bij ruggenmergletsel

Samenvatting

De expressie van plasma LINC0707 is verhoogd bij ruggenmergletsel en bevordert microglia-gemedieerde ontsteking en oxidatieve stress via de miR-145-5p/TRAF6-signaleringsas. Het uitschakelen van LINC0707 vermindert deze pathologische reacties, wat het potentieel ervan als therapeutisch doelwit benadrukt.

Samenvatting

dwarslaesies (SCI) veroorzaken levenslange invaliditeit, verminderen het welzijn aanzienlijk en leggen een aanzienlijke sociaaleconomische last op. Deze studie onderzocht de rol van LINC0707 bij SCI via regulatie van de miR-145-5p/TRAF6-signaleringsas. Plasmaproeven van 30 gezonde proefpersonen en 75 patiënten met SCI werden geanalyseerd op de expressie van LINC0707, miR-145-5p en TRAF6 met behulp van RT-qPCR. De associaties tussen plasmaniveaus van LINC0707 en pro-inflammatoire factoren werden beoordeeld bij patiënten met SCI. BV2-microgliacellen werden blootgesteld aan 10 ng/mL LPS, waarna inflammatie- en oxidatieve stress-gerelateerde factoren werden gemeten. Moleculaire interacties werden beoordeeld met behulp van een dual-luciferase reporterassay. Logistische regressieanalyse werd gebruikt om factoren te identificeren die geassocieerd waren met de expressie van LINC0707. De plasmaniveaus van LINC0707 en TRAF6 waren verhoogd bij patiënten met SCI, terwijl de miR-145-5p-niveaus verlaagd waren. Plasmaniveaus van LINC0707 waren positief gecorreleerd met de plasmaniveaus van inflammatoire factoren. LINC0707 fungeerde als een moleculaire spons voor miR-145-5p, en TRAF6 was een doelgen van miR-145-5p. Remming van LINC0707 verminderde de inflammatoire factoren, pro-oxidatieve stressstoffen en de TRAF6 mRNA-niveaus in BV2-cellen. Remming van miR-145-5p produceerde de tegenovergestelde effecten. Deze bevindingen suggereren dat een verhoogde expressie van LINC0707 geassocieerd is met de ernst van SCI en dat knockdown van LINC0707 microglia-gemedieerde inflammatie en oxidatieve stress kan verlichten door regulatie van de miR-145-5p/TRAF6-signaleringsas.

Inleiding

Ruggenmergletsel (SCI) is een traumatische aandoening waarbij het ruggenmerg, een cruciaal onderdeel van het centrale zenuwstelsel, beschadigd raakt. SCI verstoort direct de neurale geleidingspaden tussen het ruggenmerg en de hersenen, wat leidt tot ernstige beperkingen in de motorische, sensorische en autonome functies^1,2. Epidemiologische studies hebben een jaarlijkse incidentie gerapporteerd van ongeveer 5 gevallen per 10.0 personen, waarbij de ziektegerelateerde mortaliteit oploopt tot 16,7%^3,4. Een Canadese enquête schatte de levenslange rehabilitatiekosten voor elke patiënt met SCI op maximaal US$36.0⁵. De hoge incidentie, mortaliteit en de aanzienlijke kosten die verbonden zijn aan diagnose, behandeling en rehabilitatie maken SCI tot een grote klinische uitdaging die verbeterde therapeutische strategieën vereist.

De pathologische progressie van SCI bestaat uit twee stadia: primair en secundair letsel. Primair letsel is het gevolg van traumatische mechanische compressie of disruptie van het ruggenmergweefsel, terwijl secundair letsel wordt gemedieerd door pathologische processen, waaronder ontsteking en oxidatieve stress^6,7. Onder fysiologische omstandigheden draagt microglia-gemedieerde neuro-inflammatie bij aan de homeostase van het centrale zenuwstelsel^8,9,10. Na SCI raken microglia echter overmatig geactiveerd en laten zij grote hoeveelheden pro-inflammatoire mediatoren vrij^1,12. Deze mediatoren lokken een overmatige productie van reactieve zuurstofcomponenten (ROS) uit, wat leidt tot neuronale beschadiging en sterfte en het secundaire ruggenmergletsel verergert^13,14. Daarom vormen het onderdrukken van overmatige microgliële activatie en het onderbreken van de inflammatoire cascade veelbelovende therapeutische strategieën om neurologisch herstel te bevorderen en de uitkomsten na SCI te verbeteren.

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) vormen een klasse niet-coderende RNA's langer dan 200 nucleotiden die geen eiwitcoderend potentieel hebben¹⁵. Hoewel ze aanvankelijk werden beschouwd als transcriptionele "ruis," worden lncRNA's nu erkend als belangrijke regulatoren van diverse fysiologische en pathologische processen¹⁶. Recente studies hebben aangetoond dat lncRNA's een kritieke rol spelen bij neuraal letsel. Long intergenic non-protein-coding RNA 707 (LINC0707) is naar voren gekomen als een belangrijke regulator van aandoeningen van het zenuwstelsel. Eerdere studies hebben aangetoond dat LINC0707 traumatisch hersenletsel verergert door microglia-gemedieerde ontsteking te versterken¹⁷. Daarnaast hebben Zhu et al. aangetoond dat het uitschakelen van LINC00707 de door lipopolysacharide (LPS)-geïnduceerde ontsteking en apoptose in PC12-cellen significant verminderde¹⁸. Deze bevindingen bieden een eerste theoretische basis voor het onderzoeken van de betrokkenheid van LINC0707 bij SCI. Het blijft echter nog te verduidelijken of LINC0707 de microglia-gemedieerde ontsteking tijdens SCI reguleert.

LncRNA's fungeren als moleculaire sponzen via het mechanisme van competitieve endogene RNA (ceRNA), waarbij ze microRNA's (miRNA's) sequestreren en de expressie van stroomafwaartse doelgenen reguleren¹⁹. Dit regulatiepatroon is op grote schaal betrokken bij de pathogenese van diverse ziekten. Opmerkelijk is dat miR-145-5p significant is gedownreguleerd in SCI-weefsels²⁰ en tijdens LPS-geïnduceerde beschadiging²¹, en dat de overexpressie ervan de inflammatoire en oxidatieve stressresponsen van microglia effectief vermindert². Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) speelt eveneens een cruciale rol in de pathologie van SCI^23,24,25. Desalniettemin moet nog worden opgehelderd of LINC0707, miR-145-5p en TRAF6 gecoördineerde regulatiefuncties uitoefenen bij SCI.

In de huidige studie was de expressie van LINC0707 significant verhoogd in LPS-gestimuleerde microgliacellen. Daarom stelden we de hypothese op dat LINC0707 kan fungeren als een pro-inflammatoire regulator in microglia en dat de knockdown ervan de neuro-inflammatoire respons kan verminderen, waardoor de pathologische progressie van SCI kan worden verlicht. Deze studie onderzocht of LINC0707 de inflammatoire responsen van microglia reguleert en bijdraagt aan de pathogenese van SCI.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Zhangjiakou First Hospital (goedkeuringsnummer 2024-KY-18). Alle deelnemers zijn geïnformeerd over de doelstellingen en potentiële risico's van de studie en hebben vóór inclusie schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven. Veneuze bloedmonsters werden afgenomen van gezonde controles tijdens routinematige lichamelijke onderzoeken en van patiënten met SCI direct na opname in het ziekenhuis. De laboratoriummetingen werden uitgevoerd door het klinisch laboratorium van het ziekenhuis. De onderzoeksinstrumenten die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Proefpersonen
In totaal werden tussen januari 2023 en januari 2025 75 patiënten met SCI geworven in het Zhangjiakou First Hospital. De inclusiecriteria waren SCI bevestigd door computertomografie (CT) of magnetische resonantie-imaging (MRI) en een tijd tussen het letsel en de ziekenhuisopname van ≤ 12 h. De exclusiecriteria waren een voorgeschiedenis van ruggenmerg- of hersentrauma of chirurgie in de voorafgaande 6 maanden; ernstige cardiovasculaire aandoeningen, waaronder myocardinfarct of aritmie; zwangerschap of lactatie; en maligne tumoren, verminderde lever- of nierfunctie, ernstige cerebrovasculaire aandoeningen of infectieziekten.

Volgens de neurologische classificatiestandaarden van de American Spinal Injury Association (ASIA)²⁶ werden 75 patiënten met SCI ingedeeld in de groepen normale neurologische functie (n = 21), incomplete SCI (n = 36) en complete SCI (n = 18). De verdeling van de letselplaatsen was als volgt: cervicaal, 36,0%; thoracaal, 30,7%; en lumbaal, 3,3%. Er werden willekeurig 30 gezonde individuen geworven, afgestemd op de studiepopulatie, om als controlegroep te dienen. Voor alle deelnemers werden baseline klinische gegevens verzameld. De inclusiecriteria voor gezonde individuen waren: geen voorgeschiedenis van ruggenmerg- of hersentrauma, chirurgie of neurologische aandoeningen; geen voorgeschiedenis van chronische inflammatoire ziekten, auto-immuunziekten of maligniteiten; geen ernstige cardiovasculaire, hepatische of renale aandoeningen; geen acute of chronische infectie in de afgelopen 4 weken; geen zwangerschap of lactatie; en een leeftijd en geslacht die overeenkwamen met de SCI-groep.

De Functional Independence Measure (FIM) werd gebruikt om de functionele onafhankelijkheid bij dagelijkse activiteiten te beoordelen. De maximale FIM-score is 126. Tactiele sensatie, acmesthesie en motorische scores werden gebruikt om de sensorische en motorische functies te evalueren. De maximale scores voor tactiele sensatie en acmesthesie waren 12, en de maximale motorische score was 100. Lagere scores duiden op een ernstiger neurologisch defect.

2. Celkweek, modelconstructie en transfectie
Geïmmortaliseerde muizenmicrogliacellen BV2 werden verkregen van het Cell Resource Center van het Shanghai Institute of Biotechnology. Cellen werden gekweekt in high-glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (10 U/mL) en streptomycine (10 U/mL). De cellen werden in stand gehouden bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.

Voor de constructie van het model werden BV2-cellen gedurende 24 h gestimuleerd met 0, 10, 20, 50, 10, 150 of 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS). De optimale LPS-concentratie werd gekozen op basis van de experimentele resultaten.

Voor transfectie werden BV2-cellen gezaaid in 6-well platen en getransfecteerd zodra ze de juiste confluentie hadden bereikt. Een transfectiereagens werd gebruikt in een hoeveelheid van 1,5 µL/well volgens de instructies van de fabrikant. Na 6 u werd het cultuurmedium vervangen door vers medium en werden de cellen nog 24 u verder gekweekt. Het LINC00707-knockdownconstruct, de bijbehorende negatieve controle, het miR-145-5p-oligonucleotide en het bijbehorende controle-oligonucleotide werden elk gebruikt in een concentratie van 50 nM per well. Alle transfectie-experimenten werden onafhankelijk ten minste 5 keer herhaald, met 3 parallelle replica's per onafhankelijk experiment. Gegevens werden statistisch geanalyseerd op basis van de resultaten van ten minste 5 onafhankelijke experimenten.

3. ELISA
De kweeksupernatanten van getransfecteerde en LPS-gestimuleerde BV2-cellen werden geoogst door centrifugatie bij 12,0 × g gedurende 10 min, waarna de spiegels van interleukine-1β (IL-1β), IL-6 en tumornecrosefactor-α (TNF-α) werden gemeten met behulp van de corresponderende ELISA-kits. Kort samengevat werd de assay uitgevoerd door sequentieel te incuberen met een gebiotinyleerd antilichaam, een HRP-streptavidine-conjugaat en een TMB-substraat volgens de instructies van de fabrikant. De absorbentie werd geregistreerd bij 450 nm met een microplate-reader. Cytokinespiegels werden bepaald aan de hand van standaardcurven. Elk monster werd in drievoud gemeten en er werden 6 onafhankelijke experimenten uitgevoerd.

4. ROS-meting
De intracellulaire ROS-niveaus in LPS-gestimuleerde BV2-cellen werden gemeten met een reactive oxygen species assay kit. Kort samengevat werden de cellen 20 min lang geïncubeerd met 10 µmol/L DCFH-DA bij 37 °C. Na incubatie werd het supernatant afgegoten en werden de cellen 3 keer gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om overtollige extracellulaire sonde te verwijderen. De fluorescentie-intensiteit werd gemeten met een microplate-lezer bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 48 nm en 525 nm. De relatieve ROS-niveaus werden berekend op basis van de fluorescentie-intensiteit. Alle monsters werden in drievoud geanalyseerd en het volledige experiment werd onafhankelijk ten minste 5 keer herhaald.

5. Detectie van malondialdehyde, superoxide dismutase en glutathion
Behandelde BV2-cellen werden verzameld en celhomogenaten werden geprepareerd. Monsters werden gecentrifugeerd bij 12.0 × g gedurende 10 min bij 4 °C om het supernatant te verkrijgen. Commerciële detectiekits voor malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) en glutathion (GSH) werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant om hun concentraties in de supernatants van de cellen te bepalen. Alle monsters werden in triplikaat geanalyseerd en het gehele experiment werd minimaal 5 keer onafhankelijk herhaald.

6. Duale luciferase-reporterassay
De fragmenten van de 3' onvertaalde regio (3' UTR) van LINC0707 en TRAF6 die de voorspelde miR-145-5p-bindingsplaatsen bevatten, samen met de overeenkomstige gemuteerde sequenties, werden gekloond in de pmirGLO luciferase-reportervector om wild-type (WT-LINC00707 en WT-TRAF6) en gemuteerde (MUT-LINC0707 en MUT-TRAF6) reporterconstructen te genereren. BV2-cellen werden co-getransfecteerd met de reporterconstructen en miR-145-5p-oligonucleotiden en gedurende 24 h gekweekt. Vervolgens werden de cellen geoogst en werden de vuurvlieg- en Renilla-luciferaseactiviteiten gemeten met een microplatereader.

7. RT-qPCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van een RNA-extractiereagens. De RNA-kwaliteit werd beoordeeld aan de hand van de OD₂₆₀/OD₂₈₀-ratio, waarbij waarden tussen 1,8 en 2,0 als acceptabel werden beschouwd. Ongeveer 1 µg totaal RNA werd omgezet in cDNA met behulp van een reverse transcriptiekit. Genexpressie werd gekwantificeerd via RT-qPCR met een SYBR Green PCR master mix. De reverse transcriptie werd uitgevoerd bij 42 °C gedurende 15 min, gevolgd door inactivatie van de reverse transcriptase bij 95 °C gedurende 3 min. Het gesynthetiseerde cDNA werd bewaard bij −20 °C tot aan de analyse. De kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met een pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 1 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 5 s en annealing en extensie bij 60 °C gedurende 15 s. Fluorescentiesignalen werden verzameld aan het einde van elke annealing- en extensiestap. De smeltcurve-analyse werd uitgevoerd bij 95 °C gedurende 15 s, gevolgd door 60 °C gedurende 1 min. Relatieve expressieniveaus werden berekend met de 2⁻^ΔΔCt-methode. GAPDH of 5S werd gebruikt als interne referentie voor de normalisatie van de genexpressie. De primersequenties waren als volgt: LINC0707, forward 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' en reverse 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, forward 5'-GCCGAGGTCCAGTTCCCA-3' en reverse 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, forward 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' en reverse 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, forward 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' en reverse 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; en 5S, forward 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' en reverse 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische software. De normaliteit van de datadistributie werd beoordeeld met de Shapiro-Wilk-test, waarbij P > 0,05 duidde op een normale distributie. Normaal verdeelde gegevens werden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD, terwijl niet-normaal verdeelde gegevens werden gepresenteerd als de mediaan (P25, P75). Voor continue variabelen met een normale distributie werden vergelijkingen tussen 2 groepen uitgevoerd met de Student's t-test, en vergelijkingen tussen meerdere groepen met een eenweg-ANOVA gevolgd door de post hoc-test van Tukey. Voor niet-normaal verdeelde gegevens werd de Mann-Whitney U-test gebruikt voor vergelijkingen tussen 2 groepen, en de Kruskal-Wallis-test voor vergelijkingen tussen meerdere groepen. De chi-kwadraat-test werd gebruikt om categorische variabelen tussen groepen te analyseren. Univariabele en multivariabele logistische regressieanalyses werden gebruikt om klinische factoren geassocieerd met de expressie van LINC0707 te evalueren. Continue variabelen werden gedichotomiseerd op basis van de mediaan van de cohorte (groep met hoge waarde = 1; groep met lage waarde = 0). Variabelen met P < 0,05 in de univariabele logistische regressieanalyse werden opgenomen in de multivariabele logistische regressieanalyse. Resultaten werden gepresenteerd als odds ratio's (ORs) met 95% betrouwbaarheidsintervallen (CIs), waarbij OR > 1 duidde op een positieve associatie en OR < 1 duidde op een negatieve associatie. Alle experimenten naar het celphenotype omvatten ten minste 4 onafhankelijke biologische replica's, met 3 technische replica's per biologische replica. P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Plasmaniveaus van LINC00707 waren verhoogd bij patiënten met SCI
De baseline klinische kenmerken van 30 gezonde proefpersonen en 75 patiënten met SCI werden geanalyseerd. In vergelijking met gezonde proefpersonen hadden patiënten met SCI aanzienlijk lagere scores voor tactiele sensatie, acmesthésie, motoriek en de Functional Independence Measure (FIM), wat wijst op een verminderde sensorische en motorische functie. Daarnaast waren de serumspiegels van pro-inflammatoire cytokinen significant hoger bij...

Discussie

Ruggenmergletsel (Spinal cord injury, SCI) is een ernstige traumatische aandoening van het centrale zenuwstelsel die resulteert in een verminderde of volledige uitval van de neurale geleiding door het ruggenmerg, wat leidt tot levenslange motorische, sensorische en autonome dysfuncties, evenals ingrijpende fysiologische en psychologische gevolgen²⁹˒³⁰. De ernst van deze beperkingen neemt over het algemeen toe met de omvang van het SCI. In de huidige studie was de expressie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,5 mL microcentrifugebuisje	KIRGEN	KG211	Polypropyleen buis met klikdop, DNase/RNase-vrij, niet-pyrogeen, maximale centrifugale kracht 20.00 × g, voor de opslag en centrifugatie van RNA/eiwitmonsters.
6-wells celkweekplaat	Corning	3516	TC-behandelde polystyreenplaat met een platte bodem, steriel en individueel verpakt; het well-volume is 16,8 mL met een groeioppervlak van 9,5 cm²
Bloedafnamenaald	Becton, Dickinson and Company	367283	BD Vacutainer wegwerpnaald voor bloedafname. Dubbelzijdige naaldontwerp, waarbij het ene uiteinde is bedoeld voor venapunctie en het andere uiteinde verbinding maakt met de houder en de vacuümbuis voor multi-buisafname. Silicone-gecoat om het ongemak voor de patiënt tijdens de insertie te minimaliseren.
Bloedafnamebuizen	Becton, Dickinson and Company	367605	BD Vacutainer vacuümbuisjes voor bloedafname. Verschillende kleurgecodeerde doppen geven diverse additieven aan, die corresponderen met specifieke laboratoriumtests.
BV2 geïmmortaliseerde muis microgliale cellijn	Cell Resource Center van het Shanghai Institute of Biotechnology	RRID: CVCL_0182	Geïmmortaliseerde muis-microgliacellijn die stabiel microglia-specifieke markers (Iba1, CD1b, F4/80) tot expressie brengt. Na LPS-stimulatie secreteren BV2-cellen pro-inflammatoire cytokinen (IL-1β, IL-6, TNF-α) en intracellulaire ROS en MDA ophopen om de in vivo inflammatoire activatie van microglia na letsel aan het ruggenmerg na te bootsen. Cellen worden gekweekt in DMEM met een hoog glucosegehalte, aangevuld met 10% FBS en 1× penicilline-streptomycine, bewaard bij 37 °C met 5% CO2 bevochtigde incubator; gepassaged bij het bereiken van 70% confluentie–80% confluentie om overactivatie te voorkomen.
Cell Malondialdehyde (MDA) Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A03-4-2	Op microplaten gebaseerde colorimetrische kit voor kwantitatieve detectie van cellulair malondialdehyde, een marker voor lipideperoxidatie. MDA reageert onder verhitting met thiobarbituurzuur (TBA) tot rode adducten; de absorbentie wordt gemeten bij 532 nm met een microplaat-spectrofotometer. Geoptimaliseerd voor cellysaatmonsters, high-throughput werking in 96-wells, lineair kwantificeringsbereik dat lage tot matige niveaus van lipideoxidatie in microglia bestrijkt.
CO2 incubator	Thermo Scientific	3111	bevochtigde watergekoelde CO22 incubator met een inner volume van 184 L, IR CO22 sensor, HEPA-luchtfiltratiesysteem om microbiële contaminatie te minimaliseren. Handhaaft een stabiele kweekomgeving bij 37 °C, 5% CO22 en verzadigde vochtigheid voor langdurige adherente celkweek.
Dual Luciferase Reportergene Assay Kit	Beyotime Biotechnology	RG028	Deze dual-luciferase kit maakt sequentiële kwantitatieve detectie van vuurvlieg-luciferase en Renilla-luciferase in cellysaten mogelijk. Het signaal van vuurvlieg-luciferase wordt eerst gemeten met behulp van luciferinesubstraat; het daaropvolgende Renilla-detectiereagens bevat een krachtige quencher die het >9,9% residuele vuurvlieg-luminescentie, wat een zuivere Renilla-signaalaflezing met coelenterazine-substraat waarborgt. De kit bevat een specifieke cellysebuffer voor lyse van adherente cellen, compatibel met een luminometer voor 96-well microplaten. Het vuurvliegreagens is een vooraf gemengde vloeistof voor direct gebruik; de luminescentiewaarden van vuurvlieg en Renilla worden sequentieel geregistreerd om de genormaliseerde relatieve luciferase-activiteit (vuurvlieg/Renilla-ratio) te berekenen voor ceRNA-targetvalidatie.
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11995065	DMEM is een veelgebruikt basaal medium voor het ondersteunen van de groei van veel verschillende zoogdiercellen. Deze formulering bevat een hoge concentratie glucose, L-glutamine, fenolrood en natiumpyruvaat. Het vereist supplementering, gewoonlijk met 10% foetaal runderserum (FBS), en een 5–10% CO2 omgeving om de fysiologische pH te handhaven.
Foetaal runderserum	ALLES GROEN	13011-8611	FBS van premium kwaliteit, laag endotoxinegehalte, mycoplasma-vrij & bacteriofaag-negatief, toegevoegd aan DMEM in een concentratie van 10% v/v om de celgroei te ondersteunen.
GraphPad Prism Versie 9	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Geen gegevens beschikbaar	Wetenschappelijke grafiek- en statistische analyse-software gespecialiseerd in vitro cel-experimentele data. Alle ruwe qPCR-, ELISA-, oxidatieve stress- en dual-luciferase luminescentie-absorbantiewaarden werden geïmporteerd in Prism 9 om normaliteitscontroles en parametrische/niet-parametrische groepvergelijkingen uit te voeren, alle kwantitatieve figuren te genereren en het gemiddelde te berekenen ± SD, exacte P-waarden en 95% BI's, en exporteer figuren met een hoge resolutie (30 dpi) die voldoen aan de publicatiestandaarden van tijdschriften. De originele .prism-projectbronbestanden van alle grafieken zijn, zoals vereist, gedeponeerd in de openbare datarepository.
IBM SPSS Statistics Versie 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	Niet beschikbaar	Uitgebreid statistisch softwarepakket gebruikt voor het sorteren van baseline-gegevens van klinische monsters, normaliteitstesten (Shapiro-Wilk-test), onafhankelijke/niet-gepaarde t-toets en eenweg-ANOVA met Tukey’correctie voor meervoudige vergelijkingen, de non-parametrische Mann-Whitney U-toets en de berekening van exacte P-waarden en 95% betrouwbaarheidsintervallen voor alle menselijke en cellulaire kwantitatieve datasets. Alle klinische patiëntdemografische gegevens en laboratoriumgegevens werden binnen dit platform verwerkt en geanalyseerd.
IL-1β SimpleStep ELISA-kit	Abcam	ab25730	Deze colorimetrische sandwich-ELISA-kit met één wasstap maakt gebruik van de gepatenteerde SimpleStep-technologie, waardoor de volledige detectieprocedure binnen 90 minuten wordt voltooid. De kit meet kwantitatief rat-interleukine-1β in celcultuursupernatant, serum, EDTA/citraat/heparine-plasmaproeven. De detectiegevoeligheid bereikt 26,58 pg/mL, met een lineair kwantificatiebereik van 54,69–350 pg/mL. Een vooraf gecoate, breekbare 8-well strip-microplate is inbegrepen. Absorbantiesignalen worden gedetecteerd bij 450 nm via een microplatelezer om IL-1 te berekenenβ concentratie
IL-6 SimpleStep ELISA-kit	Abcam	ab234570	Een sandwich colorimetrische SimpleStep ELISA-kit geoptimaliseerd voor de kwantitatieve detectie van rat interleukine-6 (IL-6) in celcultuursupernatant, serum en citraat/EDTA/heparine-plasmaproeven. De kit maakt gebruik van een éénstaps-incubatie en een workflow met één enkele wasstap om de totale analysetijd te verkorten tot 90 min, met een detectiegevoeligheid van 43 pg/mL en een lineair kwantificeringsbereik van 125 pg/mL tot 80 pg/mL. Een vooraf gecoate, breekbare microplate met 8-well strips is inbegrepen; absorbentiewaarden worden afgelezen bij 450 nm met een microplate-spectrofotometer voor de uiteindelijke berekening van de IL-6-concentratie.
LightCycler multiwellplaat 96, wit	Roche LifeScience, Zwitserland	4729692001	Half-omranden witte polypropyleen reactieplaten met 96 wells, speciaal geoptimaliseerd voor het LightCycler 96 real-time PCR-instrument. De witte wanden van de wells verminderen interferentie door achtergrondfluorescentie en versterken de signaalreflectie om de detectiegevoeligheid voor transcripten met een lage abundantie te verbeteren. Het uniforme dunwandige ontwerp garandeert een consistente thermische geleidbaarheid in alle wells, compatibel met reactievolumes variërend van 10 tot 50 μLDNase/RNase-vrij en pyrogeenvrij voor amplificatie-assays van RNA-afgeleid cDNA.
LipofectamineTM 30 transfectiereagens	Thermo Fisher Scientific	L30015	Lipid-nanodeeltje transfectiereagens in combinatie met P30 Enhancer maakt hoogefficiënte siRNA/plasmide-transfectie in BV2-microglia mogelijk met een lage cytotoxiciteit.
lnRcute lncRNA First-Strand cDNA Synthese Kit	TIANGEN	KR202-02	Deze kit is speciaal geoptimaliseerd voor de reverse transcriptie van long non-coding RNA's (lncRNA's) met een lage abundantie, een variabel GC-gehalte en complexe secundaire structuren. De kit bevat een onafhankelijke gDNA-verwijderingsbuffer om contaminatie door genomisch DNA vóór de reverse transcriptie te elimineren, en een gespecialiseerde lnR-RT-primer mix om full-length lncRNA-templates te verrijken. De gemodificeerde reverse transcriptase maakt een efficiënte synthese van long-strand cDNA mogelijk vanuit een totale RNA-input variërend van 10 ng tot 2 ng.
lnRcute lncRNA qPCR-detectiekit (SYBR Green)	TIANGEN	FP402	Een gespecialiseerde SYBR Green-gebaseerde quantitative PCR-premix voor de kwantificering van lncRNA. De antilichaam-gemedieerde hot-start DNA-polymerase garandeert een hoge amplificatiespecificiteit; H-competitor-componenten verminderen de interferentie van secundaire structuren bij lncRNA-templates met een hoog GC-gehalte. Compatibel met cDNA gegenereerd met de lnRcute lncRNA reverse transcription kit, en geschikt voor de relatieve expressiekwantificering van lncRNA met een lage abundantie.
miR-145-5p-oligonucleotiden	Generalbiol (Wuhan, China)	Niet beschikbaar	Synthetische miR-145-5p mimic, inhibitor en overeenkomstige negatieve-controle-oligonucleotiden gebruikt om de miR-145-5p activiteit in BV2-cellen te moduleren. Gebruikt in expressie-, inflammatie-, oxidatieve stress- en dual-luciferase reporterassays.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	TIANGEN	KR21-02	Maakt gebruik van een gecombineerde poly(A)-staartaanhechting en reverse transcriptie in een één-buisreactie om de experimentele workflow te vereenvoudigen. De enzymmix bevat E. coli poly(A) polymerase, RNase H-deficiënte reverse transcriptase en RNase-inhibitor, die specifiek gericht is op volwassen enkelstrengs miRNA en amplificatie-interferentie van pre-miRNA met hairpin-structuren voorkomt. Geschikt voor miRNA geëxtraheerd uit cellysaat, plasma en weefselmonsters.
miRcute Plus miRNA qPCR-detectiekit (SYBR Green)	TIANGEN	FP41	SYBR Green premix geoptimaliseerd voor de kwantificering van volwassen miRNA, perfect afgestemd op miRcute reverse transcriptieproducten. Het buffersysteem verbetert de annealing-efficiëntie van primers voor korte miRNA-ampliconen en levert stabiele fluorescentiesignalen en een hoge gevoeligheid voor het detecteren van zwak tot expressie gebrachte miRNA's. U6 snRNA wordt veelvuldig gebruikt als interne referentie voor normalisatie.
Penicilline-streptomycine-oplossing (10×)	Beyotime Biotechnology	C022	Steriel gefilterd mengsel bestaande uit 10.0 U/mL penicilline en 10 mg/mL streptomycine; werkverdunning 1:10 in kweekmedium om bacteriële contaminatie te voorkomen.
Reactive Oxygen Species Assay Kit met verdunningsmiddel	Beyotime Biotechnology	S034M	Deze kit maakt gebruik van de DCFH-DA-fluorescente probe om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren. DCFH-DA penetreert het celmembraan en wordt door intracellulaire esterase gehydrolyseerd tot DCFH, dat vervolgens door ROS wordt geoxideerd om fluorescent DCF te genereren. Compatibel met 96-wells microplaten en fluorescentie-microplaatlezers voor high-throughput detectie (Ex = 48 nm, Em = 525 nm). Uitgerust met een specifieke probediluent en Rosup-positieve controle-reagens om kleuringssignalen te stabiliseren, geschikt voor de detectie van oxidatieve stress in adherente BV2-microglia zonder cellyse.
Reduced Glutathione (GSH) Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A06-1-2	Colorimetrische microplate-kit voor het detecteren van gereduceerd glutathione (GSH), het belangrijkste intracellulaire antioxidant. GSH reageert met dithiodinitrobenzoëzuur (DTNB) om een geel chromogeen product te vormen, waarvan de absorbantie wordt gemeten bij 405 nm op een microplate-lezer. De kit past het standaard buisprotocol aan naar high-throughput detectie in 96-wells microplates voor de analyse van antioxidanten in cellysaten.
si-LINC0707	GenePharma (Shanghai, China)	N.v.t.	Kortstokkend interfererend RNA ontworpen om de expressie van LINC0707 in BV2-cellen te verminderen. Gebruikt voor loss-of-function-experimenten om de effecten van LINC0707-knockdown op ontstekingsreacties, oxidatieve stress, miR-145-5p-expressie en TRAF6-expressie te beoordelen.
si-LINC0707 NC	GenePharma (Shanghai, China)	Niet van toepassing	Niet-targeterend klein interfererend RNA gebruikt als negatieve controle voor si-LINC0707-transfectie. Gebruikt om te controleren op aspecifieke effecten van de transfectieprocedure en siRNA-blootstelling.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	TIANGEN	4992777	Universele SYBR Green kwantitatieve PCR-premix voor relatieve kwantificatie van mRNA, bestaande uit hot-start Taq-polymerase, dNTP's, SYBR Green I en ROX-referentiekleurstof voor fluorescentienormalisatie. Lage aspecifieke amplificatie, stabiele amplificatie-efficiëntie, breed toegepast voor de kwantificatie van mRNA-doelgenen (TRAF6, GAPDH etc.).
Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 8 kleine tafelcentrifuge	Thermo Scientific	75200709	De klassieke keuze voor klinische laboratoria, in staat om tot 24 te verwerken × 5/7 mL bloedafnamebuisjes tegelijk. De R-serie is een gekoelde versie, die monsters die centrifugatie bij lage temperaturen vereisen, beter kan beschermen.
TIANScript II First-Strand cDNA Synthesis Kit	TIANGEN	GKR107-02	Ontworpen voor algemene mRNA-omgekeerde transcriptie om cDNA van grote lengte tot 12 kb te genereren. Uitgerust met zowel Oligo(dT)15- als random hexameerprimers voor flexibele primingstrategieën. De gemodificeerde M-MLV-omgekeerde transcriptase leest efficiënt door mRNA-structuren met een hoog GC-gehalte en complexe secundaire structuren, met een brede compatibiliteit voor downstream mRNA-qPCR-amplificatie.
TNF-α SimpleStep ELISA-kit	Abcam	ab236712	Een snelle SimpleStep sandwich ELISA-kit met één enkele wasstap, geoptimaliseerd voor kwantitatieve detectie van tumornecrosefactor-α bij rattenα (TNF-α) in cellcultuursupernatant, serum en diverse plasmaproeven. De totale assayduur is 90 min, met een ultra-hoge sensitiviteit van 1,04 pg/mL en een lineair detectiebereik van 15,63 pg/mL tot 100 pg/mL. Uitgerust met afneembare 8×voorbehandelde plaat met 12 putjes; OD-waarden bij 450 nm worden geregistreerd voor de uiteindelijke TNF-α kwantitatieve berekening
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) Assay Kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A01-3-2	WST-1 chromogene microplatekit voor het detecteren van de totale SOD-enzymactiviteit. SOD elimineert superoxide-anionradicalen en remt de WST-1-reductiereactie. De absorbentie wordt geregistreerd bij 450 nm via een microplatelezer voor de berekening van de activiteit. Geschikt voor celhomogenaten, serum en weefselmonsters, met een stabiele kleurontwikkeling en een hoge reproduceerbaarheid voor de evaluatie van de antioxidantcapaciteit.
TRIzol-reagens	Thermo Fisher Scientific	15596018	Monofasisch fenol-guanidine-isothiocyanaat-reagens voor éénstapsisolatie van totaal RNA uit gecultiveerde microglia-cellen; extraheert gelijktijdig DNA en eiwit uit identieke monsters.