Onderzoeksartikel

Yangjing-capsules verlichten spermatogene dysfunctie bij muizen door remming van het QKI-5/p38 MAPK-pad via upregulatie van lncRNA NONMMUT031883.2

11 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/73166

⸱

28 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie evalueert de beschermende effecten van Yangjing Capsule op cyclofosfamide-geïnduceerde spermatogene dysfunctie bij muizen en onderzoekt de betrokkenheid van de lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-signaalroute.

Samenvatting

Spermatogene dysfunctie is een belangrijke oorzaak van mannelijke onvruchtbaarheid, en cyclofosfamide (CP) kan de spermatogenese belemmeren door abnormale apoptose van spermatogonia te induceren. Yangjing Capsule (YC) is gebruikt om de reproductieve functie te verbeteren, maar het onderliggende moleculaire mechanisme blijft onduidelijk. Deze studie onderzocht de beschermende effecten van YC in een door CP geïnduceerd muismodel van spermatogene dysfunctie en in GC-1 spermatogoniale cellen. Het aantal zaadcellen en de motiliteit, de mannelijke fertiliteit, de serumspiegels van geslachtshormonen en histopathologische veranderingen in de testikels en epididymides werden geëvalueerd. Cellevensvatbaarheid, lactaatdehydrogenase-afgifte, apoptose en apoptose-gerelateerde eiwitten werden beoordeeld in GC-1 cellen. Kwantitatieve reverse transcriptie-polymeraseketsreactie, RNA pull-down assays, immunofluorescentie en Western blotting werden gebruikt om lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) en p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signalering te onderzoeken. YC verbeterde dosisafhankelijk de spermakwaliteit, de serumspiegels van geslachtshormonen, de morfologie van de voortplantingsorganen, de testiculaire histopathologie en de fertiliteit bij CP-behandelde muizen. In GC-1 cellen verhoogde YC de cellevensvatbaarheid en verminderde het de cellulaire schade en apoptose. LncRNA NONMMUT031883.2 vertoonde een fysieke interactie met QKI-5, en behandeling met YC verhoogde de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2, terwijl de expressie van QKI-5 en de p38-fosforylering afnamen. Behandeling met YC remde de apoptose die werd geïnduceerd door lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown in GC-1 cellen, terwijl QKI-5 overexpressie de anti-apoptotische effecten van YC verminderde. Deze bevindingen suggereren dat YC de door CP geïnduceerde spermatogene dysfunctie verlicht en dat de beschermende effecten worden gemedieerd door regulatie van het lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-pad.

Inleiding

Spermatogene dysfunctie verwijst naar een reproductieve beperking veroorzaakt door abnormaliteiten in de productie, rijping of functie van spermatozoën in het mannelijke voortplantingsstelsel. Het wordt gekenmerkt door een verminderd aantal en een verminderde beweeglijkheid van spermatozoën en een verhoogde frequentie van spermatozoïenafwijkingen1,2. De pathogenese van spermatogene dysfunctie is complex en wordt geassocieerd met genetische factoren, auto-immuunziekten, omgevingsgifstoffen, door chemotherapie veroorzaakte schade en letsels aan de voortplantingsorganen3-5. Chemotherapeutische middelen zoals cyclofosfamide (CP) kunnen de zaadbuisjes in de testikels direct beschadigen en apoptose van spermatogonia induceren, wat bijdraagt aan mannelijke spermatogene dysfunctie6,7. Hormoonsubstitutietherapie, antioxidatieve supplementen en assistieve reproductietechnologieën worden momenteel als klinische interventies gebruikt. Deze benaderingen vertonen echter een inconsistente effectiviteit en aanzienlijke bijwerkingen8,9,10. Daarom is het identificeren van veilige en effectieve interventies en het verduidelijken van hun moleculaire doelwitten klinisch belangrijk voor het verbeteren van de fertiliteitsresultaten bij patiënten met spermatogene dysfunctie.

Chinese kruidengeneeskunde heeft potentieel getoond bij het beschermen van de mannelijke reproductieve functie en het behandelen van spermatogene dysfunctie vanwege de multitarget-eigenschappen en de relatief lage toxiciteit11,12. Yangjing Capsule (YC) is een traditioneel Chinees gepatenteerd geneesmiddel bestaande uit Rehmannia glutinosa, Epimedium, placenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis en andere Chinese kruidengeneesmiddelen. Het wordt gebruikt om de nieren en de essentie te tonificeren, het bloed en het merg te voeden en de reproductieve functie te reguleren13. Voorgaande studies hebben aangetoond dat YC de sexhormoonspiegels bij mannelijke dieren kan reguleren, de spermakwaliteit kan verbeteren, schade aan het testisweefsel kan herstellen en kan beschermen tegen reproductief letsel geïnduceerd door chemische agentia14,15. Spermatogoniale cellen vormen de basis van de spermatogenese, en abnormale spermatogoniale apoptose is een centrale gebeurtenis bij de ontwikkeling van spermatogene dysfunctie16. Er is ook gerapporteerd dat YC de levensvatbaarheid van spermatogonia verbetert, het aandeel cellen in de S-fase verhoogt en apoptose remt17. Echter, de beschermende effecten en specifieke moleculaire mechanismen bij CP-geïnduceerde spermatogene dysfunctie blijven onduidelijk.

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn RNA-moleculen langer dan 200 nucleotiden die geen eiwitcoderend vermogen hebben18. LncRNA's kunnen genexpressie reguleren via mechanismen zoals chromosomale silencing, chromatine-modificatie, genomische imprinting en transcriptionele activatie19,20. Het RNA-bindende eiwit Quaking-5 (QKI-5) neemt deel aan fysiologische en pathologische processen, waaronder celproliferatie en apoptose, door de alternatieve splicing van downstream-genen te reguleren21. De p38 mitogeen-geactiveerde proteïnkinase (MAPK)-route is betrokken bij de regulatie van apoptose en speelt ook een belangrijke rol bij de mannelijke fertiliteit en testiculaire ontwikkeling22,23. Een eerdere studie toonde aan dat overexpressie van QKI-5 de p38 MAPK-route activeert in hepatocellulaire carcinoomcellen24. Daarnaast werd aangetoond dat lncRNA NONMMUT074098.2 bindt aan QKI-5 in spermatogonia, terwijl knockdown van QKI-5 de p38 MAPK-route remde en de apoptose van spermatogonia verminderde25. Deze studie maakte gebruik van een door CP-geïnduceerd muismodel van spermatogene dysfunctie om te onderzoeken of YC de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 en de QKI-5/p38 MAPK-signaleringsas reguleert, waardoor abnormale apoptose van spermatogonia wordt verminderd en CP-geïnduceerde spermatogene dysfunctie wordt verlicht (Figuur 1). Het doel was om het moleculaire mechanisme achter de beschermende effecten van YC op de spermatogenese te verduidelijken en het begrip van de farmacologische rol ervan bij het beschermen van de mannelijke reproductieve functie te verbreden.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematisch diagram van het experimentele ontwerp. Het bovenste paneel vat de in vitro experimenten in GC-1 spermatogoniale cellen samen. Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 werd gebruikt om apoptose en cellulaire schade te induceren, gevolgd door QKI-5 knockdown om de effecten op apoptose en celbeschadiging te evalueren. Het onderste paneel vat de in vivo experimenten samen in muismodellen van spermatogene dysfunctie geïnduceerd door cyclofosfamide (CP). Muizen kregen een behandeling met Yangjing-capsules en/of een interventie met lncRNA NONMMUT031883.2 of QKI-5. Vervolgens werden de fertiliteit, serumhormoonspiegels, testiculaire en epididymale weefsels, spermasuspensie, spermareserves, spermakwaliteit en testiculaire histopathologische schade geëvalueerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Alle experimentele protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierenproeven van de Southeast University (goedkeuringsnummer 20230216022).

1. Bereiding van serum met YC
Twee Yangjing-capsules (YC; 0,5 g/capsule) werden geopend en er werd 0,8 g van de capsule-inhoud afgewogen. Er werd normale zoutoplossing toegevoegd tot een eindvolume van 10 mL, waarna het mengsel grondig werd gevortexd om een suspensie van 80 mg/mL te bereiden. Specifieke pathogeenvrije mannelijke BALB/c-muizen met een gewicht van 22–25 g en een leeftijd van 8 weken werden gehouden bij 22 °C en een luchtvochtigheid van 55%–60% onder een licht/donkercyclus van 12 u, met ad libitum beschikbaar gesteld voer en water. Na 1 week acclimatisatie kregen de muizen YC via orale gavage in een dosis van 800 mg/kg lichaamsgewicht in een volume van 10 mL/kg, éénmaal daags gedurende 5 opeenvolgende dagen. Twee uur na de laatste toediening werden de muizen geanestheseerd met intraperitonele 1% natriumpentobarbital en werden bloedmonsters verzameld om serum met YC te bereiden. Het serum werd geïnactiveerd bij 56 °C gedurende 30 min, gefiltreerd door een 0,22 µm membraan en bewaard bij −80 °C tot gebruik.

2. Celkweek en transfectie
Muis GC-1 spermatogoniale cellen werden gekweekt in DMEM bevattend 1% penicilline-streptomycine en 10% foetaal runderserum. Alle culturen werden bewaard bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO₂ (v/v).

LncRNA-specifiek short hairpin RNA (sh-lncRNA), een QKI-5 overexpressieplasmid (OE-QKI-5), QKI-5 small interfering RNA (si-QKI-5) en hun bijbehorende negatieve controles (sh-NC, OE-NC en si-NC) werden gesynthetiseerd en geconstrueerd. GC-1 cellen werden getransfecteerd met sh-lncRNA of sh-NC, si-QKI-5 of si-NC, of OE-QKI-5 of OE-NC volgens de instructies van het transfectiereagens. Na incubatie gedurende 48 h werd de transfectie-efficiëntie beoordeeld door de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 of QKI-5 te meten.

Voor de sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide-groep werden GC-1-cellen getransfecteerd met sh-lncRNA en si-QKI-5 en vervolgens gedurende 12 h behandeld met 100 µM etoposide26. Voor de daaropvolgende celviabiliteitsassays werden GC-1-cellen gekweekt in medium aangevuld met 5%, 10% of 20% YC-bevattend serum en respectievelijk aangeduid als de laag-dosering YC (L-YC), medium-dosering YC (M-YC) en hoog-dosering YC (H-YC) groepen. De concentraties van het YC-bevattende serum (5%, 10% en 20% YC) werden bepaald op basis van de resultaten van preliminaire concentratie-gradiëntexperimenten. Voor de sh-lncRNA + H-YC + OE-NC en sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5 groepen werden GC-1-cellen gedurende 48 h getransfecteerd met sh-lncRNA plus OE-NC of sh-lncRNA plus OE-QKI-5 en vervolgens gedurende 24 h blootgesteld aan 20% YC-bevattend serum.

3. Cell Counting Kit-8 assay
GC-1 cellen werden gezaaid in 96-well platen met 5 × 103 cellen/well en gedurende 24 h gekweekt. Na celadhesie werd het oorspronkelijke medium vervangen door 100 µL compleet medium aangevuld met serum bevattend YC, en werden de cellen gedurende 6, 12 of 24 h geïncubeerd. Na incubatie werd 10 µL Cell Counting Kit-8 reagens aan elke well toegevoegd en werden de cellen 2 h in het donker geïncubeerd bij 37 °C. De absorbantie bij 450 nm werd gemeten met een microplaatlezer.

4. Lactate dehydrogenase-assay
Na transfectie met sh-NC of sh-lncRNA gedurende 48 h werd het kweekmedium van de GC-1-cellen verzameld en werd het supernatant verkregen door centrifugatie. Volgens de instructies van de lactate dehydrogenase-assaykit werd het supernatant voorzichtig gemengd met de detectiewerkoplossing en overgebracht naar een 96-wells plaat. De plaat werd 30 min geïncubeerd bij 25 °C in het donker. De absorbentie bij 490 nm werd gemeten met een microplaatlezer, en de afgifte van lactate dehydrogenase werd berekend om de celbeschadiging te beoordelen.

5. Calceïne AM/propidiumjodide-kleuring
Na transfectie met sh-NC of sh-lncRNA gedurende 48 u werd de overleving van GC-1-cellen beoordeeld met behulp van Calceïne AM/propidiumjodide (PI)-kleuring. Cellen werden gezaaid in 12-wells platen met 5 × 104 cellen/well en gekweekt totdat ze een confluentie van 60%–70% bereikten. De cellen werden voorzichtig gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing, waarna 500 µL Calceïne AM/PI-kleuringsoplossing aan elke well werd toegevoegd. De cellen werden 30 min in het donker geïncubeerd bij 37 °C en geobserveerd onder een fluorescentiemicroscoop. Levende en dode cellen werden geteld met behulp van beeldanalyse-software, waarna het aandeel overlevende cellen werd berekend.

6. Flowcytometrie
GC-1 cellen werden verzameld door centrifugatie en voorzichtig gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing. De celpellet werd geresuspendeerd in 500 µL bindingsbuffer bij een dichtheid van 5 × 105 cellen/mL. Vervolgens werden Annexin V-APC en PI toegevoegd (elk 5 µL), waarna de suspensie grondig werd gemengd en 10 min bij 25 °C in het donker werd geïncubeerd. Apoptose werd geanalyseerd via flowcytometrie met excitatie-/emissiegolflengten van 633/660 nm voor APC en 488/630 nm voor PI. De apoptosegraad werd geëvalueerd met behulp van analyse-software voor flowcytometrie.

7. Caspase-3-activiteitsassay
Na de aangegeven behandelingen werden ongeveer 1 × 106 GC-1-cellen verzameld, gespoeld en geresuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing. De cellen werden gemengd met 100 µL reagens II uit de caspase-3-activiteitsassaykit en gedurende 15 min op ijs gelyseerd. Na centrifugatie werden 50 µL van het lysaatsupernatant verzameld en gemengd met 40 µL reagens I en 10 µL reagens III. Het mengsel werd 2 u geïncubeerd bij 37 °C. De absorbentie bij 405 nm werd gemeten met een microplatelezer en de caspase-3-activiteit werd geëvalueerd volgens de instructies van de kit.

8. RNA pull-down assay
De sense- en antisense-strengen van lncRNA NONMMUT031883.2 werden gesynthetiseerd volgens de overeenkomstige sequentie en gelabeld met biotine. Cellen werden gedurende 30 min op ijs gelyseerd in immunoprecipitatie-cellysebuffer, waarna het eiwitbevattende supernatant door centrifugatie werd verzameld. Streptavidine-magnetische beads werden drie keer gewassen met RNA-bindingsbuffer en 30 min geïncubeerd in bindingsbuffer met 1% runderseerumeiwit.

De voorbehandelde beads werden gecombineerd met de biotine-gelabelde probes en 30 min geïncubeerd bij 25 °C. Ongebonden probes werden verwijderd via magnetische scheiding. Vervolgens werd het supernatant van het cellysaat toegevoegd, waarna het mengsel 4 u bij 4 °C werd geïncubeerd om magnetische bead-RNA-proteïnecomplexen te vormen. De magnetische beads werden drie keer gewassen met wasbuffer om aspecifiek gebonden proteïnen te verwijderen. De wasbuffer werd verwijderd via magnetische scheiding en er werd 2× SDS monsterlaadbuffer toegevoegd. De monsters werden 10 min verhit bij 95 °C, waarna het supernatant via magnetische scheiding werd verzameld voor een daaropvolgende Western blot-analyse.

9. Constructie van een muismodel voor spermatogene dysfunctie
Na 5 dagen acclimatisatie kregen specifieke pathogeenvrije mannelijke BALB/c muizen met een gewicht van 22–25 g en een leeftijd van 8 weken dagelijks één keer gedurende 7 dagen cyclofosfamide (CP) intraperitoneaal toegediend in een dosis van 50 mg/kg om een model voor spermatogene dysfunctie te vestigen14,27. De succesvol gemodelleerde muizen werden met behulp van een willekeurige getallentabel willekeurig toegewezen aan de groepen CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC en 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, met zes muizen per groep.

Muizen in de met YC behandelde groepen kregen dagelijks één keer gedurende 30 dagen de corresponderende dosis YC via orale gavage13. Voor de groepen 800 mg/kg YC + sh-NC en 800 mg/kg YC + sh-lncRNA werden de muizen, na een succesvolle modelvestiging, geanestheseerd door inhalatie van 2% isofluraan. Nadat was bevestigd dat elke muis geen terugtrekreflex van de poot vertoonde en dat de ademhalingsfrequentie stabiel was, werd de chirurgische plaats geschoren en gedesinfecteerd met povidon-jodium. Onder aseptische omstandigheden werd een ventrale mediane incisie gemaakt door de huid en de lichaamswand anterior van de genitaliën. De testis werd blootgelegd door voorzichtig het epididymale vetkussen te manipuleren, waarbij zorgvuldig werd gewaakt voor vaatschade. Met behulp van een micromanipulator werden de zaadbuisjes gevisualiseerd en werd 1 µL van de adenovirale suspensie (1 × 1010 TU/mL) langzaam geïnjecteerd met een micro-injectienaald28. De naald bleef na de injectie 5 min op zijn plaats voordat deze langzaam werd teruggetrokken, en hemostase werd bereikt met een steriel wattenstaafje. Dezelfde procedure werd vervolgens uitgevoerd op de contralaterale testis. De incisie werd vervolgens gehecht en de muizen kregen de gelegenheid om postoperatief te herstellen op een verwarmingsmat. Controlemuizen kregen dagelijks een gelijk volume zoutoplossing via gavage en injectie.

10. Beoordeling van de fertiliteit
Na voltooiing van de drugstoediening werden de mannelijke muizen in elke groep gedurende 7 dagen vrij gekoppeld aan vrouwelijke BALB/c-muizen in een verhouding van 1:2. De vorming van vaginale plugs bij de vrouwelijke muizen werd dagelijks gemonitord en geregistreerd. Nadat een succesvolle paring was bevestigd, werden de mannelijke muizen verwijderd en werden de vrouwelijke muizen individueel gehuisvest tot de natuurlijke bevalling. Per groep werden negen drachtige vrouwelijke muizen verkregen en meegenomen in de analyse. De gemiddelde nestgrootte werd geregistreerd om de mannelijke fertiliteit in elke groep te evalueren.

Aan het einde van de experimentele periode werden de muizen geëuthanaseerd door intraperitoneuze toediening van pentobarbitalnatrium bij 100 mg/kg. Deze euthanasiemethode werd goedgekeurd door de Commissie voor Dierenethiek van de Southeast University (goedkeuringsnummer 20230216022). De testikels en epididymides werden zorgvuldig gescheiden, gefotografeerd en gewogen. De indices voor de testikels en epididymides werden berekend als orgaangewicht/lichaamsgewicht. Van elke muis werd één epididymis verzameld, in stukken gesneden, geplaatst in 1 mL voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (37 °C) en 20 min geïncubeerd om de spermaproductie vrij te laten komen29. De spermasuspensie werd voorzichtig gemengd en 10 µL van de spermasuspensie werd geplaatst op een voorverwarmde telkamer voor bloedcellen. De spermatozoïden werden handmatig geteld onder een lichtmicroscoop bij een vergroting van 200×, en de resultaten werden uitgedrukt als 106/L. Verder werd het percentage progressief beweeglijke spermatozoïden ten opzichte van het totaal aantal spermatozoïden berekend als spermamotiliteit13.

11. Bepaling van de geslachtsestroomspiegels
Bloed werd afgenomen uit de vena orbitalis van muizen in elke groep en gedurende 30 min bij 25 °C gelaten. Serum werd verzameld door centrifugatie bij 3,000 × g gedurende 10 min30. De serumspiegels van testosteron, luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) werden gemeten met behulp van de overeenkomstige enzyme-linked immunosorbent assay-kits.

12. RNA-stabiliteitsassay
GC-1-cellen werden uitgezaaid in 96-wells kweekplaten, getransfecteerd met si-QKI-5 of si-NC en gedurende 48 h gekweekt. Vervolgens werd Actinomycine D toegevoegd in een concentratie van 5 µg/mL en werden de cellen verzameld op 0, 3, 6 en 9 h. Totaal RNA werd geïsoleerd en het relatieve expressieniveau van lncRNA NONMMUT031883.2 werd bepaald via kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction na reverse transcriptie. Het relatieve RNA-niveau op elk tijdstip werd berekend waarbij het expressieniveau op 0 h als 100% werd gehanteerd.

13. Kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie
GC-1-cellen en testikularweefsels van muizen werden gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing en gelyseerd voor de isolatie van totaal RNA. Complementair DNA werd gegenereerd door reverse transcriptie met behulp van AMV reverse transcriptase. Polymerasekettingreactie-amplificatie werd uitgevoerd met een real-time PCR-systeem en een kwantitatieve PCR-kit, waarbij complementair DNA als amplificatietemplate werd gebruikt. U6 werd gebruikt als interne referentie voor lncRNA NONMMUT031883.2, en GAPDH werd gebruikt als de interne referentie voor QKI-5. De relatieve expressie van het doelgen werd berekend met de 2−ΔΔCt-methode25. RNA werd tevens afzonderlijk geïsoleerd uit de cytoplasmatische en nucleaire fracties om de subcellulaire lokalisatie van lncRNA NONMMUT031883.2 te bepalen. De primersequenties zijn opgenomen in Tabel 1.

GenForward primer (5' naar 3')Reverse primer (5' naar 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabel 1: Primersequenties gebruikt voor kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie. Forward- en reverse-primersequenties zijn vermeld in de 5′–3′ richting voor lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 en GAPDH.

14. Hematoxiline- en eosinekleuring
Testiculaire en epididymale weefsels van muizen werden ondergedompeld in 4% paraformaldehyde en gefixeerd bij 4 °C gedurende 24 h. Na spoelen met fosfaatgebufferde zoutoplossing werden de weefsels gedehydrateerd via een ethanolreeks met toenemende concentraties, ingebed in paraffine en gesneden in secties van 5 µm. De secties werden 60 min verhit bij 60 °C en 30 min ontwaxed in xyleen.

Na hydratatie via een gradiënt van ethanolseries werden de coupes 5 min gekleurd met hematoxyline, 10 s behandeld met een zoutzuur-ethanol differentiatie-oplossing, gewassen met kraanwater voor het blauwen en 2 min gekleurd met 1% eosine. De coupes werden vervolgens gedehydrateerd in 95% ethanol en absolute ethanol en 30 min geklaard in xyleen. Na luchtdrogen werden de coupes gemonteerd met neutrale gom. Morfologische veranderingen in de testes en epididymides werden onder een microscoop waargenomen.

15. Immunofluorescentie
Paraaffine coupes van muistestikels werden ontwasst en gehydrateerd via een reeks ethanolconcentraties, gevolgd door microwave-gemedieerde antigeen-retrieval in citraatbuffer bij pH 6.0. Na natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur werden de coupes 10 min geïncubeerd met 0.3% Triton X-100. De coupes werden geblokkeerd met 5% runderserumalbumine bij 25 °C gedurende 60 min, gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing en overnacht bij 4 °C geïncubeerd met een primair antilichaam tegen Ki67. De volgende dag werd een fluorochroom-gelabeld secundair immunoglobuline G-antilichaam aangebracht, waarna de coupes 60 min bij 37 °C in het donker werden geïncubeerd. Na spoelen met fosfaatgebufferde zoutoplossing werden de coupes 10 min tegengekleurd met DAPI en geobserveerd onder een fluorescentiemicroscoop. De fluorescentie-intensiteit werd geanalyseerd met behulp van beeldanalyse-software.

Voor immunofluorescentiekleuring van GC-1-cellen werden de cellen gezaaid in 12-wells platen met 1 × 105 cellen/well en 24 h geïncubeerd. De cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 30 min, gepermeabiliseerd met 0,3% Triton X-100 gedurende 10 min, geblokkeerd met 5% runder serumalbumine en overnacht bij 4 °C geïncubeerd met een primair antilichaam tegen QKI-5. De resterende procedure werd uitgevoerd zoals beschreven voor de coupes van testikulaire weefsels.

16. TUNEL-kleuring
Paraffinecoupes van muizenteisjes werden ontwast, gehydrateerd via een gradiënt van ethanol en 5 min geïncubeerd met 0,1% Triton X-100 om de permeabiliteit van het celmembraan te verhogen. Een werkoplossing van Proteinase K van 20 µg/mL zonder DNase werd gelijkmatig op de coupes aangebracht, waarna deze 15 min werden geïncubeerd bij 37 °C. Er werd TUNEL-detectieoplossing toegevoegd en de coupes werden 90 min in het donker geïncubeerd bij 37 °C. Na incubatie met DAPI gedurende 10 min werd een antifade montage-medium aangebracht en werd het testisweefsel geobserveerd onder een fluorescentiemicroscoop.

GC-1-cellen werden uitgezaaid in 12-wells platen en gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 30 min. Na permeabilisatie met 0,1% Triton X-100 gedurende 5 min werd de TUNEL-detectieoplossing op de cellen aangebracht, gevolgd door incubatie in het donker gedurende 60 min. De cellen werden vervolgens 10 min gekleurd met DAPI en geobserveerd onder een fluorescentiemicroscoop.

17. Western blotting
Testisweefsel van muizen en GC-1-cellen werden gedurende 30 min op ijs gelyseerd in immunoprecipitatie-cellysebuffer en gedisrumpeerd door middel van ultrasonificatie. Na centrifugatie werd het eiwitbevattende supernatant verzameld en werd de eiwitconcentratie bepaald met een bicinchoninezuur-assaykit. Het eiwitsupernatant werd gemengd met SDS-laadbuffer en 10 min verhit in kokend water. Na scheiding via gelelektroforese werden de eiwitten overgebracht op polyvinylideenfluoride-membranen en 2 u geblokkeerd met 5% runder serumalbumine31.

De membranen werden overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen cleaved caspase-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspase-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), gefosforyleerd p38 (1:1000) of p38 (1:500). De volgende dag werden de membranen gespoeld met Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 en 2 uur lang bij 25 °C geïncubeerd met geiten-anti-konijn immunoglobuline G in een verdunning van 1:10000. De werkingsoplossing voor verbeterde chemiluminescentie werd op het membraanoppervlak aangebracht en de proteinebanden werden vastgelegd met een gel-beeldvormingssysteem. De bandintensiteit werd geanalyseerd met beeldanalyse-software en de relatieve proteïne-expressie werd genormaliseerd ten opzichte van GAPDH (1:3000).

Cycloheximide in een concentratie van 50 µg/mL werd gebruikt om de eiwitsynthese te remmen. Om de halfwaardetijd van QKI-5 te bepalen, werden cellen verzameld op 0, 3, 6 en 9 u, waarna de QKI-5 eiwitniveaus werden bepaald via Western blotting25.

18. Statistische analyse
Alle gegevens werden statistisch geanalyseerd en uitgezet met behulp van software voor statistiek, grafieken en beeldanalyse. De Shapiro-Wilk-test werd gebruikt om de normaliteit van de gegevens te beoordelen. Experimentele gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Eenweg-variantieanalyse werd gebruikt om verschillen tussen groepen te evalueren. De LSD-t-test werd gebruikt voor post-hoc paarsgewijze vergelijkingen wanneer de varianties homogeen waren, terwijl de T3-test van Dunnett werd gebruikt wanneer de varianties heterogeen waren. Een waarde van p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 induceert apoptose van spermatogonia
GC-1-cellen werden getransfecteerd met sh-lncRNA om de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 te reduceren. In vergelijking met sh-NC-getransfecteerde cellen was het transcriptieniveau van lncRNA NONMMUT031883.2 na sh-lncRNA-transfectie aanzienlijk verlaagd, wat een succesvolle knockdown bevestigt (Figuur 2A). Na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 was de levensvatbaarheid van GC-1-cellen significant afgenomen (Figuur 2B), terwijl de LDH-afgifte significant was toegenomen, wat wijst op grotere cellulaire beschadiging (Figuur 2C). Calcein-AM/PI-kleuring toonde een verhoogd aantal PI-positieve GC-1-cellen en een verlaagd aandeel overlevende cellen aan in de sh-lncRNA-groep (Figuur 2D, E). De apoptosegraad van GC-1-cellen was aanzienlijk verhoogd na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 (Figuur 2F, G). De TUNEL-positieve fractie was eveneens significant verhoogd in de sh-lncRNA-groep, wat verder wijst op toegenomen apoptose (Figuur 2H, I). Daarnaast verhoogde knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 de caspase-3-activiteit in GC-1-cellen significant (Figuur 2J). In de sh-lncRNA-groep was de Bax-expressie aanzienlijk verhoogd, de Bcl-2-expressie verlaagd en de ratio cleaved caspase-3/caspase-3 significant verhoogd (Figuur 2K, L). Deze resultaten geven aan dat knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 apoptose induceert in GC-1-cellen. Alle gekwantificeerde gegevens zijn verkregen met n = 6.

figure-results-1
Figuur 2: Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 induceert apoptose van spermatogonia. (A) Kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyse van de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1 cellen. (B) Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay van de levensvatbaarheid van GC-1 cellen na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2. (C) Lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte van GC-1 cellen na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) Calcein-AM/propidiumjodide (PI) kleuring van de overleving van GC-1 cellen (20×; schaalbalk, 100 µm). (F, G) Flowcytometrische analyse van apoptose na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) analyse van GC-1 cellen (40×; schaalbalk, 50 µm). (J) Caspase-3 activiteit na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) Western blot analyse van de expressie van Bcl-2, Bax, caspase-3 en cleaved caspase-3 na sh-lncRNA transfectie. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. ***p < 0.001 ten opzichte van sh-NC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

LncRNA NONMMUT031883.2 interageert met QKI-5
De interactie tussen lncRNA NONMMUT031883.2 en QKI-5 werd onderzocht om het moleculaire mechanisme ten grondslag aan spermatogoniale apoptose te verduidelijken. Na scheiding van de nucleaire en cytoplasmatische fracties toonde qRT-PCR-analyse aan dat lncRNA NONMMUT031883.2 primair gelokaliseerd was in de kernen van GC-1-cellen (Figuur 3A). Immunofluorescentieanalyse toonde aan dat QKI-5 eveneens geconcentreerd was in de kern, wat een ruimtelijke basis biedt voor interactie tussen lncRNA NONMMUT031883.2 en QKI-5 (Figuur 3B). De halfwaardetijd van lncRNA NONMMUT031883.2 werd gemeten na behandeling met actinomycine D om vast te stellen of QKI-5 de stabiliteit van het lncRNA reguleerde. QKI-5-knockdown had geen noemenswaardig effect op de halfwaardetijd van het lncRNA-transcript (Figuur 3C). Na inhibitie van de eiwitsynthese door cycloheximide veranderde lncRNA NONMMUT031883.2-knockdown de expressie van het QKI-5-eiwit niet (Figuur 3D, E). De capture-efficiëntie van de biotin-gelabelde antisense-probe gericht tegen lncRNA NONMMUT031883.2 werd vervolgens geëvalueerd via qRT-PCR. De antisense-probe verrijkte het doel-lncRNA efficiënt en werd daarom gebruikt voor de daaropvolgende RNA pull-down assay (Figuur 3F). RNA pull-down gevolgd door Western blotting toonde een specifieke fysieke interactie aan tussen lncRNA NONMMUT031883.2 en QKI-5 (Figuur 3G, H). Deze resultaten geven aan dat lncRNA NONMMUT031883.2 en QKI-5 colokaliseren in de kernen van GC-1-cellen en specifiek interageeren. De kwantitatieve gegevens van Figuur 3C en Figuur 3D, F zijn verkregen met n = 3, en de overige kwantitatieve gegevens zijn verkregen met n = 6.

figure-results-2
Figuur 3: LncRNA NONMMUT031883.2 interageert met QKI-5. (A) qRT-PCR-analyse van de nucleaire en cytoplasmatische distributie van lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1-cellen. (B) Immunofluorescentie-analyse van de subcellulaire lokalisatie van QKI-5 in GC-1-cellen (40×; schaalbalk, 50 µm). (C) qRT-PCR-analyse van de halfwaardetijd van lncRNA NONMMUT031883.2 na behandeling met actinomycine D en knockdown van QKI-5 (n = 3). (D, E) Western blot-analyse van de expressie van het QKI-5-eiwit na behandeling met cycloheximide en knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) qRT-PCR-validatie van de verrijkingsefficiëntie van de biotinyl-gelabelde antisense-probe gericht tegen lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) RNA pull-down en Western blot-analyse van de interactie tussen lncRNA NONMMUT031883.2 en QKI-5. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

QKI-5 knockdown remt apoptose van spermatogonia door onderdrukking van de p38 MAPK-route
De rol van QKI-5 en de stroomafwaartse p38 MAPK-route bij apoptose van spermatogonia werd onderzocht. Na transfectie met si-QKI-5 waren de QKI-5-proteineniveaus in GC-1-cellen significant verlaagd, wat een succesvolle knockdown bevestigt (Figuur 4A, B). Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 verhoogde de p-p38/p38-ratio significant, terwijl gelijktijdige QKI-5 knockdown deze ratio verlaagde, wat wijst op inhibitie van de activatie van de p38 MAPK-route (Figuur 4C, D). QKI-5 knockdown verzachtte de schade aan GC-1-cellen veroorzaakt door lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown, terwijl behandeling met de apoptose-inducer etoposide de cellevensvatbaarheid significant verminderde (Figuur 4E). QKI-5 knockdown verminderde de apoptosesnelheid van GC-1-cellen significant, terwijl etoposide-behandeling de apoptose duidelijk verhoogde (Figuur 4F, G). Transfectie met si-QKI-5 verminderde ook de caspase-3-activiteit significant, terwijl etoposide-behandeling de caspase-3-activiteit verhoogde (Figuur 4H). QKI-5 knockdown verlaagde de Bax-expressie, verhoogde de Bcl-2-expressie en verminderde de cleaved caspase-3/caspase-3-ratio significant, terwijl etoposide-behandeling deze expressiepatronen omkeerde (Figuur 4I, J). Deze resultaten tonen aan dat QKI-5 knockdown apoptose in GC-1-spermatogonia onderdrukt door de p38 MAPK-route te inhiberen. Alle gekwantificeerde gegevens zijn verkregen met n = 6.

figure-results-3
Figuur 4: QKI-5 knockdown remt spermatogoniale apoptose door de p38 MAPK-route te onderdrukken. (A, B) Western blot-analyse van de QKI-5-expressie in GC-1-cellen na transfectie met si-NC of si-QKI-5. (C, D) Western blot-analyse van de expressie van gefosforyleerd p38 (p-p38) en totaal p38. (E) CCK-8-analyse van de levensvatbaarheid van GC-1-cellen in de verschillende behandelingsgroepen. (F, G) Flowcytometrische analyse van apoptose na behandeling met etoposide. (H) Caspase-3-activiteit in de verschillende behandelingsgroepen. (I, J) Western blot-analyse van de expressie van Bax, Bcl-2, caspase-3 en cleaved caspase-3 in GC-1-cellen. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. ***p < 0.001 versus si-NC of sh-NC; ###p < 0.001 versus sh-lncRNA; &&&p < 0.001 versus sh-lncRNA + si-QKI-5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

YC remt spermatogoniale apoptose via het lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-pad
Na behandeling van GC-1-cellen met serum dat YC bevat gedurende 6, 12 en 24 h, nam de celviabiliteit geleidelijk toe bij stijgende YC-concentraties en langere blootstellingstijden. Daarom werden deze concentraties geselecteerd voor opeenvolgende experimenten, met een behandelingsduur van 24 h (Figuur 5A). Behandeling met YC gedurende 24 h verhoogde het transcriptionele niveau van lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1-cellen aanzienlijk (Figuur 5B) en verbeterde de bindingscapaciteit ervan aan QKI-5 (Figuur 5C, D). Na behandeling met YC waren de QKI-5-expressie en de p-p38/p38-ratio in GC-1-cellen merkbaar verlaagd, wat wijst op inhibitie van het p38 MAPK-pad (Figuur 5E, F). Behandeling met YC verlaagde ook de apoptoseratio aanzienlijk (Figuur 5G, H), verminderde de caspase-3-activiteit (Figuur 5I), verhoogde de Bcl-2-expressie en verminderde de Bax-expressie en de cleaved caspase-3/caspase-3-ratio (Figuur 5J, K).

Om de pathway-specificiteit verder te beoordelen, werden GC-1-cellen getransfecteerd met OE-NC of OE-QKI-5. De expressie van het QKI-5-eiwit was significant verhoogd in de met OE-QKI-5 getransfecteerde cellen, wat een succesvolle overexpressie bevestigt (Figuur 5L, M). Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 verminderde de celviabiliteit significant, terwijl behandeling met YC dit effect terugdraaide. Overexpressie van QKI-5 verzwakte het cytoprotectieve effect van YC (Figuur 5N). Behandeling met YC verminderde ook de apoptose geïnduceerd door knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 (Figuur 5O, P), verlaagde de caspase-3-activiteit (Figuur 5Q), verminderde de Bax-expressie, verhoogde de Bcl-2-expressie en verlaagde de ratio cleaved caspase-3/caspase-3 (Figuur 5R, S). In contrast verzwakte overexpressie van QKI-5 de anti-apoptotische effecten van YC. Deze resultaten geven aan dat YC lncRNA NONMMUT031883.2 opreguleert en de binding ervan aan QKI-5 bevordert, waardoor de p38 MAPK-pathway wordt geremd en apoptose in GC-1-cellen wordt onderdrukt. Alle gekwantificeerde gegevens zijn verkregen met n = 6.

figure-results-4
Figuur 5: YC remt spermatogoniale apoptose via het lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-pad. (A) CCK-8-analyse van de levensvatbaarheid van GC-1-cellen na blootstelling aan serum bevattende Yangjing Capsule (YC) gedurende 6, 12 en 24 u. (B) qRT-PCR-analyse van de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 in GC-1-cellen na 24 u YC-behandeling. (C, D) RNA pull-down-analyse van de binding van lncRNA NONMMUT031883.2 aan QKI-5 na YC-behandeling. (E, F) Western blot-analyse van de expressie van QKI-5, p-p38 en p38 na YC-behandeling. (G, H) Flowcytometrische analyse van apoptose in GC-1-cellen na YC-behandeling. (I) Caspase-3-activiteit na YC-behandeling. (J, K) Western blot-analyse van de expressie van Bcl-2, Bax, caspase-3 en cleaved caspase-3 na YC-behandeling. (L, M) Western blot-analyse van de expressie van QKI-5 na transfectie met OE-NC of OE-QKI-5. (N) CCK-8-analyse van de levensvatbaarheid van GC-1-cellen. (O, P) Flowcytometrische analyse van apoptose in GC-1-cellen na overexpressie van QKI-5. (Q) Caspase-3-activiteit na overexpressie van QKI-5. (R, S) Western blot-analyse van de expressie van Bax, Bcl-2, caspase-3 en cleaved caspase-3 na overexpressie van QKI-5. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. ***p < 0,001 ten opzichte van controle; ###p < 0,001 ten opzichte van sh-lncRNA; &&&p < 0,001 ten opzichte van sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

YC verbetert CP-geïnduceerde spermatogene dysfunctie bij muizen
De beschermende effecten van YC werden geëvalueerd bij muizen met spermatogene dysfunctie. De testikels en epididymides van muizen in de CP-groep vertoonden een duidelijke atrofie, een verminderd volume en een doffe aanblik. Na behandeling met verschillende doses YC verbeterden de morfologie, volheid en kleur van de voortplantingsorganen geleidelijk (Figuur 6A). De relatieve gewichten van de testikels en epididymides namen significant toe, waarbij het grootste effect werd waargenomen in de groep die 800 mg/kg YC kreeg (Figuur 6B, C).

De mate van spermadeformiteit was significant verhoogd in de CP-groep, met frequente abnormaliteiten waaronder kopvervorming, staartkrulling en structurele schade. Het aantal spermacellen en de motiliteit waren eveneens merkbaar verminderd. Na behandeling met YC verbeterde de spermamorfologie (Figuur 6D), nam het aantal spermacellen toe (Figuur 6E) en werd de spermamotiliteit significant verbeterd (Figuur 6F). Paringsexperimenten toonden aan dat de fertiliteit en de worpgrootte merkbaar waren verminderd in de CP-groep, terwijl behandeling met YC de fertiliteit verbeterde (Figuur 6G). De serumspiegels van testosteron, follikelstimulerend hormoon en luteïniserend hormoon waren eveneens merkbaar verlaagd in de CP-groep en stegen na behandeling met YC (Figuur 6H-J). Deze bevindingen geven aan dat YC de atrofie van de voortplantingsorganen, de spermakwaliteit, de fertiliteit en de secretie van geslachtshormonen verbetert bij muizen met spermatogene dysfunctie. De kwantitatieve gegevens van Figuur 6G werden verkregen met n = 9, en de overige kwantitatieve gegevens werden verkregen met n = 6.

figure-results-5
Figuur 6: YC verbetert CP-geïnduceerde spermatogene dysfunctie bij muizen. (A-C) Morfologie van de voortplantingsorganen in de controle-, cyclofosfamide (CP)- en YC-behandelingsgroepen (A), testisindex (B), en epididymisindex (C). (D-F) Spermamorfologie (D) (40×; schaalbalk, 50 µm), spermadichtheid (E), en spermamotiliteit (F). (G) Mannelijke fertiliteit beoordeeld via paringsexperimenten (n = 9). (H-J) Serumspiegels van follikelstimulerend hormoon (FSH), testosteron en luteïniserend hormoon (LH) gemeten met behulp van enzyme-linked immunosorbent assay kits. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. ***p < 0.001 ten opzichte van controle; #p < 0.05, ##p < 0.01, en ###p < 0.001 ten opzichte van CP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

YC vermindert histopathologische testisschade bij muizen met spermatogene dysfunctie
Het herstellende effect van YC op testisweefselschade werd geëvalueerd via histologische kleuring. Hematoxyline- en eosinkleuring toonden een intacte weefselstructuur, duidelijke cellagen en adequate celaantallen in de controlegroep. In contrast vertoonde de CP-groep een uitgesproken atrofie van de zaadbuisjes en structurele desorganisatie, verminderde celaantallen en collaps van het lumen van de epididymis. Na behandeling met YC was de schade aan de testis en epididymis verminderd, werd de structuur van de zaadbuisjes geleidelijk hersteld en werden de cellen ordelijker en talrijker (Figuur 7A, B).

Het aandeel TUNEL-positieve cellen in het testisweefsel was significant verhoogd in de CP-groep en significant verlaagd na YC-behandeling (Figuur 7C, D). De expressie van Bax en de verhouding tussen cleaved caspase-3/caspase-3 waren merkbaar verhoogd in de CP-groep, terwijl de expressie van Bcl-2 was verlaagd. Behandeling met YC keerde deze expressiepatronen om (Figuur 7E, F). Immunofluorescentieanalyse toonde aan dat de Ki67-fluorescentie-intensiteit sterk was verminderd in de CP-groep en significant was toegenomen na YC-behandeling, wat duidt op herstel van de proliferatie van spermatogene cellen (Figuur 7G, H). Deze bevindingen suggereren dat YC de door CP geïnduceerde histopathologische schade in de testes en epididymides vermindert, overmatige apoptose remt en de proliferatie van spermatogene cellen bevordert. Alle gekwantificeerde gegevens zijn verkregen met n = 6.

figure-results-6
Figuur 7: YC vermindert CP-geïnduceerde histopathologische schade in testikulaire weefsels van muizen. (A, B) Hematoxyline en eosine (HE) kleuring van de testes (A) en epididymides (B) na behandeling met YC (20×; schaalbalk, 100 µm). (C, D) TUNEL-analyse van apoptose in testikulaire weefsels van muizen (40×; schaalbalk, 50 µm). (E, F) Western blot-analyse van de expressie van Bax, Bcl-2, caspase-3 en cleaved caspase-3 in testikulaire weefsels na behandeling met YC. (G, H) Immunofluorescentie-analyse van Ki67-expressie in testikulaire weefsels van muizen (40×; schaalbalk, 50 µm). Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. ***p < 0.001 ten opzichte van controle; p < 0.001 ten opzichte van CP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

YC verbetert spermatogene dysfunctie en pathologische testisschade bij muizen via de lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-route
De betrokkenheid van de lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-route bij de effecten van YC werd verder geëvalueerd. De expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 was significant verlaagd in testisweefsel van muizen in de CP-groep, terwijl de expressie van QKI-5 en de p-p38/p38-ratio duidelijk waren verhoogd (Figuur 8A-D). Na behandeling met YC nam de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 toe, terwijl de expressie van QKI-5 en de p-p38/p38-ratio afnamen.

Om de specificiteit van het signaalpad verder te beoordelen, werd lncRNA NONMMUT031883.2 bij muizen uitgeschakeld met behulp van sh-lncRNA. Het expressieniveau van lncRNA NONMMUT031883.2 was significant verlaagd, wat een succesvolle knockdown bevestigde (Figuur 8E). Na de knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 veranderde het QKI-5-niveau in het testisweefsel niet significant, maar het p-p38/p38-niveau was significant verhoogd (Figuur 8F, G). Behandeling met sh-lncRNA verminderde de effecten van 800 mg/kg YC, wat resulteerde in een verlaagde expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 in het testisweefsel (Figuur 8H) en verhoogde p-p38/p38-niveaus (Figuur 8I, J). YC-behandeling verhoogde het aantal zaadcellen en de motiliteit significant na CP-inductie, terwijl de knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 deze effecten verminderde (Figuur 8K, L). YC-behandeling verhoogde ook de spiegels van testosteron, follikelstimulerend hormoon en luteïniserend hormoon in de CP-groep, terwijl lncRNA-knockdown deze effecten verminderde (Figuur 8M-O).

Kleuring met hematoxiline en eosine toonde aan dat YC de door CP geïnduceerde testikelschade verbeterde, waaronder atrofie van de zaadbuisjes en een gedesorganiseerde rangschikking van de spermatogene cellen. Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 verminderde deze beschermende effecten (Figuur 8P). Na behandeling met YC waren de expressie van Bax en de ratio cleaved caspase-3/caspase-3 verlaagd, terwijl de expressie van Bcl-2 was toegenomen. Knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 keerde deze effecten op apoptose-gerelateerde eiwitten om (Figuur 8Q, R). Deze bevindingen wijzen erop dat YC de spermakwaliteit verbetert en testikulaire weefselschade na CP-inductie vermindert door lncRNA NONMMUT031883.2 op te reguleren, QKI-5 neer te reguleren en de p38 MAPK-route te remmen. Alle gekwantificeerde gegevens zijn verkregen met n = 6.

figure-results-7
Figuur 8: YC verbetert de spermatogenese en vermindert histopathologische schade aan de testis via de lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK-route. (A) qRT-PCR-analyse van de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 in testikulaire weefsels van muizen. (B-D) Western blot-analyse van de expressie van QKI-5, p-p38 en p38 in testikulaire weefsels van muizen na YC-behandeling. (E) qRT-PCR-validatie van lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown in testikulaire weefsels van muizen na toediening van sh-lncRNA. (F, G) Western blot-analyse van QKI-5- en p-p38/p38-niveaus in het testisweefsel van muizen na knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2. (H) qRT-PCR-analyse van de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 in testikulaire weefsels van muizen na YC-behandeling en toediening van sh-lncRNA. (I, J) Western blot-analyse van de expressie van p-p38 en p38 in testikulaire weefsels van muizen. (K, L) Spermacount (K) en spermamotiliteit (L) in de verschillende behandelingsgroepen. (M-O) Serumspiegels van FSH, testosteron en LH werden gemeten met behulp van enzyme-linked immunosorbent assay-kits. (P) HE-kleuring van testikulaire weefsels in CP-behandelde muizen (20×; schaalbalk, 100 µm). (Q, R) Western blot-analyse van de expressie van Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3 en caspase-3 in testikulaire weefsels van muizen. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie; n = 6. ***p < 0.001 ten opzichte van controle; p < 0.001 ten opzichte van CP; p < 0.001 ten opzichte van 800 mg/kg YC + sh-NC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Beschikbaarheid van gegevens:
De ruwe gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie worden verstrekt als Aanvullend bestand 1.

Aanvullend bestand 1: Originele gegevens. Dit Excel-bestand bevat de ruwe numerieke gegevens ten grondslag aan de kwantitatieve analyses gepresenteerd in figuren 2–8. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Door chemotherapie veroorzaakte verworven spermatogene dysfunctie is een belangrijke oorzaak van mannelijke onvruchtbaarheid32,33,34. De specifieke moleculaire mechanismen zijn echter nog niet volledig begrepen. De resultaten van deze studie tonen aan dat Yangjing Capsule (YC) dosisafhankelijk de door cyclofosfamide (CP) geïnduceerde afwijkingen in geslachtshormonen, histopathologische schade aan de teelballen en fertiliteitsstoornissen bij mannelijke muizen verbetert. Deze verbeteringen waren geassocieerd met een opregulatie van lncRNA NONMMUT031883.2 en remming van de QKI-5/p38 MAPK-route, wat suggereert dat YC via deze as kan werken om abnormale apoptose van spermatogonia te verminderen.

De reproductieve toxiciteit van CP is uitgebreid gedocumenteerd. De metaboliet acroleïne kan zich ophopen in het testiselweefsel en apoptose van kiemcellen induceren via oxidatieve stress, DNA-schade en andere pathways. Spermatogonia, als de initiële cellen van de spermatogenese, zijn bijzonder gevoelig voor de cytotoxische effecten van CP.35,36. Cao et al. stelden vast dat DNA-schade-checkpointsignalering significant verrijkt was in testikelweefsel van patiënten met azoospermie na CP-chemotherapie, terwijl genen geassocieerd met spermatogenese significant downgereguleerd waren en de structurele integriteit van de zaadbuisjes was verstoord37Bcl-2 is een anti-apoptotisch eiwit dat functioneert door de integriteit van het mitochondriale membraan te handhaven.38Bax is een pro-apoptotisch eiwit, en de upregulatie ervan kan de afgifte van cytochroom c vanuit de mitochondriën naar het cytoplasma bevorderen, de caspase-cascade activeren en apoptose induceren.39,40. Saleh et al. aangetoond dat blootstelling aan CP leidde tot atrofie van de zaadbuisjes en interstitieel oedeem bij muizen, gepaard gaand met een downregulatie van Bcl-2 en een upregulatie van Bax, wat uiteindelijk resulteerde in een verminderd aantal zaadcellen en een verminderde motiliteit41Daarom kan de remming van overmatige door CP geïnduceerde spermatogoniale apoptose een belangrijk doelwit vormen voor het beschermen van de reproductieve functie na chemotherapie. In de huidige studie verminderde interventie met YC dosisafhankelijk de door CP geïnduceerde afwijkingen in de serumsecretie van geslachtshormonen, herstelde het de schade aan de tubuli seminiferi en verbeterde het de spermamobiliteit en de mannelijke fertiliteit. YC verhoogde bovendien de Bcl-2-expressie en verminderde de Bax-expressie, de verhouding tussen cleaved caspase-3/caspase-3 en het aantal TUNEL-positieve cellen in het testiculaire weefsel. In vitro, Serum met YC verminderde de apoptose van GC-1-cellen aanzienlijk en verhoogde de celviabiliteit, wat een remmend effect op spermatogoniale apoptose verder ondersteunt.

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) spelen belangrijke regulerende rollen in fysiologische en pathologische processen, waaronder spermatogenese en apoptose van kiemcellen42,43. Abnormale lncRNA-expressie kan de spermatogene functie van de testis belemmeren via de regulatie van oxidatieve stress en apoptotische pathways, wat een belangrijk moleculair mechanisme van mannelijke onvruchtbaarheid vormt44. Wang et al. stelden vast dat lncRNA DNM3OS de miR-214-5p/E2F2-as reguleert, wat resulteert in een verminderde activiteit van spermatogoniale cellen en verhoogde apoptose en senescentie, wat uiteindelijk bijdraagt aan niet-obstructieve azoospermie45. Voorgaand onderzoek toonde ook aan dat knockdown van lncRNA NONMMUT074098.2 in spermatogonia apoptose induceert25. Deze studies geven aan dat lncRNA's belangrijke regulatoren zijn van spermatogoniale apoptose en spermatogenese. In de huidige studie induceerde knockdown van lncRNA NONMMUT031883.2 spermatogoniale apoptose. De expressie hiervan was significant verminderd in testisteel van muizen na CP-inductie, terwijl YC-interventie de expressie gedeeltelijk herstelde. Daarnaast verzachtte YC-interventie de abnormale spermatogoniale apoptose die werd geïnduceerd door lncRNA NONMMUT031883.2-knockdown, wat suggereert dat het beschermende effect van YC geassocieerd kan zijn met de regulatie van dit lncRNA.

QKI-5 is een RNA-bindend eiwit behorend tot de STAR-familie en neemt deel aan verschillende fysiologische en pathologische processen door de splicing, stabiliteit en translationele efficiëntie van doel-mRNA te reguleren46,47Eerder onderzoek heeft aangetoond dat QKI-5 een belangrijke regulator is in het voortplantingsstelsel en dat een abnormale expressie ervan kiemcelapoptose kan bevorderen en de spermafunctie kan verslechteren via activatie van de downstream p38 MAPK-route.25. Li et al. stelde vast dat remming van de activering van de p38 MAPK-signaalroute de door CP geïnduceerde schade aan het testisweefsel verminderde en de functie van de bloed-testisbarrière bij ratten herstelde48Deze bevindingen suggereren dat de QKI-5/p38 MAPK-as een belangrijke route kan zijn die de apoptose van spermatogonia reguleert en een potentieel doelwit vormt voor de behandeling van spermatogene dysfunctie. In de huidige studie waren de expressie van QKI-5 en de fosforylering van p38 significant verhoogd in testiculaire weefsels van muizen na CP-inductie, terwijl interventie met YC de expressie van QKI-5 en de activatie van de p38 MAPK-route verminderde. LncRNA NONMMUT031883.2 bond direct aan QKI-5, terwijl de expressie van QKI-5 de stabiliteit van het lncRNA niet beïnvloedde, wat suggereert dat lncRNA NONMMUT031883.2 de functie van QKI-5 kan reguleren via directe interactie. QKI-5 knockdown verminderde de schade aan GC-1-cellen veroorzaakt door lncRNA NONMMUT031883.2 knockdown, terwijl QKI-5 overexpressie de beschermende effecten van YC op GC-1-cellen reduceerde. Li et al. meldde dat lncRNA NONMMUT074098.2 de apoptose van kiemcellen reguleert door te binden aan QKI-525De huidige bevindingen tonen aan dat lncRNA NONMMUT031883.2 ook bindt aan QKI-5 en betrokken is bij de regulatie van spermatogoniale apoptose. Gezameld suggereren deze gegevens dat YC lncRNA NONMMUT031883.2 kan opreguleren, het QKI-5/p38 MAPK-pad kan remmen, abnormale spermatogoniale apoptose kan verminderen en CP-geïnduceerde spermatogene dysfunctie kan verlichten. Er moet echter worden opgemerkt dat YC een kruidenformulering met meerdere componenten is die waarschijnlijk op meerdere targets inwerkt. Andere mechanismen, zoals directe antioxidante effecten van YC-componenten, modulatie van andere signaleringspaden of epigenetische regulatie onafhankelijk van de lncRNA-QKI-5-as, kunnen niet worden uitgesloten en kunnen bijdragen aan de waargenomen beschermende effecten.

Er moeten verschillende beperkingen worden erkend. De studie werd uitsluitend uitgevoerd in een muismodel en de GC-1-cellijn, en er ontbrak validatie met klinische monsters van patiënten met onvruchtbaarheid. Spermatogenese is een complex proces, en de volledige spermatogene cyclus van muizen duurt ongeveer 35 dagen49,50. Het 30-daagse YC-regime dat in deze studie werd gebruikt, besloeg geen volledige spermatogene cyclus. Daarom zijn toekomstige studies met interventieprotocollen van ≥35 dagen gerechtvaardigd om de therapeutische effecten van YC over een volledige spermatogene cyclus systematisch te evalueren. Daarnaast moeten de precieze moleculaire gebeurtenissen na de binding van lncRNA NONMMUT031883.2 aan QKI-5 nog worden onderzocht, zoals veranderingen in de splicing-activiteit van QKI-5 en de subcellulaire lokalisatie ervan, en de herkenning en regulatie van downstream splicing-doelen. Bovendien, hoewel YC-behandeling de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 verhoogde, moeten de upstream transcriptiefactoren en epigenetische mechanismen nog worden opgehelderd. Toekomstige studies waarin promoteranalyse en chromatin immunoprecipitation-assays worden opgenomen, zijn nodig om de moleculaire basis van de door YC geïnduceerde expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 te verduidelijken. Verder zouden toekomstige studies de effecten van YC bij patiënten met chemotherapie-geassocieerde mannelijke onvruchtbaarheid moeten evalueren en de expressie van lncRNA NONMMUT031883.2 in testisweefsel of sperma moeten beoordelen om de potentiële klinische waarde als diagnostische of therapeutische marker te bepalen.

Concluderend reguleert YC lncRNA NONMMUT031883.2 opwaarts en remt het de activatie van de QKI-5/p38 MAPK-route, waardoor spermatogoniale apoptose en testisschade worden verminderd en spermatogene dysfunctie bij muizen wordt verlicht. Deze bevindingen verduidelijken het moleculaire mechanisme ten grondslag aan de beschermende effecten van YC tegen spermatogene dysfunctie en breiden het huidige begrip uit van de rollen van lncRNA NONMMUT031883.2 en de QKI-5/p38 MAPK-route bij de regulatie van de spermatogenese. LncRNA NONMMUT031883.2 en QKI-5 kunnen potentiële therapeutische doelen vormen voor spermatogene dysfunctie bij mannen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen financiële of niet-financiële belangenverstrengelingen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82374257), de Fourth Batch of Peak Academic Talent Training Program of Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine (subsidienummer k2026yrc74), en de Scientific Research Projects of Traditional Chinese Medicine and Integrated Traditional Chinese and Western Medicine of Jiangsu Province (subsidienummer CYTF2026019).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Actinomycine DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Transcriptie-inhibitor gebruikt voor RNA-stabiliteitsassays
AMV reverse transcriptaseTakara, Tokyo, Japan2621Enzym voor synthese van complementair DNA
Annexine V-APC/PI detectiekitBioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191Kit voor flowcytometrische analyse van apoptose
Antifade monteermediumMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Monteermedium voor fluorescentiebehoud
Bax primair antilichaamAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Primair antilichaam voor detectie van Bax
BCA kitMacklin, Shanghai, ChinaB917925Kit voor bepaling van de proteïneconcentratie
Bcl-2 primair antilichaamAffinity Biosciences, OH, USAAF0769Primair antilichaam voor detectie van Bcl-2
Bovien serumalbumineBioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070Blokkeringsreagens
Calceïne/PI detectiekitBeyotime, Shanghai, ChinaC2015MKit voor levend/dood celkleuring
Caspase-3 activiteitsassay kitBioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866Kit voor het meten van de caspase-3 activiteit
Caspase-3 primair antilichaamAbcam, MA, USAab184787Primair antilichaam voor detectie van caspase-3
CCK-8 reagensMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Reagens voor bepaling van de celviabiliteit
Gesplitste caspase-3 primair antilichaamAbcam, MA, USAab32042Primair antilichaam voor detectie van gesplitste caspase-3
CycloheximideMacklin, Shanghai, ChinaH823111Proteïnesynthese-inhibitor gebruikt voor proteïnestabiliteitsassays
CyclofosfamideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Gebruikt om spermatogene dysfunctie te induceren
DAPI reagensBeyotime, Shanghai, ChinaC1006Nucleaire tegenkleuring
DMEM mediumWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Celkweekmedium voor GC-1 cellen
ECL werkoplossingSolarbio, Beijing, ChinaSW2030Chemiluminescent substraat voor detectie van proteïnebanden
EtoposideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Apoptose-inducerend agens
FlowcytometerBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburInstrument voor apoptoseanalyse
FlowJo softwareBD Biosciences, CA, USAv10.8Software voor analyse van flowcytometriegegevens
FluorescentiemicroscoopLeica, Heidelberg, GermanyDM3000Instrument voor fluorescentie-imaging
Fluorescentie-gelabeld secundair antilichaam IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Secundair antilichaam voor immunofluorescentiedetectie
Folliculostimulerend hormoon ELISA kitHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mKit voor het meten van serum folliculostimulerend hormoon
GAPDH primair antilichaamAffinity Biosciences, OH, USAT0004Loading-control antilichaam voor Western blotting
GC-1 cellenWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Muis spermatogoniale cellijn
Gel-imaging systeemJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880Imaging systeem voor visualisatie van gels en blots
Gel-imaging systeemInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Chemiluminescent imaging systeem voor Western blots
Geit anti-konijn IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Secundair antilichaam voor Western blotting
Hematoxyline oplossingBioLab Technology, Beijing, ChinaYT165Nucleaire kleuring voor histologische analyse
Zoutzuur ethanol differentiatie-oplossingBeyotime, Shanghai, ChinaC0163SDifferentiatiereagens voor hematoxyline-kleuring
ImageJ softwareNational Institutes of Health, USA1.54hSoftware voor beeldkwantificatie
IP cellysebufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013Lysebuffer voor immunoprecipitatie en proteïne-extractie
Ki67 primair antilichaamAffinity Biosciences, OH, USAAF0198Primair antilichaam voor detectie van Ki67
LDH cytotoxiciteitsassay kitBeyotime, Shanghai, ChinaC0016Kit voor het meten van lactaatdehydrogenase-afgifte en cellulaire schade
LichtmicroscoopOlympus, Tokyo, JapanCKX53Gebruikt voor spermatelling en morfologische observatie
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Transfectiereagens
Microplate readerMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniInstrument voor absorbentiemetingen
Muis luteïniserend hormoon ELISA kitHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mKit voor het meten van serum luteïniserend hormoon
Muis testosteron ELISA kitHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mKit voor het meten van serum testosteron
Neutrale gomBioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253Monteermedium voor histologische coupes
p38 primair antilichaamAffinity Biosciences, OH, USAAF6456Primair antilichaam voor detectie van totaal p38
ParaformaldehydeMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Fixeermiddel voor cellen en weefsels
PARIS kitInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Kit voor nucleaire en cytoplasmatische RNA-fractionering
PCR-systeemABI, CA, USAABI PRISM 7300Real-time PCR instrument
p-p38 primair antilichaamAffinity Biosciences, OH, USAAF3455Primair antilichaam voor detectie van gefosforyleerd p38
Proteïnase K oplossingBeyotime, Shanghai, ChinaST532Reagens voor weefselpermeabilisatie vóór TUNEL-kleuring
PVDF membranenMillipore, MA, USAISEQ00010Membranen voor proteïne-transfer bij Western blotting
QKI-5 primair antilichaamAbcam, MA, USAab126742Primair antilichaam voor detectie van QKI-5
RNA-bindingsbufferInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DBuffer voor RNA-proteïne bindingsreacties
SDS loading bufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0286Monsterlaadbuffer voor SDS-PAGE
Streptavidine magnetische kralenMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Magnetische kralen voor opvang van biotine-gelabelde RNA-probes
TB Green FAST qPCR KitTakara, Tokyo, JapanCN830SReagenskit voor kwantitatieve PCR
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275Permeabilisatieresagens
TRIzol reagensInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNReagens voor extractie van totaal RNA
TUNEL detectie-oplossingBeyotime, Shanghai, ChinaC1086Reagens voor detectie van DNA-fragmentatie
XyleenMacklin, Shanghai, ChinaX821391Reagens voor paraffineverwijdering en weefselklaring

Referenties

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

Gerelateerde artikelen