Deze studie optimaliseert de Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-assay met behulp van actieve kool en bentoniet voor de detectie van pathogene Vibrio-soorten in zeevruchten. Deze voorbehandeling verwijdert effectief reactieremmers, wat resulteert in significant snellere, gevoeligere en kosteneffectievere diagnostiek in vergelijking met conventionele methoden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Verhoogde gevoeligheid loop-amplificatie met behulp van actieve kool en bentoniet voor de detectie van Vibrio spp. in visproducten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het genus Vibrio bevat meer dan 100 soorten, waarvan 12 als pathogeen voor mensen worden beschouwd; de soorten die het meest frequent in voedsel worden geïsoleerd, zijn V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus. Het belangrijkste probleem bij de identificatie ervan via conventionele microbiologische methoden zijn de hoge kosten en de lange diagnoseperiode. Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) werd gebruikt voor de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus. Actieve kool met bentoniet (ACB) werd gebruikt om inhibitoren te verwijderen, waardoor de gevoeligheid van de test verbeterde; pH 6, 7 en 9 werden getest, evenals verschillende contacttijden tussen het monster en ACB. De gevoeligheid van de LAMP-methode verbeterde wanneer actieve kool en bentoniet werden gebruikt om reactie-inhibitoren te verwijderen in monsters van garnalen, vis en oesters. De LAMP-gevoeligheid, negatieve voorspellende waarde, positieve voorspellende waarde en LAMP-specificiteit waren gelijk aan of groter dan 90% voor alle geteste monsters. De LAMP-methode zou een alternatief kunnen zijn voor de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus in visproducten vanwege de snellere toepassing, hogere gevoeligheid en lagere kosten dan de standaardmethode.
Inleiding
Soorten van het geslacht Vibrio komen wijdverspreid voor in mariene omgevingen en kunnen geassocieerd zijn met vissen, weekdieren of kreeftachtigen op een manier die zowel pathogeen als commensaal kan zijn. Er is gerapporteerd dat 12 soorten pathogeen kunnen zijn voor mensen, waarbij Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus een hogere isolatiefrequentie vertonen in visproducten. In de Verenigde Staten schatten gezondheidsautoriteiten dat Vibrio spp. meer dan 80.000 infecties per jaar veroorzaken1,2,3,4,5. De isolatie van Vibrio spp. wordt bereikt via conventionele methoden die bestaan uit pre-enrichment, kweek in selectieve media en bevestiging via biochemische en serologische tests6,7. Deze conventionele methoden worden beperkt door de lange tijd die nodig is om de pathogeen te isoleren (tot 5 dagen) en hun gebrek aan onderscheidend vermogen, waardoor nauw verwante soorten binnen het geslacht Vibrio vaak niet nauwkeurig kunnen worden gedifferentieerd vanwege vergelijkbare fenotypische en biochemische profielen6,7,8.
Alternatief is Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) beschreven als een snelle, nauwkeurige en goedkope moleculaire techniek voor de identificatie van pathogenen9,10. Deze methode is zeer kosteneffectief en sneller dan conventionele PCR, aangezien er geen geavanceerde apparatuur zoals thermocyclers nodig is9. De LAMP-methode maakt het mogelijk om in één enkele stap het doelgen te detecteren door troebeling in de reactiebuis waar te nemen, veroorzaakt door de neerslag van magnesiumpyrofosfaat; dit is een stabiel reactieproduct bij 65 °C, de temperatuur die bij de LAMP-techniek wordt gebruikt, waardoor de toename in troebeling correleert met de hoeveelheid gesynthetiseerd DNA, wat het gebruik van agarosegelen en transilluminatoren overbodig maakt11,12,13,14,15.
De detectiegevoeligheid voor deze pathogenen kan worden verbeterd door het elimineren van reactieremmers zoals proteasen, calciumionen, glycogeen en lipiden, die Bst polymerase kunnen remmen of aan het DNA-doel kunnen binden, waardoor amplificatie wordt voorkomen13,16,17,18,19,20. Er is gerapporteerd dat de combinatie van actieve kool met bentoniet (ACB) een hoge efficiëntie heeft bij het elimineren van amplificatieremmers, waardoor de gevoeligheid van de detectie van Escherichia coli in oestermonsters toeneemt en de kosten dalen, aangezien ACB goedkoper is dan het gebruik van commerciële kits21.
In dit werk stellen we voor om de LAMP-methode te optimaliseren door gebruik te maken van actieve kool en bentoniet om de gevoeligheid bij de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus rechtstreeks uit visproducten te verhogen. Deze geoptimaliseerde methode biedt praktische richtlijnen voor routinemonitoring en kwaliteitscontrole in de voedingsmiddelenindustrie en is zeer geschikt voor de snelle diagnose van pathogenen, waardoor langdurige pre-enrichment-fasen worden vermeden. Wat betreft de verwachte prestaties vertoont de methode een uitstekende gevoeligheid (groter dan 98%) en specificiteit (100%) in matrices zoals vis en garnalen. Een belangrijke beperking om rekening mee te houden is echter dat bij sterk besmette monsters van oorsprong, zoals oesters, het ACB-systeem niet alle interfererende organische stoffen volledig kan elimineren, wat de gevoeligheid van de assay enigszins kan verlagen (94%–98%).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie betrok geen menselijke proefpersonen of gewervelde dieren; daarom was institutionele ethische goedkeuring niet vereist. De gebruikte reagentia en apparatuur zijn vermeld in de Tabel met materialen.
1. Gebruikte bacteriële stammen en extractie van DNA
De stammen Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 en V. alginolyticus ATCC 17749 werden gekweekt in brain heart infusion (BHI) bouillon met 2% NaCl gedurende 24 h bij 37 °C. De stammen Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 en Salmonella Typhimurium ATCC 14028 werden gekweekt in BHI bouillon zonder natriumchloride gedurende 24 h bij 37 °C om als negatieve controles in de tests te dienen. Voor de DNA-extractie werd een overnight-cultuur gecentrifugeerd bij 16,000 x g gedurende 6 min bij 25 °C in een centrifuge. Het supernatant werd voorzichtig weggegoten om de celpellet niet te verstoren, waarna de pellet volledig werd geresuspendeerd door pipetteren in 500 μL TAE-bufferoplossing (Tris-azijnzuur-EDTA, pH 8). De suspensie werd 6 min gekookt om de cellen te lyseren en vervolgens onmiddellijk 5 min op ijs gekoeld. Er werd een laatste centrifugatie uitgevoerd om celresten te pelletteren, wat resulteerde in een helder supernatant dat het geëxtraheerde DNA bevatte, dat vervolgens als template werd gebruikt voor amplificatie via LAMP22,23.
2. LAMP-procedure
De primers die werden gebruikt in LAMP (Tabel 1) werden getest om de specificiteit bij de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus te bevestigen. De identificatie van elke Vibrio-soort met behulp van LAMP werd uitgevoerd in reactiebuisjes door een eindvolume van 25 μL van het mengsel voor te bereiden dat bestond uit: 1,6 μM van elke primer, 1,4 mM van een dNTP-mengsel, 6 mM MgSO4, 800 mM betaine, 8 U Bst DNA-polymerase en 5 μL template-DNA. Het reactiemengsel werd voorzichtig gemengd en 60 min lang geïncubeerd in een waterbad bij 65 °C. Na de incubatietijd werden de amplificatieproducten gescheiden op een 1,5% agarosegel. De amplificatieproducten werden vervolgens gekleurd met 1 μL van een fluorescerende DNA-kleurstof, verdund 1:100, en gevisualiseerd met een blauwlicht-transilluminator. Een andere techniek om te bepalen of de test positief was voor de identificatie van het pathogeen, hield in dat er 4 μL hydroxynaphtholblauw (HNB, 125 μM) aan de reactiebuisjes werd toegevoegd en de kleurverandering met het blote oog werd waargenomen. Een positieve test werd aangegeven door de vorming van een blauwe kleur en een negatieve door een violette kleur24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 en Salmonella Typhimurium ATCC 14028 werden gebruikt als negatieve controles voor de LAMP-methode. De verkregen amplificaties in LAMP werden gescheiden op een agarosegel en waargenomen met een transilluminator. De resulterende beelden werden vastgelegd en gedigitaliseerd met de MS 1D Analysis Software.
3. Behandeling van monsters van oesters, garnalen en vis voor de eliminatie van Vibrio spp. die van nature in de monsters aanwezig zijn
Er werden tien oestermonsters, 10 garnalenmonsters en 10 vismonsters verkregen met een geschat gewicht van 200 g per stuk. Om natuurlijk voorkomende Vibrio-cellen te verwijderen, werd de eerder gepubliceerde methodologie gevolgd21. Van elk monster werd vijftig gram (50 g) gewogen en mechanisch gehomogeniseerd in een paddle-blender bij 260 rpm gedurende 1 min, waarbij een uniforme weefselsuspensie ontstond, die vervolgens 72 h bij -70 °C werd bewaard. Daarna werden de monsters volledig ontdooid in een waterbad van 40 °C en gewassen met 300 mL zout fosfaatgebufferde oplossing (0,85% NaCl, pH 9). Om te bevestigen dat de voorgaande procedure de Vibrio in de monsters succesvol had geëlimineerd, werd de pre-enrichment methodologie uitgevoerd zoals beschreven in hoofdstuk 9 van de Bacteriological Analytical Manual van de Food and Drug Administration7. De zoutoplossing met het monster werd vervangen door 450 mL alkalisch peptone water (APW, pH 9). Vervolgens werden zorgvuldig seriële verdunningen in APW voorbereid tot een 10⁻3 verdunning en 24 h geïncubeerd. Ten slotte werd een aliquot uit elke buis uitgestreken op een selectief medium van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar en 24 h bij 37 °C geïncubeerd om visueel de afwezigheid van kenmerkende Vibrio-kolonies te bevestigen. Alle tests werden in triplikaat uitgevoerd.
4. Bereiding van geactiveerde koolstof met bentoniet (ACB) en evaluatie van het cellulair herstel
Om de omstandigheden te bepalen waarbij ACB het meest efficiënt inhibitoren absorbeert die aanwezig zijn in monsters van visproducten, terwijl de absorptie van doelcellen minimaal blijft, is de gepubliceerde methodologie21 gevolgd om de optimale pH en contacttijd tussen ACB en voedselmonsters vast te stellen. Actieve kool werd grondig gewassen met gedestilleerd water en gedroogd bij 55 °C. Vervolgens werden 32,6 g actieve kool gemengd met 3,04 g bentoniet, continu geroerd bij 150 rpm gedurende 24 u om een uniforme distributie te waarborgen, gedroogd bij 55 °C en gesteriliseerd, resulterend in een fijn, homogeen droog ACB-poeder. Om het cellulair herstel te evalueren na het mengen van Vibrio-cellen met het actieve kool-bentoniet (ACB)-mengsel, werden stammen afzonderlijk gekweekt in BHI-bouillon met 2% NaCl tot een celdichtheid van 1,5 x 104 CFU/mL was bereikt. Daarna werd 1 mL van elke Vibrio-stam afzonderlijk geinoculeerd in 100 mL fosfaatbuffer (PBS, 0,85% NaCl, ingesteld op pH 4, 6 en 9). De bacteriële suspensie werd vervolgens gecombineerd met 4,6 g van de vooraf bereide ACB en gedurende 15, 30 en 60 min geroerd bij 150 rpm om het contact te faciliteren. Na elke aangewezen contacttijd werd een aliquot van 0,1 mL zorgvuldig gescheiden, uitgeplaat op TCBS-agar en 24 u bij 37 °C geïncubeerd voordat de kolonietelling werd uitgevoerd.
5. Evaluatie van de detectielimiet van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus in oester-, garnaal- en vismonsters behandeld met actieve kool en bentoniet
Elke van de gebruikte Vibrio-soorten in deze studie werd gekweekt in BHI-bouillon, en hun celdichtheden werden nauwkeurig ingesteld op 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102, en 76 CFU/mL (A600 nm ~0,25), gemeten met een spectrofotometer. Vervolgens werd 1 mL van elke Vibrio-cultuur gebruikt om 50 g van elk monster (oesters, vis, garnalen) te inoculeren, die vooraf waren behandeld om elke Vibrio-aanwezigheid te elimineren. De geïnoculeerde monsters werden gehomogeniseerd in een paddleblender bij 360 rpm gedurende 30 s en verdund met 450 mL APW (pH 6). Het mengsel werd daarna gecentrifugeerd bij 260 x g gedurende 5 min bij 4 °C om groot debris te scheiden. Het resulterende supernatant werd overgegoten in kolven met 23 g ACB, 15 min geroerd bij 150 rpm om inhibitoren te absorberen, en gefiltst met filterpapier, wat resulteerde in een helder eluaat zonder grote deeltjes. Dit eluaat werd vervolgens gecentrifugeerd bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C, wat leidde tot een zichtbaar celpellet onderin de buis, dat vervolgens werd gebruikt voor DNA-extractie. Elke Vibrio-soort werd geïdentificeerd met de LAMP-methode. Negatieve controles bestonden uit monsters geïnoculeerd met stammen van Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 en Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Het reactiemengsel werd geïncubeerd in een waterbad bij 65 °C gedurende 60 min. Na de incubatietijd werden de amplificatieproducten gescheiden op een 1,5% agarosegel en gekleurd met een fluorescente DNA-kleurstof. Gels werden gevisualiseerd in een blauwlicht-transilluminator. Ten slotte werd 4 μL hydroxynaphtholblue (125 μM) aan elke buis toegevoegd voor detectie met het blote oog24.
6. Bepaling van de positieve voorspellende waarde, negatieve voorspellende waarde, specificiteit en sensitiviteit van de LAMP-methode
De sensitiviteit, specificiteit en voorspellende waarden van de LAMP-methode werden bepaald met behulp van 30 monsters (10 van garnalen, 10 van oesters en 10 van vissen). Elk monster werd geïnoculeerd met de minimale detecteerbare concentratie die voor elke Vibrio-soort was vastgesteld. Om het percentage sensitiviteit en specificiteit, alsook de negatieve voorspellende waarde (NPV) en positieve voorspellende waarde25 te bepalen, werd een kruistabel gebruikt om de resultaten van de ware positieven (TP), ware negatieven (TN), fout-positieven (FP) en fout-negatieven (FN) die tijdens de experimenten zijn verkregen, samen te vatten. (Tabel 2). Op basis van deze gegevens werden de volgende formules toegepast:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gebruikte bacteriële stammen en de extractie van DNA
DNA is succesvol geëxtraheerd uit alle pathogene stammen en negatieve controlestammen om te dienen als templates voor de daaropvolgende LAMP-assays.
LAMP-procedure
De in dit werk gebruikte primers waren specifiek voor de amplificatie van het moleculaire doelwit in elke Vibrio-soort. De door LAMP verkregen amplificatieproducten bij gebruik van Vibrio-stammen toonden aan dat elke prim...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie stelt geoptimaliseerde condities vast om de gevoeligheid van loop-mediated isotherme amplificatie (LAMP) te verbeteren voor het detecteren van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus en V. vulnificus in besmette monsters van zeevruchten. Door de traditionele voorafgaande verrijkingsfase te omzeilen, wordt de diagnostische tijd aanzienlijk verkort, wat een zeer efficiënte en snelle aanpak biedt voor de directe identificatie van pathogenen uit visproducten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Actieve kool | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentoniet | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bio-Image systems transilluminator | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA-polymerase | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrifuge (model J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| dNTP-mengsel | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hydroxynaftolblauw | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D Analysis Software | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spectrofotometer (model 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (model 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae non-O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Whatman-papier | Whatman | 1001-055 |
Referenties
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.