Methodenartikel

Een microfluïdisch platform voor het bestuderen van de rollen van mechanische compressie bij tumor-immuuncelinteracties in een 3D extracellulaire matrix

26 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72929

⸱

28 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Wij presenteren een protocol voor het gebruik van een microfluïdisch platform om tumor-immuuninteracties in een driedimensionale (3D) omgeving te modelleren. Onze resultaten toonden aan dat Natural Killer (NK)-cellen hun anti-tumoractiviteit behielden onder mechanische compressie.

Samenvatting

Mechanische krachten hebben een aanzienlijke invloed op het vermogen van immuuncellen om tumorcellen te doden in de context van celgebaseerde immunotherapie. Om tumorcellen te doden, moeten immuuncellen krachten uitoefenen op de doelcel en een immuunsynaps vormen, waarlangs cytotoxische moleculen — waaronder granzyme B — worden afgeleverd. Ondanks het belang hiervan is het nog onvoldoende bekend hoe mechanische signalen kunnen worden benut om immuun-gemedieerde doding te verbeteren. Deze kennishiaat is mede te wijten aan het gebrek aan instrumenten die in staat zijn om goed gecontroleerde mechanische stress toe te dienen aan celculturen in een fysiologisch realistische omgeving. Hier beschrijven we een microfluïdisch compressieapparaat dat statische of dynamische compressie kan uitoefenen op tumorsferoïden ingebed in extracellulaire matrix (ECM), terwijl real-time imaging van tumor-immuuninteracties via optische microscopie mogelijk wordt gemaakt.

Het microfluïdische platform bestaat uit 12 compartimenten (6 controle- en 6 functionele compartimenten). Elk compartiment bevat een celkamer die direct onder de drukregeleenheid is geplaatst. Sferoïden ingebed in ECM worden in de celkamer geplaatst. Met behulp van dit platform hebben we de dodingsefficiëntie van Natural Killer (NK)-cellen tegen borsttumorsferoïden (MCF-7) onder gedefinieerde mechanische compressie onderzocht. De resultaten toonden aan dat NK-cellen de primaire drijvers bleven van de dood van tumorsferoïden, ongeacht de mechanische compressie in 1,5 mg/mL collageen. Dit suggereert dat NK-cellen hun antitumoractiviteit kunnen behouden onder compressiestress. Deze bevindingen tonen het nut van dit platform aan voor het onderzoeken van de rol van mechanische krachten bij tumor-immuuninteracties. Lopende studies identificeren de moleculaire mechanismen die immuuncellen in staat stellen zich aan te passen aan compressiestress. Inzichten die uit deze studies worden verkregen, kunnen een veelbelovende therapeutische weg ontsluiten.

Inleiding

Celgebaseerde kankerimmunotherapie is een therapeutische benadering waarbij immuuncellen worden gebruikt om kankercellen te targeten1. Deze strategie heeft een opmerkelijk succes aangetoond bij de behandeling van bloedkankers2,3,4. Echter is het succesniveau dat bij bloedkankers is waargenomen, nog niet volledig vertaald naar de behandeling van solide tumoren5,6,7. Een belangrijke reden voor deze beperking is de immunosuppressieve tumor-micro-omgeving (TME) die specifiek is voor solide tumoren.

De TME wordt gekenmerkt door specifieke mechanische signalen die het cellulaire gedrag kunnen reguleren. Voor een effectieve doding van tumorcellen door immuuncellen is het noodzakelijk dat deze krachten uitoefenen op doelcellen en een immuunsynaps vormen waarlangs cytotoxische moleculen worden afgeleverd8. Daarom kan inzicht in hoe mechanische krachten de functie van immuuncellen beïnvloeden, nieuwe therapeutische strategieën onthullen om de effectiviteit van celgebaseerde immunotherapieën tegen solide tumoren te verbeteren.

Een bepalend mechanisch kenmerk van de solide TME is de compressiespanning die de tumoromgeving uitoefent op de groeiende tumor9,10. Tot op heden hebben de meeste compressiestudies zich gericht op de effecten op het gedrag van tumorcellen10,11. Pas onlangs is de aandacht verschoven naar het begrijpen van hoe compressie immuuncellen binnen de TME beïnvloedt12. Bijgevolg blijven de mechanismen waarmee compressiespanning de migratie van Natural Killer (NK)-cellen, de vorming van de immuunsynaps en de cytotoxische activiteit beïnvloedt, slecht begrepen en onvoldoende gekwantificeerd. Deze lacune vormt een kritieke beperking in ons begrip van hoe mechanische signalen binnen de TME kunnen worden benut om de immuuntargeting van solide tumoren te verbeteren.

Een grote barrière bij het beantwoorden van deze vraag is het gebrek aan experimentele platforms die gecontroleerde en kwantificeerbare compressie kunnen toepassen binnen fysiologisch relevante 3D-microomgevingen, terwijl ze tegelijkertijd real-time imaging van tumor-immuuninteracties mogelijk maken. Vroege experimentele benaderingen voor het bestuderen van compressiestress hielden in dat sferoïden werden ingebed in agarosegels13. Hoewel deze methode fysieke opsluiting effectief simuleerde, werden natuurlijke interacties tussen de extracellulaire matrix (ECM) en de cellen geëlimineerd. Dolega et al. pasten osmotische druk toe om compressiestress op te wekken; sferoïden waren echter gesuspendeerd in kweekmedium en bleven daarom verstoken van ECM-interacties9. Pandey et al. gebruikten een transwell-insert en gewichten om sferoïden die in collageen waren ingebed samen te persen, wat ECM-celinteracties behield maar de hoge-resolutie imaging beperkte die nodig is om de motiliteit en cytotoxische activiteit van immuuncellen te kwantificeren14. Samen onderstrepen deze beperkingen de noodzaak voor experimentele platforms die real-time imaging mogelijk maken van de morfologische respons van cellen op compressie binnen de TME.

Hier presenteren wij een protocol voor een microfluïdisch compressieapparaat15 dat een gecontroleerde toepassing van compressiestress mogelijk maakt, terwijl fysiologisch relevante ECM-celinteracties behouden blijven en resolutie-rijke live-cell imaging van immuun-tumor-dynamiek wordt ondersteund. Het protocol bestaat uit de voorbereiding van de componenten van het apparaat (Sectie 1), de assemblage van het apparaat (Sectie 2) en de imaging van tumor-immuuninteracties (Sectie 3). Wij demonstreren de workflow met behulp van een NK-killingsassay tegen tumor-sferoïden die zijn gelabeld met green fluorescent protein (GFP). Naast deze toepassing kan het platform eenvoudig worden aangepast om de effecten van mechanische krachten op een breed scala aan celtypen en cellulaire interacties in 3D-micro-omgevingen te onderzoeken.

Protocol

1. Voorbereiding van de componenten van het apparaat

  1. Oppervlakteactivatie van de monsterlaadkamer
    1. Plaats een masker over de monsterlaadkamer (Laag 1, L1) zodanig dat alleen de wells zijn blootgesteld.
    2. Stel de gemaskerde Laag 1 gedurende 15 s bloot aan zuurstofplasma met de hoge vermogensinstelling (45 W).
    3. Plaats Laag 1 in een Petrischaal en voer de volgende stappen uit in een biologische veiligheidskabinet.
    4. Behandel elke well gedurende 10 min met 10 µL van 1% polyethyleenimine (PEI).
    5. Verwijder het PEI uit de wells door vacuümaspiratie vanuit de vier hoeken van elke well om krassen op het glasoppervlak te voorkomen.
    6. Was de wells met 10 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en verwijder vervolgens het wasmiddel door vacuümaspiratie vanaf de zijkant.
    7. Behandel de wells gedurende 30 min met 10 µL van 0,1% glutaaraldehyde en verwijder vervolgens het glutaaraldehyde door vacuümaspiratie vanuit de hoeken.
    8. Was de wells drie keer met PBS en verwijder na elke wasbeurt het wasmiddel vanuit de hoeken.
    9. Wikkel de Petrischaal met Laag 1 in aluminiumfolie en laat deze een nacht in het biologische veiligheidskabinet staan.
  2. Sterilisatie van het metalen frame
    1. Dompel het metalen frame van 38 mm × 88 mm en de twaalf M2.5 panhead-schroeven een nacht onder in 70% ethanol.
  3. Priming van de drukregeleenheid
    1. Stel de drukregeleenheid gedurende 30 s bloot aan zuurstofplasma met de hoge vermogensinstelling (45 W).
    2. Dompel de drukregeleenheid, met de kenmerken naar beneden gericht, een nacht onder in gedeïoniseerd (DI) water om de kanalen en de kamers van de drukregeleenheid te vullen.
    3. Verwijder de drukregeleenheid de volgende dag uit het DI-water waarin deze was ondergedompeld.
    4. Vul een microfluïdisch reservoir met 50 mL DI-water.
      OPMERKING: Het microfluïdische reservoir bestaat uit een conische buis van 50 mL voorzien van een op maat gemaakt deksel met twee slangverbindingen: een pneumatische slanglijn en een vloeistoftoevoerlijn.
    5. Sluit een met lucht gevulde spuit aan op de pneumatische slanglijn.
    6. Druk langzaam de zuiger van de spuit in om het reservoir onder druk te zetten en DI-water door de vloeistoftoevoerlijn te drijven totdat de slang is gevuld en het water uit de slang begint te druppelen.
    7. Sluit de vooraf gevulde, druppelende vloeistoftoevoerlijn aan via het polycarbonaatverdeelstuk op de 1,5 mm inlaat aan de achterzijde van de drukregeleenheid.
    8. Laat de drukregeleenheid en de assemblage van het verdeelstuk 2 u aan de lucht drogen. Zodra ze volledig droog zijn, zijn de drukregeleenheid en de assemblage van het verdeelstuk gereed voor de volgende stap.

2. Het apparaat assembleren

  1. Bereiding van collageen met ingebedde cellen
    1. Verwijder het metalen frame en de schroeven uit de 70% ethanol en droog deze.
    2. Plaats in de biologische veiligheidskabinet drie microtubes van 600 µL op ijs. Label de buizen als volgt: "N" (neutralisatie), "sp" (MCF-7 sferoïden) en "sp+NK" (MCF-7 sferoïden met NK-cellen).
    3. Bereid het neutralisatiemengsel voor door 10× het benodigde volume Medium 199 (M199) en natriumhydroxide (NaOH) aan de "N"-buis toe te voegen.
    4. Overbreng het juiste volume van het M199:NaOH-mengsel naar de "sp"- en "sp+NK"-buizen om een uiteindelijke 1× concentratie te bereiken.
    5. Oogst de tumorsferoïden en centrifugeer deze bij 141 × g gedurende 3 min zodat de sferoïden naar de bodem van de buis bezinken.
      OPMERKING: Tumorsferoïden met een diameter van ongeveer 200 µm werden gegenereerd met behulp van een eerder beschreven agarose microwell-platform16. Kort samengevat werden 3 × 106 MCF-7 cellen gezaaid in een 36 × 36 agarose microwell-array bestaande uit wells van 200 µm diameter en 200 µm diepte, en vervolgens 7 dagen gekweekt om de tumorsferoïden te produceren die in de experimenten zijn gebruikt.
    6. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de sferoïden in 200 µL van 50:50 MCF-7/NK compleet medium (Tabel 1 en Tabel 2).
    7. Verzamel NK-cellen in een conische buis van 50 mL, centrifugeer bij 141 × g gedurende 4 min en tel de cellen.
      OPMERKING: De viabiliteit van de NK-cellen moet >85% zijn op de dag van het experiment.
    8. Resuspendeer de resulterende pellet in 200 µL compleet NK-medium.
    9. Voeg het juiste volume collageen-stockoplossing toe aan elke microcentrifugebuis.
    10. Voeg het juiste volume cel-suspensie toe aan elke buis om een eindvolume van 200 µL te verkrijgen met een concentratie van 1,5 mg/mL collageen.
      OPMERKING: De "sp"-suspensie bevat alleen tumorsferoïden, terwijl de "sp+NK"-suspensie tumorsferoïden en 1,5 × 106 NK-cellen bevat.
    11. Meng voorzichtig door te pipetteren om een gelijkmatige verdeling van cellen en collageen te garanderen en belvorming te minimaliseren.
  2. Assemblage van het apparaat en laden van cellen
    1. Plaats Laag 1 in het gedroogde metalen frame.
    2. Laad 9 µL van het collageenmengsel in elke well.
    3. Lijn de drukregeleenheid en de manifold-assemblage uit met de celkamers op Laag 1 met behulp van een microscoop.
    4. Steek de gedroogde schroeven door de manifold en in het metalen frame, waarbij de drukregeleenheid en Laag 1 tussen de manifold en het metalen frame worden vastgezet.
    5. Plaats het geassembleerde apparaat gedurende 45 min in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ om polymerisatie van het collageen mogelijk te maken.
    6. Voeg 50:50 MCF-7/NK compleet celkweekmedium toe via de vier mediumpoorten.

3. Beeldvorming van tumor-immuuninteracties

  1. Plaats het geassembleerde apparaat in de objecttafel-incubator die is gemonteerd op een inverted epifluorescentiemicroscoop voor live-cell imaging.
    OPMERKING: De objecttafel-incubator hield gedurende de gehele imagingperiode een temperatuur van 37 °C en een luchtvochtigheid van ongeveer 50% in stand.
  2. Plaats een secundaire behuizingsdoos over het geassembleerde apparaat om de interne omgeving gedurende de imagingperiode op 37 °C, 100% luchtvochtigheid en 5% CO₂ te houden.
  3. Verbind het apparaat met de drukregelaar met behulp van de pneumatische slang.
  4. Neem brightfield- en GFP-beelden van de tumorsferoïden voordat er compressie wordt toegepast, om de vervorming van de sferoïden na compressie te kunnen beoordelen.
  5. Pas gedurende de gehele imagingperiode een constante druk van 120 mbar toe.
    OPMERKING: De software van de drukregelaar stelt de gebruiker in staat om het drukprofiel en de grootte van de druk die tijdens het experiment wordt toegepast te definiëren. Supplementary Figure 1 bevat een schema van het drukregelsysteem.
  6. Start de time-lapse imaging door elke 10 min gedurende 18 h brightfield- en GFP-beelden te nemen.
    OPMERKING: Beelden werden genomen op het centrale Z-vlak van elke tumorsferoïde met een 20× objectief op een inverted epi-fluorescentiemicroscoop. Brightfield- en GFP-fluorescentiebeelden werden vastgelegd met belichtingstijden van respectievelijk 200.1 ms en 298.9 ms.

Resultaten

Voor de volgende experimenten werd een microfluïdisch compressieapparaat15 gebruikt om tumor-immuuninteracties binnen een fysiologisch relevante 3D-micro-omgeving te modelleren, waarbij gelijktijdig statische en dynamische compressies op tumorsferoïden kunnen worden uitgeoefend (Figuur 1). De componenten van het apparaat (Figuur 1A1) en de volgorde van assemblage (Figuur 1A2) worden getoond in Figuur 1A. Het metalen frame dient als basis van het apparaat, waarbij de cellkamerlaag (L1) in het frame is geplaatst. De drukregelunit, bestaande uit L2 en L3 die via plasmabinding aan elkaar zijn verbonden, is boven L1 geplaatst, gevolgd door het manifold (Figuur 1A2). Samen vormen L1 en de drukregelunit het functionele microfluïdische apparaat en worden deze met schroeven tussen het metalen frame en het manifold geklemd. Het manifold bevat inlaatpoorten voor vloeistofslangen om druk aan het apparaat toe te voeren, evenals mediarervoirs die langetermijn-live-cell imaging-experimenten faciliteren.

Componenten en diagram van het microfluïdische apparaat; compressie van de celkamer; resultaten van het GFP-celexperiment.
Figuur 1: Microfluïdisch compressieapparaat voor studies naar interacties tussen immuuncellen en tumorsferoïden onder mechanische compressie. (A1) Foto van de componenten die nodig zijn voor de assemblage van het apparaat, van links naar rechts getoond: manifold, drukregeleenheid (L2 + L3), cellaag (L1) en metalen frame. (A2) 3D-schema van de componenten van het apparaat, van boven naar beneden getoond: manifold, drukregeleenheid (L2 + L3), cellaag (L1) en metalen frame. PDMS-lagen L2 en L3 zijn via plasmabonding verbonden om de drukregeleenheid te vormen, die boven de celkamer is gepositioneerd. De manifold en het metalen frame fixeren het geassembleerde apparaat. (B1) Dwarsdoorsnede-schema van een compressie-eenheid vóór en na compressie. In ECM ingebedde tumorsferoïden en NK-cellen zijn in de celkamer geplaatst. De initiële afstand tussen de onderkant van L1 en de onderkant van L2 vóór compressie wordt aangeduid als h. Na het aanbrengen van druk op de drukregeleenheid buigt L2 naar beneden, waardoor de PDMS-zuiger de tumorsferoïde comprimeert. De neerwaartse verplaatsing van L2 na compressie wordt aangeduid als Δh. (B2) Samengevoegde brightfield- en GFP-beelden van een MCF-7 tumorsferoïde met NK-cellen vóór (links) en na (rechts) compressie. MCF-7 cellen zijn GFP-gelabeld, terwijl NK-cellen niet zijn gelabeld. Representatieve NK-cellen zijn blauw omcirkeld, terwijl gele contouren de periferie van de tumorsferoïden markeren. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zodra het microfluïdische compressieapparaat is geassembleerd, kan het worden gebruikt om tumorsferoïden samen te persen, zoals geïllustreerd in Figuur 1B. Hier worden de in collageen ingebedde tumorsferoïden met NK-cellen in de celkamer (L1) gebracht. Bij het uitoefenen van druk op de drukkamer (L3) buigt de vervormbare membraanlaag (L2) naar beneden, waardoor de Polydimethylsiloxaan (PDMS) zuiger compressiekrachten overbrengt op de sferoïde. De drukkamer wordt aangestuurd door een externe drukbron. Aanvullende details over het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van het microfluïdische compressieapparaat zijn eerder gepubliceerd in een andere studie15.

We definiëren de afstand tussen de bodem van de celkamer (L1) en de onderzijde van het vervormbare membraan (L2) als h (Figuur 1B1, linkerpaneel). Vóór compressie is deze afstand 200 µm. Bij het aanbrengen van vloeistofdruk op de drukregeleenheid buigt het vervormbare membraan naar beneden, waardoor de afstand h met Δh wordt verminderd (Δh; Figuur 1B1, rechterpaneel), waardoor de in collageen ingebedde tumorsferoïde wordt gecomprimeerd. In dit systeem wordt de compressierek gedefinieerd als Δh/h, waarbij h de initiële afstand tussen L1 en L2 vóór compressie is, en Δh de neerwaartse verplaatsing van L2 na compressie is. De membraanverplaatsing werd eerder gekalibreerd door fluorescentiekralen te visualiseren die aan de onderzijde van L2 waren gehecht. Een gedetailleerde beschrijving van de kalibratieprocedure en de berekeningen van de compressierek is te vinden in een eerdere studie17. Een voorbeeld van een kalibratiecurve is te zien in Supplementary Figure 2.

Figuur 1B2 toont representatieve samengevoegde brightfield- en GFP-beelden van een MCF-7 sferoïde met NK-cellen ingebed in 1,5 mg/mL collageen vóór (linkerpaneel) en na compressie (rechterpaneel). De grenzen van de tumorsferoïde zijn in geel omlijnd. Na compressie vertoonde de sferoïde een toename in het geprojecteerde oppervlak, wat wijst op deformatie als reactie op de succesvolle toepassing van de mechanische belasting. Voor alle experimenten in dit manuscript hebben we een compressie-strain van Δh/h = 50% gebruikt. We merken op dat de diameter van de sferoïde varieert van 140 µm tot 200 µm. Dit betekent dat de werkelijke compressie-strain op de sferoïde iets kleiner is dan 50%. Aanvullende Video 1 en Aanvullende Video 2 tonen respectievelijk representatieve X-Y z-stacks verkregen in het GFP-fluorescentiekanaal van een MCF-7 sferoïde ingebed in 1,5 mg/mL collageen vóór en na toepassing van de 50% compressie-strain.

Het microfluïdische compressieapparaat werd gebruikt om de effecten van NK-cellen, compressie en de combinatie hiervan op de dood van tumorsferoïden te onderzoeken (Figuur 2). Dit wordt mogelijk gemaakt door het ontwerp van het apparaat, dat 12 kweekputjes bevat. Van deze putjes kunnen er zes worden blootgesteld aan compressie, terwijl de overige zes dienen als niet-gecomprimeerde controles. Deze configuratie maakt vier experimentele condities mogelijk (Figuur 2A): sferoïden alleen zonder compressie (sp), sferoïden met NK-cellen maar zonder compressie (+NK), sferoïden die zijn blootgesteld aan compressie (+comp), en sferoïden die zijn blootgesteld aan zowel compressie als NK-cellen (+comp+NK). 

Time-lapse microscopie van GFP-intensiteit; grafiek, scatterplot met genormaliseerde GFP-data-analyse.
Figuur 2: Mechanische compressie moduleert NK-cel-gemedieerde doding van tumorsferoïden. (A) Time-lapse fluorescentiebeelden van MCF-7 sferoïden ingebed in 1,5 mg/mL collageen onder vier condities: controle met alleen sferoïden (sp), sferoïden met NK-cellen (+NK), sferoïden met compressie (+comp), en sferoïden met zowel compressie als NK-cellen (+comp+NK). GFP-fluorescentie labelt levensvatbare MCF-7 tumorcellen. De gele omtrek geeft de region of interest (ROI) aan, die werd gedefinieerd met behulp van het beeld na 18 h en werd toegepast op alle tijdspunten voor fluorescentiekwantificering. De totale GFP-fluorescentie-intensiteit binnen de ROI werd gemeten en gebruikt voor daaropvolgende analyse. Schaalbalk = 50 µm. (B) Totale GFP-fluorescentie-intensiteit van één sferoïde over de tijd onder 4 condities. Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt de totale fluorescentie-intensiteit van een enkele sferoïde, genormaliseerd naar de initiële intensiteit bij t = 0. De zwarte lijn is de tweede-orde polynomiale fitting van de fluorescentie-intensiteitsgegevens samengevoegd van 7 sferoïden gekweekt onder de controleconditie en werd gebruikt als referentie voor het berekenen van het tumorcelverlies in (C). (C) Genormaliseerd GFP-verlies voor de +comp, +NK en +comp+NK condities werd berekend door de GFP-intensiteit bij t = 18 h van elke sferoïde af te trekken van de referentielijn voor alleen sferoïden (sp). Daarom vertegenwoordigt elk datapunt het genormaliseerde GFP-verlies van een enkele sferoïde. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De effecten van NK-cellen, compressie en hun combinatie op tumorsferoïden kunnen worden gevisualiseerd in de representatieve afbeeldingen van MCF-7-sferoïden in 1,5 mg/mL collageen (Figuur 2A). Omdat de MCF-7-cellen die werden gebruikt om de tumorsferoïden te genereren GFP-gelabeld waren, kon de levensvatbaarheid van de tumor worden gemonitord via veranderingen in de GFP-fluorescentie. GFP- en brightfield-opnamen werden elke 10 min gedurende 18 u gemaakt met een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Opvallend is dat sferoïden die aan compressie waren onderworpen een groter geprojecteerd oppervlak vertoonden dan niet-gecomprimeerde sferoïden, wat de succesvolle overdracht van mechanische belasting van het vervormbare membraan naar de tumorsferoïde bevestigt. Na verloop van tijd werd een progressief verlies van GFP-fluorescentie waargenomen in de +NK- en +comp+NK-condities (Figuur 2A), wat wijst op door NK-cellen gemedieerde tumorceldoding.

We gebruiken het verlies van GFP-fluorescentie als maatstaf voor de dood van tumorcellen. De GFP-gelabelde MCF-7-cellen die in deze studie zijn gebruikt, werden gegenereerd via lentivirale transductie. Kort gezegd werd een lentivirale vector gebruikt om een expressiecassette voor het enhanced green fluorescent protein (eGFP), aangestuurd door de elongatiefactor-1α (EF1α) promoter, te introduceren, samen met een puromycineresistentiegen aangestuurd door de Rous-sarcomavirus (RSV) promoter. Na infectie werden de lentivirale expressiecassettes geïntegreerd in het genomische DNA van de MCF-7-cellen, wat resulteerde in een stabiele GFP-expressie. Vervolgens werd puromycineselectie gebruikt om niet-getransduceerde cellen te elimineren. De GFP-labeling van MCF-7-cellen maakte het mogelijk om de levensvatbaarheid van tumorcellen te kwantificeren door veranderingen in de GFP-fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd te monitoren (Afbeelding 2B). Er is eerder een sterke correlatie vastgesteld tussen het verlies van GFP-fluorescentie en gevestigde markers voor celdood, waaronder de live/dead-marker propidiumjodide (PI) en de apoptosemarker annexine-V18, wat het verlies van GFP-fluorescentie valideert als een surrogaatmaat voor de dood van tumorcellen.

Om de effecten van de vier experimentele condities op de tumorviabiliteit te kwantificeren, werd de totale GFP-fluorescentie-intensiteit van elke tumorsferoïde op elk tijdstip gemeten, gecorrigeerd voor de achtergrond en genormaliseerd naar de initiële waarde (Figuur 2B). De totale fluorescentie van de sferoïde werd berekend binnen een vooraf gedefinieerd region of interest (ROI). Deze ROI werd verkregen door de grens van de tumorsferoïde in de afbeelding van 18 uur handmatig te omlijnen (gele omtrek op het 18 uurs paneel, Fig. 2A) met behulp van een intern MATLAB-script. De totale fluorescentie-intensiteit binnen deze ROI werd vervolgens berekend voor elk tijdstip en gecorrigeerd door de gemiddelde achtergrondfluorescentie, gemeten vanuit een aparte ROI elders in de afbeelding, eraf te trekken. De resulterende achtergrondgecorrigeerde fluorescentiewaarden werden vervolgens genormaliseerd naar de initiële fluorescentie-intensiteit van de sferoïde.

Elke gekleurde curve representeert een genormaliseerde GFP-intensiteit van een individueel sferoïde onder een specifieke experimentele conditie in Figuur 2B. De curve is verkregen door middel van een tweedegraads polynomele fit van de experimentele data. De paarse curves representeren sferoïden die alleen aan compressie waren onderworpen (+comp, Figuur 2B), de rode curves representeren sferoïden met NK-cellen (+NK, Figuur 2B), en de blauwe curves representeren sferoïden die werden blootgesteld aan zowel compressie als NK-cellen (+comp+NK, Figuur 2B). In contrast hiermee is de zwarte curve de tweedegraads polynomele fit van de data van zeven sferoïden die zijn gekweekt onder de controleconditie met alleen sferoïden (sp, Figuur 2B). In Figuur 2B worden, om de helderheid te vergroten, alleen de gefitte polynomele data gepresenteerd en niet de experimentele datapunten. Opmerkelijk is dat de GFP-fluorescentie-intensiteit van de condities met alleen sferoïden (sp) en sferoïd + compressie (+comp) een algemene stijgende trend over de tijd vertoonden (Figuur 2B), wat consistent is met voortdurende tumorgroei of het behoud van viabiliteit. In contrast hiermee vertoonden de +NK- en +comp+NK-condities een progressieve afname van de GFP-fluorescentie-intensiteit (Figuur 2B), wat wijst op tumormortality.

Het cumulatieve verlies van tumorcellen werd gekwantificeerd door de gefitte genormaliseerde GFP-fluorescentie-intensiteit van elke sferoïde onder een bepaalde conditie (+comp, +NK of +comp+NK) af te trekken van de controleconditie na 18 u (Figuur 2C). Hierdoor vertegenwoordigt elk datapunt het genormaliseerde GFP-verlies van een individuele sferoïde ten opzichte van de controle met alleen sferoïden (Figuur 2C). Bijgevolg weerspiegelt de +comp-conditie het GFP-verlies als gevolg van compressie alleen (paars, Figuur 2C), weerspiegelt de +NK-conditie het GFP-verlies als gevolg van NK-cellen alleen (rood, Figuur 2C), en weerspiegelt de +comp+NK-conditie het GFP-verlies als gevolg van de gecombineerde effecten van compressie en NK-cellen (blauw, Figuur 2C). De +comp-conditie vertoonde de laagste mate van GFP-verlies (Figuur 2C), wat suggereert dat compressie alleen een minimaal effect had op de levensvatbaarheid van de sferoïden. In contrast vertoonden zowel de +NK- als de +comp+NK-condities een significant groter GFP-verlies dan de +comp-conditie (Figuur 2C), wat erop wijst dat NK-cellen de primaire drijvers zijn van tumorceldood. Hoewel de +comp+NK-conditie een groter gemiddeld GFP-verlies vertoonde dan de +NK-conditie, was dit verschil niet statistisch significant (Figuur 2C). Deze bevindingen suggereren dat compressie de door NK-cellen gemedieerde doding van tumorcellen niet belemmert. Samen tonen deze resultaten aan dat het microfluïdische compressieapparaat succesvol kan worden gebruikt om de onafhankelijke en gecombineerde effecten van compressie en NK-cellen op de levensvatbaarheid van tumorsferoïden te kwantificeren binnen een fysiologisch relevante 3D-omgeving.

Daarentegen kunnen suboptimale resultaten optreden wanneer (1) sferoïden zich buiten de grens van de zuiger bevinden, (2) sferoïden te dicht bij de grens van de zuiger zijn gepositioneerd, en (3) meerdere sferoïden zich binnen één sferoïdediameter van elkaar bevinden (Figuur 3). In deze gevallen moeten de overeenkomstige velden worden uitgesloten van de analyse.

Effect van celcompressie; BF, GFP fluorescentie; voor en na; resultaten van 18u time-lapse microscopie.
Figuur 3: Representatief voorbeeld van een reeks beelden van sferoïden die zijn uitgesloten van de analyse. Time-lapse brightfield (BF), GFP fluorescentie en samengevoegde beelden van MCF-7 sferoïden met NK-cellen in 1,5 mg/mL collageen vóór (linkerkolom) en na compressie (rechter twee kolommen) worden getoond. Beelden vóór compressie werden verkregen 20 min vóór het aanbrengen van de druk en 10 min vóór de start van de time-lapse imaging. Beelden werden vervolgens elke 10 min verzameld gedurende 18 u, waarbij 0 u correspondeert met het eerste beeld dat direct na compressie is verkregen en 18 u het einde van het experiment vertegenwoordigt. De blauwe pijl geeft de rand van de PDMS-zuiger (L2) aan. Dit beeldveld werd uitgesloten van de analyse omdat er twee sferoïden aanwezig waren binnen het compressiegebied en deze zich te dicht bij de grens van de zuiger bevonden. Hierdoor konden de vervorming van de sferoïden en de GFP-fluorescentie-intensiteit tijdens de compressie niet betrouwbaar worden gekwantificeerd. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

(1) Sferoïden die zich buiten de grens van de zuiger bevinden, ondergaan geen compressie omdat de druk alleen binnen het zuigergebied wordt uitgeoefend. Deze sferoïden moeten daarom worden uitgesloten van zowel de gecomprimeerde als de controlecondities. (2) Sferoïden die zich op of nabij de grens van de zuiger bevinden (Figuur 3, bovenste sferoïde), moeten worden uitgesloten, aangezien de sferoïde een niet-uniforme mechanische belasting ervaart. (3) Sferoïden die zich binnen één sferoïdediameter van naburige sferoïden bevinden, moeten worden uitgesloten (Figuur 3). De geringe afstand tussen sferoïden bemoeilijkt de kwantificering van de GFP-fluorescentie-intensiteit, omdat het interessegebied (ROI) wordt gedefinieerd op basis van het laatste tijdspunt. Na verloop van tijd kunnen de grenzen van de sferoïden ononderscheidbaar worden, waardoor het lastig is om een ROI af te bakenen die nauwkeurig slechts één enkele sferoïde omvat. Deze problemen kunnen worden geminimaliseerd door ervoor te zorgen dat de sferoïden tijdens het laden van het apparaat gecentreerd zijn binnen het compressiegebied. Aandachtige aandacht voor de distributie, positionering en opstelling van het apparaat is essentieel voor het bereiken van een uniforme compressie en het genereren van betrouwbare, reproduceerbare experimentele resultaten.

ComponentenConcentratie
α-MEM-medium
Foetaal runderserum (FBS)10%
penicilline/streptomycine1%

Tabel 1: Volledig MCF-7 medium.

ComponentenConcentratie
α-MEM medium
Myo-inositol0.2 mM
2-mercaptoethanol0.1 mM
Fetaal runderserum (FBS)12.50%
Foliumzuur0.02 mM
Paardenserum (HS)12.50%
Penicilline/streptomycine1%

Tabel 2: Volledig NK-medium.

Aanvullende figuur 1: Schema van het drukregelsysteem. Een luchtcompressor levert samengeperste lucht (tot 20 psi) aan de drukregelaar. De drukregelaar regelt de luchtdruk die naar het drukreservoir wordt geleid op basis van door de gebruiker gedefinieerde instellingen. De regelaar heeft een maximale werkdruk van 200 mbar, een drukstabiliteit van 0,005% van de volledige schaal (FS), een drukresolutie van 0,003% FS en een responstijd van 9 ms, wat een nauwkeurige en reproduceerbare drukregeling mogelijk maakt. De regelaar is via een universal serial bus (USB) verbonden met een computer, waardoor de gebruiker de grootte en het profiel van de aangelegde druk kan programmeren met de bijbehorende software. De software ondersteunt meerdere compressiegolfvormen, waaronder constante, sinusvormige, driehoekige en periodieke compressie. In dit schema is de druk ingesteld op 120 mbar, en samengeperste lucht bij deze druk wordt via de pneumatische slang naar het onder druk gezette reservoir geleid. Het onder druk gezette reservoir bevat 50 mL gedeïoniseerd (DI) water en dient om pneumatische druk om te zetten in vloeistofdruk. Zodra het reservoir onder druk staat, drijft het vloeistof via vloeistoftoevoerslangen naar de drukregeleenheid van het microfluïdische compressieapparaat (zie Figuur 1 voor details van het apparaat), waar de vloeistofdruk wordt gebruikt om compressie uit te oefenen op de tumorsferoïde. Let op dat vloeistofdruk wordt gebruikt om luchtbellen in het PDMS-apparaat te voorkomen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Kalibratiecurve voor het microfluïdische compressieapparaat, die de relatie weergeeft tussen de zuigerverplaatsing (, µm) en de druk die wordt uitgeoefend op de drukregelingkamer (KPa). Experimentele metingen worden weergegeven door stippen, terwijl de doorgetrokken lijn overeenkomt met de COMSOL-simulatie. Foutenbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan op basis van acht onafhankelijke experimentele metingen, maar deze zijn te klein om zichtbaar te zijn. Deze figuur is gereproduceerd uit Suh et al.15 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: X-Y z-stack van een GFP-gelabelde MCF-7 sferoïde vóór compressie. De sferoïde werd ingebed in 1,5 mg/mL collageen binnen het microfluïdische compressieapparaat en afgebeeld met het GFP-fluorescentiekanaal met een z-stapgrootte van 1 µm. Vervolgens werd ImageJ gebruikt om het contrast te verbeteren. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 2: Een compressierek van 50% (Δh/h = 50%) werd vervolgens toegepast op de GFP-gelabelde MCF-7 sferoïde ingebed in 1,5 mg/mL collageen. Na compressie werd een X-Y z-stack verkregen in het GFP-fluorescentiekanaal met een stapgrootte van 1 µm en verwerkt in ImageJ om het contrast te verhogen. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze methode beschrijft het gebruik van een microfluïdisch compressieapparaat om de effecten van compressiestress op tumor-immuuninteracties te onderzoeken. Dit systeem is in staat om gecontroleerde mechanische compressie toe te passen op tumorsferoïden die zijn ingebed in een 3D-collageenmatrix. Het glazen substraat dat de basis van de celkamer (L1) vormt, maakt live-cell imaging met een hoge resolutie mogelijk, waardoor het platform zeer geschikt is voor studies die gericht zijn op het kwantificeren van de motiliteit, infiltratie en cytotoxische activiteit van immuuncellen. Belangrijk is dat het systeem cel-cel- en cel-matrixinteracties behoudt, terwijl het een nauwkeurige controle over de mechanische omgeving mogelijk maakt. In tegenstelling hiermee vereisen veel bestaande experimentele benaderingen voor het bestuderen van compressiestress een compromis tussen ECM-gemedieerde cellulaire interacties9,13 en imaging met een hoge resolutie14.

In de huidige studie werden NK-cellen en MCF-7 borsttumorsferoïden gebruikt als modelsysteem. Het microfluïdische compressieapparaat is echter niet beperkt tot deze celtypen. Tot nu toe is het platform succesvol toegepast op meerdere borstcelmodellen, waaronder MDA-MB-231 borsttumorsferoïden en MCF-10A borstsferoïden15,17. Het platform kan eenvoudig worden aangepast om tumor-immuuninteracties in diverse andere tumormodellen te onderzoeken, waaronder hersen- en longtumorsferoïden. Evenzo is het platform compatibel met een breed scala aan immuuncelpopulaties naast NK-cellen, wat onderzoek naar diverse tumor-immuuninteracties onder mechanische compressie mogelijk maakt. Bovendien is het apparaat niet beperkt tot studies op basis van sferoïden en kan het worden aangepast voor experimenten met enkelvoudige cellen. Samen maken deze kenmerken het platform tot een veelzijdig instrument om te onderzoeken hoe mechanische krachten het cellulaire gedrag reguleren in een breed scala aan biologische contexten en ziektebeelden.

Een ander voordeel van dit systeem is de nauwkeurige controle over de omvang en het patroon van de compressie die op de monsters wordt uitgeoefend. In de huidige studie werd gedurende het experiment een statische compressie-strain van 50% toegepast. Het strain-niveau kan echter eenvoudig worden aangepast, afhankelijk van het experimentele doel. Daarnaast kan er met behulp van het externe drukcontrolesysteem dynamische compressie met verschillende golfvormen, waaronder blokgolf- en sinusvormige golfvormen, op de sferoïden worden toegepast. Blokgolfcompressie bestaat uit afwisselende intervallen van compressie en ontspanning17, terwijl sinusvormige compressie bestaat uit geleidelijke toenames en afnames van de compressie in de tijd15. Deze mogelijkheden kunnen, in combinatie met kwantitatieve beeldvorming en predictieve modellering, worden gebruikt om de invloed van dynamische compressie op de efficiëntie van de immuun-killing te bestuderen.

We merken op dat dit compressieapparaat oorspronkelijk is ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van tumoren te karakteriseren17. Door de integratie van een in situ krachtsensor, een polyacrylamide (PAA) gellaag onder de tumorsferoïde, kunnen de mechanische eigenschappen van de sferoïde, zoals stijfheid en visco-elasticiteit, kwantitatief worden gekarakteriseerd15,17. Deze modificatie breidt de bruikbaarheid van het platform uit, van het modelleren van compressiestress naar de directe meting van het mechanische gedrag van tumoren.

Over het algemeen heeft het microfluïdische compressieapparaat een breed scala aan toepassingen, van de meting van de mechanische eigenschappen van sferoïden tot het onderzoeken van tumor-immuuninteracties binnen een mechanisch modulerende omgeving. Er zijn echter verschillende kritieke stappen vereist voor een succesvolle werking van het apparaat. Tumorsferoïden moeten nabij het centrum van elke put worden geplaatst om een uniforme compressie te garanderen. De drukregeleenheid moet correct worden uitgelijnd met de celkamerlaag (L1) om een nauwkeurige overdracht van de druk te waarborgen. Bij het plaatsen van de drukregeleenheid op L1 kunnen luchtbellen ontstaan, wat de beeldkwaliteit en de experimentele resultaten negatief kan beïnvloeden. Om dit probleem te voorkomen, moet er zorgvuldig worden gewerkt om het introduceren van bellen bij het laden van het collageenmengsel te vermijden, en moet er 8 µL collageenmengsel aan elke put worden toegevoegd om de kamer licht te overvullen voordat de drukregeleenheid wordt geplaatst. Dit helpt om een volledig contact tussen de lagen te garanderen en vermindert de kans op ingesloten lucht.

Concluderend maakt dit apparaat een gecontroleerde modellering van compressiestress mogelijk binnen een fysiologisch relevante 3D-collageenmatrix die tumor-immuuninteracties ondersteunt. Dit platform biedt een instrument om te onderzoeken hoe statische en dynamische mechanische krachten de immuun-gemedieerde doding en het tumorgedrag binnen de tumormicro-omgeving reguleren. Momenteel identificeren we het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan de mechanische modulatie van de immuundoding van tumorcellen. Deze studies kunnen leiden tot potentiële nieuwe therapeutische drugtargets.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door een beurs van het National Cancer Institute (Grant R01CA221346), de Lance R. Collins Fellowship van het College of Engineering aan Cornell University aan FM, en het Cornell Provost’s Fund for Research Resilience aan FM. Dit werk is gedeeltelijk uitgevoerd bij de Cornell NanoScale Facility, een lid van de National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), die wordt ondersteund door de National Science Foundation (Grant NNCI-2025233).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
10× M199-mediumSigma-AldrichM0650200 µL
2-mercaptoethanolThermoFisher313500100
LuchtcompressorElveflowJun-Air Model 3 compressor
Geautomatiseerde X-Y microscooptafelToegepaste Wetenschappelijke InstrumentatieMS-2000
CCD-cameraHamamatsu PhotonicsORCA-R2
foetaal runderserum (FBS)GeminiBioS11150
VloeistoftoevoerslangenEleveflowreserverol PTFE-slangen1/16 inch buitendiameter
FluorescentielichtbronExcelitas Technologies X-Cite serie 120 PC-unit
FoliumzuurSigmaF7876
GlutaraldehydeEM-wetenschappen 160190.10%
Harrick plasmareinigerHarrick PlasmaPDC-001-HPHoge vermogensinstelling (45 W)
paardenserum (HS)ThermoFisher16050-122
Inverteerde epifluorescentiemicroscoopOlympusIX8120x objectief (NA = 0,25), bediend met de Olympus CellSens-software
MaskerArtusAluminium shimstock, 10 vellenDikte is 0,0125" (0,75 mm)
MCF-7/GFP (puromycine) stabiele cellijnGenTarget IncSC050-G
Metalen frameOp maat gemaakt Op maat gemaakt 
Microfluïdisch reservoirEleveflow50 mL microfluidisch reservoir 
Microscoop OlympusCKX414x objectief              (NA = 0,1)
Myo-inositolSigmaI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
penicilline/streptomycineGibco 15140122
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) ThermoFisher 10010072
Pneumatische slangEleveflowPUR polyether transparante buisinvoer4" buitendiameter in mm
Polyethyleenimine (PEI)Sigma-AldrichP31431%
DrukregelaarElveflowOB1 NK4Bediend met de Elveflow Smart Interface-software
Type I collageen uit rattenstaart Corning35424931.3 µL van 9,6 mg/mL collagen-stockoplossing
SchroevenPhillipsM2,5 Panhead12 schroeven
ObjectiefbroedmachinePrecisieplasticOp maat gemaakt
SpuitBecton Dickinson303134Gekoppeld aan een mannelijk Luer Integral-slot naar 3/32" OD-barb van Eleveflow
α-MEM-mediumThermoFisher12561056

Referenties

  1. Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
  2. Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
  3. Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
  4. Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
  5. Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
  6. Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
  7. Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
  8. Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
  9. Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
  10. Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
  11. Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
  12. Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
  13. Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
  14. Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
  15. Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
  16. Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
  17. Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
  18. Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Immunology and InfectionMicrofluidicsMechanobiologyCancer ImmunologyNatural Killer cellsImmune cellsCompression
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.