Methodenartikel

Gestandaardiseerde workflow voor de collectie van menselijke fecesmonsters en geautomatiseerde extractie van deoxyribonuclezuur met behulp van een magnetische partikelprocessor

120 weergaven

⸱

11 september 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gut Microbiome Division, SKAN Research Trust, 2Stem Cells Division, SKAN Research Trust

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om de verzameling van menselijke fecesmonsters en de geautomatiseerde extractie van deoxyribonuclezuur met behulp van een magnetische deeltjesprocessor te standaardiseren.

Samenvatting

Sequencing van het darmmicrobioom is een belangrijke benadering geworden voor het onderzoeken van de dynamiek van microbiële gemeenschappen in gezonde en zieke toestanden. Veranderingen in de microbiële samenstelling zijn geassocieerd met verschillende leefstijl- en ouderdomsgerelateerde aandoeningen, waaronder diabetes, leukemie en neurodegeneratieve ziekten. Omdat verschillende micro-organismen verschillende fysiologische kenmerken en omgevingsvereisten vertonen, zijn gestandaardiseerde collectie, transport en verwerking van fecesmonsters essentieel om de integriteit van het monster te behouden en technische variabiliteit te minimaliseren. Variaties die worden geïntroduceerd tijdens de pre-analytische behandeling en de extractie van deoxyribonucleïnezuur (DNA) kunnen downstream microbiome-analyses beïnvloeden en de interpretatie van gegevens beïnvloeden. Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde workflow te bieden voor de collectie van menselijke fecesmonsters en geautomatiseerde DNA-extractie met behulp van de MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (nucleïnezuurextractiekit) en het KingFisher Flex System (geautomatiseerde magnetische partikelprocessor). De workflow integreert gecontroleerde monsterbehandeling met geautomatiseerde nucleïnezuurextractie om handmatige variabiliteit te verminderen en de procedurele consistentie te verbeteren. Het protocol omvat gestandaardiseerde collectie, opslag, preparatie, geautomatiseerde extractie en herstel van nucleïnezuren uit complexe fecesmatrices. Representatieve resultaten tonen het succesvol herstel van DNA dat geschikt is voor downstream toepassingen, waaronder 16S ribosomaal ribonucleïnezuur (rRNA) gensequencing en shotgun metagenomische sequencing. De gestandaardiseerde workflow ondersteunt reproduceerbare monsterverwerking, vergemakkelijkt de schaalbaarheid voor microbiome-studies en bevordert een grotere consistentie tussen experimenten. De visuele demonstratie biedt praktische begeleiding voor de implementatie van gestandaardiseerde fecesmonsterverwerking en geautomatiseerde nucleïnezuurextractie voor onderzoek naar het darmmicrobioom.

Inleiding

Het darmmicrobioom is een complex microbieel ecosysteem dat het metabolisme, de immuniteit en de neurologische functie van de gastheer beïnvloedt en steeds vaker wordt geïmpliceerd bij diverse ziekten, waaronder metabole stoornissen, de ziekte van Parkinson, kanker en neurodegeneratie1,2. Het speelt een belangrijke rol bij het handhaven van de fysiologie van de gastheer door invloed uit te oefenen op het metabolisme, de immuunfunctie, de opname van voedingsstoffen en de resistentie tegen pathogene micro-organismen3,4. Robuuste en reproduceerbare microbiome-metingen zijn essentieel om deze associaties te vertalen naar mechanistische inzichten en klinische toepassingen. Vooruitgang in next-generation sequencing (NGS)-technologieën heeft ons begrip van de complexe microbiële gemeenschappen in het maag-darmkanaal gerevolutioniseerd. Echter kunnen pre-analytische variabelen, zoals procedures voor het verzamelen van fecesmonsters, bewaaromstandigheden, hantering, transport en methoden voor de extractie van deoxyribonuclezuur (DNA), de structuur van de microbiële gemeenschap, de DNA-opbrengst en de sequentieresultaten selectief beïnvloeden5,6. Dergelijke methodologische inconsistenties bemoeilijken vaak vergelijkingen tussen studies.

Onder de kritieke pre-analytische stappen is DNA-extractie een van de meest bepalende factoren voor de kwaliteit van microbiomegegevens7,8. Een ideaal extractieprotocol moet consistent DNA van hoge kwaliteit en met een hoog molecuulgewicht opleveren met minimale contaminatie over een groot aantal monsters. Geautomatiseerde platforms voor nucleïnezuurextractie kunnen de reproduceerbaarheid verbeteren, fouten door handmatige manipulatie verminderen, het risico op contaminatie verlagen en de doorvoer verhogen. De prestaties van deze geautomatiseerde extractieplatforms hangen aanzienlijk af van protocolparameters, waaronder monsterhomogenisatie, bead-beating condities, lysischemie, incubatiecondities en de hantering van magnetische beads9,10. Daarom is het vaststellen van een gestandaardiseerde workflow, waarin uniforme verzameling van fecale monsters wordt geïntegreerd met geautomatiseerde DNA-extractie, essentieel voor het genereren van betrouwbare en reproduceerbare microbiome-datasets.

Hier presenteren we een gestandaardiseerde workflow voor het verzamelen en behandelen van menselijke fecesmonsters en de geautomatiseerde DNA-extractie met behulp van de hierboven beschreven nucleic acid extraction kit en geautomatiseerde magnetic particle processor. Het protocol legt de nadruk op gecontroleerde monsterbehandeling, effectieve mechanische en chemische lyse, het verwijderen van inhibitoren en kwaliteitscontrollemaatregelen die geschikt zijn voor downstream-applicaties, waaronder 16S ribosomaal ribonucleïnezuur (rRNA) gen amplicon sequencing, whole-genome sequencing, kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) en shotgun metagenomic sequencing. De visuele demonstratie biedt praktische richtlijnen voor gestandaardiseerde verwerking van fecesmonsters en geautomatiseerde extractie van nucleïnezuren om reproduceerbaar en schaalbaar onderzoek naar het darmmicrobioom te ondersteunen.

Protocol

De studie is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Ethics Committee van de SKAN Research Trust en is door het comité goedgekeurd (Goedkeuringsnr. SKAN/IEC/2025/04). Van alle deelnemers is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen vóór de monstername.

OPMERKING: Alle reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Stel de kit voor het verzamelen van ontlastingsmonsters samen

  1. Stel een kit voor de inzameling van fecesmonsters samen, bestaande uit een steriele fecesopvanger, een steriele schroefdop-verzamelbuis (capaciteit 30–50 mL) met een bevestigde spatel, een verzamelbuis vooraf gevuld met stabilisatiebuffer, wegwerphandschoenen, absorberend materiaal, een afsluitbare transportzak met biohazard-label en een instructieblad (Figuur 1).
  2. Label elke verzamelbuis met een unieke monsteridentificatie, de datum en het tijdstip van afname met een permanente marker of een vooraf gedrukt label.
  3. Voeg een instructieblad toe waarin de procedure voor monstername, voorzorgsmaatregelen bij de behandeling, bewaarcondities en transportvereisten worden beschreven.
    ​OPMERKING: De stabilisatiebuffer wordt vooraf ingevuld in de fecesverzamelbuis als onderdeel van de fecesinzamelkit. De fabrikant maakt de samenstelling of het volume van de stabilisatiebuffer niet bekend. Verzamel ongeveer 2–5 g fecesmateriaal direct in de vooraf gevulde verzamelbuis volgens de instructies van de fabrikant.

Kit voor het verzamelen van fecesmonsters met handschoenen, buisje, biohazard-zak, opvangbakje en brochure voor analyse.
Figuur 1Componenten van de kit voor het verzamelen van fecesmonsters. 
De kit voor de verzameling van fecesmonsters bevat wegwerphandschoenen, een steriele fecesvanger, een steriele fecesopvangbuis met schroefdop en een bevestelde spatel, een afsluitbare transportzak met biohazard-label en een instructiebrochure voor deelnemers met betrekking tot de verzameling, hantering, bewaring en het transport van fecesmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereid de deelnemer voor op monstername

  1. Instrueer de deelnemer om de handen te wassen vóór de monstername.
  2. Instrueer de deelnemer om de blaas te legen vóór de stoelgang om urinocontaminatie van het fecesmonster te voorkomen.

3. Verzamel de fecesmonsters met behulp van een fecesvanger

  1. Plaats een steriele fecesopvanger op de toiletbril om contact tussen het fecesmonster en het toiletwater te voorkomen.
  2. Vouw bij zelfklevende fecesopvangers het apparaat voorzichtig open langs de aangegeven randen zonder het te scheuren. Volg de instructies van de fabrikant die bij de fecesopvanger zijn geleverd en bevestig het apparaat stevig aan het achterste gedeelte van de toiletbril om een stabiel opvangoppervlak te creëren.
  3. Positioneer bij niet-zelfklevende fecesopvangers het apparaat over de toiletpot volgens de instructies van de fabrikant om een stabiele ondersteuning te bieden.
  4. Zorg ervoor dat de fecesopvanger tijdens de monstername geen contact heeft met het toiletwater.
  5. Instrueer de deelnemer om de stoelgang direct op de fecesopvanger te voltooien.
  6. Trek de in de afnameset meegeleverde wegwerphandschoenen aan voordat u het monster hanteert.
  7. Open de steriele afnamebuis en gebruik de bijgevoegde spatel om fecesmateriaal te verzamelen uit ten minste vier tot vijf verschillende regio's van de ontlasting, inclusief het buitenoppervlak en de binnenkern. Deze aanpak levert doorgaans ongeveer 2–5 g fecesmateriaal op, wat voldoende is voor DNA-extractie.
  8. Vermijd het verzamelen van fecesmateriaal dat in contact is gekomen met de randen van de fecesopvanger of andere externe oppervlakken.
  9. Sluit de afnamebuis direct na de monstername stevig af.
  10. Meng het fecesmonster grondig met de stabilisatiebuffer door de gesloten afnamebuis handmatig krachtig te schudden totdat het monster uniform gesuspendeerd is en er geen grote klonten meer aanwezig zijn.
  11. Plaats de verzegelde afnamebuis in de lekbestendige, met een biohazard-label voorziene transportzak die absorptiemateriaal bevat.
  12. Laat de fecesopvanger samen met de ontlasting voorzichtig in het toilet glijden, waarbij u erop let dat de inhoud niet morst. Spoel het toilet door om de fecesopvanger en de ontlasting samen af te voeren.

4. Bewaren en transporteren van fecesmonsters

  1. Bewaar de monsters volgens de specificaties van de gebruikte stabilisatiebuffer.
  2. Bewaar de monsters op kamertemperatuur als de stabilisatiebuffer bewaring bij omgevingstemperatuur ondersteunt. Bewaar de monsters anders op 4°C voor kortstondige bewaring (≤24–48 h) of op −20°C tot −80°C voor langdurige bewaring.
  3. Bewaar de monsters in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant. Monsters die zijn verzameld met de in deze studie gebruikte stabilisatiebuffer zijn tot 2 jaar stabiel op kamertemperatuur.
  4. Transporteer de monsters in lekvrije biohazard-zakken met absorberend materiaal om lekkage en contaminatie te voorkomen.
  5. Houd de monsters tijdens het transport onder de aanbevolen temperatuuromstandigheden. Gebruik indien nodig geïsoleerde containers en koelelementen.
  6. Zorg voor naleving van de institutionele biosafety-richtlijnen en de geldende lokale regelgeving voor het transport van biologische monsters.

5. Monsters ontvangen en registreren

  1. Inspecteer elk monster bij ontvangst in het laboratorium op de juiste etikettering, de integriteit van de buis en tekenen van lekkage.
  2. Ken, indien vereist, een laboratoriumspecifieke identificatie toe en noteer de datum en tijd van afname, de bewaarcondities en de transportduur.
  3. Sluit monsters uit die lekkage, onjuiste etikettering of een aangetaste integriteit vertonen.

6. Bereid de platen voor

OPMERKING: Bereid alle platen voor voordat u begint met de extractieworkflow. Voer alle stappen waarbij reagentia en biologische monsters betrokken zijn uit in een schone omgeving terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming. Figuur 2 toont de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor (Figuur 2A), de posities voor het laden van platen (Figuur 2B), de adapter voor deep-well platen (Figuur 2C), een plaatcompatibele centrifuge (Figuur 2D), het bead-beating instrument (Figuur 2E), de dempende ondersteuning (Figuur 2F), de platenhouder (Figuur 2G), de 96-well bead-plaat (Figuur 2H), de deep-well plaat (Figuur 2I) en de elutieplaat (Figuur 2J).

Installatie van laboratoriumapparatuur voor monstervoorbereiding en -analyse, inclusief centrifuge en weefsellyser.
Figuur 2Apparatuur en verbruiksartikelen gebruikt voor geautomatiseerde extractie van deoxyribonucleïnezuur (DNA) uit feces. 
(A) Geautomatiseerde magnetische partikelprocessor. (B) Plaats voor het laden van de plaat in de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor. (C) Deep-well plaatadapter voor centrifugatie. (D) Plaatcompatibele centrifuge. (E) Bead mill homogenisator. (F) Dempingsondersteuning gebruikt tijdens bead beating. (G) Deep-well plaathouder (adapter) voor bead beating. (H) Negenenvijftig-wells beadplaat meegeleverd bij de nucleic acid extraction kit. (I) Negenenvijftig-wells deep-well plaat. (J) Negenenvijftig-wells elutieplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Haal de kamplaat voor de tips uit de verpakking en houd deze gereed voor het laden in het instrument.
  2. Bereid de elutieplaat (Figuur 2J) voor door 200 µL van de bij de nucleïnezuurextractiekit geleverde elutiebuffer aan elke well van een 96-wells plaat toe te voegen. Seal de plaat met transparante plakfolie om contaminatie te voorkomen. Houd de plaat gesloten totdat deze in de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor wordt geladen. Label de plaat als Elutieplaat.
  3. Bereid Wasplaat 4 voor door 1 mL 80% ethanol aan elke well van een deep-well plaat toe te voegen. Seal de plaat met plakfolie om verdamping en contaminatie te voorkomen.
  4. Bereid Wasplaat 3 voor door 1 mL vers bereide 80% ethanol aan elke well van een aparte deep-well plaat toe te voegen. Seal de plaat met plakfolie.
  5. Bereid Wasplaat 2 voor door 1 mL wasbuffer aan elke well van een deep-well plaat toe te voegen. Seal de plaat met plakfolie.
  6. Bereid Wasplaat 1 voor door 1 mL wasbuffer aan elke well van een deep-well plaat toe te voegen. Seal de plaat met plakfolie.

7. Stel de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor in

  1. Zet de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor aan. Controleer of de juiste 96-deep-well magnetische kop en het 96-well deep-well verwarmingsblok zijn geïnstalleerd.
  2. Voer vóór het verwerken van monsters het juiste protocol voor de instrumentcontrole uit (bijvoorbeeld het Check_96dw_tip protocol) met een schone tipkam en een lege compatibele wellplaat.
  3. Bevestig dat het vereiste extractieprogramma beschikbaar is op de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor.
    OPMERKING: Het gebruik van een onjuiste magnetische kop of een onjuist verwarmingsblok kan de opbrengst van nucleïnezuren verminderen en het instrument beschadigen.

8. Voer monsterlysis uit

  1. Maak een plaatmap om de positie van elk monster in de 96-wells plaat vast te leggen.
  2. Centrifugeer de 96-wells bead-plaat (Figuur 2H) bij 2.750 × g gedurende 10 s met behulp van een plaatcompatibele centrifuge (Figuur 2D) en adapter (Figuur 2C) om de beads op de bodem van elke well te verzamelen.
    OPMERKING: Deze stap voorkomt verlies van beads tijdens het verwijderen van de plaatseal.
  3. Verwijder de plaatseal voorzichtig zonder de beads te verstoren.
  4. Voeg 80 µL lysisbuffer toe aan elke well van de bead-plaat.
  5. Vermijd het aspireren van de beads tijdens het pipetteren.
  6. Ontdooi bevroren fecesmonsters bij kamertemperatuur totdat ze volledig ontdooid zijn. Meng de monsters voorzichtig om ze te homogeniseren en ga onmiddellijk over tot DNA-extractie. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli, omdat deze de DNA-kwaliteit en -opbrengst kunnen verminderen.
    OPMERKING: Voor verse monsters vortex je elke fecesmonsterbuis met de stabilisatieoplossing gedurende 5–10 s om homogenisatie van het monster te waarborgen.
  7. Overbreng 20 µL van elk gehomogeniseerd monster naar de overeenkomstige well van de bead-plaat.
  8. Gebruik een enkelkanaals pipet voorzien van steriele gefilterde wide-bore (afgeknipt) pipetpunten voor het overbrengen van de monsters. Vermijd herhaald pipetteren om verlies van beads en een daaropvolgende vermindering van de DNA-opbrengst te minimaliseren.
  9. Sluit de plaat stevig af met adhesieve folie, waarbij wordt gecontroleerd of alle wells en plaatranden volledig zijn afgesloten.

9. Voer mechanische lysis uit (bead beating)

  1. Plaats de verzegelde plaat in het bead-beating instrument (Afbeelding 2E>) met behulp van de juiste platenhouder (Afbeelding 2G) en de dempende ondersteuning (Afbeelding 2F).
  2. Balanceer het instrument door een plaat van gelijk gewicht tegenover de monsterplaat te plaatsen.
  3. Stel het instrument in op 30 Hz voor 2 min en start de run.
  4. Laat de run zonder onderbreking verlopen.
  5. Verwijder de plaat voorzichtig na voltooiing van de run zonder de verzegeling te verstoren.
    OPMERKING: Gebruik de dempende ondersteuning om beschadiging van de plaat tijdens het bead beating te voorkomen.

10. Voer de verwerking na lyse uit

  1. Centrifugeer de plaat bij 2.750 × g gedurende 5 min bij kamertemperatuur met een gebalanceerde configuratie.
  2. Breng voorzichtig 40 µL van het supernatant uit elke put over naar een nieuwe deep-well plaat, aangeduid als de Sample Plate.
  3. Voorkom dat er beads worden overgebracht tijdens deze stap.
    OPMERKING: De Sample Plate bevat geen beads en vereist geen voorafgaande centrifugatie.
  4. Sluit de Sample Plate af indien u niet onmiddellijk verdergaat.
    OPMERKING: Bewaar de afgesloten lysaatplaat indien nodig overnight bij 4°C. Bewaar de afgesloten Sample Plate alternatief bij −20°C voor maximaal 3 maanden. Ontdooi de monsters tot kamertemperatuur vóór verdere verwerking.

11. Bereid het mengsel van bindingsbeads voor

  1. Bereid het mengsel van bindingskraaltjes vlak voor gebruik door per monster 50 µL nucleïnezuurbindingsbuffer te combineren met 20 µL magnetische kraaltjes. Meng grondig om een homogene suspensie te verkrijgen.
  2. Bereken het totale benodigde volume van het mengsel van bindingskraaltjes op basis van het aantal monsters.
  3. Bereid voor een volledige 96-wells plaat het mengsel van bindingskraaltjes door 48,0 mL nucleïnezuurbindingsbuffer en 1,92 mL magnetische kraaltjes toe te voegen aan een steriele conische buis. Meng grondig om een eindvolume van 49,92 mL (520 µL per well) te verkrijgen.
    OPMERKING: Bereid voldoende volume voor één of twee extra wells om te compenseren voor variabiliteit bij het pipetteren.
  4. Meng de suspensie van bindingskraaltjes voorzichtig door inversie totdat deze homogeen is.
  5. Overbreng het mengsel van bindingskraaltjes naar een schoon reagensreservoir.
  6. Resuspendeer de magnetische kraaltjes direct voor het uitpipetteren door de suspensie drie tot vier keer op en neer te pipetteren om bezinking van de kraaltjes te voorkomen.
  7. Dispenseer met een multichannel pipette 520 µL van het mengsel van bindingskraaltjes in elke well van de voorbereide monsterplaat.
  8. Pipetteer langzaam vanwege de viscositeit van de oplossing en voorkom belvorming. Resuspendeer het mengsel van bindingskraaltjes in het reagensreservoir voorzichtig voor elke dispenserstap om een uniforme verdeling van de kraaltjes over alle wells te behouden.

12. Pas het MagMAX_Microbiome_Stool_Flex instrumentprogramma aan (gewijzigd extractieprogramma)

  1. Download en installeer de BindIt-software (software voor het bewerken van protocollen) volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Download het instrumentprogramma van de website van de fabrikant.
  3. Start de software voor het bewerken van protocollen op en laat deze initialiseren.
  4. Klik op Openen en selecteer het gedownloade instrumentprogramma.
  5. Pas de protocolparameters aan zoals beschreven in Tabel 1.
  6. Sla het gewijzigde protocol op en sluit de software.
  7. Verbind de computer met de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor met behulp van een USB- of RS-232C-seriële kabel.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de automatische magnetische partikelprocessor is uitgeschakeld voordat u de computer aansluit.
  8. Zet de automatische magnetische deeltjesprocessor aan en laat deze de initialisatie voltooien.
  9. Start de software voor het bewerken van protocollen op en bevestig dat deze de automatische magnetische partikelprocessor detecteert.
  10. Overdraag het gewijzigde extractieprogramma naar de geautomatiseerde magnetische deeltjesprocessor.
  11. Bevestig de succesvolle overdracht van het gewijzigde extractieprogramma en schakel vervolgens de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor uit.
StapActieParameters
1BindingMengen; 5 opvangcycli; 37°C
2Verzamel de beads5 magnetische collectiecycli
3Wasstap 1Meng gedurende 20 s × 3 cycli; 37°C
4Wasstap 2Meng gedurende 20 s × 3 cycli; 37°C
5Wasbeurt 3Meng gedurende 20 s × 2 cycli; 37°C
6Wasstap 4Mengen; 1 cyclus; 37°C
7DroogLaat 2 min aan de lucht drogen
8Elutie75°C; 6 mengcycli; voorverwarming ingeschakeld
9Verzamel de kraaltjes3 magnetische verzamelcycli
10Breng het eluaat overBreng het gezuiverde nucleïnezuur over naar de elutieplaat

Tabel 1: Geautomatiseerd extractieprogramma voor de magnetische deeltjesprocessor.
Samenvatting van het geautomatiseerde extractieprogramma dat wordt uitgevoerd door de geautomatiseerde magnetische deeltjesprocessor tijdens de extractie van deoxyribonucleazinezuur (DNA). Het programma omvat de binding van nucleïnezuren, het verzamelen van magnetische beads, opeenvolgende wasstappen, luchtdrogen, elutie en de overdracht van gezuiverd DNA naar de elutieplaat. De operationele parameters voor elke geautomatiseerde stap staan vermeld.

13. Voer geautomatiseerde nucleïnezuurextractie uit

  1. Zet de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor (Figuur 2A) aan door eerst de hoofdvoeding en vervolgens de aan/uit-knop van het instrument in te schakelen. Laat het systeem de initialisatie voltooien.
  2. Selecteer via het bedieningspaneel van het instrument het aangepaste extractieprogramma en start de run.
  3. Plaats, wanneer daarom wordt gevraagd, de tipkamplaat in positie 7 en druk op Start om door te gaan. Raadpleeg Tabel 2 voor de posities van de plaatbelading (Figuur 2B).
  4. Verwijder de afdichtfolie van de elutieplaat en plaats deze in positie 6, waarbij u op de juiste oriëntatie let (well A1 uitgelijnd met de aangewezen positie). Druk op Start om door te gaan.
  5. Verwijder de afdichtfolie van wasplaat 4 met 80% ethanol, plaats de plaat met de juiste oriëntatie in positie 5 en druk op Start.
  6. Verwijder de afdichtfolie van wasplaat 3 met 80% ethanol, plaats de plaat in positie 4 en druk op Start.
  7. Verwijder de afdichtfolie van wasplaat 2, plaats de plaat in positie 3 en druk op Start.
  8. Verwijder de afdichtfolie van wasplaat 1, plaats de plaat in positie 2 en druk op Start.
  9. Plaats, wanneer daarom wordt gevraagd, de monsterplaat in positie 1, waarbij u op de juiste oriëntatie let.
  10. Sluit het deksel van het instrument en druk op Start om de geautomatiseerde extractierun te starten.
  11. Laat het programma ononderbroken doorlopen tot voltooiing (ongeveer 35–40 min).
    OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van het geautomatiseerde extractieprogramma dat door het instrument wordt uitgevoerd.
PlatePositiePlatetypeReagensVolume per well
Monsterplate196-deep-well plateMonsterlysaat + binding bead-mengsel920 µL
Wasplate 1296-deep-well plateWasbuffer1,0 µL
Wasplate 2396-deep-well plateWasbuffer1,0 µL
Wasplate 3496-deep-well plate80% ethanol1,0 µL
Wasplate 4596-deep-well plate80% ethanol1,0 µL
Elutieplate696-well plateElutiebuffer20 µL
Tip Comb-plate7Standaard deep-well plate96-deep-well tip combN.v.t.

Tabel 2: Configuratie van de plaatbelading voor geautomatiseerde extractie van nucleïnezuren.
Plaatbeladingsposities, plaattypen, reagentia en reagentiavolumes gebruikt voor geautomatiseerde DNA-extractie met de magnetische partikelprocessor. De Monsterplaat bevat het monsterlysaat en het mengsel van bindingsbeads. N/A geeft aan dat er geen vloeibaar reagens aan de Tipcombplaat is toegevoegd.

​14. Nucleic zuren elueren en bewaren

  1. Open het instrument na voltooiing van de run en verwijder de elutieplaat voorzichtig om morsen van de eluaten te voorkomen.
    OPMERKING: Als er zichtbare overdracht van magnetische beads in de elutieplaat aanwezig is, breng de eluaten dan over naar een standaard 96-wells plaat en plaats de plaat gedurende 5–10 min op een magnetische standaard. Breng het geklaarde supernatant over naar een nieuwe 96-wells plaat of naar overeenkomstig gelabelde buisjes met behulp van een multichannelpipet.
  2. Breng het geëlueerde DNA over naar overeenkomstig gelabelde buisjes of bewaarplaten.
  3. Bewaar het geëlueerde DNA bij 4°C voor kortstondig gebruik, bij −20°C voor bewaring tot 6 maanden, of bij −80°C voor langdurige bewaring.

15. Voer de schoonmaak na de run uit

  1. Verwijder alle gebruikte platen en tipkammen uit de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor.
  2. Voer alle verbruiksartikelen af in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor biologische veiligheid en de afvoer van chemisch afval.
  3. Reinig eventuele morsingen met een geschikt laboratoriumdesinfectiemiddel.
  4. Schakel de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor uit, gevolgd door de hoofdstroomvoorziening.

Resultaten

Ontlastingstalen van zeven deelnemers werden succesvol verzameld met behulp van de beschreven verzamelworkflow, wat resulteerde in monsters met voldoende massa en een geschikte consistentie voor verdere verwerking. De monsters werden na verzameling op kamertemperatuur bewaard. De meeste monsters vertoonden een uniforme textuur en kleur, wat consistent is met passende verzamel- en bewaarcondities, terwijl een kleine subset een geringe variabiliteit in consistentie vertoonde, wat biologische variatie tussen deelnemers kan weerspiegelen. Tijdens het transport werd geen zichtbare contaminatie of lekkage waargenomen, en alle monsters werden verwerkt binnen het gevalideerde stabiliteitsvenster van de verzamelkit (tot 2 jaar op kamertemperatuur), wat de robuustheid en betrouwbaarheid van de verzamelworkflow ondersteunt (Figuur 1).

De geautomatiseerde workflow voor DNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van de geautomatiseerde magnetische partikelprocessor (Figuur 2A), de configuratie voor het laden van platen (Figuur 2B), de adapter voor deep-well platen (Figuur 2C), een centrifuge geschikt voor platen (Figuur 2D), een bead-beating instrument (Figuur 2E), een dempende steun (Figuur 2F), een plaat houder (Figuur 2G), een bead-plaat (Figuur 2H), een deep-well plaat (Figuur 2I) en een elutieplaat (Figuur 2J), volgens het geautomatiseerde extractieprogramma dat is samengevat in Tabel 1 en de configuratie voor het laden van platen die wordt gepresenteerd in Tabel 2. De DNA-concentratie en -zuiverheid werden beoordeeld voor representatieve fecesmonsters, en de resultaten zijn samengevat in Tabel 3. De DNA-concentratie werd gemeten met de Qubit double-stranded DNA High Sensitivity assay (fluorometrische DNA-kwantificatie-assay) op een Qubit fluorometer (fluorometrisch DNA-kwantificatie-instrument) volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden gemengd met de werkoplossing, 2 min geïncubeerd bij kamertemperatuur en samen met de twee assay-standaarden gemeten. De A260/A280 en A260/A230 absorptieverhoudingen werden bepaald met een NanoDrop spectrophotometer (microvolume-spectrofotometer). DNA-concentraties varieerden van 36 tot 87 ng/µL, waarbij alle monsters werden geëlueerd in een consistent volume van 20 µL, wat een directe vergelijking van het totale DNA-herstel tussen de preparaten mogelijk maakte (Tabel 3).

MonsterDNA-concentratie
(ng/µL)		A260/A280A260/A230Elutievolume
(µL)		Totale DNA-opbrengst
(ng)
Monster A621.831.7120012,400
Monster B361.891.512007,200
Monster C871.921.8520017,400
Monster D502.031.8720010,000
Monster E551.971.8120011,000
Monster F851.991.8820017,000
Monster G442.011.512008,800
Extractieblanko0——2000

Tabel 3: Representatieve DNA-terugwinning en zuiverheid na geautomatiseerde extractie uit menselijke fecesmonsters.
Representatieve DNA-concentratie, zuiverheid (absorptieverhoudingen A260/A280 en A260/A230), elutievolume en totale DNA-opbrengst gemeten na geautomatiseerde DNA-extractie uit menselijke fecesmonsters. De DNA-concentratie werd bepaald met een fluorometrische assay. De extractieblank diende als negatieve controle en leverde geen detecteerbaar DNA op.

Representatieve resultaten toonden variabiliteit in het DNA-herstel tussen de monsters. Hogere DNA-concentraties werden verkregen voor Monster A (62 ng/µL), Monster F (85 ng/µL) en Monster C (87 ng/µL), terwijl tussenliggende concentraties werden waargenomen voor Monster D (50 ng/µL) en Monster E (5 ng/µL). Monster B en Monster G leverden de laagste DNA-concentraties op ( respectievelijk 36 ng/µL en 4 ng/µL). De A260/A280 absorbantie-ratio's varieerden van 1,83 tot 2,03, terwijl de A260/A230 absorbantie-ratio's varieerden van 1,51 tot 1,88 (Tabel 3). Deze variatie is te verwachten bij fecale monsters en kan, naast technische variatie geassocieerd met de monsterverwerking, verschillen in monstersamenstelling en biologische variabiliteit weerspiegelen. De extractieblank gaf geen detecteerbaar DNA, wat duidt op de afwezigheid van detecteerbare contaminatie tijdens de extractieprocedure. Representatieve amplificatie van het bijna volledige bacteriële 16S rRNA-gen genereerde het verwachte PCR-amplicon van ongeveer 1,5 kb in de fecale DNA-monsters, terwijl de no-template controle geen amplificatie vertoonde (Figuur 3).

Gelelektroforese; 16S rRNA PCR-resultaten; DNA-ladder; analyse van het proces van baanseparatie.
Figuur 3Agarosegelelektroforese van polymerasekettingreactie (PCR)-amplicons van het bacteriële 16S ribosomaal ribonucleïnezuur (rRNA)-gen. 
Representatieve agarosegel die de amplificatie van het bijna volledige (~1,5 kb) bacteriële 16S rRNA-gen laat zien met behulp van de universele primers 27F en 1525R na DNA-extractie uit menselijke fecesmonsters. Baan M: 10 basepaar (bp) DNA-ladder; Baan 1: controle zonder template (blank); Banen 2–8: representatieve feces-DNA-monsters die het verwachte PCR-amplicon van ~1,5 kb vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De succesvolle implementatie van dit protocol wordt aangetoond door het terugwinnen van meetbaar DNA dat geschikt is voor downstream moleculaire toepassingen, waaronder PCR-gebaseerde assays, 16S rRNA-gensequencing, shotgun metagenomische sequencing en bibliotheekpreparatie. Gezamenlijk tonen deze representatieve resultaten aan dat het protocol consistent DNA terugwint uit menselijke fecesmonsters, terwijl de variatie wordt geïllustreerd die kan worden aangetroffen tussen biologische specimens.

Discussie

Het hier beschreven protocol biedt een gestandaardiseerde workflow voor de verzameling van menselijke fecale monsters en geautomatiseerde DNA-extractie voor microbioomstudies. Kritieke stappen omvatten representatieve fecale bemonstering uit meerdere regio's van de ontlasting, grondige homogenisatie met de stabilisatiebuffer, juiste opslag en transport onder de aanbevolen condities, efficiënte mechanische lyse en zorgvuldige behandeling tijdens de geautomatiseerde extractie. Consistente naleving van deze stappen minimaliseert technische variabiliteit en ondersteunt een reproduceerbaar DNA-herstel. Eerdere studies hebben op vergelijkbare wijze monsterverzameling, opslagcondities, homogenisatie en DNA-extractie geïdentificeerd als belangrijke bronnen van variabiliteit in microbioomanalyses en hebben het belang van gestandaardiseerde workflows voor reproduceerbare resultaten benadrukt5,6,7,8. De representatieve resultaten tonen een succesvolle monsterverzameling zonder zichtbare contaminatie of lekkage en een meetbaar DNA-herstel in alle geteste monsters.

Verschillende procedurele factoren kunnen de DNA-terugwinning beïnvloeden en moeten bij de implementatie in overweging worden genomen. Onvoldoende mechanische of chemische lysis, onvolledige homogenisatie, inefficiënte binding van nucleïnezuren of monsterverlies tijdens transfer- en wasstappen kunnen de DNA-opbrengst verlagen. Variaties in de fecale samenstelling, microbiële biomassa en monsterconsistentie kunnen daarnaast bijdragen aan verschillen in DNA-terugwinning tussen specimina. Daarom is een zorgvuldige uitvoering van het protocol, in het bijzonder tijdens de homogenisatie van monsters, bead-beating en geautomatiseerde extractie, essentieel voor het verkrijgen van consistente resultaten. Bij het oplossen van problemen moet de focus liggen op het verifiëren van de reagensbereiding, de instrumentinstellingen, het laden van de platen en de uitvoering van het geautomatiseerde extractieprogramma voordat de monsters worden verwerkt. Vergelijkbare aanbevelingen zijn beschreven in studies die microbioom-analytische workflows en DNA-extractiemethodologieën evalueren5,6,7,8,11.

De belangrijkste beperking van deze methode is de geobserveerde variabiliteit in DNA-opbrengst tussen biologische monsters. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, kunnen verschillen in DNA-concentratie zowel inherent biologische variatie tussen fecesmonsters als technische variatie tijdens de monsterverwerking weerspiegelen. Bijgevolge mag de DNA-concentratie alleen niet worden beschouwd als de enige indicator voor de extractieprestaties. Afhankelijk van de beoogde downstream-applicatie kunnen aanvullende maatregelen voor DNA-kwaliteit en geschiktheid vereist zijn. Om de DNA-kwaliteit en geschiktheid voor downstream moleculaire analyses verder te evalueren, werd het bacteriële 16S rRNA-gen geamplificeerd via PCR met gebruik van de universele primers 27F en 1525R. Succesvolle amplificatie van het verwachte 16S rRNA-genfragment van ongeveer 1,5 kb werd bevestigd via agarosegelelektroforese (Figuur 3), wat aantoont dat het geëxtraheerde DNA van voldoende kwaliteit was voor downstream-applicaties, waaronder sequencing en andere moleculaire assays. Eerdere benchmarkingstudies hebben eveneens aangetoond dat de DNA-opbrengst niet noodzakelijkerwijs correleert met de downstream sequencingprestaties of de nauwkeurigheid van microbiome-profilering8,11.

In vergelijking met handmatige extractieworkflows verminderen geautomatiseerde magnetische partikelprocessors de handmatige verwerking, standaardiseren ze de extractiecondities en ondersteunen ze hoogdoorvoer-monsterverwerking, terwijl operatorafhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd9,10. Echter, variaties in de consistentie van ontlasting en de microbiële biomassa kunnen de lyse-efficiëntie en de DNA-opbrengst beïnvloeden. Daarnaast worden micro-organismen met robuuste celwanden mogelijk niet volledig gelyseerd, wat de representatie van bepaalde taxa kan beïnvloeden. Ondanks deze beperkingen biedt geautomatiseerde extractie een robuuste en efficiënte benadering voor grootschalige studies naar het darmmicrobioom5,6,7,8,9,10. Het huidige protocol combineert gestandaardiseerde verzameling van fecale monsters met een geautomatiseerde DNA-extractieworkflow, waardoor een praktische en reproduceerbare benadering ontstaat voor microbiomestudies die een consistente verwerking van grote aantallen monsters vereisen. Gestandaardiseerde methodologieën zoals deze vergemakkelijken de reproduceerbaarheid tussen studies en zijn goed geschikt voor downstream moleculaire toepassingen, waaronder microbiome-profilering, metagenomische sequencing en andere sequencing-gebaseerde analyses5,6,7,8,9,10.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële of niet-financiële belangen zijn.

Dankbetuigingen

Wij betuigen onze dank aan SKAN Research Trust (India) voor het ter beschikking stellen van de middelen en de collaboratieve omgeving die dit werk mogelijk hebben gemaakt. Tevens danken wij Dr. Anushree Kogje voor haar hulp bij de feitencontrole en de redactionele ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
80% Ethanol (bereid uit absolute ethanol)MerckET00161000Vers bereiden uit absolute ethanol zoals beschreven in het protocol.
Absorberend materiaalKimtech34256Inbegrepen in de transportzak.
Hechtingsfolie voor plaatApplied Biosystems4306311MicroAmp Clear Adhesive Film.
Geautomatiseerde magnetische partikelprocessor (KingFisher Flex Purification System met 96 deep-well head)Thermo Fisher Scientific5400630Geautomatiseerd systeem voor nucleic acid extractie.
Afdichtbare transportzak met biohazard-labelZymo ResearchR1180Lekvrije transportzak voor monster transport.
BindIt-softwareThermo Fisher Scientific5189009Software gebruikt voor het wijzigen en overdragen van het geautomatiseerde extractieprotocol.
Opvangbuis met bevestigde spatel (30–50 mL)Zymo ResearchR1180Steriele opvangbuis met schroefdop.
DempingssteunQIAGEN69984TissueLyser Adapter Set (gebruikt als dempingssteun tijdens bead beating).
Deep-well plaat (96-wells)Thermo Fisher Scientific95040460KingFisher Deepwell 96 Plate.
WegwerphandschoenenZymo ResearchR1180Poedervrij aanbevolen.
ElutiebufferApplied BiosystemsA42357Geleverd bij de MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Fecale opvangerZymo ResearchR1180Steriel opvangapparaat.
Verwarmingsblok (96-well deep-well)Thermo Fisher ScientificSupplied with instrumentComponent van het KingFisher Flex Purification System.
LaboratoriumjasLocal supplierN/APersoonlijke beschermingsmiddelen.
LysisbufferApplied BiosystemsA42357Geleverd bij de MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Magnetische beadsApplied BiosystemsA42357Geleverd bij de MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Magnetische head (96-deep-well)Thermo Fisher ScientificIncluded with 5400630Negenenzestig-deep-well magnetische head geleverd bij het KingFisher Flex-systeem.
Magnetisch statief (96-wells)Thermo Fisher Scientific12332DAlleen vereist indien carry-over van magnetische beads wordt waargenomen.
MultikanaalpipetEppendorf3125000052Compatibel met 96-wells platen.
NanoDrop spectrofotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WGebruikt om A260/280 en A260/230 ratio's te bepalen.
Nucleic acid bindingsbufferApplied BiosystemsA42357Geleverd bij de MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Permanente markerSharpie3002Gebruik alternatief vooraf geprinte labels.
Pipetpuntjes, steriel gefilterd (10 µL)Tarsons528100Steriele gegradueerde filtertips.
Pipetpuntjes, steriel gefilterd (200 µL)Tarsons528104Steriele gegradueerde filtertips.
Pipetpuntjes, steriel gefilterd (1.000 µL)Tarsons529106Steriele filtertips; afknippen om wide-bore tips te maken waar aangegeven in het protocol.
Plaatadapter voor centrifugeEppendorf5820710004Rotor A-2-DWP-AT deep-well plaatadapter.
Plaat-compatibele centrifugeEppendorf5810Compatibel met de Rotor A-2-DWP-AT adapter.
Platenhouder voor bead beatingQIAGEN69984TissueLyser Adapter Set 2 × 96.
Vooraf geprinte labels (optioneel)BradyBBP12Alternatief voor permanente marker.
Qubit dsDNA HS AssayThermo Fisher ScientificQ33231Fluorometrische assay gebruikt voor DNA-kwantificatie.
Qubit fluorometerThermo Fisher ScientificQ33327Instrument gebruikt voor fluorometrische DNA-kwantificatie.
ReagensreservoirThermo Fisher Scientific8093Matrix Reagent Reservoir.
MonsterstabilisatiebufferZymo ResearchR1180DNA/RNA Shield Fecal Collection Kit.
Steriele conische buisHiMediaTCP106HGebruikt voor de bereiding van het binding bead mengsel.
TissueLyser III bead mill homogenisatorQIAGEN9003240Instrument voor mechanische lysis.
Tip-comb plaatThermo Fisher Scientific97002534KingFisher 96 Tip Comb voor deep-well magneten.
WasbufferApplied BiosystemsA42357Geleverd bij de MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.

Referenties

  1. Joshi D, et al. Roles of human gut microbiota in metabolic, neurodegenerative, cardiovascular and gastrointestinal diseases. Discov Biotechnol. 2026;3(1):8. doi:10.1007/s44340-026-00053-2.
  2. Jin X, et al. Gut microbiota and Parkinson’s disease: exploring pathogenesis and potential therapeutic strategies from a gut-brain axis perspective. iScience. 2026;29(2):114185. doi:10.1016/j.isci.2025.114185.
  3. Hou K, et al. Microbiota in health and diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):135. doi:10.1038/s41392-022-00974-4.
  4. Valencia S, et al. Human gut microbiome: a connecting organ between nutrition, metabolism, and health. Int J Mol Sci. 2025;26(9):4112. doi:10.3390/ijms26094112.
  5. Panek M, et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota: effects of collection, storage, DNA extraction and next-generation sequencing technologies. Sci Rep. 2018;8(1):5143. doi:10.1038/s41598-018-23296-4.
  6. Ece G, et al. Basic microbiome analysis: analytical steps from sampling to sequencing. Microorganisms. 2026;14(2):387. doi:10.3390/microorganisms14020387.
  7. Bharti R, Grimm DG. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Brief Bioinform. 2021;22(1):178-193. doi:10.1093/bib/bbz155.
  8. Zoruk P, et al. Impact of DNA extraction techniques and sequencing approaches on microbial community profiling accuracy. Front Microbiomes. 2025;4:1688681. doi:10.3389/frmbi.2025.1688681.
  9. Wallinger C, et al. Evaluation of an automated protocol for efficient and reliable DNA extraction of dietary samples. Ecol Evol. 2017;7(16):6382-6389. doi:10.1002/ece3.3197.
  10. Kwa WT, Sim CK, Low A, Lee JWJ. A comparison of three automated nucleic acid extraction systems for human stool samples. Microorganisms. 2024;12(12):2417. doi:10.3390/microorganisms12122417.
  11. Demkina A, et al. Benchmarking DNA isolation methods for marine metagenomics. Sci Rep. 2023;13(1):22138. doi:10.1038/s41598-023-48804-z.

Herprints en machtigingen

Tags

DNA extractiedarmmicrobioommicrobioomsequencingmonsterbehandelingherstel van nucle nezuren16S rRNA sequencingshotgunmetagenomicsmonsterbewaring

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.