Deze studie optimaliseert de Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-assay met behulp van actieve kool en bentoniet voor de detectie van pathogene Vibrio-soorten in zeevruchten. Deze voorbehandeling verwijdert effectief reactieremmers, wat resulteert in significant snellere, gevoeligere en kosteneffectievere diagnostiek in vergelijking met conventionele methoden.
Onderzoeksartikel
Verhoogde gevoeligheid loop-amplificatie met behulp van actieve kool en bentoniet voor de detectie van Vibrio spp. in visproducten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het genus Vibrio bevat meer dan 100 soorten, waarvan 12 als pathogeen voor mensen worden beschouwd; de soorten die het meest frequent in voedsel worden geïsoleerd, zijn V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus. Het belangrijkste probleem bij de identificatie ervan via conventionele microbiologische methoden zijn de hoge kosten en de lange diagnoseperiode. Loop-mediated isothermal Amplification (LAMP) werd gebruikt voor de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus. Actieve kool met bentoniet (ACB) werd gebruikt om inhibitoren te verwijderen, waardoor de gevoeligheid van de test verbeterde; pH 6, 7 en 9 werden getest, evenals verschillende contacttijden tussen het monster en ACB. De gevoeligheid van de LAMP-methode verbeterde wanneer actieve kool en bentoniet werden gebruikt om reactie-inhibitoren te verwijderen in monsters van garnalen, vis en oesters. De LAMP-gevoeligheid, negatieve voorspellende waarde, positieve voorspellende waarde en LAMP-specificiteit waren gelijk aan of groter dan 90% voor alle geteste monsters. De LAMP-methode zou een alternatief kunnen zijn voor de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus in visproducten vanwege de snellere toepassing, hogere gevoeligheid en lagere kosten dan de standaardmethode.
Inleiding
Soorten van het geslacht Vibrio komen wijdverspreid voor in mariene omgevingen en kunnen geassocieerd zijn met vissen, weekdieren of kreeftachtigen op een manier die zowel pathogeen als commensaal kan zijn. Er is gerapporteerd dat 12 soorten pathogeen kunnen zijn voor mensen, waarbij Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus een hogere isolatiefrequentie vertonen in visproducten. In de Verenigde Staten schatten gezondheidsautoriteiten dat Vibrio spp. meer dan 80.000 infecties per jaar veroorzaken1,2,3,4,5. De isolatie van Vibrio spp. wordt bereikt via conventionele methoden die bestaan uit pre-enrichment, kweek in selectieve media en bevestiging via biochemische en serologische tests6,7. Deze conventionele methoden worden beperkt door de lange tijd die nodig is om de pathogeen te isoleren (tot 5 dagen) en hun gebrek aan onderscheidend vermogen, waardoor nauw verwante soorten binnen het geslacht Vibrio vaak niet nauwkeurig kunnen worden gedifferentieerd vanwege vergelijkbare fenotypische en biochemische profielen6,7,8.
Alternatief is Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) beschreven als een snelle, nauwkeurige en goedkope moleculaire techniek voor de identificatie van pathogenen9,10. Deze methode is zeer kosteneffectief en sneller dan conventionele PCR, aangezien er geen geavanceerde apparatuur zoals thermocyclers nodig is9. De LAMP-methode maakt het mogelijk om in één enkele stap het doelgen te detecteren door troebeling in de reactiebuis waar te nemen, veroorzaakt door de neerslag van magnesiumpyrofosfaat; dit is een stabiel reactieproduct bij 65 °C, de temperatuur die bij de LAMP-techniek wordt gebruikt, waardoor de toename in troebeling correleert met de hoeveelheid gesynthetiseerd DNA, wat het gebruik van agarosegelen en transilluminatoren overbodig maakt11,12,13,14,15.
De detectiegevoeligheid voor deze pathogenen kan worden verbeterd door het elimineren van reactieremmers zoals proteasen, calciumionen, glycogeen en lipiden, die Bst polymerase kunnen remmen of aan het DNA-doel kunnen binden, waardoor amplificatie wordt voorkomen13,16,17,18,19,20. Er is gerapporteerd dat de combinatie van actieve kool met bentoniet (ACB) een hoge efficiëntie heeft bij het elimineren van amplificatieremmers, waardoor de gevoeligheid van de detectie van Escherichia coli in oestermonsters toeneemt en de kosten dalen, aangezien ACB goedkoper is dan het gebruik van commerciële kits21.
In dit werk stellen we voor om de LAMP-methode te optimaliseren door gebruik te maken van actieve kool en bentoniet om de gevoeligheid bij de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus rechtstreeks uit visproducten te verhogen. Deze geoptimaliseerde methode biedt praktische richtlijnen voor routinemonitoring en kwaliteitscontrole in de voedingsmiddelenindustrie en is zeer geschikt voor de snelle diagnose van pathogenen, waardoor langdurige pre-enrichment-fasen worden vermeden. Wat betreft de verwachte prestaties vertoont de methode een uitstekende gevoeligheid (groter dan 98%) en specificiteit (100%) in matrices zoals vis en garnalen. Een belangrijke beperking om rekening mee te houden is echter dat bij sterk besmette monsters van oorsprong, zoals oesters, het ACB-systeem niet alle interfererende organische stoffen volledig kan elimineren, wat de gevoeligheid van de assay enigszins kan verlagen (94%–98%).
Protocol
Deze studie betrok geen menselijke proefpersonen of gewervelde dieren; daarom was institutionele ethische goedkeuring niet vereist. De gebruikte reagentia en apparatuur zijn vermeld in de Tabel met materialen.
1. Gebruikte bacteriële stammen en extractie van DNA
De stammen Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 en V. alginolyticus ATCC 17749 werden gekweekt in brain heart infusion (BHI) bouillon met 2% NaCl gedurende 24 h bij 37 °C. De stammen Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 en Salmonella Typhimurium ATCC 14028 werden gekweekt in BHI bouillon zonder natriumchloride gedurende 24 h bij 37 °C om als negatieve controles in de tests te dienen. Voor de DNA-extractie werd een overnight-cultuur gecentrifugeerd bij 16,000 x g gedurende 6 min bij 25 °C in een centrifuge. Het supernatant werd voorzichtig weggegoten om de celpellet niet te verstoren, waarna de pellet volledig werd geresuspendeerd door pipetteren in 500 μL TAE-bufferoplossing (Tris-azijnzuur-EDTA, pH 8). De suspensie werd 6 min gekookt om de cellen te lyseren en vervolgens onmiddellijk 5 min op ijs gekoeld. Er werd een laatste centrifugatie uitgevoerd om celresten te pelletteren, wat resulteerde in een helder supernatant dat het geëxtraheerde DNA bevatte, dat vervolgens als template werd gebruikt voor amplificatie via LAMP22,23.
2. LAMP-procedure
De primers die werden gebruikt in LAMP (Tabel 1) werden getest om de specificiteit bij de identificatie van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus te bevestigen. De identificatie van elke Vibrio-soort met behulp van LAMP werd uitgevoerd in reactiebuisjes door een eindvolume van 25 μL van het mengsel voor te bereiden dat bestond uit: 1,6 μM van elke primer, 1,4 mM van een dNTP-mengsel, 6 mM MgSO4, 800 mM betaine, 8 U Bst DNA-polymerase en 5 μL template-DNA. Het reactiemengsel werd voorzichtig gemengd en 60 min lang geïncubeerd in een waterbad bij 65 °C. Na de incubatietijd werden de amplificatieproducten gescheiden op een 1,5% agarosegel. De amplificatieproducten werden vervolgens gekleurd met 1 μL van een fluorescerende DNA-kleurstof, verdund 1:100, en gevisualiseerd met een blauwlicht-transilluminator. Een andere techniek om te bepalen of de test positief was voor de identificatie van het pathogeen, hield in dat er 4 μL hydroxynaphtholblauw (HNB, 125 μM) aan de reactiebuisjes werd toegevoegd en de kleurverandering met het blote oog werd waargenomen. Een positieve test werd aangegeven door de vorming van een blauwe kleur en een negatieve door een violette kleur24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 en Salmonella Typhimurium ATCC 14028 werden gebruikt als negatieve controles voor de LAMP-methode. De verkregen amplificaties in LAMP werden gescheiden op een agarosegel en waargenomen met een transilluminator. De resulterende beelden werden vastgelegd en gedigitaliseerd met de MS 1D Analysis Software.
3. Behandeling van monsters van oesters, garnalen en vis voor de eliminatie van Vibrio spp. die van nature in de monsters aanwezig zijn
Er werden tien oestermonsters, 10 garnalenmonsters en 10 vismonsters verkregen met een geschat gewicht van 200 g per stuk. Om natuurlijk voorkomende Vibrio-cellen te verwijderen, werd de eerder gepubliceerde methodologie gevolgd21. Van elk monster werd vijftig gram (50 g) gewogen en mechanisch gehomogeniseerd in een paddle-blender bij 260 rpm gedurende 1 min, waarbij een uniforme weefselsuspensie ontstond, die vervolgens 72 h bij -70 °C werd bewaard. Daarna werden de monsters volledig ontdooid in een waterbad van 40 °C en gewassen met 300 mL zout fosfaatgebufferde oplossing (0,85% NaCl, pH 9). Om te bevestigen dat de voorgaande procedure de Vibrio in de monsters succesvol had geëlimineerd, werd de pre-enrichment methodologie uitgevoerd zoals beschreven in hoofdstuk 9 van de Bacteriological Analytical Manual van de Food and Drug Administration7. De zoutoplossing met het monster werd vervangen door 450 mL alkalisch peptone water (APW, pH 9). Vervolgens werden zorgvuldig seriële verdunningen in APW voorbereid tot een 10⁻3 verdunning en 24 h geïncubeerd. Ten slotte werd een aliquot uit elke buis uitgestreken op een selectief medium van thiosulfaat-citraat-galzouten-sucrose (TCBS) agar en 24 h bij 37 °C geïncubeerd om visueel de afwezigheid van kenmerkende Vibrio-kolonies te bevestigen. Alle tests werden in triplikaat uitgevoerd.
4. Bereiding van geactiveerde koolstof met bentoniet (ACB) en evaluatie van het cellulair herstel
Om de omstandigheden te bepalen waarbij ACB het meest efficiënt inhibitoren absorbeert die aanwezig zijn in monsters van visproducten, terwijl de absorptie van doelcellen minimaal blijft, is de gepubliceerde methodologie21 gevolgd om de optimale pH en contacttijd tussen ACB en voedselmonsters vast te stellen. Actieve kool werd grondig gewassen met gedestilleerd water en gedroogd bij 55 °C. Vervolgens werden 32,6 g actieve kool gemengd met 3,04 g bentoniet, continu geroerd bij 150 rpm gedurende 24 u om een uniforme distributie te waarborgen, gedroogd bij 55 °C en gesteriliseerd, resulterend in een fijn, homogeen droog ACB-poeder. Om het cellulair herstel te evalueren na het mengen van Vibrio-cellen met het actieve kool-bentoniet (ACB)-mengsel, werden stammen afzonderlijk gekweekt in BHI-bouillon met 2% NaCl tot een celdichtheid van 1,5 x 104 CFU/mL was bereikt. Daarna werd 1 mL van elke Vibrio-stam afzonderlijk geinoculeerd in 100 mL fosfaatbuffer (PBS, 0,85% NaCl, ingesteld op pH 4, 6 en 9). De bacteriële suspensie werd vervolgens gecombineerd met 4,6 g van de vooraf bereide ACB en gedurende 15, 30 en 60 min geroerd bij 150 rpm om het contact te faciliteren. Na elke aangewezen contacttijd werd een aliquot van 0,1 mL zorgvuldig gescheiden, uitgeplaat op TCBS-agar en 24 u bij 37 °C geïncubeerd voordat de kolonietelling werd uitgevoerd.
5. Evaluatie van de detectielimiet van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus in oester-, garnaal- en vismonsters behandeld met actieve kool en bentoniet
Elke van de gebruikte Vibrio-soorten in deze studie werd gekweekt in BHI-bouillon, en hun celdichtheden werden nauwkeurig ingesteld op 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102, en 76 CFU/mL (A600 nm ~0,25), gemeten met een spectrofotometer. Vervolgens werd 1 mL van elke Vibrio-cultuur gebruikt om 50 g van elk monster (oesters, vis, garnalen) te inoculeren, die vooraf waren behandeld om elke Vibrio-aanwezigheid te elimineren. De geïnoculeerde monsters werden gehomogeniseerd in een paddleblender bij 360 rpm gedurende 30 s en verdund met 450 mL APW (pH 6). Het mengsel werd daarna gecentrifugeerd bij 260 x g gedurende 5 min bij 4 °C om groot debris te scheiden. Het resulterende supernatant werd overgegoten in kolven met 23 g ACB, 15 min geroerd bij 150 rpm om inhibitoren te absorberen, en gefiltst met filterpapier, wat resulteerde in een helder eluaat zonder grote deeltjes. Dit eluaat werd vervolgens gecentrifugeerd bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C, wat leidde tot een zichtbaar celpellet onderin de buis, dat vervolgens werd gebruikt voor DNA-extractie. Elke Vibrio-soort werd geïdentificeerd met de LAMP-methode. Negatieve controles bestonden uit monsters geïnoculeerd met stammen van Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 en Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Het reactiemengsel werd geïncubeerd in een waterbad bij 65 °C gedurende 60 min. Na de incubatietijd werden de amplificatieproducten gescheiden op een 1,5% agarosegel en gekleurd met een fluorescente DNA-kleurstof. Gels werden gevisualiseerd in een blauwlicht-transilluminator. Ten slotte werd 4 μL hydroxynaphtholblue (125 μM) aan elke buis toegevoegd voor detectie met het blote oog24.
6. Bepaling van de positieve voorspellende waarde, negatieve voorspellende waarde, specificiteit en sensitiviteit van de LAMP-methode
De sensitiviteit, specificiteit en voorspellende waarden van de LAMP-methode werden bepaald met behulp van 30 monsters (10 van garnalen, 10 van oesters en 10 van vissen). Elk monster werd geïnoculeerd met de minimale detecteerbare concentratie die voor elke Vibrio-soort was vastgesteld. Om het percentage sensitiviteit en specificiteit, alsook de negatieve voorspellende waarde (NPV) en positieve voorspellende waarde25 te bepalen, werd een kruistabel gebruikt om de resultaten van de ware positieven (TP), ware negatieven (TN), fout-positieven (FP) en fout-negatieven (FN) die tijdens de experimenten zijn verkregen, samen te vatten. (Tabel 2). Op basis van deze gegevens werden de volgende formules toegepast:
Resultaten
Gebruikte bacteriële stammen en de extractie van DNA
DNA is succesvol geëxtraheerd uit alle pathogene stammen en negatieve controlestammen om te dienen als templates voor de daaropvolgende LAMP-assays.
LAMP-procedure
De in dit werk gebruikte primers waren specifiek voor de amplificatie van het moleculaire doelwit in elke Vibrio-soort. De door LAMP verkregen amplificatieproducten bij gebruik van Vibrio-stammen toonden aan dat elke primer specifiek was voor de amplificatie van het doelgen in elke Vibrio-soort (Figuur 1).
Behandeling van monsters van oesters, garnalen en vis voor de eliminatie van Vibrio spp. die van nature in de monsters aanwezig zijn
De behandeling om Vibrio spp. te elimineren die van nature op de monsters aanwezig waren, was adequaat, waardoor een reductie van 100% Vibrio spp. werd bereikt. Er was geen groei van Vibrio spp. wanneer de BAM-methode werd gevolgd7.
Bereiding van actief kool met bentoniet (ACB) en evaluatie van het cellulair herstel
De eliminatie van reactieremmers met behulp van actief kool-bentoniet maakte een verhoging van de sensitiviteit bij de detectie van de pathogeen via de LAMP-methode mogelijk. Dit is te danken aan het vermogen van actief kool-bentoniet om remmende stoffen te absorberen die de polymerase tijdens de amplificatieprocedure kunnen beïnvloeden, naast de beperkte retentie van bacteriële cellen (Figuur 2). Het percentage Vibrio-herstel bij verschillende pH-waarden en contacttijden toonde een hoger cellulair herstel (93,4% ± 2,9%) bij een pH van 6 met een contacttijd van 15 min. Bij gebruik van pH 4 was er geen groei van Vibrio, en bij pH 7 en 9 was dit respectievelijk 33,4% ± 7,6% en 67,2% ± 5,8%. Dit werk suggereert het gebruik van pH 6 om de detectiesensitiviteit van de methode te verbeteren.
Evaluatie van de detectielimiet van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus en V. alginolyticus in oester-, garnalen- en vismonsters behandeld met actieve kool en bentoniet
In oestermonsters was de detectielimiet voor V. cholerae 150 CFU/g; voor V. alginolyticus, V. vulnificus en V. parahaemolyticus was deze 3 x 102 CFU/g. In garnalen- en vismonsters werd V. cholerae gedetecteerd bij een minimale concentratie van 150 CFU/g, terwijl dit voor V. alginolyticus, V. vulnificus en V. parahaemolyticus 76 CFU/g was. De resultaten verkregen met de LAMP-methode toonden aan dat het gebruik van hydroxinaftolblauw de LAMP-gevoeligheid beïnvloedde door reactieremmers te elimineren in monsters die niet met ACB waren behandeld (Figuur 3). We stelden vast dat de LAMP-gevoeligheid hoger was wanneer monsters met ACB waren behandeld.
Bepaling van de positieve voorspellende waarde, negatieve voorspellende waarde, specificiteit en sensitiviteit van de LAMP-methode
De diagnostische prestaties van de geoptimaliseerde loop-mediated isotherme amplificatie (LAMP)-methode, met en zonder voorbehandeling met geactiveerde koolstof-bentoniet (ACB), werden systematisch geëvalueerd over 150 tests om de robuustheid vast te stellen (Tabel 3). De eliminatie van natuurlijke voedselinhibitoren met behulp van het ACB-systeem verbeterde alle diagnostische parameters (sensitiviteit, specificiteit, positieve voorspellende waarde (PPV) en negatieve voorspellende waarde (NPV)) significant naar waarden van 90% of hoger voor alle matrices, vergeleken met onbehandelde monsters.
In vis- en garnalenmonsters behandeld met ACB vertoonde de assay een maximale diagnostische prestatie, met een sensitiviteit, specificiteit, PPV en NPV van 100% (Figuur 4). Omgekeerd werd bij onbehandelde monsters van vis en garnalen de assay ernstig belemmerd door de aanwezigheid van matrix-afgeleide inhibitoren, waardoor de detectiesensitiviteit respectievelijk daalde tot 62,5% en 52,5%. Voor de zeer complexe oestermatrix slaagde de ACB-behandeling erin om belangrijke interferentie te verminderen, wat resulteerde in een hoge algehele sensitiviteit van 95,0% en een NPV van 71,4% (Figuur 5). In tegenstelling hiermee vertoonden onbehandelde oestermonsters een kritische daling in detectiesensitiviteit tot 32,5% en een NPV van 15,6% vanwege de massale aanwezigheid van organische verbindingen, zoals glycogeen en lipiden, die de polymerase inhiberen.
De diagnostische specificiteit van de LAMP-methode bleef 100% over alle 150 tests, ongeacht het type matrix of de voorbehandeling, waarbij nul fout-positieve resultaten werden geregistreerd. Deze absolute specificiteit wordt toegeschreven aan het zeer selectieve ontwerp van de primer-sets die gericht zijn op soortspecifieke genen (gyrB voor V. alginolyticus, ompW voor V. cholerae, tlh voor V. parahaemolyticus en vvhA voor V. vulnificus). Deze statistische bevindingen tonen aan dat de geoptimaliseerde ACB-LAMP-methode een zeer betrouwbare en robuuste tool is voor de snelle, cultuurvrije detectie van pathogene Vibrio-soorten in diverse visproducten.
Ten slotte concluderen we dat het gebruik van de LAMP-methode in combinatie met een voorbehandeling om reactieremmers te elimineren, de sensitiviteit van de detectie van pathogenen in voedingsmiddelen met behulp van de LAMP-methode kan verhogen. Daarom zou deze techniek, toegepast op het opsporen van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus en V. vulnificus, nuttig kunnen zijn bij monitoring om infecties veroorzaakt door deze micro-organismen te voorkomen.
DATAbeschikbaarheid:
Alle ruwe gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie, inclusief de numerieke colony counts van het bacteriële herstel (CFU/g) onder verschillende pH-waarden en contacttijden, alsook de volledige diagnostische prestatieresultaten voor alle 150 validatieproeven, zijn openbaar beschikbaar in de Zenodo-repository op https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. De bijbehorende dataset bevat het volledige spreadsheetbestand (Aanvullend bestand 1).
Figuur 1: Specificiteitsanalyse van LAMP-geamplificeerde producten op een 1,5% agarosegel. Baan M, 100 bp moleculair groottemarkeerder; Baan 1, negatieve controle (Escherichia coli ATCC 25922); Baan 2, negatieve controle (Listeria monocytogenes ATCC 49594); Baan 3, V. alginolyticus ATCC 17749; Baan 4, V. cholerae non-O1 CECT 557; Baan 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; Baan 6, V. vulnificus ATCC 29037. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2Percentage herstel van Vibrio stammen onder verschillende pH-condities en contacttijden met het mengsel van geactiveerde koolstof-bentoniet (ACB). Het percentage cellulair herstel (%) werd bepaald na inoculatie Vibrio stammen bij 1,5 × 104 CFU/mL in PBS bij een pH van 4,0, 6,0, 7,0 en 9,0, en behandeling met 4,6 g ACB gedurende 15 min, 30 min en 60 min. Het datapunt bij pH 6,0 en een contacttijd van 15 min vertoont een optimale cellulaire terugwinning (93,4% ± 2,9%), wat aantoont dat een korte contacttijd voldoende is om de doelcellen terug te winnen terwijl een hoge efficiëntie bij de verwijdering van inhibitoren behouden blijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Detectielimiet van LAMP-geamplificeerde producten in kunstmatig gespike seafood-monsters. Amplificatieresultaten in (A) oesters, (B) garnalen en (C) vismonsters gespike met seriële verdunningen van Vibrio-soorten en voorbehandeld met ACB. Buisjes: (1) Negatieve controle; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae non-O1; en (6) V. mimicus (gebruikt als doelcontrole). Bovenpaneel: Visuele colorimetrische detectie met behulp van 4 μL Hydroxynaphthol Blue (HNB, 125 μM) bij inspectie met het blote oog, waarbij positieve reacties blauw kleuren en negatieve reacties violet blijven. Onderpaneel: Fluorescentiegebaseerde detectie met gebruik van Midori Green Advanced (MGA) kleurstof gevisualiseerd onder een blauwe licht-transilluminator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijkende diagnostische prestatieparameters van de LAMP-methode met en zonder verwijdering van inhibitoren. Vergelijking van de totale sensitiviteit, specificiteit, positieve voorspellende waarde (PPV) en negatieve voorspellende waarde (NPV) in vis-, shrimp- en oestermonsters gespiked op de minimale detectielimieten (n = 10 proeven per soort/matrix-combinatie, voor een totaal van 150 proeven). De staven vergelijken monsters die voorbehandeld zijn met het geoptimaliseerde mengsel van geactiveerde koolstof-bentoniet (ACB) met onbehandelde controles (geen verwijdering van inhibitoren). De spiking-niveaus werden vastgesteld op 150 CFU/g voor V. cholerae in alle matrices; 300 CFU/g voor V. parahaemolyticus, V. alginolyticus en V. vulnificus in oester; en 76 CFU/g in vis en shrimp. Voorbehandeling met ACB herstelde alle diagnostische parameters succesvol naar ≥90% in alle matrices. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Doelspecifieke sensitiviteit en specificiteit van de geoptimaliseerde ACB-LAMP-methode in verschillende seafood-matrices. Individuele diagnostische prestaties voor V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus in monsters van vis, garnalen en oesters (n = 10 tests per doel/voedselcombinatie) voorbehandeld met ACB. De specificiteit bedroeg 100% voor alle doelen dankzij het soortspecifieke primerontwerp dat gericht is op de gyrB, ompW, tlh en vvhA genen. De sensitiviteit bereikte 100% in vis- en garnalenmatrices, waarbij een lichte afname naar 90% werd waargenomen in oesters door de hoge baseline-complexiteit van de organische matrix die de reactie verstoorde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Primers gebruikt in Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)-assays. Beschrijving van forward en backward inner primers (FIP, BIP), outer primers (F3, B3) en loop primers (LF, LB) ontworpen voor soortspecifieke targeting van V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) en V. cholerae (ompW). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Kruistabel voor het beoordelen van de diagnostische prestatieparameters van de LAMP-methode. Standaard 2x2-matrixopstelling gebruikt om True Positives (TP), True Negatives (TN), False Positives (FP) en False Negatives (FN) te classificeren en samen te vatten om de sensitiviteit, specificiteit, positieve voorspellende waarde (PPV) en negatieve voorspellende waarde (NPV) in gespikede en niet-gespikede seafoodmonsters te berekenen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Ruwe datasets ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie stelt geoptimaliseerde condities vast om de gevoeligheid van loop-mediated isotherme amplificatie (LAMP) te verbeteren voor het detecteren van V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus en V. vulnificus in besmette monsters van zeevruchten. Door de traditionele voorafgaande verrijkingsfase te omzeilen, wordt de diagnostische tijd aanzienlijk verkort, wat een zeer efficiënte en snelle aanpak biedt voor de directe identificatie van pathogenen uit visproducten.
Een belangrijke methodologische verbetering in deze studie is de optimalisatie van de stap voor het verwijderen van remmers. Voorgaande methodieken maakten gebruik van een pH van 4 voorafgaand aan de amplificatie21; dit resulteerde echter in een nulherstel van Vibrio-stammen, voornamelijk omdat Vibrio-soorten zeer gevoelig zijn voor zure omgevingen26. Om dit aan te pakken, werden de condities systematisch aangepast om gelijktijdig het cellulair herstel te verbeteren en natuurlijk voorkomende reactieremmers te elimineren. Het resuspenderen van actieve kool met bentoniet (ACB) in een buffersolution bij pH 6, gevolgd door 15 min agitatie met het monster, bleek de optimale conditie te zijn. Deze modificatie maximaliseert de elektrostatische afstoting tussen de bacteriën en de ACB door het isoelektrisch punt van het bacteriële membraan te benaderen21,27,28, waardoor het verlies van doelcellen wordt geminimaliseerd. Bijgevolg leverde deze methodologische verbetering een detectiegevoeligheid op die 2–50 keer groter was dan die van monsters die zonder ACB-behandeling waren verwerkt.
Terwijl deze methodologische verbeteringen apart staan, kan de succesvolle implementatie van dit protocol expliciete probleemoplossing vereisen als er veelvoorkomende problemen optreden. Een frequent probleem tijdens de implementatie is de onvolledige verwijdering van organisch materiaal, wat de polymerase kan hinderen en de LAMP-gevoeligheid kan verminderen, vooral in sterk vervuilde matrices. Als de amplificatie mislukt of de gevoeligheid afneemt, moet de probleemoplossing eerst beginnen met het controleren van de pH van het ACB-monster-mengsel; afwijkingen van pH 6 kunnen leiden tot celdood (indien te zuur) of ontoereikende absorptie van remmers. Daarnaast moeten onderzoekers, indien er vals-negatieven optreden ondanks een correcte ACB-behandeling, ervoor zorgen dat de contacttijd 15 min niet overschrijdt, aangezien langdurige blootstelling kan leiden tot onbedoelde retentie van doelcellen door de matrix. Bij detectie met het blote oog kunnen ambigue kleurveranderingen worden opgelost door ervoor te zorgen dat calciumionen uit de matrix volledig zijn verwijderd, aangezien deze anders de neerslag van magnesiumpyrofosfaat in de LAMP-assay kunnen verstoren.
Dit werk rapporteert voor het eerst de identificatie van Vibrio spp. in vismonsters met behulp van de LAMP-methode in combinatie met een ACB-voorbehandeling. Dit onderzoek bevordert het wetenschappelijke veld door het vaststellen van een snelle, betrouwbare en kosteneffectieve identificatiemethode voor visproducten13,19,23,29. Hoewel conventionele PCR een alternatieve benadering vormt om deze hypothese te testen, tonen de robuuste specificiteit en voorspellende waarden die hier zijn verkregen aan dat de ACB-LAMP-assay een superieure optie is. Een kritisch methodologisch voordeel van deze techniek is de onafhankelijkheid van geavanceerde en dure apparatuur, zoals thermocyclers, elektroforesekamers en transilluminatoren9,30. Bovendien vereenvoudigt de visuele detectie van resultaten via hydroxynaphthol blue de interpretatie van de gegevens aanzienlijk.
Ondanks de bereikte hoge sensitiviteit en specificiteit is een opmerkelijke beperking van de studie waargenomen bij matrices met een hoge basiscontaminatie, zoals oestermonsters. In deze gevallen kan het ACB-systeem niet alle interfererende organische stoffen volledig elimineren, wat de sensitiviteit van de assay enigszins verlaagt in vergelijking met vis- of garnalenmonsters. Tot slot benadrukken de potentiële toepassingen van deze methode de bruikbaarheid ervan voor routinematige monitoring met een hoge doorvoercapaciteit in de voedingsindustrie om Vibrio-gerelateerde infecties te voorkomen. Toekomstige richtingen zouden prioriteit moeten geven aan de automatisering van de DNA-extractie en de ACB-stappen voor het verwijderen van inhibitoren. De automatisering van deze cruciale methodologische kenmerken is een belangrijk voordeel dat de handmatige tijd aanzienlijk zal verminderen, menselijke fouten zal minimaliseren en variabelen bij het oplossen van problemen zal standaardiseren, waardoor de grootschalige toepassing van deze techniek in industriële kwaliteitscontrolelaboratoria wordt gefaciliteerd.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Actieve kool | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentoniet | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Bio-Image systems transilluminator | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Bst DNA-polymerase | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrifuge (model J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| dNTP-mengsel | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Hydroxynaftolblauw | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| MS 1D Analysis Software | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spectrofotometer (model 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (model 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae non-O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Whatman-papier | Whatman | 1001-055 |
Referenties
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.