Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
* These authors contributed equally
Deze studie integreert netwerkfarmacologie, gevalideerde moleculaire docking en in vitro experimenten om kandidaat verbinding-doelwitrelaties tussen bestanddelen van Cordyceps sinensis en processen gerelateerd aan chronische glomerulonefritis te evalueren. β-Sitosterol werd geselecteerd voor validatie op verbindingsniveau en bleek de inflammatoire en profibrotische activatie in mesangiaalcelmodellen te verminderen.
Chronische glomerulonefritis (CGN) wordt gekenmerkt door aanhoudende inflammatoire schade en progressieve fibrotische remodellering, maar de relaties tussen verbindingen en targets die ten grondslag liggen aan interventies op basis van natuurproducten blijven onvolledig gedefinieerd. Deze studie integreerde netwerkfarmacologie, gevalideerde moleculaire docking en in vitro experimenten om kandidaatbestanddelen van Cordyceps sinensis (C. sinensis) te evalueren in CGN-gerelateerde pathologische processen. Kandidaatbestanddelen van C. sinensis werden gescreend, en de verbinding-geassocieerde targets afgeleid van het Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform werden gekruist met CGN-geassocieerde genen. Functionele verrijking en proteïne-proteïne-interactieanalyses werden gebruikt om biologische processen en hub-targets te prioriteren. PTGS2 werd geïdentificeerd als een belangrijk overlappend target. Moleculaire docking werd uitgevoerd met behulp van een celecoxib-gebonden COX-2 structuur. Re-docking van de co-gekristalliseerde celecoxib-ligand reproduceerde de kristallografische pose met een RMSD van 0,876 Å, wat het docking-protocol ondersteunt. β-Sitosterol en linoleylacetaat vertoonden een voorspelde compatibiliteit met de COX-2 docking-regio, met bindingsaffiniteiten van respectievelijk −7,2 en −7,5 kcal/mol. β-Sitosterol werd geselecteerd voor validatie op verbindingniveau in HBZY-1 rat glomerulaire mesangiale cellen. Bij 0,5–10 µM reduceerde β-sitosterol de celviabiliteit niet merkbaar. In Lipopolysaccharide (LPS)-gestimuleerde cellen reduceerde β-sitosterol de expressie van Tnf, Il6 en Ptgs2, verminderde de productie van prostaglandine E2 (PGE2) en verlaagde de hoeveelheid cyclooxygenase-2 (COX-2) proteïne. In cellen behandeld met transforming growth factor β1 (TGF-β1) reduceerde β-sitosterol de expressie van Col1a1 en Acta2 en verminderde de hoeveelheid alpha-smooth muscle actin (α-SMA) proteïne. Deze bevindingen leveren hypothese-genererend bewijs dat β-sitosterol inflammatoire en profibrotische activatie moduleert in mesangiale-celmodellen, maar zij stellen geen directe COX-2 enzymatische inhibitie of therapeutische effectiviteit bij CGN vast.
Chronische glomerulonefritis (CGN) omvat een heterogene groep glomerulaire aandoeningen die kunnen voortschrijden naar chronische nierziekte en terminale nierinsufficiëntie1. Het kenmerkt zich door aanhoudende glomerulaire schade, inflammatoire activatie en progressieve fibrotische remodellering2,3. Hoewel corticosteroïden en immunosuppressiva bij geselecteerde patiënten worden gebruikt, blijft ziektecontrole op lange termijn in veel gevallen moeilijk en zijn behandelgerelateerde bijwerkingen gebruikelijk1,4,5. De progressie van CGN omvat interagerende pathologische processen, waaronder immuunactivatie, endotheeldisfunctie, oxidatieve stress en accumulatie van de extracellulaire matrix3,6,7. Daarom kan het identificeren van moleculaire knooppunten die inflammatoire en profibrotische responsen verbinden, helpen bij het genereren van toetsbare hypothesen voor ziekterelevante interventiestrategieën.
Cordyceps sinensis (C. sinensis) is gebruikt in klinische en experimentele contexten gerelateerd aan de nieren en er is gemeld dat het ontstekingsremmende, anti-apoptotische en cytoprotectieve effecten uitoefent in verschillende ziektemodellen8,9,10. De moleculaire basis waardoor de kandidaatbestanddelen kunnen interageren met doelwitten die relevant zijn voor glomerulonefritis is echter onvoldoende gedefinieerd11. Gegeven de multicomponentaard van C. sinensis en de mechanistische heterogeniteit van CGN, biedt netwerkfarmacologie een nuttig kader voor het prioriteren van relaties tussen kandidaatverbindingen, doelwitten en pathways12,13.
In deze studie werden compound-screening, target-identificatie, ziekte-gen-intersectieanalyse, functionele verrijking, eiwit-eiwitinteractienetwerkanalyse, moleculaire docking en in vitro validatie geïntegreerd om potentiële moleculaire relaties tussen kandidaatbestanddelen van C. sinensis en pathologische processen gerelateerd aan CGN te onderzoeken. Prostaglandine-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) werd als hub-target uit het compound-ziekte-netwerk geprioriteerd en geëvalueerd via moleculaire docking met behulp van een celecoxib-gebonden cyclooxygenase-2 (COX-2) structuur met redocking-validatie. Op basis van de netwerkresultaten, de docking-analyse en voorafgaand bewijs voor anti-inflammatoire en anti-fibrotische activiteit werd β-sitosterol geselecteerd als representatieve kandidaat-compound voor downstream-validatie14,15,16. Lipopolysaccharide (LPS)-gestimuleerde mesangiale cellen werden gebruikt om inflammatoire activatie en de COX-2/prostaglandine E2 (PGE2)-geassocieerde respons te beoordelen, terwijl een transforming growth factor β1 (TGF-β1)-geïnduceerd model werd ingezet om de expressie van profibrotische markers te evalueren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De netwerkfarmacologische en bio-informatische analyses waren gebaseerd op openbaar toegankelijke databases en betroffen geen menselijke deelnemers of dieren. De in vitro experimenten werden uitgevoerd met een gevestigde cellijn en vereisten geen ethische goedkeuring volgens de institutionele vereisten.
Screening van potentiële bestanddelen en terugwinning van doelwit
Kandidaatbestanddelen en hun bijbehorende targets werden op 13 juli 2025 opgehaald uit de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) met behulp van de zoekterm “dongchongxiacao”. Verbindingen met een voorspelde orale biologische beschikbaarheid van ten minste 30% en een drug-likeness van ten minste 0,18 werden behouden. Zeven kandidaatbestanddelen voldeden aan beide screeningscriteria. Het molecuulgewicht, de orale biologische beschikbaarheid, de drug-likeness en andere beschikbare farmacokinetische descriptoren werden uit de TCMSP geregistreerd voor een beschrijvende vergelijking.
De informatie over verbinding-doelwitrelaties die geassocieerd was met de behouden bestanddelen werd rechtstreeks gedownload van TCMSP. Dubbele doelwitvermeldingen werden handmatig verwijderd bij het samenstellen van de niet-redundante doelwitset, terwijl de oorspronkelijke verbinding-doelwitrelaties werden behouden voor de daaropvolgende netwerkconstructie. Omdat TCMSP doelwitnamen in hun volledige vorm verstrekte in plaats van gestandaardiseerde gensymbolen, werd elk doelwit opgezocht in de UniProt-database (geraadpleegd op 14 juli 2025). De overeenkomstige menselijke vermelding werd geselecteerd en de doelwitnaam werd omgezet in het officiële gensymbool. De gestandaardiseerde dataset van verbindingen en doelwitten werd gebruikt voor de intersectie tussen ziekte en doelwit en voor de analyse van het verbinding-doelwitnetwerk.
Verzameling van glomerulonefritis-geassocieerde genen en doelwitintersectie
Ziekte-geassocieerde genen werden op 14 juli 2025 opgehaald uit GeneCards, DisGeNET, PharmGKB en de Therapeutic Target Database met behulp van de zoekterm “glomerulonephritis”. Voor GeneCards werden vermeldingen met relevantiescores hoger dan de mediane score van 10 behouden. Geschikte vermeldingen uit de andere databases werden opgenomen op basis van hun gecureerde ziekte-target-annotaties. Gennamen werden gestandaardiseerd naar officiële menselijke gensymbolen en dubbele vermeldingen werden verwijderd. Deze procedure leverde 1.134 unieke glomerulonefritis-geassocieerde genen op. Omdat de zoekopdracht de bredere term “glomerulonephritis” gebruikte, werd de resulterende dataset beschouwd als relevant voor moleculaire processen geassocieerd met chronische glomerulonefritis, in plaats van specifiek voor één histopathologisch subtype.
Op basis van TCMSP afgeleide targets geassocieerd met verbindingen werden met behulp van R gekruist met de set genen die geassocieerd zijn met de ziekte. Hierbij werden drieëntwintig overlappende targets geïdentificeerd. Venn-diagrammen werden gegenereerd met het R-pakket venn, en het netwerk van overlappende targets van verbindingen werd geconstrueerd en gevisualiseerd met Cytoscape. De relaties tussen de kandidaat-bestanddelen en de overlappende targets zijn samengevat in Tabel 1.
Functionele verrijking en analyses van eiwit-eiwitinteracties
Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses werden uitgevoerd in R met behulp van clusterProfiler en org.Hs.eg.db. Gene Ontology-termen werden geanalyseerd in de categorieën biologisch proces, cellulaire component en moleculaire functie. P-waarden werden gecorrigeerd voor meervoudig testen met de Benjamini-Hochberg-methode, en termen of pathways met gecorrigeerde P-waarden lager dan 0,05 werden behouden. Verrijkte termen en pathways werden weergegeven met behulp van onafhankelijk gegenereerde staafdiagrammen en dot plots.
De 23 overlappende targets werden ingevoerd in STRING, waarbij Homo sapiens als organisme werd geselecteerd en een minimale interactiescore van meer dan 0,4 werd gehanteerd. Het resulterende proteïne-proteïne-interactienetwerk werd geïmporteerd in Cytoscape. De netwerktopologie werd geëvalueerd met behulp van CytoNCA op basis van graad, betweenness, closeness, eigenvector-centraliteit, lokale gemiddelde connectiviteit en netwerkcentraliteit. Hub-targets werden gedefinieerd als knooppunten waarbij de waarden voor graad, betweenness-centraliteit, closeness-centraliteit, eigenvector-centraliteit, lokale gemiddelde connectiviteit en netwerkcentraliteit allen hoger waren dan de overeenkomstige mediaanwaarden van het netwerk. Deze analyse prioriteerde negen hub-targets voor verdere interpretatie.
Moleculaire docking en validatie door redocking
Moleculaire docking werd uitgevoerd met behulp van de celecoxib-gebonden cyclooxygenase-2 structuur PDB ID 3LN1. Keten A en de bijbehorende heemgroep werden behouden als receptor, terwijl kristallografische watermoleculen en het co-gekristalliseerde celecoxib-ligand tijdens de receptorpreparatie werden verwijderd. De natuurlijke celecoxib-conformatie werd afzonderlijk uit keten A geëxtraheerd voor redocking-validatie. Polaire waterstofatomen en Gasteiger-ladingen werden toegevoegd met AutoDockTools, en de receptor werd opgeslagen in PDBQT-formaat. PDB ID 3LN1 is een 2,40 Å structuur van murine COX-2 gebonden aan celecoxib. De structuren van β-sitosterol en linoleylacetaat werden verkregen via PubChem en geprepareerd met Open Babel. Waterstofatomen en Gasteiger-partiële ladingen werden toegevoegd, roteerbare bindingen werden toegewezen en elk ligand werd geconverteerd naar PDBQT-formaat. Celecoxib, β-sitosterol en linoleylacetaat werden gedockt met AutoDock Vina met behulp van dezelfde receptor en zoekparameters.
De dockingbox werd gecentreerd op de natuurlijke celecoxib-bindingsregio met behulp van de volgende coördinaten: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. De exhaustiveness-waarde werd ingesteld op 16, het aantal output-modi op 10 en het energiebereik op 3 kcal/mol. De best gerangschikte pose, gebaseerd op de laagste voorspelde bindingsenergie, werd behouden voor visualisatie. Voor de validatie van het protocol werd natuurlijk celecoxib onder dezelfde omstandigheden opnieuw gedockt, waarna de root mean square deviation van de zware atomen tussen de kristallografische en de opnieuw gedockte poses werd berekend met PyMOL. Een root mean square deviation van minder dan 2 Å werd beschouwd als een acceptabele reproductie van de referentiepose. Residuen die zich binnen 4 Å van elk gedockt ligand bevonden, werden geïdentificeerd in PyMOL. Dockingscores en poses werden geïnterpreteerd als schattingen van de structurele compatibiliteit en niet als direct bewijs voor doelbinding of enzymatische remming.
Celkweek en preparatie van verbindingen
HBZY-1 rat glomerulaire mesangiale cellen werden gekweekt in high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C onder bevochtigde omstandigheden met 5% CO₂. Cellen in passages 2–7 werden gebruikt voor alle experimenten, en de mycoplasmavrije status werd vóór gebruik geverifieerd. β-Sitosterol en celecoxib dienden als chemisch gedefinieerde verbindingen. β-Sitosterol werd opgelost in absolute ethanol om een 10 mM voorraadoplossing te genereren (ongeveer 4,15 mg/mL). Indien nodig werden korte sonicatie en opwarming tot 50–60 °C uitgevoerd om een visueel heldere oplossing te verkrijgen. Celecoxib werd opgelost in dimethylsulfoxide om een 10 mM voorraadoplossing te bereiden (ongeveer 3,81 mg/mL). De voorraadoplossingen werden in aliquots verdeeld en bewaard bij −20 °C. Vóór de behandeling werden de voorraden direct verdund in voorverwarmd kweekmedium en onmiddellijk gemengd.
De concentraties van het oplosmiddel werden binnen elk experiment gelijkgetrokken. In de assay voor celviabiliteit werd de uiteindelijke ethanolconcentratie in alle groepen aangepast naar 0,2% v/v, aangezien de hoogste geteste β-sitosterolconcentratie 20 µM was. In het experiment naar LPS-geïnduceerde ontsteking werden de uiteindelijke concentraties van ethanol en dimethylsulfoxide in alle groepen respectievelijk aangepast naar 0,1% en 0,01% v/v. In het experiment naar TGF-β1-geïnduceerde profibrotische effecten werd de uiteindelijke ethanolconcentratie in alle groepen aangepast naar 0,1% v/v. Gelijkwaardige volumes van de overeenkomstige oplosmiddelen werden toegevoegd aan de Controle-, LPS- en TGF-β1-groepen.
Celviabiliteitsassay
Cellen werden uitgeplaat in 96-wells platen met een dichtheid van 5 × 103 cellen per well in 100 µL compleet medium en kregen 24 h de tijd om te hechten. Om het concentratiebereik van β-sitosterol te bepalen, werden de cellen 24 h geïncubeerd met 0,5, 1, 5, 10 of 20 µM β-sitosterol. Voor de LPS-gerelateerde celviabiliteitsassay werden de cellen 2 h voorbehandeld met β-sitosterol in concentraties van 1, 5 of 10 µM, gevolgd door blootstelling aan 1 µg/mL lipopolysaccharide gedurende nog eens 24 h.
De behandelingsgroepen waren Controle, β-sitosterol bij 0,5 µM, β-sitosterol bij 1 µM, β-sitosterol bij 5 µM, β-sitosterol bij 10 µM, β-sitosterol bij 20 µM, LPS, LPS plus β-sitosterol bij 1 µM, LPS plus β-sitosterol bij 5 µM en LPS plus β-sitosterol bij 10 µM. Cell Counting Kit-8 reagens werd toegevoegd in een volume van 10 µL per putje, waarna de platen gedurende 2 h werden geïncubeerd. De absorptie werd vervolgens gemeten bij 450 nm. De celviabiliteit werd bepaald na aftrek van de celvrije blanco en uitgedrukt relatief aan de Controlegroep. Voor elke conditie werden zes technische putjes gebruikt in elk van de zes onafhankelijke biologische experimenten. De waarden van de technische putjes uit elk experiment werden gemiddeld om één biologische replica-waarde te genereren voor statistische analyse.
LPS-geïnduceerde inflammatoire activatie
Voor experimenten naar inflammatoire activatie werden HBZY-1-cellen geplaatst in 6-wells platen met een dichtheid van 2 × 105 cellen per well en behandeld nadat een confluentie van ongeveer 70%–80% was bereikt. De cellen werden 12 u vóór de behandeling aangehouden in medium aangevuld met 1% foetaal runderseerum. β-Sitosterol of celecoxib werd 2 u vóór de LPS-stimulatie toegediend. Vervolgens werden de cellen 24 u lang blootgesteld aan 1 µg/mL LPS.
De experimentele groepen waren Controle, β-sitosterol bij 10 µM, LPS, LPS plus β-sitosterol bij 1 µM, LPS plus β-sitosterol bij 5 µM, LPS plus β-sitosterol bij 10 µM en LPS plus celecoxib bij 1 µM. Celecoxib werd toegevoegd als functionele positieve controle voor de remming van de COX-2-afhankelijke prostaglandineproductie. Aan het einde van de behandeling werden de cultuursupernatanten verzameld voor de meting van PGE2. Cellen werden afzonderlijk verzameld voor kwantitatieve real-time PCR-analyse van Tnf, Il6 en Ptgs2 en voor western blot-analyse van COX-2.
TGF-β1-geïnduceerde profibrotische activatie
Een apart TGF-β1-geïnduceerd model werd gebruikt om de profibrotische activatie te beoordelen. HBZY-1-cellen werden uitgeplaat in 6-wells platen met een dichtheid van 2 × 105 cellen per well en gedurende 12 u vóór de behandeling onderhouden in medium aangevuld met 1% foetaal runderserum. De cellen werden 2 u voorbehandeld met β-sitosterol, gevolgd door stimulatie met 10 ng/mL recombinant TGF-β1 gedurende 48 u.
De behandelingsgroepen bestonden uit Controle, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM) en TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM). Aan het einde van de behandelingsperiode werden de cellen geoogst voor kwantitatieve real-time PCR-analyse van Col1a1 en Acta2 en voor western blot-analyse van alfa-gladspieractine (α-SMA).
Kwantitatieve real-time PCR
Totaal RNA werd geïsoleerd uit behandelde cellen met een RNA-extractiereagens op basis van fenol-guanidinium volgens het protocol van de fabrikant. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden bepaald met een spectrofotometer. Alleen monsters met een A260/A280-ratio van 1,8–2,0 werden gebruikt voor reverse transcriptie. Voor elk monster werd 1 µg totaal RNA getranskribeerd naar complementair DNA in een finaal reactievolume van 20 µL. Het resulterende complementaire DNA werd vijf keer verdund met nucleasevrij water voorafgaand aan de kwantitatieve PCR. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd in een totaal volume van 20 µL bestaande uit 10 µL 2× SYBR Green master mix, telkens 0,4 µL van 10 µM forward- en reverse-primers, 2 µL verdund complementair DNA en 7,2 µL nucleasevrij water. De amplificatiecondities bestonden uit een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 5 s en annealing-extensie bij 60 °C gedurende 30 s. Vervolgens werd een smeltcurve-analyse uitgevoerd van 65 °C tot 95 °C om de amplificatiespecificiteit te verifiëren.
De gemeten genen waren Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 en Gapdh. Gapdh diende als het interne referentiegen. De relatieve genexpressie werd bepaald met de 2−ΔΔCt methode, waarbij de controlegroep als calibrator werd gebruikt. De primersequenties zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1. Elk monster werd in technisch triplikaat geanalyseerd, en er werden zes onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd. De waarden verkregen uit de technische replica's werden gemiddeld voorafgaand aan de statistische analyse.
PGE2-meting via enzyme-linked immunosorbent assay
Kweeksupernatanten werden verzameld na 24 u LPS-stimulatie en gecentrifugeerd bij 1,000 × g gedurende 10 min bij 4 °C om celresten te verwijderen. PGE2-concentraties werden bepaald met behulp van een commercieel verkrijgbare enzyme-linked immunosorbent assay-kit volgens de instructies van de fabrikant.
Standaarden en monsters werden in dubbeltoets op de assayplaat geladen. Na voltooiing van de antilichaambindings- en kleurontwikkelingsstappen werd de absorbentie bij 450 nm geregistreerd met een microplaatlezer. PGE2-concentraties werden bepaald aan de hand van een vierparameter logistische standaardcurve en uitgedrukt in pg/mL. Supernatanten van zes onafhankelijke celexperimenten werden geanalyseerd. Dubbele metingen voor elk biologisch monster werden gemiddeld voorafgaand aan de statistische analyse.
Western blotting
Behandelde cellen werden gelyseerd in radioimmunoprecipitatie-assaybuffer aangevuld met een protease-inhibitormengsel. De lysaten werden 30 min op ijs geïncubeerd en 15 min gecentrifugeerd bij 12,000 × g bij 4 °C. Proteïneconcentraties in de supernatanten werden bepaald met een bicinchonininezuur-proteïneassay. Gelijke hoeveelheden proteïne (30 µg per lane) werden gemengd met loadingbuffer en 5 min gedenatureerd bij 95 °C. Proteïnen uit de LPS-experimenten werden gescheiden op 10% sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamidegels, terwijl die uit de TGF-β1-experimenten werden gescheiden op 12% gels. De gescheiden proteïnen werden vervolgens overgebracht op polyvinylideenfluoridmembranen.
De membranen werden geblokkeerd met 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 gedurende 1 u bij kamertemperatuur en vervolgens overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) en GAPDH (1:5000). COX-2 werd geanalyseerd in monsters uit het LPS-experiment, terwijl α-SMA werd geanalyseerd in monsters uit het TGF-β1-experiment. Na het wassen werden de membranen 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met mierik wortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5000). Proteinebanden werden gevisualiseerd met behulp van een enhanced chemiluminescence substraat en vastgelegd met een chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. De belichtingstijden waren ongeveer 10 s voor COX-2, 10 s voor α-SMA en 2 s voor GAPDH.
Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ. COX-2 en α-SMA signalen werden genormaliseerd ten opzichte van het overeenkomstige GAPDH signaal. Western blotting werd uitgevoerd met eiwitmonsters verkregen uit zes onafhankelijke celkweek- en behandelingsexperimenten.
Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Voor elke kwantitatieve analyse werden zes onafhankelijke celkweek- en behandelingsexperimenten uitgevoerd, waarbij elk onafhankelijk experiment één biologisch replica vertegenwoordigde. Technische replica-metingen verkregen uit hetzelfde biologische experiment werden gemiddeld vóór de statistische analyse en werden niet als onafhankelijke waarnemingen beschouwd.
Voor de celviabiliteitsassay bestond elk biologisch experiment uit zes technische wells per conditie. Kwantitatieve PCR-reacties werden in technisch triplikaat uitgevoerd voor elk biologisch monster, en PGE2-metingen werden in dubbeltoestanden uitgevoerd. De kwantificering van de Western blot was gebaseerd op zes onafhankelijk voorbereide eiwitmonsters. Bijgevolg bevat elke kwantitatieve staaf zes individuele biologische replicaatwaarden.
Verschillen tussen meerdere groepen werden geanalyseerd met behulp van eenweg-variantieanalyse, gevolgd door de Tukey-toets voor meervoudige vergelijkingen. Een tweezijdige P-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Individuele biologische replica-waarden werden samen met het gemiddelde en de standaardafwijking weergegeven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Screening van potentiële bestanddelen, ophalen van targets en target-intersectie
De workflow voor het identificeren van kandidaat-verbinding-ziekte overlapdoelwitten is samengevat in Figuur 1A. Zeven kandidaat-verbindingen van C. sinensis voldeden aan de vooraf gedefinieerde screeningscriteria van OB ≥30% en DL ≥0,18, waaronder arachidonzuur, linoleylacetaat, β-sitosterol, peroxyergosterol, cerevisterol, cholesterylpalmitaat en CLR (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie integreerde netwerkfarmacologie, moleculaire docking gevalideerd met referentie-liganden en experimenten op verbindingsniveau om een hypothese geassocieerd met PTGS2 te onderzoeken, afgeleid van kandidaatbestanddelen van C. sinensis. Zeven bestanddelen voldeden aan de vooraf gedefinieerde TCMSP-screeningscriteria, en 23 targets overlapten met de genenset geassocieerd met glomerulonefritis. Protein-interactieanalyse prioriteerde negen centrale targets, waaronder PTGS2 werd geselectee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben. Tools op basis van kunstmatige intelligentie (ChatGPT, OpenAI) werden gebruikt om te helpen bij de taalredactie en het voorlopige ontwerp van schematische figuren. Generatieve kunstmatige intelligentie werd gebruikt om te helpen bij het opstellen van voorlopige grafische concepten voor Figuren 1A en 7, welke vervolgens door de auteurs zijn beoordeeld en herzien om consistentie met de gerapporteerde methoden en resultaten te waarborgen. Alle door AI ondersteunde outputs zijn kritisch geëvalueerd en goedgekeurd door de auteurs. De auteurs hebben de uiteindelijke inhoud van de figuren geverifieerd en dragen de volledige verantwoordelijkheid voor de integriteit en nauwkeurigheid van het manuscript.
Deze studie werd ondersteund door de Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Nephropathy Characteristic Specialty (ZYTSZK2-3) en de Study on TCM Intervention Strategy of Chronic Kidney Disease from the Perspective of Chronic Disease Management (202240169).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich/Merck | E7023 | 200 proof, niet-gedenatureerde ethanol van moleculaire biologie-kwaliteit; oplosmiddel voor β-sitosterol-stamoplossing. |
| AutoDock Vina | Scripps Research | Versie 1.1.2 | Moleculaire docking-simulatie |
| Veiligheidskast voor biologische agentia | Thermo Fisher Scientific | 1300 Serie A2 | Steriele celcultuurprocedures |
| Celecoxib | MedChemExpress | HY-14398 | Selectieve COX-2-remmer gebruikt als positieve controle; 10 mM stockoplossing in DMSO. |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | CK04 | WST-8 colorimetrische assay voor celviabiliteit; absorbantie gemeten bij 450 nm. |
| Chemiluminescentiesysteem voor beeldvorming | Bio-Rad Laboratories | ChemiDoc MP | Acquisitie van Western blot-beelden |
| clusterProfiler R-pakket | Bioconductor | Versie 4.10.0 | GO- en KEGG-verrijkingsanalyse |
| CO2 celkweekincubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3111 | Celkweekincubatie bij 37 °C en 5% CO22 |
| COX-2 (D5H5) konijn monoklonaal antilichaam | Cel-signaaltechnologie | 12282 | Western blot gevalideerd voor humane, muizen- en raten COX-2; gebruikt in een verdunning van 1:1.000. |
| CytoNCA-plug-in | Cytoscape App Store | Versie 2.1.6 | Topologische analyse van hub-doelwitten |
| Cytoscape-software | Cytoscape Consortium | Versie 3.8.0 | Netwerkvisualisatie en -analyse |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich/Merck | D2650 | sterielgefilterd bioreagens, ≥99,7%; oplosmiddel voor celecoxib-stockoplossing. |
| DisGeNET-database | Integratieve Biomedische Informatica Groep | Niet van toepassing | Ziekte-gen-opvraging voor glomerulonefritis |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | C11995500BT | Basaal medium voor HBZY-1 celkweek |
| Verbeterd chemiluminescentiesubstraat | Beyotime Biotechnology | P0018S | Visualisatie van Western blot-banden |
| Foetaal runderserum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10099-141C | Serumsupplement voor celkweek |
| GAPDH (D16H11) konijn monoklonaal antilichaam | Cell Signaling Technology | 5174 | Western blot-ladingscontrole; reactief met menselijke, muis- en rat-GAPDH; gebruikt in een verdunning van 1:5.000 na interne optimalisatie. |
| GeneCards-database | Weizmann Institute of Science | N/A | Identificatie van genen geassocieerd met glomerulonefritis |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versie 9.0.0.121 | Statistische analyse van in vitro experimentele gegevens |
| HRP-geconjugeerd geiten anti-konijn IgG | Proteintech Group | SA00001-2 | Secundair antilichaam voor konijnen primaire antilichamen |
| ImageJ-software | National Institutes of Health | Versie 1.54 | Densitometrische analyse van Western blots |
| Inverted fasecontrastmicroscoop | Olympus | CKX53 | Observatie van celmorfologie |
| org.Hs.eg.db R-pakket | Bioconductor | Versie 3.18.0 | Humane genannotatie voor enrichmementanalyse |
| Penicilline-streptomycine-oplossing | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibioticsupplement voor celkweek |
| PGE2 Parameter Assay Kit | R&D Systems, een merk van Bio-Techne | KGE004B | Multi-species competitieve ELISA voor celkweeksupernatanten; assaybereik 39–2.500 pg/mL; colorimetrische detectie bij 450 nm. |
| PharmGKB-database | Kennisbank voor Farmacogenomica | Niet beschikbaar | Opvragen van ziektegerelateerde targets |
| PubChem-database | National Center for Biotechnology Information | N.v.t. | Ophalen van ligandstructuren |
| PVDF-membraan | Millipore/Merck | IPVH00010 | Proteïne-transfermembraan voor western blotting |
| PyMOL moleculaire graphicsysteem | Schrijfödinger, LLC | Versie 2.6.2 | Visualisatie van de docking-pose |
| R-software | R Foundation for Statistical Computing | Versie 4.3.2 | Analyse van doelwitintersectie en verrijking |
| Ratten glomerulaire mesangiale cellijn (HBZY-1) | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0117 | In vitro validatiemodel voor mesangiale cellen |
| RCSB Protein Data Bank | Research Collaboratory voor Structurele Bio-informatica | PDB ID: 3LN1 | Opvraging van de kristalstructuur van PTGS2/COX2 |
| Recombinant humaan TGF-β1 eiwit | PeproTech, een merk van Thermo Fisher Scientific | 100-21-10UG | recombinant humaan TGF- afgeleid van HEK293β1; profibrotische stimulatie bij 10 ng/mL. |
| SDS-PAGE-elektroforese-systeem | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN Tetra | Proteïnescheiding via SDS-PAGE |
| STRING-database | ELIXIR/STRING-consortium | Versie 12.0 | Constructie van eiwit-eiwitinteractienetwerken |
| TCMSP-database | Systeemfarmacologische database voor Traditionele Chinese Geneeskunde | Niet beschikbaar | Screening van kandidaatverbindingen uit Cordyceps sinensis |
| Database voor therapeutische targets | Innovatieve Drugsonderzoek- en Bio-informatica Groep | Niet beschikbaar | Opvragen van therapeutische targets |
| α-primair SMA-antilichaam | Proteintech Group | 14395-1-AP | Detectie van α-SMA-proteïne-expressie |
| β-Sitosterol (zuiverheid >98%) | MedChemExpress | HY-N0171A | CAS 83-46-5; gedefinieerde verbinding gebruikt voor celbehandeling; 10 mM voorraadoplossing in absol ethanol. |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.