Nefroprotectieve effecten van ethanol en fomepizol in een met methotrexaat voorbehandeld ratmodel van methanolintoxicatie

Samenvatting

Deze studie vergelijkt de nefroprotectieve effecten van ethanol en fomepizool in een met methotrexaat voorbehandeld ratmodel van methanolintoxicatie, ontworpen om de folaat-afhankelijke formiaatklaring te verminderen. De renale uitkomsten werden geëvalueerd aan de hand van maatstaven voor de nierfunctie, biomarkers voor nierschade, ontstekingsmarkers, redox-gerelateerde biomarkers en histopathologische bevindingen.

Samenvatting

Methanolintoxicatie veroorzaakt metabole acidose, orgaanschade en de dood; nierschade is een voorspeller voor nadelige uitkomsten. Ethanol en fomepizool werden vergeleken in een met methotrexaat voorbehandeld ratmodel van methanolintoxicatie. Dertig mannelijke Wistar-ratten werden verdeeld over vijf groepen: Controle, methotrexaat (MTX), MTX + methanol, MTX + methanol + fomepizool en MTX + methanol + ethanol (n = 6 per groep). MTX werd toegediend via orale gavage in een dosis van 0,3 mg/kg/dag op dag 1–7. De drie met methanol blootgestelde groepen ontvingen 3 g/kg methanol via orale gavage op dag 8. Fomepizool werd intraperitoneaal toegediend in een dosis van 15 mg/kg 4 u na de toediening van methanol, gevolgd door 10 mg/kg na 12, 24 en 36 u. Ethanol werd eenmalig toegediend via orale gavage in een dosis van 0,5 g/kg 4 u na de toediening van methanol. Monsters werden verzameld op dag 10. Er was prospectief geen primaire uitkomst vastgesteld. De nierfunctie, schade aan nierhomogenaat, inflammatoire biomarkers, bloedafgeleide redox-gerelateerde biomarkers en histopathologische bevindingen werden beoordeeld. Variantieanalyse (ANOVA) onthulde significante groepsverschillen in cystatine C in het nierhomogenaat (p = 0,003), interleukine-6 (IL-6; p = 0,013), kidney injury molecule-1 (KIM-1; p = 0,017), serumurea (p = 0,017) en serumcreatinine (p < 0,001). Duncan post-hoc toetsing toonde lagere waarden voor deze parameters aan in beide antidote-groepen dan in de MTX + methanol-groep. Er werden geen significante biochemische verschillen vastgesteld tussen de twee antidote-groepen. De histopathologische scores waren lager in de antidote-groepen. Hoewel fomepizool een gunstiger descriptief patroon vertoonde, bewijzen de resultaten niet dat het superieur is aan ethanol. Variantieheterogeniteit, meervoudig testen, ongelijke antidote-schema's, de afwezigheid van toxicokinetische en zuur-basemetingen en een korte follow-up beperken de interpretatie. Toekomstige studies zouden directe metingen van methanol en formaat, renale cytosolische alcoholdehydrogenase-activiteit, correlaties met renale biochemische uitkomsten, langere follow-upperioden en vergelijkbare antidote-schema's moeten bevatten.

Inleiding

Methylalcoholvergiftiging (methanolvergiftiging) is een ernstige toxicologische noodsituatie die wereldwijd gepaard gaat met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit, met name na consumptie van illegale of illegaal geproduceerde alcoholische dranken. Hoewel methanol zelf een relatief lage toxiciteit heeft, wordt het in de lever hoofdzakelijk door alcoholdehydrogenase (ADH) gemetaboliseerd tot formaldehyde en vervolgens tot mierenzuur; de resulterende ophoping van formaat kan leiden tot metabole acidose met een hoge anionkloof, optische neuropathie en multi-orgaanletsel^1,2. Formaldehyde is een kortlevende tussenstof, terwijl de ophoping van formaat wordt beschouwd als de primaire oorzaak van toxiciteit via inhibitie van mitochondriaal cytochroomoxidase, cellulaire hypoxie en oxidatieve stress 3. Vroege diagnose, correctie van de metabole acidose, antidotumtherapie en hemodialyse zijn de belangrijkste therapeutische benaderingen om de mortaliteit te verlagen².

Bij methanolvergiftiging worden klinische manifestaties doorgaans pas na een latente periode duidelijk. Misselijkheid, braken, buikpijn en een milde depressie van het centraal zenuwstelsel kunnen worden gevolgd door een metabole acidose met een hoge anionenkloof, dyspneu, een veranderde mentale status en visuele symptomen^1,2. Wazig zien, fotofobie, mydriasis, oedeem van de oogzenuwpapil en, in ernstige gevallen, permanente blindheid behoren tot de meest kenmerkende toxische effecten die geassocieerd worden met de door mierenzuur gemedieerde remming van mitochondriaal cytochroomoxidase^1,2. Huidige behandelstrategieën omvatten ondersteunende zorg; correctie van de metabole acidose met natriumbicarbonaat; suppletie van folinezuur of foliumzuur; remming van alcoholdehydrogenase met ethanol of fomepizol; en, in geselecteerde ernstige gevallen, hemodialyse om de eliminatie van methanol en formaat te versnellen^3,4. Fomepizol wordt in toenemende mate beschouwd als een eerstelijnsantidotum vanwege de meer voorspelbare farmacokinetiek, eenvoudigere dosering en een lager risico op bijwerkingen; ethanol blijft echter een belangrijk alternatief vanwege de beschikbaarheid en de lagere kosten^4,5,6,7.

Hoewel letsel aan de nervus opticus en het centrale zenuwstelsel traditioneel worden beschouwd als de belangrijkste manifestaties van methanoltoxiciteit, wordt de nier in toenemende mate erkend als een klinisch relevant doelorgaan^8,9,10. In methanol-specifieke cohorten is acute nierinsufficiëntie (AKI) geassocieerd met ernstigere metabole acidose, respiratoir falen, multi-orgaanfalen, mechanische ventilatie, extracorporele behandeling, langere ziekenhuisopname en een hogere mortaliteit tijdens opname; volumedepletie, sepsis, rhabdomyolyse en acute pancreatitis zijn eveneens geïdentificeerd als factoren die geassocieerd zijn met de ontwikkeling van AKI^8,10. In het door Chang et al. gerapporteerde cohort bleef AKI in een multivariabele analyse onafhankelijk geassocieerd met mortaliteit tijdens opname; het retrospectieve observationele ontwerp stelt echter niet vast dat AKI zelf de mortaliteit veroorzaakte⁸. Bijgevolg moet AKI worden geïnterpreteerd als een marker voor een grotere ernst van de ziekte en een slechtere prognose bij methanolintoxicatie. Daarentegen evalueerde de systematische review van Wang et al. nieruitkomsten na vergiftiging met toxische alcoholen breder, hoofdzakelijk methanol en ethyleenglycol; daarom zijn de conclusies daarvan niet exclusief methanol-specifiek⁹. Die review identificeerde aanzienlijke mortaliteit op korte termijn en belangrijke hiaten in de bewijsvoering met betrekking tot herstel van de nieren op lange termijn, voortdurende dialyse en gestandaardiseerde rapportage van renale uitkomsten⁹.

De relatie tussen methanoltoxiciteit en AKI is waarschijnlijk multifactorieel. Accumulatie van toxische metabolieten kan bijdragen via mitochondriële inhibitie, cellulaire hypoxie, ernstige metabole acidose en redox-onbalans, terwijl systemische factoren die in klinische cohorten zijn gedocumenteerd — waaronder volumedepletie, hemodynamische compromittering, rhabdomyolyse, sepsis, respiratoir falen en multimorgelfalen — kunnen zorgen voor aanvullende renale insulten^1,2,3,8,10. Deze mechanismen bieden biologisch en klinisch plausibele verbanden tussen methanolvergiftiging en nierletsel. Renale metabole verstoringen kunnen het gevolg zijn van blootstelling aan circulerend formaat, mitochondriële inhibitie, metabole acidose en systemische hemodynamische stress. De specifieke bijdrage van alcohol- en aldehydemetabolisme binnen het nierweefsel blijft echter onzeker, omdat methanol-, formaldehyde- en formaatconcentraties, renale ADH-activiteit en mitochondriële functie in de huidige studie niet direct zijn beoordeeld.

Een belangrijke methodologische uitdaging bij experimentele studies naar methanoltoxiciteit is dat ratten mierenzuur sneller metaboliseren dan mensen. Hoewel de ophoping van mierenzuur een belangrijke determinant is van methanoltoxiciteit bij mensen, is het bereiken van een vergelijkbare ophoping en het daaruit voortvloeiende orgaanschade bij ratten moeilijker vanwege hun zeer efficiënte folaatafhankelijke formaatmetabolisme. Daarom worden middelen die het folaatmetabolisme onderdrukken vaak gebruikt in experimentele modellen van methanoltoxiciteit^11,12. Voorbehandeling met methotrexate (MTX) werd gebruikt om de folaatafhankelijke klaring van formaat bij ratten te verminderen, waardoor de vatbaarheid voor methanoltoxiciteit toenam^11,12. Methotrexate induceert op zichzelf geen methanoltoxiciteit, en het resulterende model reproduceert niet alle aspecten van methanolvergiftiging bij mensen. Omdat methotrexate onafhankelijk de renale, oxidatieve en inflammatoire uitkomsten kan beïnvloeden, is een groep die alleen MTX kreeg opgenomen om de veranderingen geassocieerd met de voorbehandeling te karakteriseren. Binnen deze beperkingen biedt het model een gecontroleerd preklinisch platform voor het vergelijken van renale uitkomstpatronen tussen experimentele groepen die hetzelfde methotrexate-voorbehandelings- en methanolblootstellingsprotocol ontvingen, en voor het evalueren van deze uitkomsten op biochemisch, inflammatoir, oxidatief en histopathologisch niveau.

Remming van alcoholdehydrogenase vormt de hoeksteen van de antidotumbehandeling bij methanolvergiftiging. De twee middelen die in de klinische praktijk het meest voor dit doel worden gebruikt, zijn ethanol en fomepizol (4-methylpyrazool). Ethanol onderdrukt competitief de vorming van toxische metabolieten vanwege de hogere affiniteit voor ADH dan methanol, terwijl fomepizol, een potente en selectieve ADH-remmer, de omzetting van methanol naar formaldehyde en mierenzuur direct voorkomt^5,6. Er bestaat echter geen volledige consensus over de relatieve klinische effectiviteit, veiligheid, het gemak van toediening en de orgaanbeschermende effecten van deze twee antidota. Fomepizol wordt in veel centra als voordelig beschouwd vanwege het gestandaardiseerde doseringsschema, het ontbreken van de noodzaak voor serumspiegelmonitoring, de afwezigheid van depressie van het centraal zenuwstelsel en meer voorspelbare farmacokinetische eigenschappen, terwijl ethanoltherapie geassocieerd wordt met potentiële nadelen, waaronder hypoglykemie, hepatotoxiciteit, veranderde mentale status en de noodzaak voor intensieve monitoring^6,7. Omgekeerd hebben grootschalige klinische vergelijkingen gesuggereerd dat de effecten van de twee antidota op de mortaliteit en de klinische uitkomsten vergelijkbaar kunnen zijn. In de studie van Zakharov et al., waarin gevallen van massavergiftiging werden geëvalueerd, werd geen significant verschil in overleving waargenomen tussen fomepizol en ethanol⁵.

Ondanks het prognostische belang van AKI bij methanolvergiftiging^8,9,10, heeft nierschade aanzienlijk minder aandacht gekregen dan okulaire en neurologische toxiciteit, en de vergelijkende effecten van ethanol en fomepizol op de nieren blijven onvoldoende gekarakteriseerd. Een evaluatie met de focus op de nieren, inclusief conventionele nierfunctietesten, biomarkers voor vroege tubulaire schade, inflammatoire cytokinen, redox-gerelateerde parameters en histopathologie, is daarom gerechtvaardigd om vast te stellen of de twee antidotische strategieën geassocieerd zijn met verschillende patronen in de nieruitkomsten. Daarnaast kan dit gecontroleerde, met methotrexaat voorbehandelde ratmodel de preklinische evaluatie van kandidaat-antidota, niergerichte en ondersteunende interventies onder gedefinieerde experimentele omstandigheden faciliteren. De onderzoekswaarde van dit model ligt in de vergelijkende beoordeling binnen een acute experimentele setting, in plaats van in een directe replicatie van de klinische en metabole complexiteit van methanolvergiftiging bij mensen.

Verschillen in het methanolmetabolisme tussen knaagdieren en mensen, samen met het gebruik van farmacologische voorbehandeling om de folaatafhankelijke formiaatklaring te verminderen, blijven belangrijke methodologische beperkingen. Bovendien weerspiegelt acute toxiciteit die onder experimentele omstandigheden wordt opgewekt mogelijk niet volledig de variërende blootstellingsduren en comorbide aandoeningen die in de klinische praktijk worden aangetroffen. Bijgevolg moeten de bevindingen uit dit diermodel worden beschouwd als preliminaire preklinische bewijzen en mogen ze niet direct worden gebruikt ter ondersteuning van behandelbeslissingen bij mensen. Bevestiging in adequaat ontworpen klinische studies is vereist voordat klinische conclusies kunnen worden getrokken. Tegen deze achtergrond is de belangrijkste kennishiaat of ethanol en fomepizol geassocieerd zijn met verschillende patronen in de renale uitkomsten op basis van conventionele maatstaven voor de nierfunctie, biomarkers voor tubulaire beschadiging, inflammatoire cytokinen, redox-gerelateerde parameters en histopathologie in een met methotrexaat voorbehandeld ratmodel. De hypothese van de studie was dat remming van alcoholdehydrogenase met ofwel ethanol of fomepizol geassocieerd zou zijn met een vermindering van nierbeschadiging, met potentiële verschillen tussen de behandelingen over de geëvalueerde uitkomstdomeinen. Nefroprotectie werd operationeel gedefinieerd als een gunstiger patroon van renale uitkomsten dan in de MTX + Methanol-groep. Dit patroon bestond uit lagere serumconcentraties van ureum en creatinine; lagere renale spiegels van kidney injury molecule-1 (KIM-1), cystatine C, tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), interleukine-6 (IL-6) en interleukine-1 bèta (IL-1β); lagere serumconcentraties van malondialdehyde (MDA); een hogere serumactiviteit van superoxide dismutase (SOD), hogere bloedspiegels van gereduceerd glutathione (GSH) en een hogere bloedactiviteit van catalase (CAT); en lagere histopathologische scores voor tubulaire degeneratie, tubulaire necrose, glomerulaire beschadiging, vasculaire congestie, interstitiële ontsteking en fibrose. Nefroprotectie werd niet berekend als één enkele samengestelde score; in plaats daarvan werden individuele uitkomsten collectief geëvalueerd over deze complementaire domeinen. De studie was derhalve gericht op het vergelijken van de effecten van ethanol en fomepizol op de nierfunctie, tubulaire beschadiging, ontsteking, redoxstatus en renale histopathologie in dit model.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dierproeven van de Kırşehir Ahi Evran University (goedkeuringsbesluit nr. 1, vergadering nr. 12, goedkeuringsdatum: 12 juni 2025) en werden uitgevoerd in overeenstemming met nationale en internationale richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. Gedurende de gehele studie zijn maatregelen genomen om pijn en stress te minimaliseren en om het kleinst mogelijke aantal dieren te gebruiken.

Voorbereiding van chemicaliën
Methotrexaat werd gebruikt als voorbehandelingsmiddel om de vestiging van het experimentele methanoltoxiciteitsmodel te vergemakkelijken. Omdat foliumzuur-afhankelijke formaatoxidatie bij ratten efficiënter verloopt dan bij mensen, werd voorbehandeling met methotrexaat toegepast om de klaring van formaat te verminderen en de gevoeligheid voor methanoltoxiciteit te verhogen; het werd gebruikt als een model-sensitiserende interventie en niet als een surrogaat voor methanolblootstelling^11,12. Methotrexaat werd geleverd als een formulering van 500 mg/5 mL, wat overeenkomt met een voorraadconcentratie van 100 mg/mL. De formulering werd verdund met een steriele 0,9% natriumchloride-oplossing om een uiteindelijke werkconcentratie van 0,06 mg/mL te verkrijgen. De werkoplossing werd toegediend via orale gavage in een dosis van 5 mL/kg, wat overeenkomt met een MTX-dosis van 0,3 mg/kg. Voor ratten met een gewicht van 200–220 g bij aanvang van de studie varieerde het dagelijkse toedieningsvolume van 1,00 tot 1,10 mL per dier en werd dit individueel berekend op basis van het bij aanvang van de studie vastgestelde lichaamsgewicht. Het lichaamsgewicht werd tijdens de 7-daagse MTX-voorbehandelingsperiode niet opnieuw gemeten. Methotrexaat werd één keer daags gedurende 7 opeenvolgende dagen toegediend (studiedagen 1–7), en methanol werd op studiedag 8 toegediend na voltooiing van het MTX-voorbehandelingsprotocol. Dit regime was consistent met eerder gepubliceerde modellen voor MTX-voorbehandeling via orale gavage¹³.

Methanol (≥99.8% zuiverheid) werd op de dag van toediening vers bereid als een 20% (v/v) waterige werkoplossing door verdunning met steriel gedestilleerd water. De werkoplossing werd bereid door 1 volume methanol te mengen met 4 volumes steriel gedestilleerd water. In overeenstemming met eerder beschreven methotrexaat-voorbehandelde ratmodellen van methanolintoxicatie werd op studiedag 8 een enkele dosis methanol van 3 g/kg toegediend aan Groepen 3–5 via orale gavage. Voorafgaand aan de toediening van methanol werden geen beperkingen opgelegd wat betreft voedsel of water. Het benodigde toedieningsvolume werd individueel berekend op basis van het lichaamsgewicht van elk dier en bedroeg ongeveer 18.9 mL/kg voor de 20% methanoloplossing. Voor een rat met een gewicht van ongeveer 220 g kwam deze dosis overeen met 0.66 g methanol en een definitief gavagevolume van ongeveer 4.2 mL. Dit schema voor methanolblootstelling is gekozen om de vergelijkbaarheid te behouden met eerder gepubliceerde methotrexaat-voorbehandelde ratmodellen van acute methanoltoxiciteit^13,14,15.

De werkoplossing van fomepizool werd bereid in een steriele 0,9% natriumchloride-oplossing met een eindconcentratie van 10 mg/mL. Een intraperitonele laaddosis van 15 mg/kg werd 4 u na de toediening van methanol toegediend, gevolgd door intraperitonele onderhoudsdoses van 10 mg/kg na 12, 24 en 36 u. Bij de werkconcentratie van 10 mg/mL waren de toedieningsvolumes 1,5 mL/kg voor de laaddosis en 1,0 mL/kg voor elke onderhoudsdosis. Voor een rat met een lichaamsgewicht bij aanvang van de studie van ongeveer 220 g kwamen deze doses overeen met ongeveer 0,33 mL voor de laaddosis en 0,22 mL voor elke onderhoudsdosis. Alle toedieningsvolumes werden berekend op basis van het lichaamsgewicht dat bij aanvang van de studie was geregistreerd. De laad- en onderhoudsdoses van fomepizool werden gekozen met referentie naar vastgestelde behandelingsaanbevelingen voor methanolvergiftiging^1,6.

Ethanol werd gebruikt als antidotale vergelijkingsbehandeling. Absolute ethanol (≥99.8% zuiverheid) werd verdund met steriel gedestilleerd water door 1 volume absolute ethanol te mengen met 4 volumes steriel gedestilleerd water om een uiteindelijke 20% (v/v) waterige werkoplossing te verkrijgen. Een enkele dosis ethanol werd toegediend via orale gavage in een dosering van 0.5 g/kg, 4 u na de toediening van methanol; er werden geen onderhoudsdoses ethanol toegediend. Het toedieningsvolume was ongeveer 3.2 mL/kg. Voor een rat met een lichaamsgewicht bij aanvang van de studie van ongeveer 220 g kwam dit overeen met een uiteindelijke gavage-volume van ongeveer 0.70 mL. Het toedieningsvolume werd berekend op basis van het lichaamsgewicht dat bij aanvang van de studie was vastgesteld. De ethanolconcentratie, dosis, toedieningsroute en het tijdstip van toediening werden gekozen op basis van eerder gepubliceerde, met methotrexaat voorbehandelde ratmodellen waarin ethanol als antidotale comparator werd gebruikt^13,14.

Alle oplossingen werden vers bereid op de dag van toediening en gecontroleerd op een homogeen uiterlijk en de afwezigheid van zichtbare deeltjes. Orale toedieningen werden uitgevoerd met een gavagecannule van roestvrij staal. Tijdens de gavage werd de cannulet zorgvuldig vanuit de mondholte in de slokdarm geschoven, waarbij regurgitatie, lekken via de mond, aspiratie en ademnood werden voorkomen. Intraperitoneale injecties werden onder aseptische omstandigheden uitgevoerd met steriele wegwerpspuiten en naalden. Alle procedures met betrekking tot de bereiding en toediening van chemicaliën werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele laboratoriumveiligheidsvoorschriften.

Proefdieren, huisvestingsomstandigheden en randomisatie
In totaal werden 30 volwassen mannelijke Wistar albino ratten, in de leeftijd van 8–12 weken en met een gewicht van 220 ± 20 g, verkregen van het Experimental Animal Research Laboratory van de Ahi Evran University, Kırşehir, Türkiye. Wistar ratten werden geselecteerd omdat zij veelvuldig zijn gebruikt in experimentele toxiciteits- en nefroprotectiestudies, wat vergelijking met eerder gepubliceerde studies mogelijk maakte. De dieren werden gehuisvest bij 24 ± 2 °C onder een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur. Gedurende de experimentele periode van 10 dagen kregen zij ad libitum standaard pelletvoer en kraanwater. Voorafgaand aan de experimentele procedures ondergingen alle dieren een acclimatisatieperiode van 7 dagen.

Dertig ratten werden verdeeld over vijf experimentele groepen met behulp van een computergestuurde randomisatieprocedure, met een doel van zes dieren per groep. Voor elke rat werd een willekeurig geheel getal tussen 1 en 5 gegenereerd, waarna het dier aan de overeenkomstige experimentele groep werd toegewezen. Zodra een groep zes dieren bevatte, werd elke daaropvolgende trekking voor die groep verworpen en werd er een nieuw willekeurig getal gegenereerd totdat een groep met een beschikbare plek was geselecteerd. Deze procedure werd voortgezet totdat alle 30 ratten waren toegewezen, wat resulteerde in 6 dieren per groep. Dezelfde onderzoeker genereerde de willekeurige toewijzingen en voerde de allocatie uit; er werd geen aparte operator voor de allocatie gebruikt. Groep 1 (Controle) ontving geen experimentele medicamenteuze behandeling, en de dieren ondergingen dezelfde geplande bemonstering aan het eindpunt als de andere groepen. Groep 2 (MTX) ontving methotrexate via orale gavage in een dosis van 0.3 mg/kg gedurende 7 dagen. Groep 3 (MTX + Methanol) ontving methotrexate gedurende 7 dagen, gevolgd door methanol in een dosis van 3 g/kg op studiedag 8. Groep 4 (MTX + Methanol + Fomepizole) ontving een voorbehandeling met methotrexate gevolgd door methanol, waarbij de behandeling met 4-methylpyrazole 4 h later werd gestart. Groep 5 (MTX + Methanol + Ethanol) ontving een voorbehandeling met methotrexate gevolgd door methanol, waarbij ethanol 4 h later werd toegediend.

Alle drie de met methanol blootgestelde groepen kregen hetzelfde MTX-voorbehandelings- en methanoltoedieningsprotocol en verschilden uitsluitend wat betreft de antidotbehandeling na blootstelling. De toewijzing van de experimentele groepen, het toedieningsprotocol, het tijdstip van de antidotbehandeling en het proces van monstername zijn samengevat in Figuur 1. Er werd een a priori poweranalyse uitgevoerd voor een one-way ANOVA met vaste effecten voor vijf onafhankelijke groepen. Uitgaande van een grote gestandaardiseerde effectgrootte (Cohen’s f = 0.70), een significantieniveau van 0.05 en een statistische power van 80%, werd de minimaal vereiste totale steekproefomvang berekend op 30 dieren, wat overeenkomt met zes dieren per groep. De berekende power voor een totale steekproefomvang van 30 was ongeveer 80.9%. De aangenomen effectgrootte (Cohen’s f = 0.70) werd vóór het experiment vastgesteld op basis van de verwachting van de onderzoekers van een groot algemeen effect tussen de groepen in dit acute toxiciteitsmodel. Deze aanname was gebaseerd op het oordeel van de onderzoeker en niet op een schatting afgeleid van pilotdata of een specifieke eerdere studie. Er is voor deze studie prospectief geen enkele primaire uitkomst aangewezen; de berekening van de steekproefomvang was gebaseerd op een aangenomen groot algemeen effect in een omnibusvergelijking tussen de vijf experimentele groepen. Een primaire uitkomst kan niet retrospectief worden aangewezen als een prospectief gespecificeerd eindpunt. Bijgevolg biedt de berekening van de steekproefomvang geen adequate power voor elke individuele uitkomst of voor paarsgewijze vergelijkingen.

Protocol voor methanolintoxicatie en antidotische behandeling
Na de acclimatisatieperiode kregen de dieren in Groepen 2–5 gedurende 7 opeenvolgende dagen (studiedagen 1–7) eenmaal daags methotrexate. Op studiedag 8 kregen de dieren in Groepen 3–5 een eenmalige dosis van 20% methanoloplossing (3 g/kg) via orale gavage. Voorafgaand aan de toediening van methanol werden geen vastenperiodes of andere beperkingen in voeding of water opgelegd.

In de MTX + Methanol + Fomepizol-groep werd 4 u na toediening van methanol een intraperitonele laaddosis van 15 mg/kg toegediend, gevolgd door intraperitonele onderhoudsdoses van 10 mg/kg op 12, 24 en 36 u na toediening van methanol. In de MTX + Methanol + Ethanol-groep werd 4 u na toediening van methanol een enkele dosis ethanol van 0,5 g/kg toegediend via orale gavage; er werden geen onderhoudsdoses ethanol toegediend. De twee antidota-regimes werden gekozen om de vastgestelde doseringsaanbevelingen voor fomepizol en eerder gepubliceerde comparatorprotocollen voor ethanol te weerspiegelen^1,6,13,14. De regimes waren niet ontworpen om een behandeling te bieden die was afgestemd op dosis, toedieningsweg of blootstelling. Daarom vormden het herhaalde intraperitonele fomepizol-regime en de enkele orale ethanol-dosis een ongelijke farmacologische vergelijking. Succesvolle toediening via gavage werd bevestigd door de afwezigheid van regurgitatie, oraal lekken of respiratoire nood tijdens de procedure. Succesvolle intraperitonele toediening werd bevestigd door de afwezigheid van lekkage, bloedingen of duidelijke zwelling op de injectieplaats.

Na toediening werden de dieren regelmatig gecontroleerd op algemene gezondheidstoestand, mobiliteit, voedselinname, houding, uiterlijk van de vacht en tekenen van toxiciteit. Het behandelingsschema was zo ontworpen dat de vorming van toxische metabolieten uit methanol kon worden geïnitieerd, terwijl de beschermende en therapeutische effecten van de antidota konden worden geëvalueerd.

Euthanasie, humane eindpunten en monstername
Gedurende het gehele experiment werden alle dieren dagelijks geëvalueerd op algemene gezondheidstoestand, voedsel- en waterinname, mobiliteit en gedragsveranderingen. Humane eindpuntcriteria waren vooraf gedefinieerd als uitgesproken lethargie, onvermogen om voedsel of water te consumeren, ernstig gewichtsverlies, beperkte mobiliteit, abnormale houding, aanhoudende piloerectie of duidelijke tekenen van distress. Voor dieren die aan een van deze criteria voldeden, was humane euthanasie gepland. Er was echter geen enkel dier dat tijdens de studie de vooraf gedefinieerde humane eindpuntcriteria bereikte.

Alle dieren in de vijf experimentele groepen werden op studiedag 10 geëuthanaseerd. Voor de groepen MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole en MTX + Methanol + Ethanol kwam dit eindpunt overeen met 48 u na de enkele toediening van methanol op studiedag 8. De controlegroep bleef onbehandeld tot studiedag 10, terwijl de MTX-alleengroep werd gemonitord tot studiedag 10 na voltooiing van het 7-daagse MTX-toedieningsprotocol. Zo hadden alle vijf de groepen dezelfde totale studieduur en werden ze op dezelfde studiedag geëuthanaseerd voor monstername.

Ketamine en xylazine werden gebruikt om diepe anesthesie op te wekken. De diepte van de anesthesie werd bevestigd door het wegvallen van de pedale terugtrekreflex. Nadat diepe anesthesie was bereikt, werden bloedmonsters afgenomen via intracardiale punctie. Met een geschikte spuit en naald werd ongeveer 3–5 mL bloed verkregen. Bloed dat was afgenomen voor de meting van serumureum- en creatinineconcentraties, serum-SOD-activiteit en serum-MDA-concentratie werd overgebracht naar buisjes zonder antistollingsmiddel en liet men volledig stollen. Bloed bedoeld voor de meting van het GSH-gehalte en de CAT-activiteit werd apart verzameld in buisjes met ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) en werd verwerkt zonder stollingsstap. Na volledige stolling werden de serummonsters gecentrifugeerd bij 3.000 × g gedurende 10–15 min bij 4 °C. Het gescheiden serum werd bewaard bij −80 °C tot aan de analyse. Succesvolle serumscheiding werd bevestigd door een helder, niet-gehemolyseerd uiterlijk. Na de bloedafname werd de euthanasie voltooid door exsanguinatie onder diepe anesthesie. Vervolgens werd een mediane laparotomie uitgevoerd en werden beide nieren voorzichtig verwijderd. Nadat het omringende vet en bindweefsel waren verwijderd, werden de nieren gespoeld met koude fysiologische zoutoplossing. Weefselmonsters werden verdeeld voor histopathologische en biochemische analyses. Monsters bestemd voor histopathologisch onderzoek werden geplaatst in 10% neutraal gebufferd formaldehyde. Monsters bestemd voor biochemische analyses werden op de juiste wijze gelabeld en bewaard bij −80 °C.

Monsterverzameling, biochemische analyses en uitkomstbeoordelingen werden uitgevoerd door onderzoekers die niet op de hoogte waren van de experimentele groepen. Geen enkele dier werd uitgesloten van de analyses.

Biochemische analyses
De serumureumconcentratie werd gemeten met een enzymatische urease-glutamaatdehydrogenase kinetische assay op een geautomatiseerde biochemische analyzer. Ureum werd gehydrolyseerd door urease om ammoniak te produceren, dat vervolgens reageerde met 2-oxoglutaraat en gereduceerd nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) in aanwezigheid van glutamaatdehydrogenase. De afname in absorbentie als gevolg van NADH-consumptie werd kinetisch gemeten. De serumcreatinineconcentratie werd colorimetrisch gemeten met dezelfde geautomatiseerde biochemische analyzer.

De serumsuperoxide dismutase (SOD)-activiteit werd bepaald met een colorimetrische assay gebaseerd op de generatie van superoxide radicalen door het xanthine-xanthine oxidase-systeem en de reactie daarvan met 2-(4-jodofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyltetrazoliumchloride tot een gekleurd formazan-product. De eindpuntabsorbantie werd gemeten bij 505 nm. De serummalondialdehyde (MDA)-concentratie werd bepaald met de thiobarbituurzuurreactie. Serummonsters werden gemengd met koud trichloorazijnzuur om eiwitten te precipiteren en gecentrifugeerd bij 7.500 × g gedurende 5 min bij 4 °C. De resulterende supernatant werd gemengd met een gelijk volume thiobarbituurzuur en geïncubeerd bij 90 °C gedurende 60 min. De reactiebuisjes werden vervolgens 10 min afgekoeld in een koudwaterbad, waarna de absorbantie werd gemeten bij 532 nm. MDA-concentraties werden berekend aan de hand van de overeenkomstige kalibratiecurve. Gereduceerd glutathion (GSH) werd gemeten in EDTA-anticoagulatiebloed met behulp van een gemodificeerde Ellman-methode. Na eiwitprecipitatie met trichloorazijnzuur werden de gedeproteïniseerde monsters gereageerd met 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzeenzuur) in 500 mM Tris-buffer bij pH 8,2, waarna de absorbantie werd gemeten bij 412 nm. Catalase (CAT)-activiteit werd gemeten in EDTA-anticoagulatiebloed met een twee-staps colorimetrische assay. Monsters werden geïncubeerd met een bekende hoeveelheid waterstofperoxide, en nadat de enzymatische reactie werd gestopt, werd het resterende waterstofperoxide gemeten met een chromogeen reagens bij 405 nm.

Omdat de SOD-activiteit en MDA-concentratie in serum werden gemeten, en het GSH-gehalte en de CAT-activiteit in met EDTA anticoagulerend behandeld bloed in plaats van in kidney tissue homogenaten, was normalisatie van deze redox-gerelateerde parameters naar de totale eiwitconcentratie van het weefsel niet van toepassing. Voor de interpretatie van het redox-gerelateerde biomarkerprofiel werden hogere serum-MDA-concentraties beschouwd als consistent met een grotere lipideperoxidatie, terwijl een lagere serum-SOD-activiteit, lagere bloed-GSH-gehaltes en een lagere bloed-CAT-activiteit werden beschouwd als indicatief voor een verminderde antioxidantcapaciteit; veranderingen in de tegenovergestelde richting werden geïnterpreteerd als een gunstiger redox-gerelateerd profiel.

Voor enzym-gelinkte immunosorbent-assays (ELISA) van nierweefsel werd ongeveer 50 mg nierweefsel, bewaard bij −80 °C, op ijs gehomogeniseerd in 500 µL homogenisatiebuffer met een protease-remmercocktail, wat overeenkomt met een vaste weefsel-bufferverhouding van 1:10 (w/v). Voor elke rat werd één dierspecifiek nierweefselhomogenaat bereid. Monsters van verschillende dieren werden onafhankelijk verwerkt en in geen enkele fase samengevoegd. De homogenaten werden gecentrifugeerd bij 14,000 × g gedurende 10 min bij 4 °C, waarna het supernatant van elk dier afzonderlijk werd verzameld en verdeeld in aliquots voor de geplande nierweefselanalyses. De totale eiwitconcentratie werd niet afzonderlijk gemeten; daarom werden de ELISA-resultaten van het weefsel hierniet op genormaliseerd. De uiteindelijke concentraties, berekend op basis van de overeenkomstige assay-specifieke standaardcurves, werden uitgedrukt in ng/L voor TNF-α en IL-6 en in ng/mL voor IL-1β, KIM-1 en cystatine C.

Nierbeschadigingsmolecuul-1 (KIM-1) en cystatine C werden geëvalueerd als biomarkers voor nierschade, terwijl tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-6 (IL-6) en interleukine-1β (IL-1β) werden geëvalueerd als renale inflammatoire markers. Alle vijf de analyten werden gemeten in homogenaten van nierweefsel met behulp van rat-specifieke ELISA-kits volgens de protocollen van de fabrikanten. Voor de respectievelijke assays waren de analytische sensitiviteiten en meetbereiken 2,51 ng/L en 5–1.000 ng/L voor TNF-α, 0,052 ng/L en 0,1–40 ng/L voor IL-6, 0,08 ng/mL en 0,2–60 ng/mL voor IL-1β, 0,01 ng/mL en 0,05–10 ng/mL voor KIM-1, en 0,25 ng/mL en 0,5–100 ng/mL voor cystatine C. Voorafgaand aan de analyse werden alle reagentia, standaarden en supernatanten van het nierweefsel op kamertemperatuur gebracht. Standaardcurves werden afzonderlijk gegenereerd voor elke assay-run volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Standaarden en supernatanten van het nierweefsel werden toegevoegd aan met antilichamen geprecoatte wells, gevolgd door het corresponderende gebiotinyleerde detectie-antilichaam en streptavidine-mierikwortelperoxidase-conjugaat. Monsters en ELISA-reagentia werden 1 h geïncubeerd bij 37 °C. Na vijf wascycli met een automatische microplate-wasser werden substraatoplossingen A en B toegevoegd en 10 min geïncubeerd bij 37 °C. De kleurreactie werd beëindigd met een zure stopoplossing en de absorbentie werd gemeten bij 450 nm. Voor elke analyt werden blanco-gecorrigeerde absorbentiewaarden omgezet in concentraties met behulp van de corresponderende assay-specifieke standaardcurve.

Alle biochemische analyses werden uitgevoerd onder gestandaardiseerde omstandigheden en alle monsters werden verwerkt met dezelfde procedures. ELISA-metingen in nierweefsel werden in dubbeltoevoeging uitgevoerd. Voor elke analyt werd het gemiddelde van de twee technische replica-wells berekend om één waarde op dierniveau te verkrijgen. Technische replica-wells en afzonderlijke aliquots verkregen uit hetzelfde dierspecifieke homogenaat werden niet beschouwd als onafhankelijke waarnemingen. Het individuele dier werd beschouwd als de experimentele eenheid, en één resultaat op dierniveau voor elke parameter werd opgenomen in de statistische analyse.

Histopathologische verwerking en scoren van nierbeschadiging
Weefselmonsters werden verwerkt voor microscopische evaluatie met behulp van standaard histopathologische procedures. Nierweefsels werden gefixeerd in 10% neutraal gebufferd formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 72 h. Na fixatie werden de weefsels gedehydrateerd via graduele ethanolconcentraties van 50%, 70%, 80%, 96% en 100%, waarbij elke concentratie 1 h werd aangehouden. Vervolgens werden de weefsels ontkleurd met een tweestaps xyleenprocedure en ingebed in paraffineblokken. Sneden van 5 µm dik werden uit de paraffineblokken verkregen met een rotatiemicrotoom.

Voor hematoxylin- en eosinekleuring werden de coupes gedeparaffineerd en gehydrateerd, 5 min gekleurd met hematoxylin en 5 min afgespoeld onder stromend kraanwater. De differentiatie werd uitgevoerd met zuuralcohol, waarna de coupes 1 min in ammoniakwater werden bewaard. De coupes werden vervolgens 2 min tegengekleurd met eosine. Daarna werden de coupes gedehydrateerd via een oplopende alcoholreeks, geklaard in xyleen en gemonteerd met een geschikt montage medium.

Voor de Masson-trichroomkleuring werden de coupes gedeparaffineerd en gehydrateerd, vervolgens 60 min geïncubeerd in een beitsoplossing bij 56 °C en 10 min afgespoeld onder stromend water. De coupes werden daarna sequentieel behandeld met Weigert-ijzerhematoxyline gedurende 10 min, Biebrich-karmijn-zuurfuchsine gedurende 15 min, fosforwolfraamzuur gedurende 10 min en anilineblauw gedurende 10 min. Tot slot werden de coupes 5 min in 1% azijnzuur bewaard, gedehydrateerd, geklaard in xyleen en gemonteerd.

Succesvolle kleuring werd bevestigd door een duidelijke kernkleuring, behoud van cytoplasmatisch contrast, behoud van de renale architectuur en een duidelijke visualisatie van bindweefselstructuren. Alle gekleurde coupes werden geëvalueerd onder gestandaardiseerde omstandigheden met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust met een digitaal beeldvormingssysteem.

Histopathologische evaluaties werden uitgevoerd door een enkele ervaren patholoog die niet op de hoogte was van de experimentele groepen. De histopathologische scoring werd uitgevoerd bij een vergroting van 200×. Voor elk dier en elke histopathologische parameter werden 10 willekeurig geselecteerde microscopische velden onderzocht. Het veld dat de meest ernstige afwijking vertoonde voor de geëvalueerde parameter werd gebruikt om de enkele gehele score van het dier toe te kennen op de schaal van 0–4. Tubulaire schade werd geëvalueerd op basis van tubulaire dilatatie, ophoping van eiwitrijk materiaal in het tubulaire lumen, degeneratie van het tubulaire epitheel en tubulaire necrose. Glomerulaire schade werd geëvalueerd op basis van glomerulaire degeneratie of atrofie, vergroting van de ruimte van Bowman en vasculaire congestie. Interstitiële schade werd geëvalueerd op basis van interstitiële ontsteking en fibrose. Voor de histopathologische evaluatie werden niersneden van 5 µm dik gebruikt, gekleurd met hematoxyline en eosine en Masson's trichroom, afkomstig van elk dier. Representatieve fotomicrografieën werden verkregen bij een vergroting van 200×, met schaalbalken die 100 µm vertegenwoordigen. Het aantal afzonderlijke histologische coupes dat per dier is onderzocht, kon niet uit de studieregistraties worden herleid en kan daarom niet worden gerapporteerd.

De resultaten van de Masson-trichroomkleuring werden histomorfologisch geïnterpreteerd, waarbij rekening werd gehouden met de lokalisatie en het morfologische patroon van de collageenafzetting in plaats van enkel de intensiteit van de blauwe kleuring. De semikwantitatieve score voor interstitiële fibrose was gebaseerd op deze histomorfologische beoordeling; het percentage collageen-positief gebied werd niet gekwantificeerd. De histopathologische scoring werd semikwantitatief uitgevoerd met behulp van eerder beschreven criteria voor de beoordeling van nierschade^16,17. Voor elke histopathologische parameter kreeg elk dier een gehele score toegewezen op een schaal van 0–4, waarbij 0 = afwezig, 1 = minimaal, 2 = mild, 3 = matig en 4 = ernstig. De graderingscategorieën vormden de globale beoordeling van de geblindeerde patholoog met betrekking tot de morfologische ernst van elke laesie, in plaats van een continue morfometrische meting.

Veiligheidsvoorschriften en afvalbeheer
Er werd gebruikgemaakt van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met methanol, formaldehyde, xyleen, biologische monsters en dierweefsels. Er werden laboratoriumjassen, handschoenen en oogbescherming gedragen. Vanwege de systemische toxiciteit en vluchtigheid van methanol werden alle procedures met voorzichtigheid uitgevoerd. Procedures met formaldehyde en xyleen werden indien mogelijk uitgevoerd in een chemische zuurkast. Scherpe voorwerpen werden verzameld in geschikte containers voor naaldafval. Chemisch afval en biologische materialen werden afgevoerd in overeenstemming met de institutionele procedures voor bioveiligheid en het beheer van gevaarlijk afval.

Statistische analyse
Continue biochemische variabelen, biomarkers voor nierbeschadiging, inflammatoire variabelen, niersfunctievariabelen en redox-gerelateerde variabelen werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). De normaliteit van de datadistributie werd beoordeeld met de Shapiro–Wilk-toets en de homogeniteit van de varianties werd geëvalueerd met de toets van Levene. Tussen-groepsvergelijkingen voor biochemische uitkomsten werden uitgevoerd met behulp van eenweg-variantieanalyse (ANOVA). Controles op aannames identificeerden afwijkingen van de normaliteit in één groep voor serumcreatinine en variantie-heterogeniteit voor verschillende biochemische uitkomsten. De oorspronkelijke ANOVA-benadering is behouden; deze afwijkingen kunnen echter de betrouwbaarheid van de resulterende p-waarden hebben beïnvloed, waardoor de bevindingen met voorzichtigheid zijn geïnterpreteerd.

Wanneer ANOVA een statistisch significant verschil detecteerde, werden paarsgewijze vergelijkingen tussen groepen uitgevoerd met de post hoc meervoudige vergelijkingstest van Duncan. Waarden met dezelfde superscriptletter binnen elke rij vertoonden geen significant verschil volgens de post hoc test van Duncan. Er is geen aanvullende correctie voor meervoudig testen toegepast over de biochemische resultaten. De procedure van Duncan bood geen strikte controle over de family-wise type I-foutmarge, en het testen van meerdere resultaten verhoogde het risico op fout-positieve bevindingen verder. Daarom werden individuele significante vergelijkingen voorzichtig geïnterpreteerd.

De totale effectgroottes voor biochemische uitkomsten werden geschat met behulp van eta-kwadraat (η²), berekend als (F × df_between)/(F × df_between + df_error), met df_between = 4 en df_error = 25. Tweezijdige 95% betrouwbaarheidsintervallen werden berekend door de niet-centrale F-verdeling om te keren en de niet-centraliteitslimieten (λ) te transformeren met λ/(λ + N), waarbij N = 30. Deze aanvullende berekeningen werden uitgevoerd in een wetenschappelijke computeromgeving. De schattingen zijn afgeleid van de afgeronde F-statistieken uit de primaire statistische analyse en zijn daarom benaderingen. De betrouwbaarheidsintervallen waren gebaseerd op de aannames van normaliteit en gelijke variantie van het ANOVA-model en zijn niet gecorrigeerd voor meerdere uitkomsten.

Histopathologische scores waren ordinale, semikwantitatieve observaties, die beschrijvend werden samengevat als gemiddelde ± SD om de gemiddelde laesielast op groepniveau en de variabiliteit tussen dieren aan te tonen. Er werden geen inferentiële hypothesetesten of post hoc paarsgewijze vergelijkingen uitgevoerd voor de histopathologische scores. Daarom werden ANOVA, de post hoc test van Duncan en de rapportage van p-waarden alleen toegepast op biochemische resultaten, biomarkers voor nierbeschadiging, inflammatoire resultaten, nierfunctieresultaten en redox-gerelateerde resultaten. Een p-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Alle 30 dieren werden in de analyses opgenomen, met zes dieren in elk van de vijf experimentele groepen. Alle dieren in de vijf groepen werden geëuthanaseerd en bemonsterd op studiedag 10. Voor de drie met methanol behandelde groepen kwam dit eindpunt overeen met 48 uur na toediening van methanol. Daarom waren de totale studieduur en het tijdstip van monsterafname consistent voor alle experimentele groepen. Nierschade en inflammatoire biomerkers, nierfunctie en redox-gerelateerde parameters, en histopathologische bevindingen werden geëvalueerd zoals hieronder beschreven.

Biochemische bevindingen: nierletsel en inflammatoire biomerkers
De bevindingen voor nierletsel en inflammatoire biomerkers gemeten in homogenaten van nierweefsel worden gepresenteerd in Tabel 1Eenweg-ANOVA wees significante algemene verschillen aan tussen de vijf groepen wat betreft cystatine C [F(4,25) = 5,329, p = 0,003], IL-6 [F(4,25) = 3,907, p = 0,013], KIM-1 [F(4,25) = 3,673, p = 0,017], TNF-α [F(4,25) = 7,660, p < 0,001] en IL-1β [F(4,25) = 11,584, p < 0,001]. A posteriori groepvergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van Duncan’s meervoudige bereiktest, met groepsindeling aangegeven door bovenstaande letters in Tabel 1. De concentraties van cystatine C, IL-6 en KIM-1 in het nierweefselhomogenaat waren het hoogst in de MTX + Methanol-groep, terwijl er voor deze variabelen geen significante verschillen werden waargenomen tussen de controlegroep, de alleen-MTX-groep, de MTX + Methanol + Fomepizole-groep en de MTX + Methanol + Ethanol-groep. Concentraties van TNF-α in het nierweefselhomogenaatα en IL-1β waren ook het hoogst in de MTX + Methanolgroep. De alleen-MTX-groep vertoonde hogere niveaus van TNF-α en IL-1β in nierweefselhomogenaten dan de controlegroep, terwijl de groepen die een tegengif kregen, intermediaire waarden vertoonden (Tabel 1).

Renale functie en redox-gerelateerde parameters
Serumindices van nierfunctie en uit bloed afgeleide redox-gerelateerde parameters werden gepresenteerd in Tabel 2Eenweg-ANOVA toonde significante algemene verschillen tussen de vijf groepen in serumureum [F(4,25) = 3,694, p = 0,017], serumcreatinine [F(4,25) = 12,988, p < 0,001], serum SOD-activiteit [F(4,25) = 11,621, p < 0,001], bloed GSH-niveau [F(4,25) = 10,164, p < 0,001], bloed CAT-activiteit [F(4,25) = 10,631, p < 0,001] en serum MDA-concentratie [F(4,25) = 8,814, p < 0,001]. Post hoc groepsvergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van Duncan’s meervoudige bereiktest, met groepsindeling aangegeven door bovenstaande letters in Tabel 2.

De concentraties serum ureum, serum creatinine en serum MDA waren het hoogst in de MTX + methanolgroep. De concentraties serum ureum en serum MDA verschilden niet significant tussen de controlegroep, de MTX-alleen-groep, de MTX + methanol + fomepizolgroep en de MTX + methanol + ethanolgroep, terwijl de serumcreatinineconcentratie het laagst was in de controlegroep (Tabel 2).

De MTX + Methanol-groep vertoonde ook de laagste serum-SOD-activiteit, bloed-GSH-spiegel en bloed-CAT-activiteit. In vergelijking met de MTX + Methanol-groep toonde de met fomepizole behandelde groep significant hogere serum-SOD- en bloed-CAT-activiteiten, terwijl de overeenkomstige toenames in de met ethanol behandelde groep statistisch niet significant waren. De bloed-GSH-spiegels verschilden niet significant tussen de alleen-MTX-, MTX + Methanol- en de twee met antidotum behandelde groepen.Tabel 2).

In vergelijking met de controlegroep vertoonde de alleen-MTX-groep hogere niveaus van TNF-α in het nierweefselhomogenaatα en IL-1β en lagere serum-SOD-activiteit, bloed-GSH-niveau en bloed-CAT-activiteit, maar vertoonden geen significante verschillen in de niveaus van cystatine C, IL-6 of KIM-1 in nierweefselhomogenaat, noch in serum ureum, serum creatinine of serum MDA-concentratie.

Histopathologische bevindingen en nierletscoren
De resultaten van de histopathologische evaluatie van nierweefsels werden gepresenteerd in Tabel 3. Beschrijvende variatie tussen de groepen werd waargenomen in tubulaire dilatatie, ophoping van eiwitachtig materiaal, tubulaire epitheliale degeneratie, tubulaire necrose, glomerulaire degeneratie, vergroting van Bowman’s ruimte, vasculaire congestie, interstitiële ontsteking en interstitiële fibrose.

In de controlegroep bleef de nierweefsels structuur normaal met geen duidelijke pathologische veranderingen in de glomerulaire of tubulaire structuren. In de MTX-groep werden lichte tubulaire degeneratie, vaatcongestie en interstitiële ontsteking waargenomen.

De MTX + Methanol-groep vertoonde de hoogste geobserveerde letselscores voor de beoordeelde tubulaire, glomerulaire, vasculaire en interstitiële parameters. Beide met tegengif behandelde groepen vertoonden beschrijvend lagere geobserveerde scores dan de MTX + Methanol-groep. In beschrijvende vergelijkingen toonde de met fomepizole behandelde groep lagere geobserveerde scores dan de met ethanol behandelde groep voor de meeste parameters, met name tubulaire dilatatie, tubulaire necrose, glomerulaire degeneratie en vergroting van Bowman’s ruimte, vasculaire congestie en interstitiële fibrose (Tabel 3). Deze vergelijkingen waren beschrijvend, en er zijn geen inferentiële statistische toetsen uitgevoerd op de histopathologische scores. Vertegenwoordigende renale histopathologische afbeeldingen, verkregen met hematoxyline en eosine en Masson’s trichroomkleuring zijn weergegeven in Figuur 2.

Over het geheel genomen vertoonde de groep MTX + Methanol de hoogste waarden voor nierbeschadiging en inflammatoire biomerkers, de minst gunstige nierfunctie en redoxprofielen, en de hoogste histopathologische beschadigingsscores. Beide met tegengif behandelde groepen vertoonden gunstigere nieruitkomstpatronen dan de groep MTX + Methanol, waarbij de met fomepizole behandelde groep een consistent gunstiger patroon liet zien over de geëvalueerde domeinen heen. De groep met alleen MTX vertoonde eveneens veranderingen in geselecteerde inflammatoire en redox-gerelateerde parameters in vergelijking met de controlegroep.

GEGEVENSBESCHIKBAARHEID:
De op dierenniveau verkregen ruwe gegevens die de biochemische, nierbeschadigingsbiomerkers, inflammatoire, nierfunctie- en redox-gerelateerde analyses ondersteunen, zijn verstrekt in Aanvullend bestand 1.

Figuur 1: Experimenteel ontwerp en behandelingsschema. Schematische weergave van het experimentele rattenmodel van methanolintoxicatie. Volwassen mannelijke Wistar-albino-ratten werden ingedeeld in vijf groepen: Controle, methotrexaat (MTX) alleen, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, en MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/groep). Standaard pelletvoer en kraantjeswater waren gedurende de tien dagen durende studie ad libitum beschikbaar, en er werden geen vastenperioden of andere beperkingen op voedsel- of waterinname opgelegd, noch vóór noch na de toediening van methanol. De controlegroep kreeg geen experimentele behandeling. Dieren in groep 2–5 kregen MTX per orale sonde toegediend in een dosis van 0,3 mg/kg eenmaal daags gedurende zeven opeenvolgende dagen (studiedagen 1–7). Dieren in groepen 3–5 kregen op studiedag 8 een enkele dosis methanol van 3 g/kg via orale sonde. In de groep MTX + Methanol + Fomepizol werd 4 uur na toediening van methanol een intraperitoneale initiële dosis fomepizol van 15 mg/kg toegediend, gevolgd door onderhoudsdoses van 10 mg/kg op 12, 24 en 36 uur. In de groep MTX + Methanol + Ethanol kreeg ethanol 4 uur na toediening van methanol als een enkele dosis van 0,5 g/kg via orale sonde toegediend. Alle dieren werden op studiedag 10 geëuthanaseerd. Voor Groepen 3–5, wat overeenkwam met 48 uur na methanoltoediening. Bloed- en niermonsters werden verzameld voor analyses van nierfunctie, biomarkers voor nierletsels, inflammatoire cytokinen, redox-gerelateerde biomarkers en nierhistopathologie. Afkortingen: MTX = methotrexate. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2Representatieve histopathologische bevindingen in nierweefsel van experimentele groepen. Vertegenwoordigende niersneden van de groepen Controle, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole en MTX + Methanol + Ethanol worden getoond. De bovenste rij toont hematoxyline en eosine (H&E)&E) kleuring, terwijl de onderste rij Masson’s trichroomkleuring. De controle groep vertoonde behouden nierarchitectuur met normale glomerulaire en tubulaire morfologie. De blauw gekleurde collageen die werd waargenomen in de glomerulaire en tubulaire basismembranen, vaatwanden en interstitiële bindweefsel van de controlegroep werd beschouwd als fysiologisch collageen in plaats van bewijs van pathologische fibrose. De MTX-groep toonde milde tubulaire degeneratie, vaatcongestie en inflammatoire veranderingen. De MTX + Methanol-groep vertoonde uitgesproken nierbeschadiging, gekenmerkt door tubulaire degeneratie (*), vaatcongestie (+), verbreding van de Bowman’s ruimte (x), tubulaire necrose (↑), interstitiële ontsteking (↕) en periglomerulaire collageenophoping in overeenstemming met een histomorfologische fibrotische verandering (‡), zoals waargenomen in de Masson’s trichroom-gekleurde snede. De groep die behandeld was met Fomepizole toonde lagere histopathologische letselscores dan de MTX + Methanol-groep, met relatief behouden tubulaire en glomerulaire structuren en minder uitgebreide necrose, ontsteking, vasculaire congestie en collageen-geassocieerde veranderingen. De groep die behandeld was met Ethanol toonde eveneens lagere histopathologische letselscores dan de MTX + Methanol-groep; echter waren residuerende tubulaire, glomerulaire en vasculaire afwijkingen duidelijker zichtbaar dan in de Fomepizole-behandelde groep. Fotomicroscopische opnamen werden verkregen bij 200× vergroting, en schaalbalken geven 100 µm. Masson’S’trichroomkleuring werd beoordeeld als aanvullend histomorfologisch bewijs; verschillen in intensiteit van de blauwe kleuring tussen de panelen werden niet gebruikt als kwantitatieve maat voor vergelijking van fibrose tussen groepen. Symbolen: * tubulaire degeneratie; + vasculaire congestie; x verbreding van Bowman’s ruimte; ↑ tubulaire necrose; ↕ interstitiële ontsteking; ‡ periglomerulaire collageenophoping in overeenstemming met een histomorfologische fibrotische verandering. MTX, methotrexaat. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Variabele	Controle (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Methanol (n = 6)	MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6)	MTX + Methanol + Ethanol (n = 6)	p	η² (95% BI)
Cystatine C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Tabel 1: Nierletsels- en inflammatoire biomerkers in experimentele groepen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), met zes dieren per groep. Alle biomerkers werden gemeten in homogenaten van nierweefsel. Cystatine C, KIM-1 en IL-1β concentraties worden uitgedrukt in ng/mL; IL-6 en TNF-α concentraties worden uitgedrukt in ng/L. Gemeld p waarden zijn afkomstig van een omnibus eenwegvariantieanalyse (ANOVA) over de vijf groepen. Na een significante omnibus-toets zijn post hoc-vergelijkingen uitgevoerd met behulp van Duncan’s meervoudige bereiktest. Binnen elke rij verschillen groepen die minstens één bovenindexletter delen niet significant, terwijl groepen zonder gemeenschappelijke letter significant verschillen op het 0,05-niveau. Er is geen aanvullende correctie voor multipliciteit toegepast over de biomerkers heen. Variantieheterogeniteit werd geïdentificeerd bij enkele biomerkers; daarom dienen de ANOVA- en Duncan-resultaten met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd. Afkortingen: MTX = methotrexaat; KIM-1 = molecule voor nierbeschadiging-1; IL-6 = interleukine-6; TNF-α = tumor necrose factor-alfa; IL-1β = interleukine-1-beta; SD = standaardafwijking; ANOVA = variantieanalyse; CI = betrouwbaarheidsinterval. η² geeft het totale effectgrootte over de vijf groepen weer. De tweezijdige 95% betrouwbaarheidsintervallen zijn modelgebaseerd, gaan uit van normaal verdeelde fouten met gelijke varianties en zijn niet aangepast voor meervoudige uitkomsten. De betrouwbaarheidsintervallen dienen daarom met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd wanneer aan deze aannames niet is voldaan.

Variabele	Controle	MTX	MTX + methanol	MTX + Methanol + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol	p	η² (95% BI)
Serumureum (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serumcreatinine (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Serum SOD-activiteit (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Bloed GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Bloed CAT-activiteit (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Tabel 2: Nierfunctie en aan redox gerelateerde parameters in experimentele groepen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), met zes dieren per groep. De concentraties van ureum en creatinine in serum, evenals de activiteit van superoxide-dismutase (SOD) en de concentratie van malondialdehyde (MDA) werden in serum gemeten, terwijl het gehalte aan verlaagde glutathion (GSH) en de activiteit van catalase (CAT) werden gemeten in bloed dat was geanticoaguleerd met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). De concentraties van ureum en creatinine in serum worden uitgedrukt in mg/dL, de activiteiten van SOD en CAT in U/mL, de gehaltes van GSH in mmol/L en de concentraties van MDA in nmol/mL. Gemeld p waarden zijn afkomstig uit een omnibus eenwegs variantieanalyse (ANOVA) over de vijf groepen. Na een significante omnibus-toets zijn post hoc-vergelijkingen uitgevoerd met behulp van Duncan’s meervoudige bereiktest. Binnen elke rij verschillen groepen die ten minste één bovenindexletter delen niet significant, terwijl groepen zonder gemeenschappelijke letter significant verschillen op het 0,05-niveau. Er is geen aanvullende correctie voor multipliciteit toegepast over de biomerkers heen. Voor sommige uitkomsten werd heterogeniteit van variantie vastgesteld; daarom dienen de ANOVA- en Duncan-resultaten met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd. De redox-gerelateerde biomerkers zijn indirecte indicatoren en vormen geen directe metingen van mitochondriële functie of moleculaire mechanismen van letsel. η² geeft het totale effectgrootte over de vijf groepen weer. De tweezijdige 95% betrouwbaarheidsintervallen zijn modelgebaseerd, gaan uit van normaal verdeelde fouten met gelijke varianties en zijn niet aangepast voor meerdere uitkomsten. Daarom dienen de betrouwbaarheidsintervallen met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd wanneer aan deze aannames niet is voldaan. Afkortingen: MTX = methotrexaat; SOD = superoxide dismutase; GSH = gereduceerd glutathion; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethyleendiaminetetraazijnzuur; SD = standaardafwijking; ANOVA = variantieanalyse; CI = betrouwbaarheidsinterval.

Variabele	Controle	MTX	MTX + methanol	MTX + methanol  + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol
Tubulaire dilatatie	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Ophoping van eiwitachtig materiaal	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tubulaire epitheliale degeneratie	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tubulaire necrose	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerulaire degeneratie	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman'vergroting van de s-ruimte	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vasculaire congestie	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Interstitiële ontsteking	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Interstitiële fibrose	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Tabel 3: Beschrijvende histopathologische scores in experimentele groepen. De gegevens worden beschrijvend weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), met zes dieren per groep. Histopathologische scores werden verkregen uit niersecties gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) en Masson’s trichroom; de scores zijn dimensieloos. Aan elk dier werd één gehele score toegekend voor elke histopathologische parameter op een schaal van 0–4, waarbij 0 = afwezig, 1 = minimaal, 2 = licht, 3 = matig en 4 = ernstig. De decimale waarden in de tabel geven het rekenkundig gemiddelde weer van de individuele gehele scores verkregen van de zes dieren in elke experimentele groep en stellen geen scores voor die aan individuele dieren zijn toegekend of een continu scoresysteem. De standaardafwijkingen geven de variabiliteit tussen dieren binnen elke groep weer. Er zijn geen inferentiële statistische toetsen of post-hoc paarsgewijze vergelijkingen uitgevoerd op de histopathologische scores; daarom dienen de waargenomen patronen tussen groepen beschrijvend te worden geïnterpreteerd in plaats van als statistisch significante verschillen. De histopathologische evaluatie omvatte tubulaire dilatatie, ophoping van eiwitachtig materiaal, tubulaire epitheliale degeneratie, tubulaire necrose, glomerulaire degeneratie, vergroting van Bowman’s ruimte, vasculaire congestie, interstitiële ontsteking en interstitiële fibrose.

Aanvullend bestand 1: Ruwe gegevens ter ondersteuning van de biochemische analyses. Deze werkmap bevat de rauwe waarden op dierenniveau die zijn gebruikt voor de biochemische, nierbeschadigingsbiomerkers, inflammatoire en redox-gerelateerde analyses die in het manuscript worden gerapporteerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De belangrijkste bevinding van deze studie was dat de MTX + Methanol-groep het meest nadelige profiel van nierbeschadiging vertoonde over de functionele, inflammatoire, redox-gerelateerde en histopathologische uitkomsten. Deze groep had de hoogste waarden voor serumureum, serumcreatinine, renale cystatine C, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β en MDA, en de laagste SOD-activiteit, GSH-spiegels en CAT-activiteit, samen met de hoogste waargenomen histopathologische beschadigingsscores. Beide met antidotum behandelde groepen vertoonden gunstigere nieruitkomstpatronen dan de MTX + Methanol-groep, waarbij de met fomepizool behandelde groep een consistenter gunstig patroon vertoonde over de geëvalueerde domeinen. Deze bevindingen werden echter verkregen in een acuut met MTX voorbehandeld ratmodel met ongelijke antidotumregimes: herhaalde intraperitoneale toediening van fomepizool versus een enkele orale dosis ethanol. Deze verschillen in toedieningsroute en doseringsfrequentie beperken de directe vergelijking van de nefroprotectieve effectiviteit, en de waargenomen uitkomstpatronen vestigen de superioriteit van fomepizool ten opzichte van ethanol niet vast. De MTX-alleengroep vertoonde hogere TNF-α- en IL-1β-spiegels en een lagere SOD-activiteit, GSH-spiegels en CAT-activiteit dan de controlegroep, terwijl de spiegels van renale cystatine C, IL-6, KIM-1, serumureum, serumcreatinine en MDA statistisch vergelijkbaar bleven tussen de groepen. Dit patroon gaf aan dat MTX-voorbehandeling bijdroeg aan het inflammatoire en redox-gerelateerde achtergrondprofiel. Bijgevolg vonden de aanvullende veranderingen die werden waargenomen in de MTX + Methanol-groep plaats op een met MTX voorbehandelde achtergrond en konden deze niet uitsluitend worden toegeschreven aan methanol. Omdat er geen methanol-alleengroep was opgenomen, konden de onafhankelijke bijdrage van methanol en potentiële MTX-methanol-interacties niet volledig worden gescheiden.

Op basis van de gevestigde methanoltoxicologie vormde de accumulatie van toxische metabolieten een plausibele bijdrage aan nierbeschadiging. Methanol wordt hoofdzakelijk in de lever door ADH gemetaboliseerd tot formaldehyde en vervolgens tot mierenzuur^1,3,18,19,20. De nier zou daarom primair beïnvloed kunnen zijn door circulerend formaat en de resulterende systemische metabole verstoringen, in plaats van door uitgebreid lokaal methanolmetabolisme. Een bijdrage van alcohol- of aldehydemetabolisme in het nierweefsel kon echter niet worden uitgesloten, aangezien de concentraties van methanol, formaldehyde en formaat, alsook de renale ADH-activiteit, niet werden gemeten. Mierenzuur remt mitochondriaal cytochroom c oxidase, waardoor de oxidatieve fosforylering wordt belemmerd, de ATP-productie afneemt en histotoxische hypoxie wordt geïnduceerd; dit proces kan resulteren in lactaatacidose, een verhoogde generatie van reactieve zuurstofcomponenten en membraanschade^1,2,3,19,20. Vergeleken met de lever, de belangrijkste plaats van methanolmetabolisme, kan de nier bijzonder gevoelig zijn voor de downstream-effecten van formaat en systemische metabole verstoringen. Proximale tubulaire epitheelcellen hebben een hoge energiebehoefte en zijn bijzonder kwetsbaar voor mitochondriale dysfunctie, oxidatieve stress en microcirculatoire stoornissen. Bijgevolg kunnen formaat-gemedieerde hypoxie, metabole acidose en inflammatie bijdragen aan nierbeschadiging^{2,8,9,21,22,23}. Klinische studies die associaties aantoonden tussen acuut nierfalen en metabole acidose, respiratoir falen, rhabdomyolyse, sepsis en multi-orgaanfalen suggereerden dat nierbeschadiging de systemische toxische belasting kan weerspiegelen^8,9,10,21. De snellere folaat-afhankelijke oxidatie van formaat bij ratten dan bij mensen vormde een belangrijke beperking van experimentele modellen^1,11,12. Bijgevolg werd voorbehandeling met methotrexaat gebruikt om de klaring van formaat te verminderen en de gevoeligheid voor methanoltoxiciteit te verhogen, in plaats van om de volledige klinische en metabole kenmerken van methanolvergiftiging bij de mens te reproduceren.

Nierdysfunctie werd aangetoond door de gecombineerde evaluatie van conventionele biochemische parameters en biomarkers voor nierschade. Verhoogde serumconcentraties van ureum en creatinine in de MTX + Methanol-groep wezen op een verminderde renale filtratie- en excretiecapaciteit. Verhoogde spiegels van renaal cystatine C en KIM-1 suggereerden dat tubulaire schade gepaard ging met functionele beperkingen. Gegeven de associatie van KIM-1 met proximale tubulaire schade, was deze stijging consistent met tubulair epitheliale degeneratie, dilatatie en necrose^24,25. Verhoogde cystatine C-spiegels ondersteunden eveneens de aanwezigheid van een verminderde nierfunctie^26,27. De lagere spiegels van deze biomarkers in de met fomepizol en ethanol behandelde groepen suggereerden een afname van de nierschade, waarbij een consistenter patroon werd waargenomen in de met fomepizol behandelde groep. Het patroon van redox-gerelateerde biomarkers was consistent met oxidatieve stress als een mogelijke bijdrage aan nierschade, in plaats van bewijs voor een bevestigd mechanisme. MDA wordt gewoonlijk gebruikt als index voor lipideperoxidatie, terwijl GSH bijdraagt aan het behoud van de cellulaire redox-homeostase^28,29. In experimentele modellen van methanolintoxicatie en methanol-geassocieerde optische neuropathie zijn oxidatieve stress, lipideperoxidatie en een verminderde antioxidantcapaciteit ook geassocieerd met weefselschade^10,15,20. Een lagere serum-SOD-activiteit, hogere serum-MDA-concentraties en lagere bloed-GSH-spiegels en CAT-activiteit in de MTX + Methanol-groep waren consistent met een verminderde antioxidantcapaciteit en verhoogde lipideperoxidatie; deze metingen stelden echter geen onderliggend mitochondriaal of moleculair mechanisme vast. Lagere serum-MDA-concentraties en een gedeeltig herstel van de serum-SOD- en bloed-CAT-activiteiten in de met antidota behandelde groepen waren compatibel met een gunstiger redox-gerelateerd biomarkerprofiel, waarbij een consistenter gunstig patroon werd waargenomen in de met fomepizol behandelde groep.

Hogere waarden van TNF-α, IL-6 en IL-1β in de MTX + Methanol-groep waren consistent met een pro-inflammatoir renaal profiel. Omdat deze cytokinen niet route-specifiek waren en MTX zelf werd geassocieerd met veranderingen in geselecteerde inflammatoire markers, ondersteunden de bevindingen ontsteking als een mogelijke bijdrager in plaats van een bevestigd mechanisme van renale beschadiging. Door mierenzuur gemedieerde mitochondriële dysfunctie, cellulaire hypoxie en oxidatieve stress kunnen een basis vormen voor de activatie van inflammatoire routes; daarom kunnen oxidatieve stress en ontsteking progresseren als wederzijds versterkende processen bij methanoltoxiciteit^1,2,3,15. Experimentele modellen van methanolintoxicatie hebben associaties gerapporteerd tussen methanolblootstelling en infiltratie van inflammatoire cellen, histopathologische schade en verhoogde spiegels van pro-inflammatoire markers zoals IL-1β en TNF-α^13,15. Deze bevindingen waren consistent met de verhoogde pro-inflammatoire cytokineniveaus en de verhoogde scores voor interstitiële ontsteking, tubulaire degeneratie en tubulaire necrose die werden waargenomen in de MTX + Methanol-groep. Collectief waren de bevindingen compatibel met een multifactorieel proces waarbij effecten van toxische metabolieten, oxidatieve stress, ontsteking, microcirculatoire stoornissen en systemische toxische belasting betrokken waren; echter werden deze routes niet direct beoordeeld. Lagere TNF-α, IL-6 en IL-1β-spiegels in de met antidotum behandelde groepen suggereerden dat remming van de vorming van toxische metabolieten mogelijk ook de inflammatoire respons heeft beperkt. Histopathologische bevindingen boden correlaten op weefselniveau van renale beschadiging, waarbij de MTX + Methanol-groep de hoogste waargenomen beschadigingsscores vertoonde over tubulaire, glomerulaire, vasculaire en interstitiële parameters. Beide met antidotum behandelde groepen vertoonden beschrijvend lagere histopathologische beschadigingsscores, en de met fomepizol behandelde groep vertoonde beschrijvend lagere scores dan de met ethanol behandelde groep voor de meeste parameters. Omdat er echter geen inferentiële statistische toetsing is uitgevoerd op de histopathologische scores, stelden deze observaties geen statistisch significante histopathologische bescherming of superioriteit vast voor 어느 van beide antidota^16,17.

De antidotische effecten van ethanol en fomepizol bij methanolintoxicatie zijn gebaseerd op de onderdrukking van het door alcoholdehydrogenase-gemedieerde metabolisme, waardoor de vorming van formaldehyde en mierenzuur wordt verminderd. Ethanol werkt als een competitief substraat, terwijl fomepizol fungeert als een directe en potente remmer van alcoholdehydrogenase^{1,3,4,6,7,30,31,32}. De gunstigere patronen van de renale uitkomsten die in beide met antidotum behandelde groepen werden waargenomen, waren consistent met de verwachte effecten van alcoholdehydrogenase-inhibitie. Desondanks toont de huidige literatuur geen definitieve klinische superioriteit van fomepizol ten opzichte van ethanol aan. Hoewel fomepizol vaak wordt verkozen vanwege een eenvoudigere dosering, voorspelbare farmacokinetiek en een lager bijwerkingenprofiel, blijft ethanol een effectief alternatief^{1,3,4,6,7,30,32}. In de data over massale methanolvergiftigingen gerapporteerd door Zakharov et al. werd geen duidelijk verschil waargenomen tussen de twee antidota met betrekking tot mortaliteit, de duur van de intensive care of de noodzaak tot dialyse; interpretaties over klinische superioriteit vereisen daarom voorzichtigheid⁵. Met de post hoc-toets van Duncan werden geen statistisch significante directe verschillen tussen de met fomepizol en ethanol behandelde groepen vastgesteld voor de biochemische uitkomsten. Bovendien werd fomepizol in herhaalde doses toegediend, terwijl ethanol als een enkele dosis werd toegediend. De schema's waren niet afgestemd op toedieningsweg, doseringsfrequentie of systemische blootstelling. Bijgevolg zou het descriptief gunstigere patroon geassocieerd met fomepizol kunnen wijzen op verschillen in het doseringsschema, de toedieningsweg of de blootstelling aan het geneesmiddel, naast verschillen tussen de antidotische middelen, en stelt het geen grotere biochemische werkzaamheid, klinische superioriteit of een klinische behandelvoorkeur vast^5,6,30,32. Een belangrijk sterk punt van de studie was de geïntegreerde beoordeling van serumureum en creatinine, cystatine C, KIM-1, pro-inflammatoire cytokinen, redox-gerelateerde biomarkers en histopathologische scores over complementaire functionele, tubulaire, inflammatoire, redox-gerelateerde en structurele domeinen. Dit op nierletsel gerichte model kan een nuttig preklinisch kader bieden voor het evalueren van antidotische schema's, aanvullende renoprotectieve interventies en biomarkers voor nierletsel onder omstandigheden van verminderde folaatafhankelijke formiaatklaring^8,9,10,21.

Verschillende beperkingen beïnvloedden de interpretatie. De directe generaliseerbaarheid naar klinische methanolintoxicatie werd beperkt door het experimentele diermodel en metabole verschillen tussen soorten. Methotrexaat kan onafhankelijk de renale, inflammatoire en oxidatieve uitkomsten beïnvloeden³³, en de afwezigheid van een groep met alleen methanol verhinderde een volledige scheiding van de effecten van methanol van potentiële MTX–methanol interacties. Serum- of weefselconcentraties van methanol, formaldehyde, formaat, ethanol en fomepizol werden niet gemeten, en de ADH-activiteit in de ruwe renale cytosolische fractie werd niet beoordeeld; daarom konden metabole sensibilisatie, vorming van toxische metabolieten, blootstelling aan het antidotum en inhibitie van het methanolmetabolisme niet direct worden geverifieerd, en konden correlatieanalyses met renale biochemische uitkomsten niet worden uitgevoerd. Zuur-base variabelen, waaronder pH, bicarbonaat, base excess en anion gap, werden niet gemeten. De follow-up van 48 h maakte alleen evaluatie van acute renale uitkomsten mogelijk en stelde geen renale herstel, persistentie of reversibiliteit van letsel, of chronische structurele veranderingen vast. Masson's trichroomkleuring werd histomorfologisch geëvalueerd zonder kwantitatieve meting van het collageen-positieve gebied, en moleculaire of biochemische fibrosemarkers, waaronder de expressie van α-smooth muscle actin, collageengehalte en 4-hydroxyprolineconcentratie, werden niet geëvalueerd. Histopathologische beoordeling door een enkele geblindeerde patholoog sloot de evaluatie van interobservator-overeenstemming uit, en semikwantitatieve lesion grading bleef potentieel onderhevig aan observatorafhankelijke classificatie. De antidotumregimes waren farmacologisch ongelijk; ELISA-concentraties in het renale weefsel werden niet genormaliseerd naar de totale proteïneconcentratie; moleculaire analyses van mitochondriale functie en celdoodpaden werden niet uitgevoerd; de steekproefomvang was beperkt; en er werden alleen mannelijke ratten opgenomen. Toekomstige studies zouden groepen met alleen methanol en alleen MTX, vergelijkbare antidotumregimes, seriële metingen van methanol-, formaat- en antidotumconcentraties, renale ADH-activiteit, zuur-base metingen, kwantitatieve fibrosebeoordeling, een langere follow-up en een adequaat ontworpen klinische validatie moeten bevatten. Concluderend was methanolblootstelling in dit met methotrexaat voorbehandelde ratmodel geassocieerd met een verslechterde renale functie, verhoogde renale letsel- en inflammatoire biomarkers, een ongunstig redox-gerelateerd profiel en histopathologisch letsel. Beide met antidotum behandelde groepen vertoonden gunstigere renale uitkomstpatronen dan de MTX + Methanol groep. Fomepizol vertoonde een consistenter gunstiger descriptief patroon over de geëvalueerde domeinen; echter, de afwezigheid van significante directe biochemische verschillen tussen de antidotumgroepen, het descriptieve karakter van de histopathologische vergelijkingen, ongelijke antidotumregimes en de afwezigheid van toxicokinetische metingen verhinderden conclusies met betrekking tot superioriteit ten opzichte van ethanol. Deze bevindingen zijn beperkt tot het met methotrexaat voorbehandelde ratmodel en stellen de renale effecten van geen van beide antidota vast na methanolblootstelling zonder methotrexaat-voorbehandeling of bij methanolvergiftiging bij mensen. Verdere studies met directe toxicokinetische metingen, mechanistische beoordelingen, vergelijkbare antidotumdoseringsregimes en een langere follow-up zijn nodig om de reproduceerbaarheid en bredere toepasbaarheid van deze bevindingen te beoordelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% Neutraal Gebufferd Formaline	Merck	Niet geregistreerd	Weefselfixatie voor histopathologische verwerking.
Absoluut Ethanol (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	Niet geregistreerd	Verdund met steriel gedestilleerd water om een eindoplossing van 20% (v/v) te verkrijgen; toegediend als een enkele orale sonde-dosis van 0,5 g/kg, 4 uur na methanoltolerantie.
Benchtop Centrifuge	Nüve	NF048	Monstervoorbereiding en centrifugatie.
Biotine-geconjugeerd Antilichaam	BT Lab ELISA Kit-onderdelen	Inbegrepen in kit	Detectie-antilichaam
CAT (Catalase) Kit	Otto Scientific	Otto3051	Kolorimetrische meting van catalase (CAT)-activiteit in met EDTA-anticoagulans behandelde bloedmonsters.
cOmplete Mini EDTA-vrije Protease-inhibitormix	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Toegevoegd aan de homogenisatiebuffer tijdens de voorbereiding van nierweefselhomogenaten voor ELISA-analyses.
Creatinine Kit	Otto Scientific	OttoBC139	Beoordeling van serumcreatinineniveaus.
Digitale Homogenisator	Daihan Scientific	HG-15D	Weefselhomogenisatie
ELx50 Auto Strip Washer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	ELISA-wassen
ELx800 Microplaatlezer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Meting van extinctie voor ELISA en kolorimetrische assays; ELISA-extinctie werd gemeten bij 450 nm.
Eosine Y (Geelachtig)	Merck	1.15935.0025	Histopathologische kleuring
Fomepizole (4-Methylpyrazole)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türkiye	Niet geregistreerd	Bereid in steriel 0,9% natriumchloride-oplossing met een eindconcentratie van 10 mg/mL; intraperitoneaal toegediend als een initiële dosis van 15 mg/kg, 4 uur na methanoltolerantie, gevolgd door onderhoudsdoses van 10 mg/kg op 12, 24 en 36 uur na methanoltolerantie.
GSH (Glutathion) Kit	Otto Scientific	Otto3053	Kolorimetrische meting van gereduceerde glutathion (GSH)-niveaus in met EDTA-anticoagulans behandelde bloedmonsters.
Harris Hematoxyline-oplossing	BSLAB	BS-002	Histopathologische kleuring
Zoutzuur (HCl)	Merck	7647-01-0	pH-aanpassing
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Versie 29.0	Statistische analyse; RRID:SCR_016479.
Ketaminehydrochloride (Ketalar)	Pfizer, USA	Niet geregistreerd	Algemene anesthesie vóór bloed- en nierweefselverzameling.
Lichtmicroscoop	Nikon Eclipse	Ni-U	Histopathologisch onderzoek
Masson's Trichroom-kleurstofkit	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye)	BKMTO001	Histopathologische kleuring
MDA (Malondialdehyde) Kit	Otto Scientific	Otto1001	Kolorimetrische meting van malondialdehyde (MDA)-niveaus in serum als indicator voor lipidenperoxidatie.
Methanol (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Oraal toegediend (3 g/kg) om experimentele methanolintoxicatie op te wekken.
Methotrexaat (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	Niet geregistreerd	Commerciële 100 mg/mL-formulering verdund met steriel 0,9% natriumchloride-oplossing tot een eindwerkconcentratie van 0,06 mg/mL; toegediend via orale sonde in een dosis van 5 mL/kg, wat overeenkomt met 0,3 mg/kg, eenmaal daags gedurende 7 opeenvolgende dagen.
Mindray Chemistry Analyzer	Mindray	BS-400	Meting van serumureum en -creatinine.
Paraffine, histologische kwaliteit	Niet geregistreerd	Niet geregistreerd	Weefselinsluiting.
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Merck	P4417	Weefsel spoelen/wassen
Rat Cystatine-C ELISA Kit	BT Lab, China	E0145Ra	Quantificering van cystatine C-niveaus in nierweefselhomogenaten; analytische gevoeligheid, 0,25 ng/mL; detectiebereik, 0,5–100 ng/mL.
Rat IL-1β ELISA Kit	BT Lab, China	E0119Ra	Quantificering van IL-1β-niveaus in nierweefselhomogenaten; analytische gevoeligheid, 0,08 ng/mL; detectiebereik, 0,2–60 ng/mL.
Rat IL-6 ELISA Kit	BT Lab, China	E0135Ra	Quantificering van IL-6-niveaus in nierweefselhomogenaten; analytische gevoeligheid, 0,052 ng/L; detectiebereik, 0,1–40 ng/L.
Rat KIM-1 ELISA Kit	BT Lab, China	E0549Ra	Quantificering van KIM-1-niveaus in nierweefselhomogenaten; analytische gevoeligheid, 0,01 ng/mL; detectiebereik, 0,05–10 ng/mL.
Rat TNF-α ELISA Kit	BT Lab, China	E0764Ra	Quantificering van TNF-α-niveaus in nierweefselhomogenaten; analytische gevoeligheid, 2,51 ng/L; detectiebereik, 5–1.000 ng/L.
RIPA Lyse- en Extractiebuffer	Thermo Scientific	89900	Nierweefselhomogenisatie en -lyse voor ELISA-analyses.
SOD (Superoxide Dismutase) Kit	Otto Scientific	Otto3047	Kolorimetrische meting van superoxide dismutase (SOD)-activiteit in serum.
Natriumcitraat	Merck	03-04-6132	Bufferbereiding
Natriumhydroxide (NaOH)	Merck	1310-73-2	pH-aanpassing
Roestvrijstalen voedingsnaald (22 G orale sonde-cannula)	Instech Laboratories, USA	Niet geregistreerd	Herbruikbare roestvrijstalen cannula voor orale sonde-toediening bij ratten.
Stopoplossing	BT Lab ELISA Kit-onderdelen	Inbegrepen in kit	Beëindiging van ELISA-reactie
Streptavidine-peroxidase	Thermo Scientific	SHRP248-B	ELISA-detectiesysteem
TMB-substraatoplossing	BT Lab ELISA Kit-onderdelen	Inbegrepen in kit	Kleurstofsubstraat
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Bufferbereiding
Ureum Kit	Otto Scientific	OttoBC157	Meting van serumureumniveaus.
Wasbufferconcentraat	BT Lab ELISA Kit-onderdelen	Inbegrepen in kit	Plaatwassen
Wistar-albino ratten	Experimenteel Dierenonderzoekslaboratorium van Ahi Evran University, , Türkiye	Fok-/productielicentie nr. 184	Mannelijk; 8–12 weken oud; lichaamsgewicht, 220 ± 20 g
Xylazinehydrochloride (Rompun)	Bayer, Duitsland	Niet geregistreerd	Algemene anesthesie vóór bloed- en nierweefselverzameling.
Xyleen, histologische kwaliteit	Niet geregistreerd	Niet geregistreerd	Histologische weefselverwerking en doorschijnend maken.