Nefroprotectieve effecten van behandeling met N-acetylcysteïne en montelukast na contrasttoediening in een ratmodel van contrast-geïnduceerde acute nierschade

Samenvatting

Dit protocol presenteert een ratmodel van contrast-geïnduceerde acute nierinsufficiëntie en evalueert de toediening van N-acetylcysteïne en montelukast na het contrastmiddel, afzonderlijk en in combinatie. De behandelingsregimes waren geassocieerd met minder ernstige renale dysfunctie, oxidatieve stress, ontsteking en histopathologische schade, hoewel de gecombineerde behandeling niet consistent beter presteerde dan monotherapie.

Samenvatting

Contrast-geïnduceerde acute nierinsufficiëntie (CI-AKI) is een belangrijke complicatie bij blootstelling aan gejodeerde contrastmiddelen, waarbij oxidatieve stress en ontstekingsprocessen bijdragen aan nierbeschadiging. In deze studie werd een experimenteel ratmodel van CI-AKI opgezet en werden de effecten onderzocht van een behandeling met N-acetylcysteïne (NAC), montelukast, of een combinatie van beide, gestart na de toediening van het contrastmiddel. Volwassen mannelijke Wistar-ratten ondergingen waterrestrictie, gevolgd door sequentiële intraveneuze toediening van Nω-nitro-L-arginine methylester (L-NAME), indomethacine en iohexol. De behandeling werd gestart 1 h na voltooiing van de iohexol-toediening, ongeveer 1,5 h na de L-NAME-toediening, en werd gedurende 3 opeenvolgende dagen één keer per dag voortgezet. Nierfunctie-indices, parameters voor oxidatieve stress, inflammatoire cytokines, biomarkers voor nierschade en nierhistopathologie werden geëvalueerd. De onbehandelde CI-AKI-groep vertoonde een uitgesproken nierdisfunctie, een ongunstig profiel van oxidatieve stress en ontsteking, en aanzienlijke histopathologische schade. In vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep vertoonden dieren die NAC, montelukast of het gecombineerde regime kregen over het algemeen verbeterde biochemische en histopathologische bevindingen. De glutathione- (GSH) spiegels waren het hoogst en de gemiddelde histopathologische scores voor beschadiging waren numeriek het laagst in de combinatiegroep; gecombineerde behandeling presteerde echter niet consistent beter dan monotherapie over de beoordeelde uitkomsten. Dit protocol biedt een gecontroleerd preklinisch kader voor het evalueren van interventies na contrasttoediening bij CI-AKI, en de bevindingen rechtvaardigen verder experimenteel onderzoek naar NAC en montelukast, zonder klinische effectiviteit of een specifiek voordeel van de combinatie vast te stellen.

Inleiding

Acute nierinsufficiëntie (AKI) compliceert vaak het beloop bij gehospitaliseerde patiënten en draagt bij aan een toename van morbiditeit, mortaliteit en het gebruik van zorgmiddelen. Aangezien gejodeerde contrastmiddelen routinematig worden ingezet bij diagnostische beeldvorming en interventionele procedures, is de verslechtering van de nierfunctie na blootstelling aan contrastmiddelen een belangrijk klinisch aandachtspunt geworden. De huidige nomenclatuur maakt onderscheid tussen contrast-geassocieerde acute nierinsufficiëntie (CA-AKI), wat elke episode van AKI omvat die optreedt na toediening van contrastmiddelen, en contrast-geïnduceerde acute nierinsufficiëntie (CI-AKI), waarbij het nierschade causaal wordt toegeschreven aan het contrastmiddel. In gecontroleerde experimentele modellen, waar blootstelling aan contrast direct kan worden gekoppeld aan nierschade, blijft de term CI-AKI daarom veelvuldig worden gebruikt^1,2.

Patiënten met chronische nierziekte, diabetes mellitus, hoge leeftijd, hartfalen of andere cardiovasculaire comorbiditeiten zijn bijzonder gevoelig voor CI-AKI. Bij veel getroffen patiënten herstelt de nierfunctie; bij ernstigere gevallen kunnen echter aanhoudende nierinsufficiëntie, de noodzaak voor niervervangende therapie en een verhoogd risico op overlijden optreden. CI-AKI is ook geassocieerd met een langere ziekenhuisopname en een groter beroep op zorgmiddelen. Deze nadelige gevolgen onderstrepen de aanhoudende behoefte aan de ontwikkeling van effectieve preventieve en therapeutische benaderingen voor contrastmiddel-gerelateerde nierschade^1,3,4,5.

De ontwikkeling van CI-AKI omvat verschillende onderling samenhangende processen, waaronder een veranderde renale perfusie, een zuurstofonbalans in de medulla, oxidatieve stress, ontsteking en directe tubulaire toxiciteit. Blootstelling aan contrastmiddelen verschuift de intrarenale vasculaire tonus richting vasoconstrictie en verzwakt tegelijkertijd de vasodilatatoire responsen, waardoor de renale bloedstroom afneemt. De buitenste medulla is bijzonder kwetsbaar omdat de zuurstofbeschikbaarheid in deze regio onder fysiologische omstandigheden al beperkt is. Een verdere afname van de zuurstoftoevoer na toediening van contrastmiddelen kan daarom leiden tot hypoxisch tubulair letsel^2,6,7.

Renale hypoxie na blootstelling aan contrastmiddelen gaat gepaard met een verhoogde generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), wat aanzienlijk bijdraagt aan nierschade. Wanneer de ROS-productie de endogene antioxidantcapaciteit overschrijdt, kan er oxidatieve schade ontstaan aan cellulaire lipiden, eiwitten en DNA, terwijl inflammatory signalering gelijktijdig wordt versterkt. In zowel experimentele als klinische settings is de toediening van contrastmiddelen geassocieerd met verhoogde parameters van oxidatieve stress en een vermindering van de antioxidantverdediging. Moleculaire routes die betrokken zijn bij deze respons omvatten nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH)-oxidase-afhankelijke radicaalvorming en activatie van nucleaire factor kappa-B (NF-κB)^1,6,8,9.

De bijdrage van ontsteking geeft aan dat CI-AKI niet alleen door hemodynamische verstoringen kan worden verklaard. Recent bewijs heeft ook ferroptose, nitrosatieve stress en extracellulaire neutrofielennetten (neutrophil extracellular traps) geïmpliceerd bij nierschade na blootstelling aan contrastmiddelen. De erkenning van deze aanvullende mechanismen heeft het scala aan moleculaire doelwitten dat wordt onderzocht voor de preventie en behandeling van CI-AKI verbreed¹.

Serumcreatinine en urineproductie worden veel gebruikt om CI-AKI te identificeren, maar beide kunnen pas veranderen nadat er reeds nierschade is ontstaan. Deze beperking heeft geleid tot de evaluatie van vroegere indicatoren, waaronder kidney injury molecule-1 (KIM-1), dat tubulaire schade weerspiegelt, en cystatine C, dat geassocieerd is met veranderingen in de glomerulaire filtratie. Bewijs uit experimentele en klinische studies wijst erop dat veranderingen in deze biomarkers detecteerbaar kunnen worden tijdens de vroege fase van CI-AKI en daarom een eerdere beoordeling van nierschade ondersteunen^9,10,11.

Vooruitgang in het begrip van de pathofysiologie van CI-AKI heeft geleid tot de evaluatie van farmacologische interventies gericht op oxidatieve en inflammatoire pathways. Adequate hydratatie blijft de belangrijkste preventieve maatregel, terwijl de gerapporteerde voordelen van geneesmiddelgebaseerde benaderingen per studie verschilden. Bijgevolg heeft geen enkele farmacologische behandeling tot nu toe een consistent voldoende effectiviteit aangetoond om als standaard klinische interventie voor CI-AKI te worden ingevoerd^1,4,12,13.

N-acetylcysteïne (NAC) is uitgebreid geëvalueerd als farmacologische benadering om CI-AKI te beperken. De voorgestelde renoprotectieve effecten zijn gerelateerd aan het wegvangen van reactieve species en het herstel van glutathionreserves. Vroege klinische ondersteuning kwam voort uit een baanbrekende studie bij patiënten met chronische nierziekte, waarin NAC de incidentie van contrast-gerelateerde renale dysfunctie verlaagde¹⁴. Latere klinische trials en bewijssyntheses produceerden echter inconsistente resultaten, waarbij sommige studies voordeel rapporteerden en andere geen betekenisvol klinisch effect lieten zien. De effectiviteit van NAC bij CI-AKI blijft daarom onzeker^12,15,16,17.

Montelukast blokkeert selectief de cysteinyl-leukotriëenreceptor-1 en wordt al lang gebruikt voor de behandeling van astma en allergische aandoeningen. Experimenteel bewijs wijst er ook op dat dit middel ontstekingsremmende, antioxidatieve en anti-apoptotische effecten uitoefent. In verschillende modellen van nierletsel werd de toediening van montelukast geassocieerd met een verminderde lipidperoxidatie, versterkte endogene antioxidantverdediging, minder ernstige histopathologische schade en een afzwakking van het nierletsel^{18,19,20,21,22}.

Bewijs dat specifiek montelukast bij CI-AKI onderzoekt, blijft beperkt. Beschikbare experimentele bevindingen suggereren dat de renale effecten ervan mogelijk betrekking hebben op de modulatie van oxidatieve en inflammatoire signalering. Een verminderde expressie van NADPH-oxidase 4 (NOX4), p22phox en NF-κB is voorgesteld als één mechanisme waardoor montelukast contrast-gerelateerde nierschade kan verminderen⁹.

NAC en montelukast beïnvloeden gedeeltelijk verschillende maar overlappende routes die betrokken zijn bij nierschade. NAC ondersteunt primair de antioxidantverdediging, terwijl montelukast zowel ontstekingsremmende als antioxidatieve werkingen heeft. Gelijktijdige toediening van deze middelen kan daarom meerdere componenten van de pathofysiologie van CI-AKI beïnvloeden; het is echter in experimentele modellen nog niet vastgesteld of hun interactie een additief of synergetisch voordeel oplevert^{18,19,20,21,22}.

Eerdere onderzoeken hebben hoofdzakelijk interventies geëvalueerd die vóór blootstelling aan contrastmiddelen werden toegediend, terwijl bewijs over behandelingen die na blootstelling zijn gestart schaars blijft. In het bijzonder is de toediening van montelukast samen met NAC na contrasttoediening beperkt onderzocht bij experimentele CI-AKI. De huidige studie evalueerde daarom montelukast en NAC, toegediend na contrastblootstelling zowel afzonderlijk als in combinatie, met betrekking tot de nierfunctie, parameters van oxidatieve stress en antioxidantverdedigingen, nierbeschadiging en inflammatoire biomarkers, en histopathologische veranderingen in een ratmodel van CI-AKI.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met internationaal geaccepteerde richtlijnen voor de zorg voor en het gebruik van laboratoriumdieren en voldeden aan de Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) richtlijnen. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dierproeven van de Ahi Evran Universiteit, Kırşehir, Turkije (Besluit nr. 2, Vergadering nr. 12, Datum: 12 juni 2025). Elke inspanning is geleverd om het lijden van de dieren te minimaliseren en het aantal gebruikte dieren gedurende de studie te beperken. De details van alle gebruikte reagentia en apparatuur zijn vermeld in de Tabel met Materialen.

Bereiding van chemicaliën

Nω-nitro-L-arginine methylester (L-NAME), indomethacine, iohexol, montelukastnatrium en NAC werden in deze studie gebruikt. Een 10 mg/mL L-NAME oplossing werd bereid in steriele 0,9% normale zoutoplossing met 1 g L-NAME per 100 mL. De oplossing werd vers bereid op de dag van toediening en werd niet langer bewaard dan die dag. Voor de inductie van het experimentele CI-AKI-model werd L-NAME intraveneus (IV) toegediend in een dosis van 10 mg/kg. Voor een rat met een gewicht van ongeveer 220 g was de berekende hoeveelheid ongeveer 2,2 mg, wat overeenkomt met een toedieningsvolume van ongeveer 0,22 mL. Indomethacine werd bereid in een 5% natriumbicarbonaatoplossing met een concentratie van 10 mg/mL door 100 mg op te lossen in een eindvolume van 10 mL. De oplossing werd gevortexd tot deze visueel homogeen was. De uiteindelijke pH van de bereide indomethacine-oplossing werd tijdens het experiment niet gemeten en kon daarom retrospectief niet worden bepaald. Een specifieke steriliteits- of filtratieprocedure voor de bereide indomethacine-oplossing was niet gedocumenteerd in de experimentele verslagen en kon daarom retrospectief niet worden gerapporteerd. Er is geen formeel stabiliteitsinterval vastgesteld of geëvalueerd; de oplossing werd vers bereid en op dezelfde dag gebruikt. Om het experimentele CI-AKI-model te induceren, werd indomethacine intraveneus toegediend in een dosis van 10 mg/kg. Voor een rat met een gewicht van ongeveer 220 g was de berekende hoeveelheid ongeveer 2,2 mg, wat overeenkomt met een toedieningsvolume van ongeveer 0,22 mL.

De commerciële iohexol-formulering, met een concentratie van 647 mg iohexol/mL en een equivalente jodiumconcentratie van 300 mg/mL, werd toegediend zonder verdere verdunning. De exacte temperatuur van de iohexol op het moment van injectie is niet geregistreerd. Een formuleringsspecifieke osmolaliteitswaarde kon niet betrouwbaar worden geverifieerd uit de beschikbare experimentele verslagen en wordt daarom niet vermeld. Voor de inductie van het experimentele CI-AKI-model werd iohexol intraveneus toegediend in een dosis van 3 g jodium/kg. Bij een rat met een gewicht van ongeveer 220 g leverde deze dosis ongeveer 0,66 g jodium op, wat overeenkwam met een injectievolume van ongeveer 2,2 mL.

Een suspensie van montelukastnatrium werd bereid in 0,5% carboxymethylcellulose (CMC). Deze werd op elke dag van toediening vers bereid en direct vóór dosering gevortexd om een gelijkmatige verdeling van de gesuspendeerde deeltjes te verkrijgen. De benodigde dosis montelukast voor elk dier werd afzonderlijk berekend op basis van het lichaamsgewicht dat aan het begin van de studie was vastgesteld, met behulp van de volgende formule: benodigde dosis (mg) = lichaamsgewicht (kg) × 10 mg/kg. Voor een dier met een gewicht van ongeveer 220 g was de berekende dosis ongeveer 2,2 mg, welke via orale gavage werd toegediend. De suspensie werd vóór elke toediening visueel gecontroleerd, en elke bereiding waarbij sedimentatie zichtbaar was, werd vóór gebruik opnieuw gevortexd.

NAC werd aan de behandelingsgroepen toegediend uit de commerciële formulering zonder verdere verdunning in een intraperitoneale dosis van 100 mg/kg. Voor elk dier werd de benodigde dosis individueel berekend op basis van het lichaamsgewicht dat aan het begin van de studie was vastgesteld. Bij een dier met een gewicht van ongeveer 220 g kwam dit overeen met ongeveer 22 mg NAC en een toedieningsvolume van ongeveer 0,15 mL. Voorafgaand aan de dosering werd de oplossing visueel gecontroleerd, waarbij alleen preparaten werden gebruikt die helder waren en geen zichtbare deeltjes bevatten.

Elke bereiding werd visueel geïnspecteerd vóór toediening. De L-NAME-, indomethacine-, iohexol- en NAC-oplossingen werden gecontroleerd op verkleuring en zichtbare partikels. Direct voor toediening werd de montelukast-suspensie gevortexd en visueel onderzocht om uniformiteit te bevestigen. Elke bereiding die niet voldeed aan deze acceptatiecriteria werd niet gebruikt. Tijdens de bereiding en toediening van alle chemicaliën werden laboratoriumjassen, beschermende handschoenen en oogbescherming gedragen. Alle procedures waren in overeenstemming met de institutionele eisen voor laboratoriumveiligheid en biosafety.

Selectie van dieren, huisvesting, experimentele groepen en randomisatie

Dertig volwassen mannelijke Wistar albino ratten (8–12 weken oud; lichaamsgewicht, 200–220 g) werden verkregen van het Experimental Animal Research Laboratory van de Ahi Evran University, Kırşehir, Türkiye. Mannelijke ratten werden geselecteerd om methodologische consistentie te behouden met eerder gepubliceerde experimentele CI-AKI-modellen en om te voorkomen dat de fase van de oestruscyclus als een extra biologische variabele zou worden geïntroduceerd. Geslacht werd in de huidige studie niet geëvalueerd als experimentele variabele. De dierfaciliteit beschikte over een fok-/productievergunning nr. 184, en de ratten werden daar gefokt en gehouden onder standaard laboratoriumcondities. Bij aanvang hadden de dieren geen gedocumenteerde specifiek-pathogeenvrije (SPF) status of andere formeel toegewezen microbiologische gezondheidsclassificatie. Elke rat werd afzonderlijk gehuisvest in een polycarbonaatkooi van 40 cm × 25 cm × 20 cm, met grof gehakt dennenhoutschaafsel als strooisel. De kamercondities werden op 24 °C ± 2 °C en 35% ± 10% relatieve vochtigheid gehouden door een geautomatiseerd milieucontrole- en ventilatiesysteem. Er werd een schema van 12 u licht/12 u donker toegepast, met verlichting van 07:00 tot 19:00 uur. Er werd geen specifieke milieuverrijking geboden tijdens de 7-daagse acclimatisatiefase of de daaropvolgende experimentele periode. Standaard gepelletteerd knagerenvoer en kraanwater waren ad libitum beschikbaar, afgezien van de gedefinieerde periode van 16 u waterdeprivatie voorafgaand aan de inductie van CI-AKI. De samenstelling van het voer was 24% ruwe proteïne, 3,94% ruwe cellulose, 5,08% ruw vet, 8,8% ruwe as, 1,44% lysine, 0,61% methionine, 1,14% calcium, 0,89% fosfor en 0,28% natrium. Alle dieren werden 7 dagen geacclimatiseerd voordat de experimentele procedures begonnen. Dagelijkse observaties werden uitgevoerd tijdens zowel de acclimatisatie- als de experimentele perioden om de algemene conditie, voedsel- en waterconsumptie, mobiliteit, houding, uiterlijk van de vacht en eventuele tekenen van stress te beoordelen. Om selectiebias te minimaliseren, werden de dieren toegewezen aan de vijf experimentele groepen met behulp van een door de computer gegenereerde randomisatiesequentie, waarbij zes dieren aan elke groep werden toegewezen. De steekproefomvang werd bepaald door een a priori poweranalyse met G*Power versie 3.1.9.6.

De steekproefomvang werd bepaald door een a priori poweranalyse voor een one-way analyse van variantie met vaste effecten voor vijf experimentele groepen. Uitgaande van een effectgrootte (f) van 0,65, een type I-foutenpercentage (α) van 0,05 en een statistische power van 80%, werd de vereiste totale steekproefomvang berekend op 30 dieren, wat overeenkomt met zes dieren per groep. De effectgrootte (f = 0,65) werd a priori aangenomen om een groot algemeen effect tussen de groepen weer te geven voor de vergelijking van de vijf groepen. De berekening was bedoeld om de steekproefomvang te bepalen die nodig is om een dergelijk algemeen effect te detecteren en was niet specifiek ontworpen om kleinere paarsgewijze verschillen tussen de actieve behandelgroepen te detecteren. Het individuele dier werd beschouwd als de experimentele eenheid voor alle analyses.

Behalve voor routinematige verzorging, dagelijkse gezondheidsmonitoring en terminale procedures, ondergingen de dieren in de controlegroep geen protocolgerelateerde hantering of fixatie, waterdeprivatie, intraveneuze of intraperitoneale injecties, orale gavage of toediening van het vehikel. De CI-AKI-groep bestond uit dieren bij wie het CI-AKI-model op dag 8 werd vastgesteld en die geen behandeling kregen. De CI-AKI + Montelukast-groep bestond uit dieren bij wie het CI-AKI-model werd vastgesteld en die vervolgens werden behandeld met montelukast. De CI-AKI + NAC-groep bestond uit dieren bij wie het CI-AKI-model werd vastgesteld en die vervolgens werden behandeld met NAC. De CI-AKI + Montelukast + NAC-groep bestond uit dieren bij wie het CI-AKI-model werd vastgesteld en die vervolgens werden behandeld met een combinatie van montelukast en NAC. Noch de controlegroep, noch de onbehandelde CI-AKI-groep onderging sham-procedures die waren afgestemd op de behandeling. Specifiek werden er in deze groepen geen sham-hantering, sham-orale gavage, sham-behandelingsinjecties of op de behandeling afgestemde vehikeltoedieningen uitgevoerd. De vehikels die werden gebruikt voor de bereiding van L-NAME, indomethacine en montelukast waren respectievelijk 0,9% normale zoutoplossing, 5% natriumbicarbonaatoplossing en 0,5% CMC, zoals beschreven bij de bereiding van chemicaliën. NAC werd toegediend vanuit de commerciële formulering zonder verdere verdunning, en er werd geen apart vehikel voor NAC bereid. Op dag 8 ondergingen alle dieren, behalve die in de controlegroep, 16 h waterdeprivatie, gevolgd door opeenvolgende intraveneuze toediening van L-NAME (10 mg/kg), indomethacine (10 mg/kg) en iohexol (3 g jodium/kg) om contrastmiddel-geïnduceerde acute nierinsufficiëntie (CI-AKI) op te wekken. In de aangewezen behandelingsgroepen werden montelukast (10 mg/kg, orale gavage) en/of NAC (100 mg/kg, intraperitoneale injectie) eerst toegediend 1 h na voltooiing van de iohexol-toediening op dag 8, wat overeenkomt met ongeveer 1,5 h na de L-NAME-toediening, en werden deze vervolgens eenmaal daags op hetzelfde tijdstip toegediend op dag 9 en 10.

Protocol voor toediening van geneesmiddelen

CI-AKI werd tot stand gebracht volgens een gepubliceerd experimenteel protocol bestaande uit 16 h waterdeprivatie, gevolgd door sequentiële intraveneuze toediening van L-NAME, indomethacine en iohexol^23,24,25. L-NAME en indomethacine werden elk toegediend in een dosis van 10 mg/kg, terwijl iohexol werd toegediend in een dosis van 3 g jodium/kg. De behandelingsdoses waren 10 mg/kg voor montelukastnatrium en 100 mg/kg voor NAC. De selectie van de doses voor modelinductie en behandeling was gebaseerd op eerder gepubliceerde experimentele studies^22,26,27. Er is geen voorafgaande studie uitgevoerd voor doseringsbereik of dosisoptimalisatie. De doses NAC en montelukast werden onafhankelijk geselecteerd op basis van eerder gepubliceerde experimentele studies naar de individuele middelen en zijn niet afgeleid van een combinatiespecifieke dosiszoekende studie. De gekozen doses waren niet bedoeld om farmacologisch equipotente blootstellingen te vertegenwoordigen, en er is geen dosis-respons- of formele drug-interactieanalyse uitgevoerd. Er is geen vooraf vastgestelde numerieke of laboratoriumdrempel gebruikt om een succesvolle modelinductie op individueel dierniveau te definiëren. Bij het eindpunt van de studie werd de succesvolle inductie van nierschade ondersteund door de karakteristieke histopathologische veranderingen die werden waargenomen in de onbehandelde CI-AKI-groep vergeleken met de controlegroep. Op dag 8 ondergingen alle dieren, behalve die in de controlegroep, een enkele periode van 16 h waterdeprivatie direct voorafgaand aan de inductie van contrastmiddel-geïnduceerde acute nierinsufficiëntie. Waterdeprivatie werd niet herhaald tijdens de rest van de experimentele periode. Standaard pelletvoer bleef ad libitum beschikbaar gedurende de gehele periode van waterdeprivatie. Na voltooiing van de enkelvoudige periode van 16 h waterdeprivatie werd de toegang tot kraanwater gelijktijdig en ad libitum hersteld voor alle waterdepriveerde experimentele groepen, vóór toediening van het eerste modelinducerende middel, L-NAME, en werd deze gehandhaafd voor de rest van de experimentele periode. Het tijdstip en de condities van het herstel van de watertoevoer waren identiek voor alle waterdepriveerde groepen. De waterinname na herstel was niet beperkt tot een vooraf gedefinieerd volume en werd niet kwantitatief gemeten. Gepaarde lichaamsgewichten direct voor en na de periode van 16 h waterdeprivatie werden niet gemeten; daarom kon het percentage lichaamsgewichtverlies geassocieerd met dehydratie niet worden berekend. De urineproductie werd niet kwantitatief gemonitord. Na herstel van de watertoevoer werd de inductie van CI-AKI gestart. Alle sequentiële intraveneuze toedieningen van L-NAME, indomethacine en iohexol werden uitgevoerd via een laterale staartader met een 26 G naald bevestigd aan een steriele spuit van 5 mL. Voorafgaand aan de intraveneuze toediening werd de staart enkele minuten in water verwarmd om de visualisatie en dilatatie van de laterale staartaders te vergemakkelijken. Na elke intraveneuze toediening werd de ader gespoeld met 0,5 mL steriele 0,9% normale zoutoplossing, in aanvulling op het berekende toedieningsvolume van het respectievelijke modelinducerende middel. De injectieplaats werd gedurende de toediening en het spoelen visueel gecontroleerd op zwelling, lekkage of tekenen van extravasatie. L-NAME (10 mg/kg) werd als eerste toegediend. Vijftien minuten na toediening van L-NAME werd indomethacine (10 mg/kg) intraveneus toegediend via dezelfde laterale staartader. Vijftien minuten na toediening van indomethacine werd iohexol intraveneus toegediend via dezelfde laterale staartader in een dosis van 3 g jodium/kg. Voor elk dier werden de iohexoldosis en het bijbehorende injectievolume individueel berekend op basis van het lichaamsgewicht bij aanvang van de studie en de commerciële jodiumconcentratie van 300 mg jodium/mL. Dit kwam overeen met een toedieningsvolume van 10 mL/kg en dus ongeveer 2,0–2,2 mL voor ratten met een gewicht van 200–220 g. Er was geen apart protocol-gedefinieerd maximaal toegestaan intraveneus volume vastgelegd; de grootste intraveneuze toediening van een enkel middel in deze studie was iohexol bij 10 mL/kg. Iohexol werd langzaam toegediend over ongeveer 1–2 min. Succesvolle intraveneuze toediening werd geverifieerd door de afwezigheid van zichtbare zwelling, lekkage of extravasatie op de injectieplaats. Er werd geen partiële extravasatie waargenomen en geen enkele injectie vereiste een nieuwe poging of herhaalde dosering vanwege vermoedelijke extravasatie. Eén uur na voltooiing van de iohexoltoediening werden de aangewezen behandelingen voor het eerst toegediend aan de behandelingsgroepen. Omdat de toediening van iohexol startte 30 min na de toediening van L-NAME en werd voltooid over ongeveer 1–2 min, vond de start van de behandeling plaats ongeveer 91–92 min (ongeveer 1,5 h) na toediening van L-NAME. Montelukastnatrium (10 mg/kg) werd toegediend via orale gavage, terwijl NAC (100 mg/kg) intraperitoneaal werd toegediend.

Orale gavage werd uitgevoerd met een 22 G roestvrijstalen voedingscanule. Elk dier werd in een rechtopstaande positie gehouden en de voedingscanule werd voorzichtig via de slokdarm in de maag ingebracht. Indien er overmatige weerstand werd ondervonden, werd de canule teruggetrokken en opnieuw gepositioneerd vóór toediening. De dieren werden tijdens en direct na de gavage geobserveerd op regurgitatie. Er werd bij geen enkel dier regurgitatie of ander bewijs van onvolledige orale dosering waargenomen tijdens of direct na de gavage, en geen enkel dier werd uitgesloten op basis van vermoedelijk ongeslaagde orale toediening. Intraperitoneale injecties werden toegediend in het onderste rechterkwadrant van de buikholte. De naald werd onder een hoek van ongeveer 30°–45° ingebracht, en er werd aspiratie uitgevoerd vóór toediening om onbedoelde vasculaire entry te controleren. De injectieplaats werd tijdens en direct na toediening visueel gecontroleerd op lekkage, bloedingen of andere zichtbare complicaties. De vastgestelde behandelingen werden éénmaal daags op hetzelfde tijdstip toegediend op dag 8, 9 en 10. Overeenkomstig ontvingen dieren in de CI-AKI + Montelukast-groep éénmaal daags montelukast gedurende drie opeenvolgende dagen, ontvingen dieren in de CI-AKI + NAC-groep éénmaal daags NAC gedurende drie opeenvolgende dagen, en ontvingen dieren in de CI-AKI + Montelukast + NAC-groep zowel montelukast als NAC éénmaal daags volgens hetzelfde 3-daagse behandelingsschema. Alle model-inducties en toedieningen van behandelingen werden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker. Het lichaamsgewicht werd één keer per dier gemeten bij aanvang van de studie en werd tijdens de experimentele periode niet opnieuw gemeten. Voor elk dier werden de dosis en het bijbehorende toedieningsvolume van alle model-inducerende middelen en studiebehandelingen individueel berekend op basis van het lichaamsgewicht vastgesteld bij aanvang van de studie. Alle intraveneuze, intraperitoneale en orale gavage-procedures werden uitgevoerd met dezelfde gestandaardiseerde techniek om variabiliteit gerelateerd aan de toediening te minimaliseren.

Euthanasieprocedure, humane eindpunten en monstername

Dieren werden gedurende het hele experiment dagelijks één keer geobserveerd op veranderingen in de algemene conditie, voedsel- en waterconsumptie, mobiliteit, houding, vachtaspect en tekenen van distress. De prospectief gedefinieerde humane eindpunten bestonden uit uitgesproken lethargie, het onvermogen om beschikbaar voedsel of water te bereiken of te consumeren, een abnormale houding, verminderde mobiliteit, aanhoudende piloerectie en elke andere overduidelijke uiting van distress. Dieren die aan een van deze criteria voldeden, moesten onmiddellijk worden geëuthanaseerd; geen enkel dier voldeed echter aan de criteria voor humane eindpunten tijdens de studie. Op dag 11, 24 h na de laatste behandeling, werd een diepe anesthesie geïnduceerd door intraperitonele toediening van ketamine (80 mg/kg) samen met xylazine (10 mg/kg). De afwezigheid van de pedaalreflex werd gebruikt om een adequaat anesthesieniveau te verifiëren. Nadat een voldoende anesthesiediepte was bevestigd, werd van elk dier ongeveer 3–5 mL bloed afgenomen via een intracardiale punctie. Euthanasie werd vervolgens voltooid door exsanguinatie terwijl het dier onder diepe anesthesie bleef. De afwezigheid van zowel hartactiviteit als spontane ademhaling werd gebruikt om het overlijden te bevestigen.

Bloed dat werd afgenomen voor serum biochemische metingen werd in buisjes zonder anticoagulans geplaatst en gelaten tot de stolling voltooid was. De buisjes werden vervolgens gecentrifugeerd bij 3.000 × g gedurende 10–15 min bij 4 °C, waarna de serumfractie werd gescheiden en bewaard bij −80 °C tot aan de analyse. Monsters bedoeld voor glutathionmeting werden afzonderlijk verzameld in buisjes die ethylenediaminetetra-azijnzuur (EDTA) bevatten. Omdat deze monsters waren anticoaguleerd, werden ze verwerkt zonder stollingsfase in overeenstemming met de bijbehorende glutathion-assayprocedure. De serumscheiding werd als acceptabel beschouwd wanneer het verkregen serum helder was en geen zichtbare tekenen van hemolyse vertoonde.

Zodra de dood was bevestigd, werd een mediane laparotomie uitgevoerd en werden beide nieren zorgvuldig uit elk dier verwijderd. Omringend vet- en bindweefsel werden van de monsters verwijderd. De rechternier werd uitsluitend gereserveerd voor histopathologisch onderzoek, terwijl de linkernier werd toegewezen aan biochemische analyse. Gemengd weefsel van de linkernier werd geanalyseerd zonder de renale cortex en medulla afzonderlijk te dissekeren. De twee nieren werden onafhankelijk behandeld, en monsters van verschillende dieren bleven gedurende de verwerking gescheiden zonder pooling. De gehele rechternier werd geplaatst in 10% neutraal gebufferd formaldehyde en verwerkt voor histopathologische beoordeling. Secties die de renale cortex en de buitenste medulla omvatten, werden geprepareerd en onderzocht volgens de procedures beschreven bij de histopathologische verwerking en scoring. Elke linkernier werd individueel gelabeld en bewaard bij -80 °C tot de homogenisatie en biochemische testing. Na excisie werd de grove weefselintegriteit gecontroleerd en werd een adequate hoeveelheid weefsel behouden voor de beoogde histopathologische en biochemische beoordelingen.

De onderzoeker die verantwoordelijk was voor de inductie van het model en het toedienen van de behandeling kon niet worden geblinderd, omdat de experimentele groepen verschillende procedures ondergingen. De groepsidentiteiten werden echter verborgen voor de onderzoekers die de biochemische en statistische analyses uitvoerden en voor de patholoog die de histopathologische beoordelingen verrichtte. Alle geïncludeerde dieren bleven in de studie en werden meegenomen in de daaropvolgende analyses. Biologische monsters, dierlijke weefsels, formaldehyde-gebaseerde fixatievloeistoffen en andere chemische afvalmaterialen werden behandeld met passende persoonlijke beschermingsmiddelen. De verwijdering van alle biologische en chemische afvalstoffen werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele vereisten voor biosafety en het beheer van gevaarlijk afval.

Biochemische analyses

Biochemische metingen werden uitgevoerd met behulp van serum, EDTA-geanticoaguleerd bloed en homogenaten van weefsel uit de linkernier, verzameld van elk dier. De procedures worden hieronder gepresenteerd op basis van de gebruikte biologische matrix voor elke parameter. Serum werd geanalyseerd op ureum, bloedureumstikstof (BUN), creatinine, superoxide dismutase (SOD) en malondialdehyde (MDA). Ureum, BUN en creatinine dienden als indices voor de nierfunctie, terwijl de SOD-activiteit en MDA-concentratie werden geëvalueerd als parameters voor oxidatieve stress. Serumureum- en BUN-waarden werden verkregen met dezelfde enzymatische urease-glutamaatdehydrogenase-assay. Bij deze methode werd ureum door urease gehydrolyseerd om ammoniak te produceren, dat vervolgens reageerde met 2-oxoglutaraat en gereduceerd nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) in de aanwezigheid van glutamaatdehydrogenase. De gebruikte analytische methode was een enzymatische urease-glutamaatdehydrogenase kinetische assay. De afname van de absorptie als gevolg van NADH-consumptie werd kinetisch gemeten met een spectrofotometer. De serumcreatinineconcentratie werd colorimetrisch gemeten met een geautomatiseerde biochemische analyzer. De serum-SOD-activiteit werd colorimetrisch gemeten met een commercieel verkrijgbare assaykit op dezelfde geautomatiseerde biochemische analyzer. De SOD-assay was gebaseerd op de generatie van superoxide-radicalen door het xanthine-xanthine-oxidase-systeem en hun reactie met 2-(4-jodofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyltetrazoliumchloride om een gekleurd formazanproduct te vormen. De eindpuntabsorptie werd gemeten bij 505 nm en de SOD-activiteit werd uitgedrukt als U/mL. De serum-MDA-concentratie werd colorimetrisch bepaald met de thiobarbituuurzuurreactie. Serummonsters werden gemengd met koud trichloroazijnzuur om eiwitten te precipiteren, en het resulterende precipitaat werd gescheiden door centrifugatie. Deze centrifugatiestap werd uitgevoerd bij 7.500 × g gedurende 5 min bij 4 °C. De supernatant werd bij 90 °C gedurende 60 min gereageerd met thiobarbituuurzuur, afgekoeld en gemeten bij 532 nm. MDA-concentraties werden berekend aan de hand van de overeenkomstige kalibratiecurve en uitgedrukt als nmol/mL. Glutathion (GSH)-analyse werd uitgevoerd met EDTA-geanticoaguleerd bloed. Eiwitten werden geprecipiteerd met trichloroazijnzuur en de resulterende gedeproteïniseerde monsters werden colorimetrisch geanalyseerd via een gemodificeerde Ellman-methode. De monsters werden gecombineerd met 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzozuur) (DTNB) in 500 mM Tris-buffer bij pH 8,2. De reactie van de thiolgroepen van GSH met DTNB genereerde een gekleurd product en de absorptie werd geregistreerd bij 412 nm. De catalase (CAT)-activiteit werd bepaald met een colorimetrische procedure in twee stappen. Monsters werden aanvankelijk geïncubeerd met een bekende hoeveelheid waterstofperoxide, die door catalase werd omgezet in water en moleculaire zuurstof. Nadat de enzymatische reactie was beëindigd, werd het resterende waterstofperoxide gemeten met een chromogeen reagens. De absorptie werd geregistreerd bij 405 nm en de CAT-activiteit werd gerapporteerd als U/mL. Voor de metingen in nierweefsel werd de linkernier van elk dier gebruikt als mengweefsel, zonder de cortex van de medulla te scheiden. Zoals vermeld in de procedure, werd de rechternier uitsluitend behouden voor histopathologisch onderzoek. Monsters van individuele dieren werden onafhankelijk verwerkt en in geen enkele fase samengevoegd. Elk specimen van de linkernier werd op ijs gehomogeniseerd in 50 mM fosfaatbuffer bij pH 7,4 met een weefsel-bufferverhouding van 1:10 (w/v). Er werd één dierspecifiek nierweefselhomogenaat gegenereerd voor elke rat. Afzonderlijke aliquots van dit homgeneaat werden gebruikt voor de verschillende metingen in het nierweefsel, om ervoor te zorgen dat alle parameters afkomstig waren van hetzelfde individuele dier. De resulterende nierweefselhomogenaten werden gecentrifugeerd bij 14.000 × g gedurende 10 min bij 4 °C. Na centrifugatie werd de supernatant van elk dier afzonderlijk verzameld en verdeeld in aliquots voor de geplande nierweefselanalyses. Concentraties van tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), interleukine-1 bèta (IL-1β), interleukine-6 (IL-6), cystatine C en KIM-1 in de supernatants van het nierweefsel werden gemeten met rat-specifieke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. De assays werden uitgevoerd volgens de protocollen van de fabrikant. De incubatiecondities waren identiek voor de TNF-α, IL-1β, IL-6, cystatine C en KIM-1 ELISA's. Voor elke assay werden de monsters en ELISA-reagentia gedurende 1 u bij 37 °C geïncubeerd; na vijf wascycli werden substraatoplossingen A en B toegevoegd en gedurende 10 min bij 37 °C geïncubeerd. Kort samengevat werden standaarden en supernatants van nierweefsel toegevoegd aan de met antilichamen gecoate wells, gevolgd door het overeenkomstige gebiotinyleerde detectieantilichaam en streptavidine-mierikwortelperoxidase-conjugaat. Na de gespecificeerde incubatiestappen werden ongebonden componenten verwijderd met een geautomatiseerde microplate-wasser. Vervolgens werd de substraatoplossing toegevoegd en de kleurreactie werd beëindigd met de zure stopoplossing. De absorptie werd gemeten bij 450 nm met een microplate-reader en de analytconcentraties werden berekend aan de hand van de overeenkomstige standaardcurves. Nierweefsel-ELISA-metingen werden in dubbeltoets uitgevoerd. Voor elke analyt werd het gemiddelde van de twee technische replica-wells berekend om één waarde op dierniveau te verkrijgen. Technische replica-wells en afzonderlijke aliquots verkregen uit hetzelfde dierspecifieke homogenaat werden niet beschouwd als onafhankelijke observaties. Alle biochemische metingen werden uitgevoerd onder gestandaardiseerde assay-specifieke condities. Serum, EDTA-geanticoaguleerd bloed en nierweefselmonsters werden afzonderlijk verwerkt volgens de vereisten van de overeenkomstige analytische methoden. Onderzoekers die de biochemische analyses uitvoerden, waren geblindeerd voor de groepstoewijzing. Het individuele dier, en niet elk serummonster, bloedmonster, nierspecimen, homogenaat-aliquot of technische replica-well, werd beschouwd als de experimentele eenheid. Bijgevolg werden zes onafhankelijke observaties op dierniveau opgenomen in de statistische analyse voor elke experimentele groep.

Histopathologische verwerking en scoring

Monsters van de rechternier werden voorbereid voor microscopische evaluatie via routinematige histologische verwerking. De gehele rechternier van elk dier werd gedurende 72 u bij kamertemperatuur ondergedompeld in 10% neutraal gebufferde formaldehyde. Na fixatie werd weefseldehydratatie sequentieel uitgevoerd in 50%, 70%, 80%, 96% en 100% ethanol, waarbij elke concentratie gedurende 1 u werd toegepast. De monsters werden vervolgens blootgesteld aan twee xyleenbaden van 30 min per bad voorafgaand aan het inbedden in paraffine. Met behulp van een rotatiemicrotoom werden coupes van 5 µm verkregen uit de paraffineblokken, die zowel de nierschors als het buitenste merg bevatten.

Voor hematoxyline en eosine (HE)-kleuring werden de coupes gedeparaffiniseerd en gehydrateerd, gedurende 5 min blootgesteld aan hematoxyline en vervolgens gedurende nog eens 5 min gewassen onder stromend kraanwater. Zuur alcohol werd gebruikt voor de differentiatie, waarna de coupes gedurende 1 min blauwden in ammoniakwater en gedurende 2 min werden tegengekleurd met eosine. De gekleurde coupes werden vervolgens gedehydrateerd in oplopende alcoholconcentraties, geklaard met xyleen en permanent gemonteerd onder dekglasjes.

Snedes bestemd voor Masson's trichroomkleuring werden op dezelfde wijze gedeparaffineerd en gehydrateerd. De beitsbehandeling werd 60 min lang uitgevoerd bij 56 °C, gevolgd door spoelen onder stromend kraanwater gedurende 10 min. De snedes werden vervolgens opeenvolgend behandeld met Weigerts ijzerhematoxyline gedurende 10 min, Biebrich scarlet-zuur fuchsine-oplossing gedurende 15 min, fosfowolfraamzuuroplossing gedurende 10 min en anilineblauwoplossing gedurende 10 min. Na onderdompeling in 1% azijnzuur gedurende 5 min werden de snedes gedehydrateerd, geklaard in xyleen en gemonteerd met dekglas.

Vóór de microscopische beoordeling werd de adequaatheid van de kleuring afzonderlijk voor elke methode geverifieerd. HE-gekleurde coupes werden als geschikt beschouwd wanneer nucleaire details en cytoplasmatisch contrast duidelijk waarneembaar waren, terwijl Masson-trichroom-gekleurde coupes werden geaccepteerd wanneer bindweefselstructuren duidelijk konden worden gevisualiseerd. Voor elk dier werden drie HE-gekleurde coupes en drie Masson-trichroom-gekleurde coupes onderzocht. In elke coupe werden vijf willekeurig geselecteerde microscopische velden geëvalueerd met een 40× objectief. Bijgevolg werden per dier 15 microscopische velden per kleuringsmethode onderzocht. Alle microscopische onderzoeken werden uitgevoerd met hetzelfde objectief en onder gestandaardiseerde evaluatieomstandigheden voor alle dieren en experimentele groepen. Masson-trichroom-gekleurde coupes werden kwalitatief geëvalueerd op interstitiële collageenverdeling en -depositie, accumulatie van de extracellulaire matrix en tubulo-interstitiële architectuur. Deze coupes werden niet gebruikt om de semi-kwantitatieve histopathologische letselscores van 0–3 te genereren. Representatieve HE- en Masson-trichroom-gekleurde fotomicrografieën werden vastgelegd met een 40× objectief, waarbij in elke representatieve afbeelding een schaalbalk van 100 µm was opgenomen. Deze fotomicrografieën werden verkregen voor illustratieve doeleinden en werden niet behandeld als onafhankelijke waarnemingen in de histopathologische scoring of statistische analyses. Alle histopathologische beoordelingen werden uitgevoerd door één ervaren patholoog die blind bleef voor de identiteit van de experimentele groepen. Het gebruik van een enkele geblindeerde beoordelaar was bedoeld om beoordelingsbias en variatie als gevolg van verschillen tussen waarnemers te beperken. Tubulaire necrose, tubulaire dilatatie, cellulaire degeneratie en vasculaire congestie werden semi-kwantitatief gescoord op HE-gekleurde renale coupes volgens een systeem aangepast uit eerder gepubliceerde nierschademodellen^28,29. Voor elke parameter varieerden de scores van 0 tot 3, wat respectievelijk overeenkomt met afwezig, mild, matig en ernstig histopathologisch letsel. Voor elk dier werden de bevindingen uit de vijf microscopische velden die in elk van de drie HE-gekleurde coupes waren onderzocht (in totaal 15 velden) gezamenlijk beschouwd om één enkele score van 0–3 toe te kennen voor elke histopathologische parameter. Zo droeg elk dier één score bij voor tubulaire necrose, tubulaire dilatatie, cellulaire degeneratie en vasculaire congestie. Histologische coupes en microscopische velden werden behandeld als submonsters binnen het dier en werden niet beschouwd als onafhankelijke waarnemingen. Binnen elke coupe werden microscopische velden willekeurig geselecteerd uit vergelijkbare regio's van de renale cortex en de buitenste medulla om de anatomische bemonstering over de dieren en experimentele groepen te standaardiseren. Het individuele dier, in plaats van elke nier, histologische coupe of microscopisch veld, werd beschouwd als de experimentele eenheid. Bijgevolg werden zes onafhankelijke waarnemingen op dierniveau opgenomen in de statistische analyse voor elke experimentele groep. De waarden in Tabel 3 vertegenwoordigen de groepsgemiddelden berekend uit de individuele scores op dierniveau van de zes dieren in elke experimentele groep.

Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware. Het individuele dier werd beschouwd als de experimentele eenheid voor alle statistische analyses. Elke experimentele groep bestond uit zes onafhankelijke dieren (n = 6 per groep). Technische replica's, assay-wells, weefselcoupes en microscopische velden werden niet behandeld als onafhankelijke waarnemingen en werden niet gebruikt om de statistische steekproefomvang te vergroten. Continue variabelen worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Normaliteit werd per experimentele groep afzonderlijk geëvalueerd met de Shapiro–Wilk-test, en homogeniteit van varianties werd beoordeeld met de Levene-test. Gezien het volledig gebalanceerde experimentele ontwerp met gelijke steekproefomvangen tussen de groepen, werd een eenweg-variantieanalyse (ANOVA) gebruikt om groepen te vergelijken. Paarsgewijze vergelijkingen werden uitgevoerd met de post hoc multiple comparison test van Duncan. Potentiële uitschieters werden geëvalueerd door grafische inspectie van boxplots en controle van individuele waarnemingen. Geen enkele waarneming werd beschouwd als een meetfout of een ongeldig experimenteel resultaat, en er werden geen datapunten om statistische redenen uitgesloten. Een p-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Serummarkeringen voor nierfunctie (ureum, bloedureumstikstof en creatinine)

Het experimentele ontwerp, de diergroepen, het behandelingschema en de tijdlijn voor het verzamelen van monsters van de huidige studie zijn samengevat in Figuur 1. Er werden statistisch significante verschillen waargenomen tussen de groepen voor de niveaus van ureum, BUN en creatinine in serum (p = 0.003, p = 0.003 en p = 0.002, respectievelijk). Het gemiddelde ureumgehalte in serum was 67,43 mg/dL ± 53,11 mg/dL in de controlegroep en steeg tot 606,71 mg/dL ± 429,42 mg/dL in de CI-AKI-groep. Evenzo steeg het gemiddelde BUN-niveau van 31,51 mg/dL ± 24,82 mg/dL in de controlegroep naar 268,63 mg/dL ± 190,84 mg/dL in de CI-AKI-groep. De creatinineconcentraties in serum stegen eveneens sterk, van 0,60 mg/dL ± 0,05 mg/dL in de controlegroep tot 3,27 mg/dL ± 2,14 mg/dL in de CI-AKI-groep. Post-hoc vergelijkingen volgens Duncan toonden aan dat de niveaus van ureum, BUN en creatinine in serum significant lager waren in elke behandelingsgroep — de CI-AKI + Montelukast-, CI-AKI + NAC- en CI-AKI + Montelukast + NAC-groepen — vergeleken met de onbehandelde CI-AKI-groep (allemaal p < 0,05). De gegevens voor de serummarkers van nierfunctie zijn weergegeven in Tabel 1.

Parameters voor oxidatieve stress en activiteiten van antioxidatieve enzymen

Er werden statistisch significante verschillen waargenomen tussen de groepen wat betreft de niveaus van SOD, GSH, CAT en MDA (p = 0,044, p = 0,001, p = 0,003 en p = 0,001, respectievelijk; Tabel 1). Uit de post-hoc-analyse van Duncan bleek dat de GSH-niveaus significant hoger waren in de montelukast-, NAC- en combinatiebehandelingsgroepen in vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep (allemaal p < 0,05). De combinatiegroep had ook een significant hoger GSH-niveau dan de controlegroep (p < 0,05). Er werden echter geen statistisch significante verschillen waargenomen tussen de combinatiegroep en een van de monotherapiegroepen, noch tussen de twee monotherapiegroepen (allemaal p > 0,05). Het laagste SOD-niveau werd waargenomen in de CI-AKI-groep (92,23 U/mL ± 16,37 U/mL), terwijl de controlegroep 147,81 U/mL ± 33,27 U/mL vertoonde. De GSH-niveaus waren het laagst in de CI-AKI-groep (66,05 mmol/L ± 24,72 mmol/L) en het hoogst in de CI-AKI + Montelukast + NAC-groep (172,44 mmol/L ± 60,48 mmol/L). De CAT-activiteit was het hoogst in de controlegroep (93,35 U/mL ± 18,75 U/mL) en het laagst in de CI-AKI-groep (33,22 U/mL ± 17,07 U/mL). Wat betreft de MDA-niveaus, was de hoogste waarde waargenomen in de CI-AKI-groep (54,13 nmol/mL ± 19,37 nmol/mL), terwijl de laagste waarde werd geregistreerd in de CI-AKI + NAC-groep (21,53 nmol/mL ± 5,07 nmol/mL). De gegevens over parameters van oxidatieve stress en activiteiten van antioxidante enzymen zijn weergegeven in Tabel 1.

Nierletsels en inflammatoire biomerkers (KIM-1, Cystatine C, TNF-α, IL-1β en IL-6)

Er werden statistisch significante verschillen waargenomen tussen de groepen wat betreft de niveaus van renale cystatine C, IL-6, KIM-1, TNF-α en IL-1β (p < 0,001, p = 0,008, p = 0,027, p = 0,006 en p < 0,001, respectievelijk; Tabel 2). Duncan’s post hoc-vergelijkingen toonden aan dat de niveaus van cystatine C, IL-6, KIM-1, TNF-α en IL-1β significant lager waren in elke behandelingsgroep, namelijk de CI-AKI + Montelukast-, CI-AKI + NAC- en CI-AKI + Montelukast + NAC-groepen, in vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep (allemaal p < 0,05). Voor IL-1β werd ook een statistisch significant verschil waargenomen tussen de CI-AKI + Montelukast- en de CI-AKI + NAC-groepen (p < 0,05). De renale cystatine C-niveaus waren het hoogst in de CI-AKI-groep (18,43 ng/mL ± 1,06 ng/mL), terwijl de Controle-groep een waarde vertoonde van 10,30 ng/mL ± 0,78 ng/mL. Evenzo waren de IL-6-niveaus het hoogst in de CI-AKI-groep (13,41 ng/L ± 2,14 ng/L) en het laagst in de Controle-groep (9,29 ng/L ± 2,70 ng/L). De KIM-1-niveaus waren het hoogst in de CI-AKI-groep (3,07 ng/mL ± 0,36 ng/mL), vergeleken met 2,25 ng/mL ± 0,54 ng/mL in de Controle-groep. Op dezelfde manier waren de TNF-α-niveaus het hoogst in de CI-AKI-groep (161,69 ng/L ± 26,14 ng/L), terwijl de laagste waarden werden waargenomen in de Controle-groep (95,49 ng/L ± 16,98 ng/L). De IL-1β-niveaus waren het hoogst in de CI-AKI-groep (9,28 ng/mL ± 0,68 ng/mL), terwijl de laagste waarde werd waargenomen in de CI-AKI + Montelukast-groep (7,34 ng/mL ± 0,57 ng/mL). De gegevens met betrekking tot renale letsels en inflammatoire biomerkers zijn weergegeven in Tabel 2. Belangrijk is dat, hoewel sommige waarden van biochemische merkers in de CI-AKI + Montelukast + NAC-groep numeriek hoger waren dan in de CI-AKI + Montelukast-groep, Duncan’s post hoc-vergelijkingen geen statistisch significante verschillen aantoonden tussen deze twee behandelingsgroepen voor enige van de beoordeelde biochemische variabelen, inclusief parameters voor oxidatieve stress, biomerkers voor renale letsels en inflammatoire biomerkers (p > 0,05).

Histopathologische evaluatie

Hispathologische bevindingen

Niersecties gekleurd met HE toonden een behouden nierarchitectuur in de controlegroep, met normale glomerulaire en tubulaire morfologie. Daarentegen vertoonde de onbehandelde CI-AKI-groep uitgesproken histopathologische veranderingen, waaronder tubulaire epitheliale letsels, wijdverspreide cellulaire degeneratie, tubulaire dilatatie, cellulaire resten in de tubulaire lumen en vasculaire congestie. Necrotische veranderingen waren vooral duidelijk in de proximale tubulaire segmenten. In de CI-AKI + Montelukast-groep was de ernst van de tubulaire letsels verminderd in vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep, hoewel focale degeneratieve veranderingen nog steeds zichtbaar waren. Evenzo toonde de CI-AKI + NAC-groep een betere behoud van de tubulaire epitheliale integriteit en minder necrotische gebieden. Bij kwalitatieve histopathologische inspectie leek de nierarchitectuur behouden in de CI-AKI + Montelukast + NAC-groep, met grotendeels behouden corticale en medullaire structuren en relatief beperkte tubulaire necrose, tubulaire dilatatie, cellulaire degeneratie en vasculaire congestie. Met Masson’s trichroom gekleurde secties onthulden een normale verdeling van interstitieel collageen in de controlegroep. In de onbehandelde CI-AKI-groep werd verhoogde afzetting van interstitieel collageen, tubulointerstitiële architectonische desorganisatie en ophoping van extracellulaire matrix waargenomen. Deze veranderingen leken minder uitgesproken in de behandelingsgroepen, inclusief de groep met gecombineerde behandeling, in vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep. Representatieve met HE en Masson’s trichroom gekleurde niersecties die deze bevindingen illustreren, zijn weergegeven in Figuur 2.

Semi-kwantitatieve histopathologische score

Semi-kwantitatieve histopathologische beoordeling toonde aan dat de scores voor tubulaire necrose, tubulaire dilatatie, cellulaire degeneratie en vasculaire congestie het hoogst waren in de niet-behandelde CI-AKI-groep. De gemiddelde scores in deze groep waren respectievelijk 2,67, 2,83, 2,67 en 2,50. De relatief hoge gemiddelde scores, die de bovengrens van de 0–3-schaal naderden, waren in overeenstemming met de uitgebreide en ernstige tubulaire en vasculaire veranderingen die bij kwalitatieve histopathologische onderzoeken in dezelfde groep werden waargenomen. In tegenstelling daarmee waren alle parameters afwezig in de controlegroep. Lagere letselscores werden waargenomen in alle behandelingsgroepen in vergelijking met de niet-behandelde CI-AKI-groep. De CI-AKI + Montelukast-groep vertoonde gemiddelde scores van 1,33 voor tubulaire necrose, 1,50 voor tubulaire dilatatie, 1,17 voor cellulaire degeneratie en 1,00 voor vasculaire congestie. De overeenkomstige waarden in de CI-AKI + NAC-groep waren respectievelijk 1,17, 1,17, 0,83 en 0,83. Numeriek gezien waren de laagste gemiddelde histopathologische letselscores waargenomen in de CI-AKI + Montelukast + NAC-groep, met gemiddelde waarden van 0,50, 0,67, 0,50 en 0,17 voor tubulaire necrose, tubulaire dilatatie, cellulaire degeneratie en vasculaire congestie, respectievelijk. Gedetailleerde histopathologische scores zijn weergegeven in tabel 3.

De ruwe gegevens ten grondslag aan alle biochemische en histopathologische analyses, en de originele onbewerkte HE- en Masson’s trichroom-histologieafbeeldingen worden verstrekt als Supplementair bestand 1.

Figuur 1: Experimenteel ontwerp en studietijdlijn. Schematische weergave van de experimentele werkwijze. Dertig volwassen mannelijke Wistar-ratten werden na een acclimatisatieperiode van 7 dagen willekeurig ingedeeld in vijf groepen (n = 6 per groep). De controlegroep onderging geen wateronttrekking, geen inductie van CI-AKI en kreeg geen behandeling. De overige groepen ondergingen eenmalig een periode van 16 uur wateronttrekking, gevolgd door opeenvolgende intraveneuze toediening van L-NAME (10 mg/kg), indomethacine (10 mg/kg) en iohexol (3 g jood/kg) om CI-AKI te induceren. Een uur na toediening van iohexol kregen de aangewezen behandelingsgroepen eenmaal daags montelukast (10 mg/kg, orale gavage), NAC (100 mg/kg, intraperitoneale injectie) of beide op dag 8–10, terwijl de onbehandelde CI-AKI-groep geen therapeutische behandeling kreeg. Alle groepen ondergingen terminale procedures en bemonstering op dag 11. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.

Figuur 2: Vertegenwoordigende HE- en Masson’s trichroom-gekleurde niersneden van experimentele groepen. Vertegenwoordigende HE- en Masson’s trichroom-gekleurde niersneden verkregen uit de (A) Controle-, (B) CI-AKI-, (C) CI-AKI + Montelukast-, (D) CI-AKI + NAC- en (E) CI-AKI + Montelukast + NAC-groepen. HE-gekleurde sneden (bovenste rij) tonen behouden nierarchitectuur in de controlegroep, terwijl de CI-AKI-groep uitgesproken tubulaire necrose (*), tubulaire dilatatie (+), celdegeneratie (×) en vasculaire congestie (↑) vertoont. Deze histopathologische veranderingen leken verminderd in de representatieve sneden van de behandelingsgroepen in vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep. Masson’s trichroom-gekleurde sneden (onderste rij) tonen toegenomen interstitiële collageenafzetting en tubulointerstitiële desorganisatie in de CI-AKI-groep, terwijl deze veranderingen minder uitgesproken waren in de representatieve sneden van de behandelingsgroepen. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.

Variabele	Controle	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
UREUM (mg/dL)	67,43±53,11a	606,71±429,42b	105,89±28,63a	243,14±135,99a	293,61±212,05a	0,003
BUN (mg/dL)	31,51±24,82a	268,63±190,84b	51,53±14,69a	129,54±73,54a	108,38±87,36a	0,003
Creatinine (mg/dL)	0,60±0,05a	3,27±2,14b	0,61±0,12a	1,53±1,17a	1,28±0,55a	0,002
SOD (U/mL)	147,81±33,27a	92,23±16,37b	130,96±42,19a	137,87±31,95a	141,71±30,27a	0,044
GSH (mmol/L)	124,29±21,24b	66,05±24,72a	133,87±26,95bc	139,31±30,10bc	172,44±60,48c	0,001
CAT (U/mL)	93,35±18,75c	33,22±17,07a	58,67±32,95ab	52,64±19,97ab	75,46±26,85bc	0,003
MDA (nmol/mL)	23,42±13,48a	54,13±19,37b	22,40±14,81a	21,53±5,07a	37,01±9,29a	0,001
Binnen elke rij waren groepen die minstens één superscriptletter delen, niet significant verschillend, terwijl groepen zonder gemeenschappelijke superscriptletter significant verschillend waren volgens de post-hoc toets van Duncan (p < 0,05).

Tabel 1: Biochemische en oxidatieve stressparameters in experimentele groepen. Aanzienlijke paarsgewijze verschillen: ureum, BUN, creatinine (CREA), SOD en MDA, CI-AKI versus Controle, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC en CI-AKI+M+NAC; GSH, CI-AKI versus alle andere groepen en Controle versus CI-AKI+M+NAC; CAT, Controle versus CI-AKI, CI-AKI+M en CI-AKI+NAC, en CI-AKI versus CI-AKI+M+NAC. De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 6) en werden geanalyseerd met een eenweg-ANOVA gevolgd door de post-hoc toets van Duncan. Waarden zonder gemeenschappelijke bovenindexletter verschillen significant (p < 0,05).

Variabele	Controle	CI-AKI	CI-AKI+M	CI-AKI+NAC	CI-AKI+NAC+M	p
Cystatine C (ng/mL)	10,30±0,78a	18,43±1,06b	10,90±1,13a	11,00±0,59a	11,13±0,84a	<0,001
IL-6 (ng/L)	9,29±2,70a	13,41±2,14b	10,24±0,86a	10,66±0,83a	10,85±1,63a	0,008
KIM-1 (ng/mL)	2,25±0,54a	3,07±0,36b	2,39±0,60a	2,45±0,33a	2,45±0,17a	0,027
TNF-α (ng/L)	95,49±16,98a	161,69±26,14b	110,26±38,12a	119,42±35,35a	127,76±15,13a	0,006
IL-1β (ng/mL)	7,65±0,53ab	9,28±0,68c	7,34±0,57a	8,24±0,73b	8,11±0,72ab	<0,001
Binnen elke rij waren groepen die minstens één superscriptletter delen, niet significant verschillend, terwijl groepen zonder gemeenschappelijke superscriptletter significant verschillend waren volgens de post-hoc toets van Duncan (p < 0,05).

Tabel 2: Nierschade- en inflammatoire biomerkerniveaus in experimentele groepen. Significante paarsgewijze verschillen: cystatine C, IL-6, KIM-1 en TNF-α, CI-AKI versus Controle, CI-AKI+M, CI-AKI+NAC en CI-AKI+M+NAC; IL-1β, CI-AKI versus alle andere groepen en CI-AKI+M versus CI-AKI+NAC. De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 6) en werden geanalyseerd met een eenweg-ANOVA gevolgd door de post-hoc toets van Duncan. Waarden zonder gemeenschappelijke bovenindexletter verschillen significant (p < 0,05).

Groepen	Tubulaire necrose	Tubulaire dilatatie	Celdegeneratie	Vasculaire congestie
Controle	0	0	0	0
CI-AKI	2,67	2,83	2,67	2,5
CI-AKI+M	1,33	1,5	1,17	1
CI-AKI+NAC	1,17	1,17	0,83	0,83
CI-AKI+NAC+M	0,5	0,67	0,5	0,17

Tabel 3: Vergelijking van histopathologische schadeparameters van nierweefsel in experimentele groepen. Semi-kwantitatieve, op HE-gebaseerde histopathologische letselscores worden weergegeven als groepsgemiddelden (n = 6 dieren/groep). De scores werden beoordeeld als 0 (geen schade), 1 (licht), 2 (matig) en 3 (ernstige schade), waarbij hogere scores overeenkomen met grotere histopathologische schade.

Supplementair bestand 1: Gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze experimentele CI-AKI-studie evalueerde de post-contrastbehandeling met montelukast, NAC of hun combinatie op basis van nierfunctie, parameters van oxidatieve stress, inflammatoire responsen, biomarkers voor nierschade en histopathologische uitkomsten. Blootstelling aan contrastmiddelen leidde tot aanzienige stijgingen van serumureum, BUN en creatinine en ging gepaard met nadelige veranderingen in parameters van oxidatieve stress en inflammatoire biomarkers. Verhoogde spiegels van KIM-1 en cystatine C leverden aanvullend bewijs voor nierschade.

Behandeling met montelukast, NAC of hun combinatie na het contrastmiddel was geassocieerd met gunstige veranderingen in verschillende geëvalueerde parameters. De combinatie presteerde echter niet consistent beter dan monotherapie met montelukast voor de biochemische uitkomsten. Samen zijn deze observaties verenigbaar met de betrokkenheid van oxidatieve stress en ontsteking bij CI-AKI en suggereren ze dat interventies die op deze processen inwerken de nierschade kunnen verminderen, hoewel de onderliggende signaleringspaden in de huidige studie niet direct zijn onderzocht^1,30.

De uitgesproken stijgingen van serumureum, BUN en creatinine na toediening van contrastmiddelen ondersteunen de succesvolle inductie van renale dysfunctie in dit experimentele CI-AKI-model. Blootstelling aan contrastmiddelen kan de nierfunctie beïnvloeden via interactieve processen, waaronder intrarenale vasoconstrictie, medullaire hypoxie, oxidatieve schade en beschadiging van tubulaire cellen. De resulterende afname van de renale perfusie en glomerulaire filtratie kan de eliminatie van stikstofhoudende afvalproducten beperken, waardoor hun circulerende concentraties toenemen. De geobserveerde veranderingen in de nierfunctie in de onbehandelde CI-AKI-groep zijn consistent met resultaten gerapporteerd in eerdere experimentele studies^1,30,31,32.

Er werd aanzienlijke variabiliteit binnen de groep waargenomen voor serumurea en BUN in de onbehandelde CI-AKI-groep, wat wordt weerspiegeld door de relatief grote standaarddeviaties. Deze spreiding kan wijzen op interindividuele biologische verschillen in gevoeligheid voor het gesensitiseerde CI-AKI-inductieprotocol, waaronder variabiliteit in de renale respons op waterrestrictie, inhibitie van stikstofmonoxide- en prostaglandinepaden en blootstelling aan contrastmiddel. Kleine verschillen in de renale functionele reserve en fysiologische reacties tussen de dieren kunnen ook hebben bijgedragen aan de heterogene ernst van de nierbeschadiging. Daarom moeten de grote standaarddeviaties worden geïnterpreteerd als bewijs van aanzienlijke biologische variabiliteit binnen dit experimentele model in plaats van als meetfouten. Desondanks moeten, gezien het geringe aantal dieren in elke groep, de distributiekenmerken en de omvang van de behandelingsgerelateerde verschillen met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.

In de huidige studie waren de serumureum-, BUN- en creatininespiegels numeriek lager in de met NAC behandelde groep dan in de onbehandelde CI-AKI-groep, een patroon dat consistent is met een mogelijke vermindering van de renale dysfunctie. NAC is uitgebreid bestudeerd bij CI-AKI, maar de gerapporteerde effecten op de nierfunctie zijn tussen studies verschillend^14,15,16,17. Voorgestelde mechanismen omvatten het wegvangen van reactieve species, ondersteuning van de glutathionsynthese en het beperken van oxidatieve schade binnen het nierweefsel¹. Het geobserveerde profiel van de nierfunctie na NAC-behandeling kan dus gerelateerd zijn aan de antioxidatieve eigenschappen ervan, hoewel dit mechanisme in de huidige studie niet direct is onderzocht.

In de huidige studie waren de serumureum-, BUN- en creatininespiegels numeriek lager in de met montelukast behandelde groep dan in de onbehandelde CI-AKI-groep, wat wijst op een mogelijke vermindering van de renale dysfunctie. Eerdere experimentele studies, waaronder onderzoeken naar CI-AKI, hebben op soortgelijke wijze lagere serumcreatinine- en ureumspiegels gerapporteerd na toediening van montelukast^9,18,19. De combinatiegroep vertoonde eveneens numeriek lagere markers voor de nierfunctie dan de onbehandelde CI-AKI-groep. Urea, BUN en creatinine waren echter numeriek lager bij monotherapie met montelukast dan bij de gecombineerde behandeling, en post hoc-vergelijkingen van Duncan toonden geen statistisch significante verschillen tussen deze twee groepen (p > 0,05). Combinatietherapie bleek hiermee dus niet superieur aan monotherapie met montelukast voor deze markers van de nierfunctie.

Oxidatieve schade wordt beschouwd als een belangrijke bijdrage aan de pathofysiologie van CI-AKI. Medullaire hypoxie, veroorzaakt door blootstelling aan contrastmiddelen, bevordert de overmatige generatie van ROS, wat cellulaire lipiden en mitochondriën kan beschadigen, tubulaire epitheelcellen kan beschadigen en inflammatoire signalering kan versterken^1,12,30.

De onbehandelde CI-AKI-groep vertoonde de hoogste MDA-concentratie, samen met de laagste SOD- en CAT-activiteiten en het laagste GSH-niveau, wat wijst op een onbalans tussen de oxidatieve belasting en de antioxidantdefensies na blootstelling aan contrastmiddelen. Vergelijkbare profielen, gekenmerkt door een verhoogde MDA samen met een verminderde antioxidantcapaciteit, zijn gerapporteerd in andere experimentele modellen van CI-AKI^18,19. Deze bevindingen zijn consistent met de stelling dat oxidatieve stress bijdraagt aan de ontwikkeling en progressie van nierschade, in plaats van dat het enkel als een secundair gevolg optreedt^1,30.

Vergeleken met de onbehandelde CI-AKI-groep vertoonden de met NAC en montelukast behandelde groepen over het algemeen lagere MDA-waarden samen met hogere SOD-, GSH- en CAT-waarden, een patroon dat consistent is met de vermindering van oxidatieve schade. De voorgestelde antioxidatieve werkingen van NAC omvatten de neutralisatie van reactieve soorten en het behoud van de intracellulaire beschikbaarheid van glutathion^1,14. Montelukast kan renale oxidatieve schade mogelijk ook beperken via mechanismen die verder gaan dan de blokkade van cysteinyl-leukotriënereceptoren, waaronder de onderdrukking van oxidatieve reacties binnen het nierweefsel^18,33. Eerdere studies naar renale schade, waaronder CI-AKI-modellen, hebben op soortgelijke wijze melding gemaakt van verminderde lipideperoxidatie en verbeterde antioxidatieve afweer na behandeling met montelukast^9,19,27. Hoewel er in de combinatiegroep ook gunstige parameters voor oxidatieve stress werden waargenomen, presteerde de gecombineerde behandeling niet consistent beter dan een van de monotherapieën. Bijgevolg bevestigen deze bevindingen geen additief of synergetisch antioxidant effect van NAC en montelukast wanneer deze samen worden toegediend.

De bevindingen voor KIM-1 en cystatine C leverden complementair bewijs voor nierschade na blootstelling aan contrastmiddelen. KIM-1 is primair geassocieerd met tubulaire epitheliale schade, terwijl cystatine C wordt gebruikt als indicator voor veranderingen gerelateerd aan renale filtratie en letsel; beide zijn geëvalueerd als vroege biomarkers in experimentele CI-AKI-modellen^1,10. In de onbehandelde CI-AKI-groep gingen de hoogste spiegels van beide biomarkers gepaard met een uitgesproken verslechtering van de conventionele parameters van de nierfunctie. Dit patroon is consistent met eerdere experimentele studies waarin verhogingen van KIM-1 en cystatine C werden gerapporteerd na contrast-geïnduceerde nierschade^1,10.

Vergeleken met de onbehandelde CI-AKI-groep vertoonden de behandelgroepen lagere KIM-1- en cystatine C-waarden, een patroon dat consistent is met een vermindering van nierschade. Dit biomarkerprofiel liep parallel aan de numeriek lagere serumureum- en creatinineconcentraties die na behandeling werden waargenomen. Eerdere experimentele studies hebben de toediening van montelukast geassocieerd met een verminderde KIM-1-expressie, minder ernstige tubulaire schade en behoud van de nierfunctie bij CI-AKI en andere modellen van nierschade^9,18,19. NAC is op soortgelijke wijze geassocieerd met gunstigere biomarkerprofielen bij acute nierschade, mogelijk door de beperking van oxidatieve stress-gerelateerde celbeschadiging^14,15,16,17. Er werden echter geen statistisch significante verschillen in KIM-1 of cystatine C vastgesteld tussen de combinatiebehandelingsgroep en de montelukast-monotherapiegroep (p > 0,05). Bijgevolg tonen de huidige bevindingen geen aanvullend biomarkervoordeel aan van een gecombineerde behandeling.

Oxidatieve en inflammatoire responsen kunnen elkaar versterken tijdens CI-AKI. Een overschot aan ROS kan pro-inflammatoire signalering stimuleren, waarbij daaropvolgende stijgingen van TNF-α, IL-1β en IL-6 mogelijk de nierschade versterken^1,12,13,30.

De onbehandelde CI-AKI-groep vertoonde de hoogste concentraties TNF-α, IL-1β en IL-6, wat de aanwezigheid van een ontstekingsreactie na blootstelling aan contrastmiddelen ondersteunt. In experimentele CI-AKI-modellen zijn stijgingen van deze cytokinen geassocieerd met tubulaire beschadiging, infiltratie van ontstekingscellen en een verslechterde nierfunctie^10,12,13. Het profiel van ontstekingscytokinen dat in de huidige studie is waargenomen, is consistent met eerdere experimentele bevindingen gerapporteerd na toediening van contrastmiddelen¹.

De met NAC- en montelukast-behandelde groepen vertoonden lagere waarden van TNF-α, IL-1β en IL-6 dan de onbehandelde CI-AKI-groep, een patroon dat consistent is met een demping van de ontstekingsreactie. De voorgestelde ontstekingsremmende activiteit van NAC kan gedeeltelijk voortvloeien uit een verminderde oxidatieve belasting en de daaruit voortvloeiende beperking van de productie van pro-inflammatoire cytokinen^{1,14,15,16,17}. Montelukast kan de expressie van cytokinen beïnvloeden via blokkade van de cysteinyl-leukotriënereceptor en via modulatie van andere inflammatoire signaleringsprocessen^18,33. Experimentele studies naar nierschade hebben montelukast-behandeling ook geassocieerd met verminderde NF-κB-gerelateerde signalering en pro-inflammatoire activiteit^9,19,27. Bijgevolg is het in deze studie waargenomen cytokinenprofiel consistent met de modulatie van inflammatoire processen waarbij pathways zoals NF-κB en het NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasoom betrokken zijn. Aangezien NF-κB, NLRP3 en NOX4 echter niet direct zijn gemeten, bieden de bevindingen van de biomarkers slechts indirect ondersteunend bewijs en kunnen ze geen pathway-specifieke activatie of inhibitie vaststellen.

De waarden van inflammatoire cytokinen waren lager in de groep met combinatietherapie dan in de onbehandelde CI-AKI-groep, maar de combinatietherapie produceerde niet consistent lagere waarden dan montelukast alleen. Er werden geen statistisch significante verschillen vastgesteld tussen de groepen CI-AKI + Montelukast en CI-AKI + Montelukast + NAC voor TNF-α, IL-1β of IL-6 (p > 0.05). De huidige resultaten leveren dus geen bewijs dat de toevoeging van NAC aan montelukast een aanvullend anti-inflammatoir voordeel biedt.

Histopathologische evaluaties toonden verder aan dat de toediening van contrastmiddelen leidde tot aanzienlijke structurele nierschade. De bevindingen van tubulaire necrose, tubulaire dilatatie, cellulaire degeneratie en vasculaire congestie die werden waargenomen in de CI-AKI-groep, vertegenwoordigen kenmerkende histopathologische kenmerken van CI-AKI en zijn geassocieerd met een verminderde renale perfusie, oxidatieve stress en tubulaire celbeschadiging^1,12,18,19. Samen met de biochemische bevindingen bevestigen deze histopathologische veranderingen dat de toediening van contrastmiddelen leidde tot aanzienlijke schade aan het nierweefsel. De lagere graad van histopathologische schade die werd waargenomen in de met montelukast en NAC behandelde groepen, suggereert dat deze middelen beschermende effecten op het nierweefsel kunnen uitoefenen. Opvallend is dat de combinatietherapiegroep de numeriek laagste histopathologische scores voor weefselschade vertoonde van alle behandelgroepen. Verder toonde kwalitatieve evaluatie van met Masson's trichroom gekleurde coupes minder prominente interstitiële collageendepositie en een betere bewaring van de tubulo-interstitiële architectuur in de behandelgroepen vergeleken met de onbehandelde CI-AKI-groep. Gezien de korte observatieperiode en het kwalitatieve karakter van de beoordeling met Masson's trichroom, moeten deze bevindingen worden geïnterpreteerd als bewijs voor een betere structurele bewaring op het onderzochte tijdstip, en niet als bewijs voor een veranderde remodellering van de extracellulaire matrix op lange termijn.

De semi-kwantitatieve histopathologische beoordeling was in overeenstemming met de kwalitatieve observaties en liet lagere scores voor weefselschade zien in alle behandelingsgroepen in vergelijking met de onbehandelde CI-AKI-groep. Hoewel de combinatiegroep numeriek de laagste histopathologische scores voor weefselschade vertoonde, ging deze bevinding niet gepaard met een consistente superioriteit in de biochemische uitkomsten. Daarom mogen de gunstige histopathologische bevindingen waargenomen bij de gecombineerde behandeling, op basis van het huidige onderzoeksontwerp, niet worden geïnterpreteerd als bewijs voor een additief of synergetisch effect. In dezelfde lijn hebben eerdere studies in experimentele modellen van CI-AKI en andere vormen van acute nierinsufficiëntie gerapporteerd dat het onderdrukken van oxidatieve stress en inflammatie de histopathologische schade vermindert en bijdraagt aan het behoud van de tubulaire integriteit^9,18,19,27.

Er werd een schijnbare divergentie waargenomen tussen de biochemische en histopathologische bevindingen. Hoewel verschillende biochemische variabelen numeriek gunstiger waren in de montelukast-monotherapiegroep dan in de combinatiegroep, waren deze verschillen niet statistisch significant. In contrast hiermee vertoonde de combinatiegroep de numeriek laagste histopathologische letselscores. Deze gedeeltelijke dissociatie kan verschillen weerspiegelen in de biologische processen en temporele profielen die door de twee beoordelingsbenaderingen worden vastgelegd. Histopathologisch onderzoek evalueert direct lokale cellulaire en structurele schade binnen het nierweefsel en kan daarom weefselbehoud onthullen op het onderzochte tijdstip, zelfs wanneer serummarkers voor de nierfunctie en andere biochemische maten niet in dezelfde mate verbeteren. Biochemische uitkomsten bieden daarentegen indirecte functionele of moleculaire read-outs en kunnen worden beïnvloed door de functionele nierreserve, compensatiemechanismen, biologische variabiliteit tussen dieren en het tijdstip van monstername. Omdat alle eindpunten op één enkel terminaal tijdstip werden beoordeeld, zijn structureel behoud en biochemisch herstel mogelijk niet gesynchroniseerd. Bijgevolg moet het gunstigere histopathologische beeld in de combinatiegroep worden geïnterpreteerd als een verschil tussen beoordelingsmodaliteiten en niet als bewijs voor een superieure algehele werkzaamheid. Desalniettemin, hoewel histopathologische evaluaties onder geblindeerde omstandigheden werden uitgevoerd om waarnemersbias te minimaliseren, werden alle weefselcoupes door één patholoog beoordeeld, waardoor evaluatie van de inter-waarnemer variabiliteit niet mogelijk was. Toekomstige studies met meerdere onafhankelijke beoordelaars kunnen de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de histopathologische bevindingen verder verhogen.

De reproduceerbaarheid van de toepassing van dit model is afhankelijk van de consistente uitvoering van verschillende procedurele stappen. De duur van de waterdeprivatie, de vooraf vastgestelde intervallen tussen de toediening van L-NAME, indomethacine en iohexol, en de langzame intraveneuze toediening van iohexol moeten voor alle dieren worden gestandaardiseerd. Extravasatie bij de staartvene kan de effectieve contrastdosering verlagen en de variabiliteit in de ernst van het nierschade vergroten; daarom dient de injectieplaats tijdens de toediening zorgvuldig te worden gecontroleerd. Wanneer lekkage, extravasatie of aanzienlijke weerstand tijdens de injectie optreedt, moet de mogelijkheid van een onvolledige toediening van het contrastmiddel worden meegewogen bij de interpretatie van de bijbehorende resultaten. De consistentie van de dosis kan ook worden beïnvloed door regurgitatie tijdens orale gavage of onvoldoende resuspensie van de montelukast-preparaat. Het toepassen van dezelfde gestandaardiseerde procedures bij alle dieren en het toewijzen van de toedieningen aan dezelfde onderzoeker, indien mogelijk, kan vermijdbare procedurele variabiliteit verminderen.

Dit protocol maakt het mogelijk om CI-AKI vast te stellen binnen een relatief korte experimentele periode, terwijl biochemische en histopathologische resultaten kunnen worden onderzocht in hetzelfde diermodel^1,2,9.

Een sterk punt van de huidige studie is dat nierbeschadiging werd gekenmerkt aan de hand van complementaire functionele, biochemische, inflammatoire en histopathologische uitkomsten. De evaluatie van indices voor de nierfunctie samen met parameters voor oxidatieve stress, inflammatoire cytokines, KIM-1, cystatine C en de morfologie van het nierweefsel maakte het mogelijk om verschillende componenten van CI-AKI binnen hetzelfde experiment te onderzoeken. De inclusie van KIM-1 en cystatine C breidde de beoordeling bovendien uit voorbij de conventionele metingen van serumcreatinine. Door montelukast en NAC zowel afzonderlijk als gezamenlijk te testen, kon een directe vergelijking van de behandelstrategieën worden gemaakt; de bevindingen toonden echter geen consistente superioriteit van de combinatie ten opzichte van monotherapie voor de geëvalueerde uitkomsten. Bovendien, in tegenstelling tot inductiemethoden die uitsluitend gebaseerd zijn op blootstelling aan contrastmiddelen, incorporeert het huidige model renale vasoconstrictie en medullaire hypoxie, waardoor een uitgesproken setting van nierbeschadiging wordt gecreëerd waarin behandelingsgerelateerde biologische veranderingen kunnen worden geëvalueerd.

Het interval van 1 h tussen de blootstelling aan contrastmiddel en de start van de behandeling vertegenwoordigt slechts het tijdstip dat in dit experimentele protocol is onderzocht en mag niet worden geïnterpreteerd als een klinisch gevalideerd therapeutisch venster. Hoewel een behandeling kort na een bekende blootstelling aan contrastmiddel relevant kan zijn voor toekomstig translationeel onderzoek, kan de huidige dierstudie de haalbaarheid of effectiviteit hiervan in klinische settings niet vaststellen. In het bijzonder blijven de optimale starttijd, dosis, toedieningsroute, behandelduur en patiëntenpopulatie onbekend. Deze factoren moeten worden onderzocht in specifieke translationele en klinische studies voordat de toediening van NAC of montelukast na contrastgebruik kan worden overwogen voor klinisch gebruik.

Er moet rekening worden gehouden met enkele beperkingen van de huidige studie. De resultaten zijn verkregen uit een preklinisch diermodel en kunnen daarom niet rechtstreeks worden gegeneraliseerd naar de klinische praktijk. Omdat het protocol waterdeprivatie combineerde met inhibitie van de stikstofoxide- en prostaglandinepaden, kan de resulterende nierschade ernstiger zijn geweest dan de schade die doorgaans wordt waargenomen na blootstelling aan contrastmiddelen bij patiënten. De resultaten moeten bijgevolg worden geïnterpreteerd binnen de context van deze gesensitiseerde experimentele setting. Hoewel het model een gecontroleerde evaluatie van biologische responsen op kandidaat renoprotectieve behandelingen mogelijk maakt, reproduceert het niet de volledige heterogeniteit of het variërende ernstniveau van klinische CI-AKI. Behandelingsgerelateerde veranderingen waargenomen in deze studie kunnen daarom verschillen bij patiënten met mildere of meer gevarieerde risicoprofielen. Replicatie in minder intensieve modellen die nauwer aansluiten bij algemene klinische omstandigheden, gevolgd door adequaat ontworpen klinische studies, is vereist voordat de omvang of klinische relevantie van deze effecten kan worden vastgesteld. Een aanvullende beperking is dat alleen mannelijke ratten in de studie waren opgenomen. Daarom zijn potentiële sekse-gerelateerde verschillen in vatbaarheid voor CI-AKI en responsen op NAC en montelukast niet geëvalueerd, en mag er niet van worden uitgegaan dat de huidige bevindingen algemeen geldig zijn voor vrouwelijke dieren. Toekomstige studies waarin beide seksen zijn opgenomen, zijn nodig om vast te stellen of sekse invloed heeft op de ernst van de nierschade of de behandelingsrespons.

Een andere beperking is de afwezigheid van een procedurele sham-groep die was afgestemd op de experimentele groepen voor wat betreft protocolgerelateerde hantering, fixatie, waterdeprivatie, injecties, orale gavage en toediening van het vehikel. Omdat de controlegroep deze procedures niet onderging, kunnen ongelijke procedurele stress en aspecifieke effecten gerelateerd aan fixatie, herhaalde hantering, injecties, orale gavage en blootstelling aan het vehikel niet volledig worden uitgesloten als potentiële factoren die bijdragen aan enkele van de waargenomen verschillen tussen de controlegroep en de experimentele groepen. De opname van passend afgestemde procedurele sham- en vehikelcontrolegroepen in toekomstige studies zou helpen om deze aspecifieke proceduregerelateerde effecten te onderscheiden van effecten die specifiek toeschrijfbaar zijn aan de inductie van en behandeling van CI-AKI.

Hoewel de vooraf vastgestelde steekproefomvang was berekend om 80% power te bieden voor het detecteren van een verondersteld groot algemeen effect over de vijf experimentele groepen, was de studie niet specifiek ontworpen met voldoende power om kleinere paarsgewijze verschillen tussen de monotherapie- en combinatietherapiegroepen te detecteren. Daarom kan de studie een beperkte power hebben gehad om dergelijke verschillen tussen de behandelingen te detecteren, en niet-significante numerieke trends mogen niet worden geïnterpreteerd als bewijs van equivalentie. Studies met grotere steekproefomvangen zullen nodig zijn om vast te stellen of deze trends reproduceerbare verschillen in de behandeling vertegenwoordigen.

Omdat er slechts één dosis van elk middel is geëvalueerd, kan de huidige studie geen optimale NAC-montelukast-dosiskombinatie bepalen, dosisafhankelijke synergetische of antagonistische interacties karakteriseren, of de relatieve bijdrage van elk middel aan de effecten die bij de combinatietherapie zijn waargenomen kwantificeren. Bijgevolg kan één middel sterker hebben bijgedragen aan specifieke uitkomsten, maar dit kan niet worden vastgesteld op basis van het huidige studiedesign. Toekomstige studies met meerdere doseringsniveaus en formele analyses van geneesmiddelinteracties zullen vereist zijn om dosis-responskwesties te karakteriseren en een optimaal combinatieregime te identificeren.

De studie evalueerde biochemische indicatoren van oxidatieve stress en ontsteking, maar onderzocht niet direct de bijbehorende intracellulaire signaleringsroutes. Daarom kunnen de waargenomen biomarkerprofielen niet aantonen of NF-κB-, NLRP3- of NOX4-gerelateerde signalering werd geactiveerd of geremd door de behandeling. Toekomstig onderzoek met moleculaire benaderingen, waaronder Western blotting en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), is vereist om vast te stellen hoe deze routes bijdragen aan de renale effecten van montelukast en NAC.

Omdat de beoordelingen beperkt waren tot de acute fase, biedt de huidige studie geen informatie over het daaropvolgende renale herstel of weefselremodellering op langere termijn. De relatief beperkte collageenafzetting die in de behandelgroepen werd waargenomen op het onderzochte eindpunt, moet daarom worden beschouwd als een vroege structurele bevinding en niet als bewijs dat chronische renale fibrose is voorkomen. Deze bevinding kan in plaats daarvan een demping van de initiële renale insult weerspiegelen. Longitudinale studies met latere beoordelingsmomenten zijn nodig om vast te stellen of deze vroege veranderingen aanhouden en of ze de renale functie op lange termijn of de weefselremodellering beïnvloeden.

Over het algemeen was de toediening van montelukast en NAC na het contrastmiddel, zowel afzonderlijk als in combinatie, geassocieerd met een vermindering van renale dysfunctie, oxidatieve stress, inflammatoire responsen en histopathologisch letsel in dit experimentele CI-AKI-model. De combinatietherapie vertoonde echter geen consistente superioriteit ten opzichte van monotherapie over de geëvalueerde uitkomsten. Deze bevindingen zijn beperkt tot het huidige preklinische model en ondersteunen verdere experimentele onderzoeken in plaats van een directe extrapolatie naar de klinische praktijk.

Concluderend was een behandeling na contrasttoediening met montelukast, NAC, of een combinatie hiervan geassocieerd met gunstigere biochemische en histopathologische bevindingen in dit experimentele CI-AKI-model. Het combinatieregime presteerde echter niet consistent beter dan monotherapie bij de beoordeelde uitkomsten. Omdat deze waarnemingen zijn verkregen in een preklinische dierstudie, moeten ze worden beschouwd als een basis voor verdere experimentele validatie en niet als bewijs van klinische effectiviteit of toepasbaarheid. Aanvullend onderzoek is nodig om de potentiële relevantie van deze behandelingsbenaderingen na contrasttoediening voor klinische CI-AKI te bepalen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Auto Strip Washer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Geautomatiseerd wassen van ELISA-platen.
Microplate Reader	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	ELISA-absorptiemetingen. RRID:SCR_028651
10% neutraal gebufferde formaline	Merck	Niet geregistreerd	Weefselfixatie voor histopathologie.
Benchtopcentrifuge	Nüve	NF048	Monstervoorbereiding en centrifugatie.
Carboxymethylcellulose (CMC)	Sigma-Aldrich, USA	C5678	Drager gebruikt voor montelukastsuspensie.
CAT Kit Universal	Otto Scientific	Otto3051	Colorimetrische meting van CAT-activiteit in serum met een Mindray BS-400 chemie-analyzer.
Digitale homogenisator	Daihan Scientific	HG-15D	Weefselhomogenisatie.
Eosine Y (geelachtig)	Merck	1.15935.0025	HE-kleuring.
Harris hematoxyline-oplossing	BSLAB	BS-002	HE-kleuring.
Indomethacine	Sigma-Aldrich, USA	I7378	Gebruikt voor inductie van CI-AKI.
Iohexol (Omnipaque 300)	GE HealthCare	Niet geregistreerd	Contrastmiddel gebruikt om CI-AKI te induceren.
Ketaminehydrochloride (Ketalar)	Pfizer, USA	Niet geregistreerd	Algemene anesthesie vóór monsterafname.
Lichtmicroscoop (Nikon Eclipse)	Nikon	Ni-U	Histopathologisch onderzoek en beeldvorming. RRID:SCR_024835
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methylester)	Sigma-Aldrich, USA	N5751	Gebruikt voor inductie van CI-AKI.
Masson's trichroomkleuringskit	MOSLAB, Türkiye	BKMTO001	Masson trichroomkleuring.
Mindray chemie-analyzer	Mindray	BS-400	Biochemische analyses.
Montelukastnatrium	Sigma-Aldrich, USA	SML0101	Oraal toegediend via gavage als behandeling.
N-acetylcysteïne (ASIST 300 mg/2 mL)	MAC laç, Türkiye	Niet geregistreerd	Intraperitoneaal toegediend als behandeling.
Rat Cystatine C ELISA Kit	BT Lab, China	E0145Ra	ELISA-meting van cystatine C in supernatanten van nierweefsel.
Rat IL-1β ELISA Kit	BT Lab, China	E0119Ra	ELISA-meting van IL-1β in supernatanten van nierweefsel.
Rat IL-6 ELISA Kit	BT Lab, China	E0135Ra	ELISA-meting van IL-6 in supernatanten van nierweefsel.
Rat KIM-1 ELISA Kit	BT Lab, China	E0549Ra	ELISA-meting van KIM-1 in supernatanten van nierweefsel.
Rat TNF-α ELISA Kit	BT Lab, China	E0764Ra	ELISA-meting van TNF-α in supernatanten van nierweefsel.
RVS voedingsnaald (22 G orale gavagecanule)	Instech Laboratories, USA	Niet geregistreerd	Toediening via orale gavage.
Standaard gepelletiseerd knaagdiervoer (Optima)	Optima, Türkiye	Niet geregistreerd	Lot nr. 58931. Voedingssamenstelling: 24% ruw eiwit, 3,94% ruwe cellulose, 5,08% ruw vet, 8,8% ruwe as, 1,44% lysine, 0,61% methionine, 1,14% calcium, 0,89% fosfor en 0,28% natrium.
Universal Creatinine Kit	Otto Scientific	OttoBC139	Colorimetrische meting van creatinine in serum.
Universal GSH Kit	Otto Scientific	Otto3053	Colorimetrische meting van GSH in EDTA-anticoagulatiebloed met behulp van een gemodificeerde Ellman-methode.
Universal MDA Kit	Otto Scientific	Otto1001	Colorimetrische meting van MDA in serum met een ELx800 microplate reader.
Universal SOD Kit	Otto Scientific	Otto3047	Colorimetrische meting van SOD-activiteit in serum met een Mindray BS-400 chemie-analyzer.
Universal Urea Kit	Otto Scientific	OttoBC157	Colorimetrische meting van ureum en BUN in serum.
Xylazinehydrochloride (Rompun)	Bayer, Germany	Niet geregistreerd	Algemene anesthesie vóór monsterafname.