Methodenartikel

Fabricage en gebruik van een microplaat met 32 ingebouwde LED's voor optogenetische dynamische controle

23 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/73445

⸱

22 september 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe men een 32-well microplaat met ingebedde lichtemitterende diodes (LED) voor optogenetische studies (LEMOS 2.0) kan vervaardigen, programmeren en bedienen in een microplaatlezer om high-throughput optogenetische stimulatie en kwantitatieve metingen van genexpressie in microbiële culturen mogelijk te maken.

Samenvatting

Optogenetische controle maakt lichtgestuurde regulatie van genexpressie mogelijk en biedt een programmeerbare interface tussen levende cellen en elektronische systemen. Echter blijft routineuze prototyping van optogenetische constructen beperkt door de beschikbare infrastructuur. Bestaande closed-loop platforms vereisen vaak chemostaten, microfluidica, robotische handling of aangepaste optische sensoren, wat de kosten kan verhogen, de toegankelijkheid kan verminderen of de meetprestaties kan beperken.

Hier wordt LEMOS 2.0 gepresenteerd, een bijgewerkte microplaat met ingebedde lichtemitterende diodes (LED) voor optogenetische studies, een kosteneffectief apparaat voor optogenetische stimulatie en karakterisering van genencircuits in standaard microplaatlezers. LEMOS 2.0 bouwt voort op het oorspronkelijke LEMOS-platform door de doorvoer te verhogen van 16 naar 32 microwells en lichtlekkage tussen aangrenzende microwells te verminderen, waardoor donkere condities als extra verlichtingsstatus mogelijk zijn. Het apparaat bestaat uit een driedimensionaal (3D)-geprint frame, individueel aanstuurbare LED's die naast elke microwell zijn geplaatst, een oplaadbare batterij en een ingebouwde microcontroller voor draadloze communicatie via Bluetooth. Biocompatibele polydimethylsiloxaan (PDMS) microwells worden direct in het apparaat gegoten via replica-mallen, waardoor stimulatie van bacteriële culturen door de transparante mal mogelijk is. Het apparaat past in standaard plaatlezers, wat meting van de optische dichtheid en fluorescentie mogelijk maakt.

Dit protocol beschrijft de volledige LEMOS 2.0-workflow, inclusief de fabricage van het apparaat, de assemblage van het circuit, de Arduino-programmering, het gieten van de PDMS-microwells, de instelling van de platlezer, de preparatie van stammen en culturen, de geautomatiseerde uitvoering van het experiment, het reinigen van het apparaat en de analyse van fluorescentie/OD600-gegevens. Ter demonstratie maakt het protocol gebruik van het CcaSR-optogenetische systeem, waarbij sfGFP-expressie wordt geactiveerd door groen licht en onderdrukt door rood licht. LEMOS 2.0 is bedoeld om optogenetische perturbatie en karakterisering van genexpressie toegankelijker te maken voor wet-labgebruikers, waardoor snellere design-build-test-learn-cycli mogelijk zijn zonder dat er gespecialiseerde bioreactor- of microfluïdische infrastructuur vereist is.

Inleiding

Optogenetica biedt een programmeerbare interface tussen levende cellen en elektronische controlesystemen. Door licht te gebruiken om genexpressie te reguleren, kan cellulair gedrag worden aangestuurd met temporele precisie, reversibiliteit en minimale verstoring van het cultuurmedium1. Wanneer ze worden gecombineerd met fluorescente of luminescente reporters, maken optogenetische systemen het mogelijk om biologische toestanden elektronisch te meten en via feedback te reguleren1. Deze bidirectionele optische interface heeft cybergenetische controle van cellulaire processen mogelijk gemaakt, waaronder genexpressie, celgroei en populatiesamenstelling2,3,4. Veel succesvolle gesloten-lus optogenetische systemen vereisen echter gespecialiseerde chemostaten5, microfluïdische apparaten4,6,7 of robotische bemonstering2,3,8, wat de toegankelijkheid kan beperken en routinematige design-build-test-learn cycli kan belemmeren.

Microplate-lezers behoren tot de meest gebruikte instrumenten voor het meten van microbiële groei en dynamiek van genexpressie. Ze leveren betrouwbare metingen van de optische dichtheid en fluorescentie over vele monsters, ondersteunen omgevingscontrole en zijn reeds geïntegreerd in standaard workflows voor synthetische biologie9. De verlichtingspaden in standaard commerciële plate-lezers zijn echter ontworpen voor optische meting, niet voor programmeerbare, putspecifieke optogenetische actuatie tijdens de kweekgroei. Als gevolg hiervan vereisen optogenetische experimenten vaak aparte verlichtingsapparatuur10,11,12,13,14, robotgestuurde overdracht tussen stimulatie- en meetplatforms8,15, of op maat gemaakte readout-hardware5,16,17. Deze extra stappen verminderen de temporele resolutie, introduceren variabiliteit door handelingen en compliceren closed-loop controle.

De LED-ingebedde microplaat voor optogenetische studies, of LEMOS, werd eerder ontwikkeld om dit hiaat te vullen18. LEMOS is een apparaat dat compatibel is met microplaatlezers en individueel aanstuurbare LED's bevat die rondom kweek-microwells zijn gepositionneerd. Het apparaat blijft gedurende het gehele experiment in een commerciële microplaatlezer, waardoor optische stimulatie en metingen van fluorescentie/optische dichtheid bij 600 nm (OD600) op hetzelfde platform kunnen plaatsvinden. In de oorspronkelijke implementatie ondersteunde LEMOS 16 kweek-microwells en werd het gebruikt om open-loop optogenetische stimulatie en closed-loop feedbackregeling van genexpressie in batchcultuur aan te tonen18. Het apparaat was gesynchroniseerd met een externe computer, zodat de LED-verlichting tijdens de meetvensters kon worden uitgeschakeld, waardoor directe interferentie met de fluorescentie- en optische dichtheidsmetingen werd geminimaliseerd.

Dit protocol beschrijft een bijgewerkte versie van het apparaat, LEMOS 2.0, en het gebruik ervan voor optogenetische experimenten in microbiële culturen. LEMOS 2.0 is herontworpen om het aantal onafhankelijk adresseerbare cultuur-microwells te verhogen van 16 naar 32, waardoor de experimentele doorvoersnelheid is verbeterd en er meer condities, replica's of controller-ontwerpen in één run kunnen worden getest. Het ontwerp van het apparaat is daarnaast aangepast om lichtlekkage tussen verlichte microwells en aangrenzende donkere microwells te verminderen, wat de betrouwbaarheid van donkere controles en experimenten met ruimtelijk gepatroneerde stimulatie verbetert. Deze aanpassingen maken het platform beter geschikt voor vergelijkende optogenetische karakterisering, het testen van controllers onder meerdere condities en de routinematige adoptie van het protocol door laboratoria die al microplaatlezers gebruiken.

LEMOS 2.0 is ontworpen voor microbiële batch-culturexperimenten die herhaalde OD600- en fluorescentiemetingen vereisen met programmeerbare rode, groene, blauwe of donkere verlichtingscondities. De plaatlezer moet kinetische OD600- en fluorescentiemetingen, temperatuurregeling, schudden, een aangepaste plaatindeling voor de 32 LEMOS-microwells en automatische export van meetbestanden naar een map die wordt gemonitord door het Python-aansturingsscript ondersteunen. De huidige implementatie is gevalideerd met een BioTek Synergy H1 microplate reader met BioTek Gen5 v3.14; implementatie met andere software voor plaatlezers vereist passende aanpassingen aan het exportformaat, de bestandsparser en de stappen voor schermautomatisering. Aangezien het apparaat LED's gebruikt met emissiepieken bij 620–630 nm, 515–525 nm en 465–475 nm, dienen gebruikers optogenetische actuatoren en fluorescente reporters te selecteren waarvan de activerings- en uitleesspectra compatibel zijn met deze kanalen19,20. Nieuwe gaststammen, reporters, optogenetische systemen, media, groeitemperaturen, bemonsteringsintervallen of controllerontwerpen zouden waarschijnlijk een herkalibratie van de LED-intensiteit, duty-cycle range, blanco-correctie, fluorescentienormalisatie en controllerparameters vereisen.

Het protocol beschrijft de volledige LEMOS 2.0-workflow: de fabricage van het apparaat, de assemblage van het circuit, de Arduino-programmering, het gieten van microwells van polydimethylsiloxaan (PDMS), de configuratie van de platenlezer, de preparatie van stammen en culturen, de geautomatiseerde uitvoering van experimenten, het reinigen van het apparaat en de analyse van fluorescentie/OD600-gegevens. Hoewel de voorbeeldworkflow zich richt op de optogenetische controle van genexpressie in bacteriën, kan hetzelfde raamwerk worden aangepast voor andere microbiële stammen, fluorescente reporters, optogenetische actuatorsystemen en controle-algoritmen. Door programmeerbare verlichting te combineren met standaardmetingen van platenlezers, biedt het vernieuwde LEMOS 2.0-platform een toegankelijke route voor high-throughput optogenetische perturbatie- en feedback-controle-experimenten in batchculturen.

Protocol

Alle experimentele procedures met betrekking tot Escherichia coli stam MG1655  werden uitgevoerd in aangewezen Bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2)-laboratoria bij Texas A&M University. Bacteriekweken en -manipulaties werden uitgevoerd in gecertificeerde klasse II veiligheidskasten overeenkomstig de standaardrichtlijnen voor biologische beveiliging. De procedures werden uitgevoerd onder aangewezen beveiligingsvoorwaarden, die zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Texas A&M Institutionele Biologische Veiligheidscommissie (IBV) onder vergunningnummer IBV2023-044.

1. Fabricage van het LEMOS 2.0-frame en LED-array

OPMERKING: Begin met het vervaardigen van LEMOS 2.0 door het frame van LEMOS 2.0 te 3D-printen en de LED-strips in het apparaatlichaam te plaatsen. Het doel is een mechanisch stabiel frame te verkrijgen waarin elke LED naast de overeenkomstige microwell is geplaatst. Juiste plaatsing van de LED's in dit stadium is belangrijk, omdat verkeerde uitlijning de stimulatie-uniformiteit kan verlagen en optische crosstalk tussen microwells kan verhogen.

  1. 3D-print het LEMOS 2.0 binnenframe en de gietvorm voor de PDMS-microputjes met behulp van de meegeleverde STL-bestanden in de GitHub-opslagplaats (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). Verwijder na het printen alle ondersteuningsmateriaal.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om polylactidezuur (PLA) filament te gebruiken en een fused deposition modelling (FDM) printer met de volgende afdrukparameters: 0,2 mm laagdikte, 20% opvulgraad voor het LEMOS 2.0-frame en 40% opvulgraad voor de gietvorm.
  2. Knip de LED-strips dwars door het midden van de soldeerpads in twee sets van 16 LEDs. Zorg ervoor dat aan elk uiteinde van de strip drie soldeerpads beschikbaar zijn voor solderen, zoals verder besproken in sectie 2.
  3. Vouw elke LED-strip dubbel, met de LED's naar buiten gericht (Aanvullende figuur 1A, Aanvullende video 1).
  4. Conformeer de LED-strip handmatig aan de geometrie van het apparaat en plaats deze tussen de microwellen, waarbij de +5 V soldeeraansluitingen naar beneden zijn gericht, en let op de pijl op de LED-stripAanvullende figuur 1A, Aanvullende video 1). Pas de positie van de strip iteratief aan totdat elke LED correct in zijn sleuf zit, voordat u verdergaat.

2. Assemblage en validatie van de elektrische schakeling

OPMERKING: Monteer de benodigde verbindingen voor stroom, opladen, microcontroller, schakelaar en LED's die nodig zijn voor de draadloze werking van het apparaat. Na montage moet het LEMOS 2.0-apparaat werken op de ingebouwde batterij, oplaadbaar zijn via de oplaadmodule en LED-opdrachten kunnen ontvangen van de externe Arduino-kaart. Controleer elke stroomverbinding voordat u de LED-strips aansluit, omdat onjuiste spanningsrouting de microcontroller of LED's kan beschadigen.

LET OP: Het protocol vereist ervaring met solderen, inclusief passende veiligheidsmaatregelen (bijvoorbeeld gebruik van een rookabsorber, beschermende oogbescherming en methoden om brandwonden te voorkomen), onderhoud van de soldeerbout en basisvaardigheden in through-hole-/draadsoldeertechnieken. Gebruikers zonder deze ervaring dienen eerst een opleiding te volgen voordat zij de stappen in dit gedeelte uitvoeren.

  1. Verzamel alle elektronische componenten die zijn opgenomen in de Overzicht van materialen en controleer op zichtbare fysieke beschadigingen. Raadpleeg het bedradingsschema (Aanvullend bestand 1).
  2. Stel de step-up-spanningsomvormer in op een uitgangsspanning van 5 V, in plaats van de standaard 12 V. Volgens de configuratiesleutel op de achterkant van de printplaat, verwijder de verbinding tussen paden A en B door warmte aan te brengen met een soldeerbout.
  3. Solder de VIN-pin van de Arduino Nano BLE Rev2 (hierna aangeduid als BLE Nano) aan de OUT+-pin van de step-up-converter en de GND-pin van de BLE Nano aan de OUT--pin van de step-up-converter (Aanvullende afbeelding 1B).
  4. Soldeer de step-up-converter IN– pin aan de negatieve (-) pen van de oplaadmodule van de batterij.
  5. Scheid de twee draden van de 'JST PH 2-polige kabel – Vrouwelijk aansluitstuk, 100 mm' door de uiteinden van de batterijverbinding los te trekken van de witte behuizing. Verkort elk tot ongeveer 70 mm om beter in het apparaat te passen, door te verkorten aan de kanten die niet zijn verbonden met de batterij (Aanvullende afbeelding 1C).
  6. Pas de schakelaar aan. Verwijder eerst de bevestigingspinnen in elke hoek. Vervolgens verkort u alle pinnen tot 30% van hun lengte. Verwijder daarna volledig T1, T3 en B3 (Notatie: T = boven, B = onder, genummerd van links naar rechts van 1 tot 4 wanneer men rechtstreeks naar de pinnen kijkt met de schakelaar bovenaan)Aanvullende figuur 1D).
  7. Solder de rode JST-kabel aan B2, waarbij het uiteinde voor de batterijaansluiting vrijblijvend wordt gelaten om aan de batterij te kunnen worden verbonden’s-mannelijke connector laterAanvullende figuur 1D).
  8. Solder een verbindingsdraad tussen B1 en B4.
  9. Solder de B+-pen van de oplaadmodule van de batterij aan B1, waarbij u ervoor zorgt dat de verbindingsdraad uit de vorige stap ook nog steeds aan B1 gesoldeerd blijft (Aanvullende afbeelding 1E).
  10. Solder de IN+ pen van de step-up-converter aan T4.
  11. Solder de pluspool (+) van de oplaadmodule van de batterij aan T2.
  12. Solder de zwarte JST-kabel aan de batterijladermodule B– speld. Laat het uiteinde voor de batterijverbinding los voor latere aansluiting op de batterij’mannelijke connector
  13. Controleer de verbindingen onder normale bedrijfsmodus van het apparaat. Sluit de Li-ionbatterij aan op de schakeling via de losse aansluitdraden van de batterij die zijn overgelaten tijdens de soldeerstappen, met de schakelaar in de middelste/uit-positie (Aanvullende afbeelding 1E).
  14. Zet de schakelaar naar de linker-/aan-positie (de zijde met slechts 2 bezette pinnen).
  15. Controleer de voeding van de BLE Nano via de ingebouwde voedings-LED (gemarkeerd als ‘AAN’, naast de USB-poort), die groen zou moeten oplichten (Aanvullende figuur 1E, Aanvullende video 1).
  16. Controleer de voeding van de step-up-converter via de ingebouwde LED, die blauw zou moeten oplichten.
    OPMERKING: Als de LED-indicatoren niet oplichten, controleer dan alle verbindingen met een multimeter voordat u verdergaat.
  17. Verwijder de eerste LED-strip (ingezet in stap 1.4) en soldeer draden aan beide sets VIN-, DIN- en GND-aansluitpunten. Plaats de LED-strip opnieuw, waarbij u de draden door de opening aan de zijkant van het frame voertAanvullende figuur 1F, Aanvullende video 1).
  18. Herhaal met de tweede LED-strip, volgens Aanvullende video 1.
  19. Solder de eerste LED-strip aan de GND-pen, D13-pen en VIN-pen van de BLE Nano.
    OPMERKING: het solderen aan de VIN-pen vereist het solderen van twee draden aan dezelfde Arduino-pen. Solder één draad binnenin de penopening en de andere naar de buitenkant van het gaatje, bij de inkeping in de Nano-kaart.
  20. Soldereer de twee LED-strips aan elkaar.
  21. Controleer de verbindingen met een multimeter in continuïteitsmodus door de VIN-pin op de BLE Nano en de +5 V-pad op de laatste niet-gelaste LED-pad aan te raken. Herhaal dit voor GND.
  22. Bevestig de LED-strips met een lijmpistool (Aanvullende afbeelding 1F, Aanvullende video 1). Werk langzaam en lijm slechts één of twee LED-paren tegelijk, zodat de lijm tussen de toepassingen kan afkoelen. Gebruik indien nodig een pincet om de LEDs op hun plaats vast te houden.

3. Programmeren van de centrale en perifere Arduino-bordjes

OPMERKING: Programmeer de twee Arduino-bordjes die worden gebruikt voor draadloze communicatie en LED-besturing. Het centrale Arduino-bord (Arduino Nano IOT 33) is tijdens een experiment aangesloten op de computer en zendt opdrachten door vanuit het Python-script. Het perifere Arduino-bord (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) bevindt zich in het LEMOS 2.0-apparaat en bestuurt de LED-array. Beide bordjes moeten vooraf worden voorzien van de juiste sketches voordat een experiment wordt gestart. Visuele indicatoren voor een succesvolle verbinding met het andere apparaat zijn beschikbaar door de vermelde regels in de Arduino-scripts te activeren: Centraal – Regels 34–37, Gele LED knippert; Perifeer – Regels 99–106, Groene LED knippert. Herneem deze regels nadat succesvolle verbindingen tussen apparaten zijn waargenomen. Anders kunnen knipperende LEDs aangaan terwijl het apparaat zich in de plaatlezer bevindt, wat de metingen mogelijk in gevaar kan brengen.

  1. Download de Arduino-bestanden van de GitHub-opslagplaats: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Download en installeer de nieuwste versie van de Arduino Integrated Development Environment (IDE) van http://www.arduino.cc/en/software.
  2. Installeer de nieuwste versie van het boardpakket via de Boardbeheerder (Hulpmiddelen > Raad > Boardsbeheerder) (Aanvullende figuur 2A).
    Centraal: Arduino SAMD-bordjes
    Randapparatuur: Arduino Mbed OS Nano-bordjes
  3. Installeer de volgende Arduino-bibliotheken in de bibliotheekbeheerder (Hulpmiddelen > Beheer bibliotheken) (Aanvullende figuur 2B): 'ArduinoBLE’ voor Bluetooth Low Energy-communicatie tussen zowel perifere als centrale apparaten, en ‘Adafruit_NeoPixel’ voor LED-programmering.
  4. Open het LEMOS_Central.ino Arduino-bestand in de Arduino IDE.
  5. Sluit het overeenkomstige apparaat aan op de computer via een universele seriële bus (USB)-datakabel.
  6. Selecteer de juiste COM-poort voor het aangesloten apparaat (Hulpmiddelen > Poort). Als de COM-poort onduidelijk is, observeer welke poort verschijnt en verdwijnt wanneer het apparaat wordt aangesloten en losgekoppeld.
  7. Selecteer het Arduino Nano 33 IoT-bord in het bordmenu (Hulpmiddelen > Raad).
  8. Upload het script naar het apparaat.
  9. Herhaal dit voor het LEMOS_Peripheral.ino-bestand en het randapparaat (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Vormen van PDMS-microputjes door replica-gieterij

OPMERKING: Giet transparante PDMS-microputjes direct in het LEMOS 2.0-frame met behulp van replica-molding21. De PDMS-microputjes bevatten de bacteriële culturen tijdens plaatlezerexperimenten en moeten een heldere, belvrije bodem hebben voor betrouwbare OD-metingen600 en fluorescencemetingen. Stof, luchtbellen of onvolledig uitharden kunnen variatie tussen putjes veroorzaken en dienen vermeden te worden tijdens het gieten. Zorg ervoor dat het oppervlak van de afzuigkap schoon is voordat wordt gegoten, omdat aanwezig stof of vuil in de PDMS de optische transparantie zal verstoren en leiden tot inconsistente OD-waarden600 metingen in microwells

LET OP: Werk in een afzuigkap wanneer u met onverhard PDMS omgaat. Vermijd huidcontact met het verhardingsmiddel.

  1. Desinfecteer het interieur van het LEMOS 2.0-frame, waarin de microputjes worden gegoten, door 70% ethanol te spuiten, waarbij direct contact met elektrische componenten, met uitzondering van de LEDs, vermeden moet worden. Laat het LEMOS 2.0-frame volledig drogen voordat PDMS-microputjes worden gegoten.
    OPMERKING: Blootstelling van de LEDs aan ethanol is veilig, maar zal alle andere elektrische componenten beschadigen.
  2. Bespuit de gietvorm voor de PDMS-microputjes met een ontkoppelmiddel en wacht 10 minuten totdat de spray is neergeslagen op het kunststofoppervlak. Een tweede bespuiting na nog eens 10 minuten kan de ontkoppeling van de vorm verbeteren, maar is optioneel.
    OPMERKING: Het ontkoppelmiddel (bijvoorbeeld Ease Release 200) zal de gietvorm hydrofoob maken, waardoor de gietvorm gemakkelijk kan worden verwijderd van de uitgeharde PDMS-microputjes.
  3. Weeg de vulstof en de basis van 184 siliconenelastomeer af en meng deze in een wegwerpbeker van plastic in een massaverhouding van 10:1 (basis tot vulstof).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 2,5 g uithardingsmiddel + 25 g basis te gebruiken voor een totaal van 27,5 g mengsel voor één LEMOS 2.0-apparaat; schaal proportioneel op als meerdere apparaten tegelijk worden gegoten.
  4. Meng grondig gedurende minstens 5 minuten met een wegwerpspatel of houten staafje, waarbij u de zijkanten en de bodem van de beker afschuift om een volledige menging te garanderen.
    OPMERKING: Grondig mengen is cruciaal. Ondervoldoende gemengde PDMS zal niet gelijkmatig uitharden en leidt tot inconsistente basislijn-OD600 metingen in microwells
  5. Plaats de beker met het PDMS-mengsel in een vacuümdroogkast. Pas vacuüm toe (minstens 65 cmHg / 25 inHg) ged selde 45–60 min, totdat alle zichtbare luchtbellen uit het mengsel zijn verwijderd. De PDMS zal uitzetten terwijl luchtbellen naar het oppervlak stijgen en kan over het randje van de beker lopen. Gebruik een container met minstens 3× het volume van het mengsel
    OPMERKING: Restluchtbelletjes in de uitgeharde PDMS zullen de optische doorgang van de bodems van de microwellen veranderen, wat leidt tot inconsistente uitgangswaarden voor de OD600 metingen
  6. Bevestig het LEMOS 2.0-frame aan de buitenste behuizing met klemmen van passende grootte aan alle vier zijden.
    OPMERKING: De paperclips beperken de hoeveelheid PDMS die in de spleet tussen de buitenste behuizing en het LEMOS 2.0-frame doordringt. Te veel PDMS in deze spleet kan de totale hoogte van het apparaat vergroten en voorkomen dat het LEMOS 2.0-frame vlak in de buitenste behuizing ligt. Het aanbrengen van Kapton-tape langs de onderste omtrek van het LEMOS 2.0-frame, naast de microkuilen, kan doordringing verder verminderen.
  7. Giet het ontgaste PDMS voorzichtig in het LEMOS 2.0-frame. Gebruik een spuit om PDMS aan elke microwell in het frame toe te voegen, zodat deze worden gevuld met een minimum aan luchtbellen.
    OPMERKING: Vorming van kleine belletjes is onvermijdelijk; deze zullen uiteindelijk naar het oppervlak stijgen en verdwijnen. Giet het ontgaste PDMS onmiddellijk na het ontgassen om de opnieuw introductie van belletjes tijdens het hanteren tot een minimum te beperken.
  8. Plaats de 3D-geprinte gietvorm in het met PDMS gevulde frame. Druk de vorm zacht en gelijkmatig aan, zodat de ronde uitsteeksels in de gietvorm in de gaten van het LEMOS 2.0-frame passen. De vorm bepaalt de vierkante microwells die naast de LED's zijn uitgelijnd. Veeg overtollig PDMS dat over de randen uitloopt weg met een schonen, pluisvrije doek.
  9. Laat het PDMS bij kamertemperatuur (25 °C) uitharden °C) op een vlakke ondergrond gedurende ten minste 30 uur. Indien nodig, versnel de uitharding door het apparaat op 37 °C te plaatsen. °C gedurende 4 uur, maar pas nadat alle zichtbare luchtbellen uit het PDMS zijn verwijderd.
    LET OP: Blootstel het LEMOS-apparaat niet aan temperaturen boven de 37 °C, omdat dit kan leiden tot oververhitting en barsten van de ingebouwde Li-ionbatterij.
  10. Verwijder de gietvorm nadat de PDMS-microputjes zijn uitgehard door de randen vast te pakken en met een gelijkmatige kracht omhoog te trekken. Zorg ervoor dat de PDMS-microputjes in het frame blijven zitten.
  11. Inspecteer elke microwell om ervoor te zorgen dat de wanden optisch helder zijn en de bodem vrij is van luchtbellen. Het LEMOS 2.0-apparaat met verse PDMS-microwells is nu klaar voor gebruik.

5. De microplaatlezer en workflow voor gegevensexport configureren

OPMERKING: Configureer de microplaatlezer voor LEMOS 2.0-compatibele kinetische metingen en automatisering van gegevensexport. De lezer moet de aangepaste LEMOS 2.0-microputjesindeling herkennen, OD-waarden verkrijgen600 en fluorescentiemetingen op vooraf bepaalde tijdstippen, en exporteer de gegevensbestanden naar de map die wordt gecontroleerd door het Python-besturingsscript. Voer een basismeting uit met steriel medium vóór biologische experimenten om te bevestigen dat de PDMS-microputjes en de instellingen van de plaatlezer consistente waarden opleveren. Dit protocol maakt gebruik van een BioTek Synergy H1-microplaatlezer die wordt bediend via BioTek Gen5-software versie 3.14.

  1. Start Gen5.
  2. Ga naar Plaattypes en importeren LEMOS 2.0.xml van GitHub, of stel alternatief de aangepaste plaatindeling voor LEMOS 2.0 in Gen5 in door te verwijzen naar Aanvullend bestand 2 (Afdeling 1)  en Aanvullend bestand 3.
  3. Voer een basismeting uit met het LEMOS 2.0-apparaat (microwellplaten gevuld met 200 µL steriele M9CA-media, bedekt met een medisch keur afsluitfolie [bijv. Breathe-Easy-folie]). Noteer de OD600 en de fluorescentiebasaalwaarden voor alle 32 microwells, en vergelijk deze waarden met die van een standaard 96-wells microplaat. Indien een groot verschil wordt waargenomen, giet de PDMS-microwells opnieuw, omdat luchtbellen of vuil in de uitgeharde PDMS de meest waarschijnlijke oorzaak zijn.
    OPMERKING: Breathe-Easy-folie is gasdoorlatend, waardoor aerobe omstandigheden voor celgroei worden behouden, en blijft tegelijkertijd optisch transparant om interferentie met fluorescentie en OD te voorkomen600 metingen
  4. Open het experimentprotocol closed_loop_protocol.prt uit de GitHub-opslagplaats in Gen5.
    OPMERKING: Voor het gemak is een vooraf geconfigureerd experimentbestand template.xpt beschikbaar in de GitHub-opslagplaats. De instellingen worden echter gedetailleerd beschreven in Aanvullend bestand 2 (Paragraaf 2) en Aanvullend bestand 3 als referentie voor probleemoplossing voor gebruikers met verschillende versies van Gen5.

6. Voorbereiding van bacterieculturen voor LEMOS 2.0-experimenten

OPMERKING: Bereid bacteriële culturen voor een tijdsverloopexperiment met LEMOS 2.0-optogenetica. Een zorgvuldige aanpak van de bereiding van de culturen is belangrijk, omdat de initiële dichtheid en lichtblootstelling vóór het experiment van invloed kunnen zijn op de gemeten genexpressiedynamiek. De demonstratiestam is Escherichia coli (E. coli) MG1655 met pSR58.6 en pNO286-322. pSR58.6 bevat superfolder groen fluorescerend eiwit (sfgfp) onder PcpcG2 en constitutieve CcaR, chlooramfenicolresistentie en een pColE1-oorsprong. pNO286-3 bevat constitutieve CcaS, spectinomycineresistentie en een p15A-oorsprong. Samen vormen deze plasmiden een groenlicht-induceerbaar, roodlicht-reprimeerbaar genexpressiesysteem. pSR58.6 en pNO286-3 werden getransformeerd in chemisch competente E. coli MG1655 met behulp van standaard warmteschoktransformatie23De platen werden in een doos bewaard om de cellen te beschermen tegen omgevingslicht en voortijdige activatie van het optogenetische circuit te voorkomen.

  1. Inoculeer een enkele kolonie van de CcaSR-optogenetische stam en een fluorescens-negatieve controliestam in afzonderlijke 14 mL ronde bodemkunststoffen buizen, elk gevuld met 2 mL M9CA-bouillon, aangevuld met 50 µg/mL spectinomycine en 25 µg/mL chlooramfenicol. Gebruik deze mediumformulering voor alle volgende kweekstappen gedurende het hele experiment.
  2. Dek elke buis af met aluminiumfolie en incubeer gedurende de nacht (14–16 uur) bij 37 °bij schudden op 220 tpm.
    OPMERKING: Het omwikkelen met folie handhaaft donkere omstandigheden en voorkomt onbedoelde activatie van het CcaSR-systeem. Alternatief kunnen de culturen worden geïncubeerd onder constante rode verlichting door de buizen op te slaan in een LED-behuizing die is aangesloten op dezelfde elektrische opstelling als beschreven in sectie 2, wat de geremde toestand van het systeem vóór het experiment beter nabootst.
  3. Overdragen 100 µL van elke overnachtcultuur in 2 mL vers medium in een nieuwe met folie omwikkeld kweekbuis. Incubeer 4 uur bij 37 °bij schudden op 220 tpm.
  4. Meet de OD600 van elke subcultuur na 4 uur met behulp van de microplaatlezer.
    OPMERKING: De culturen zouden een OD moeten hebben bereikt600 van 0,4–0.6.
  5. Verdun elk kweek tot OD600 = 0,1 in vers medium, pipetteer 200 µL in elke microwell van het LEMOS 2.0-apparaat, waarbij tijdens het pipetteren zorgvuldig wordt opgelet om de vorming van luchtbellen te voorkomen, en verzeg het apparaat met een medisch geschikte verzegelingsfolie.

7. Starten van een LEMOS 2.0 optogenetisch tijdverloopexperiment

OPMERKING: Start het geautomatiseerde LEMOS 2.0-experiment door de microplaatlezer, de centrale Arduino en het Python-besturingscript te synchroniseren. Tijdens de uitvoering coördineert de computer metingen met de plaatlezer, gegevensexport, Bluetooth-communicatie en LED-activering. Het is cruciaal dat het Gen5-venster zichtbaar blijft, omdat het Python-script schermgebaseerde automatisering gebruikt om met de software van de plaatlezer te communiceren. Een succesvolle start wordt aangegeven door geëxporteerde gegevensbestanden die verschijnen in de verwachte map, terminaluitvoer die Bluetooth-communicatie bevestigt, en LED-opdrachten die bij elk controle-interval worden bijgewerkt.

  1. Schuif de schakelaar naar links om het LEMOS 2.0-apparaat in te schakelen. De eerste LED op de LED-strip in LEMOS 2.0 zal groen oplichten.
  2. Sluit de centrale Arduino via USB aan op de computer en selecteer deze in de Arduino IDE in het keuzemenu (Hulpmiddelen > Raad).
  3. Open de Seriële monitor en sluit de perifere Arduino die is opgesteld in LEMOS 2.0 aan op de centrale Arduino.
  4. Schakel de indicator-LED op de LED-strip uit door de letter in te voeren 'o' naar de seriële monitor.
  5. Open het experimentbestand LEMOS-start-data.xpt in Gen5 en neem een basiswaardeaflezing van de culturen in het apparaat, waarbij u ervoor zorgt dat de OD600 en de fluorescentiewaarden zijn in overeenstemming met de verwachtingen. Sluit het experimentbestand.
  6. Open het protocolbestand dat in stap 5.4 is opgeslagen in Gen5 en sla het op als een experiment door te verwijzen naar de Aanvullend bestand 2 (Afdeling 3) en Aanvullend bestand 3.
  7. Zorg ervoor dat Python 3.10 of nieuwer op het systeem is geïnstalleerd, en installeer de vereiste pakketten met behulp van het meegeleverde requirements.txt-bestand.
  8. Open control_duty_cycle.py (voor duty cycle-experimenten) of control_pid.py (voor PID-experimenten) in een geschikte IDE, zoals Visual Studio Code of Spyder.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de werkmap is ingesteld op de map die alle Python-scripts bevat, zodat deze kunnen worden geïmporteerd tijdens de uitvoering van het script. De keuze van de IDE is niet van cruciaal belang.
  9. In de Hoofd gedeelte van het pythonscript, wijzig de bestand variabele om overeen te komen met de bestandsnaam die gekozen is voor het Gen5-experimentbestand in stap 7.6.
  10. Richt het experimentbestand en het Python-script naast elkaar inFiguur 1).
  11. Klik Uitvoeren op het Gen5-experiment en annuleer het zodra de kinetische stap begint.
    OPMERKING: Het Python-script zoekt naar een Ga verder knop na het klikken Uitvoeren. In een nieuw experimentbestand wordt deze knop echter pas weergegeven nadat de tweede meting is uitgevoerd of de kinetische run is afgebroken.
  12. Voer het Python-script uit. Minimaliseer of bedek het Gen5-venster niet tijdens de uitvoering.
    OPMERKING: Het Python-script maakt gebruik van schermgebaseerde automatisering en moet ongeveer elke 20 minuten in staat zijn het Gen5-venster te lokaliseren om de gegevensexport na elke kinetische cyclus te kunnen uitvoeren. Het verbergen of minimaliseren van het venster gedurende deze periode kan het experiment verstoren.

8. Schoonmaken van het apparaat, verwijderen van PDMS en opladen van de batterij

OPMERKING: Maak het LEMOS 2.0-apparaat na het experiment schoon en zet het terug. Verwijder de bacterieculturen en de gebruikte PDMS-microputjes, desinfecteer het herbruikbare frame en de behuizing, en laad de batterij op voor de volgende run. Vermijd dat de elektronische componenten zonder LED in aanraking komen met ethanol of overmatige mechanische belasting tijdens het schoonmaken.

  1. Pel zachtjes de medische afdichtfolie van de bovenkant van het LEMOS 2.0-apparaat en gooi deze weg.
  2. Aspireer en verwijder met een pipet alle cel-suspensievloeistof uit elke microwell volgens de procedures voor de verwijdering van biologisch afval.
  3. Scheid de buitenste behuizing van het LEMOS 2.0-frame door een constante, gelijkmatige kracht uit te oefenen. Vermijd overmatig buigen of wringen van het PLA-frame, omdat dit kan leiden tot barsten of blijvende vervorming.
  4. Verwijder de dikke PDMS-laag van de buitenkant van het frame en gebruik een pincet om de PDMS-microputjes zorgvuldig te verwijderen uit het LEMOS 2.0-frame.
  5. Desinfecteer het LEMOS 2.0-frame en de buitenste behuizing met 70% ethanol, waarbij u direct contact met elektrische componenten vermijdt, behalve met de LEDs, zoals beschreven in stap 4.1.
  6. Laad de Li-ionbatterij op voor het volgende experiment:
    1. Schuif de schakelaar naar rechts/in de laadpositie.
    2. Sluit de USB aan op de laadmodule.
    3. Controleer het opladen via de ingebouwde LED, die knippert tijdens het opladen (Aanvullende figuur 1E).

9. Analyseren van fluorescentie- en groeiddynamica

OPMERKING: Verwerk de fluorescentie en OD600 tijdens het LEMOS 2.0-experiment gegenereerde gegevens. De analyse-notebook importeert de geëxporteerde plaatlezergegevens, past blanco- en negatieve controlecorrecties toe, berekent de genormaliseerde fluorescentie en genereert tijdsgrafieken. Controleer voordat u de notebook uitvoert of de toewijzingen van de microwell's en de conditielabels overeenkomen met de experimentele opzet.

  1. Open een van beide FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb of FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    OPMERKING: Dit maakt gebruik van fluorescentie (FL) en optische dichtheidsgegevens (OD), die zijn opgeslagen in deze bestanden en zijn gegenereerd tijdens de run: Databestand/fl.csv en Databestand/od.csv. Het PID-analiserekenblad gebruikt ook de afwijkingen in expressie ten opzichte van de instelwaarde die zijn opgeslagen in Databestand/fouten.csv.
  2. Stel de voorwaardenvariabele in met voorwaardennamen en wells.
  3. Stel in negatieve_wells gelijk aan een tussen haakjes weergegeven lijst met namen van negatieve controle-microputjes.
  4. Stel in od_blank en fl_blank naar gemiddelden over blanco-wells, of naar bekende waarden als er geen blanco is uitgevoerd.
  5. Stel in kleuren_4_figuren naar de gewenste kleuren (volledige lijst van genoemde kleuren beschikbaar op https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
  6. Stel figsize in op de gewenste breedte en hoogte van de resulterende figuren in inches.
  7. Bevestig de bestandsnamen die worden weergegeven onder Constanten.
  8. Voer het notitieblok uit, er worden figuren gegenereerd als .png-bestanden.

10. Probleemoplossing

  1. Tijdens het aansluiten van de LED, als de soldeerpads van de LED eraf breken, dient u het volgende te overwegen:
    1. Buig de hoek van de LED-strip om de draden gemakkelijker door de bedradingopening te kunnen leiden.
    2. Als een stijvere (massieve) draad werd gebruikt, wissel dan over naar een flexibelere (gevlochten) draad.
  2. Als de schakelaar wordt ingeschakeld en de BLE Nano'Als de stroom-LED niet oplicht, overweeg het volgende:
    1. Controleer eerst of de batterij is opgeladen. Zet de schakelaar in de laadstand en sluit de laadmodule aan op de stroomvoorziening. Indien de batterij vol is, dient de indicatie-LED na enkele minuten te stoppen met knipperen en continu groen te branden. Indien de batterij leeg was, laad deze dan volledig op voordat u opnieuw probeert.
    2. Als de batterij is opgeladen en de LED blijft nog steeds uit, gebruik dan een multimeter om de spanning over de BLE Nano te meten's VIN- en GND-pinnen.
      1. 0 V: Een bedradingverbinding is verbroken. Controleer elke soldeerverbinding langs de batterij > schakelaar > step-up-converter > Nano pad en herstroom elk aansluitpunt dat er koud of onvolledig uitziet.
      2. 5 V: De stroomvoorziening bereikt de Nano correct, dus het bord zelf is mogelijk beschadigd. Probeer de Nano via een kabel van stroom te voorzien om dit te bevestigen. Als de stroom-LED nog steeds niet oplicht, soldeer een nieuwe Nano om de defecte Nano te vervangen.
      3. Meer dan 5 V: de step-up-converter is niet geconfigureerd om 5 V uit te voeren. Controleer of paden A en B zijn losgekoppeld op de step-up-converter, zoals beschreven in de sectie over apparaatassembly.
  3. Als het Python-script niet wordt uitgevoerd, houd dan het volgende in overweging:
    1. Controleer of het Python-script wordt geopend vanuit de volledige projectmap en niet als een stand-alone bestand; zowel control_duty_cycle.py als control_pid.py is afhankelijk van andere lokale modules en zal mislukken wanneer ze onafhankelijk worden geopend.
    2. Controleer of de Arduino IDE is gesloten, omdat de Arduino slechts één actieve verbinding tegelijk kan hebben. Het besturingssysteem verleent toegang aan het programma dat de poort als eerste opent.
    3. Controleer of het Gen5-protocol correct is ingesteld, met name wanneer u verschillende software gebruikt. Raadpleeg Aanvullend bestand 2 (Paragraaf 2).
    4. Zorg ervoor dat de vereiste pakketten zijn geïnstalleerd. Maak een virtuele omgeving aan en installeer de pakketten zoals vermeld in het bestand requirements.txt.
  4. Als het experiment onverwacht stopt, houd dan het volgende in overweging:
    1. Stopt na de eerste cyclus: het exportpad van Gen5 is waarschijnlijk verkeerd geconfigureerd. Controleer of de exportbestemming overeenkomt met de map waarvan het Python-script verwacht te lezen bestand variabele
    2. Stopt na enkele cycli: PyAutoGUI herkent af en toe beeldschirmelementen niet meer, vaak na een wijziging in schermresolutie, weergaveschaling of venstergrootte. Neem opnieuw de referentieschermopnamen op die worden gebruikt door het script, en houd het Gen5-venster tijdens de uitvoering actief en in de voorgrond; het Python IDE-venster mag worden geminimaliseerd.
    3. In het geval dat Gen5 meldt dat de kamertemperatuur buiten het streefbereik ligt, laat de lezer eerst evenwichtigen voordat u verdergaat. Overschrijd de temperatuurwaarschuwing niet, omdat dit een auditrapportvenster kan activeren dat handmatig gesloten moet worden en de automatisering kan verstoren.
  5. Als de OD ongebruikelijk hoog of inconsistent is600/fluorescentiebasiswaarden over microwellplaten worden waargenomen, overweeg het volgende:
    1. Inspecteer de PDMS-microputjes op vastzittend stof of vuil, omdat dit licht verstrooit en de metingen verhoogt.
    2. Vermijd het langdurig onbedekt laten van PDMS en blootstellen aan omgevingslucht voordat het wordt gegoten of gebruikt.
  6. Als cellen geen waarneembare reactie op licht vertonen ondanks het uitvoeren van het experiment, overweeg het volgende:
    1. Bevestig LED "op" opdrachten worden uitgegeven door zowel de IDE-terminaluitvoer als het BLE-communicatieprotocol te controleren.
    2. Als er wel commando's worden verzonden maar er geen licht zichtbaar is, controleer dan de soldeerverbindingen van de LED met een multimeter.

Resultaten

LEMOS 2.0 is een platform met 32 putjes dat compatibel is met microplaatlezers24 voor programmeerbare optogenetische stimulatie en kwantitatieve meting van genexpressie (Figuur 2A,B). Elk microputje is gekoppeld aan een individueel adresseerbare WS2812B lichtemitterende diode (LED), die wordt aangestuurd door een Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 via de Adafruit_NeoPixel-bibliotheek. Het apparaat communiceert via Bluetooth met een externe computer, waardoor verlichtingscommando's tijdens het experiment kunnen worden bijgewerkt. Verse PDMS-microputjes worden voor gebruik in het apparaat gegoten via replica-gieten (Figuur 2C,D). E. coli-culturen die in LEMOS 2.0 zijn gekweekt bij 30 °C onder constante LED-verlichting vertoonden reproduceerbare groei in de microputjes, wat aantoont dat het apparaat bacteriële cultuur en metingen met de plaatlezer ondersteunt gedurende het experimentele tijdsverloop18 (Figuur 2E). Bovendien waren de groeicurves vergelijkbaar bij verschillende verlichtingscondities, wat aangeeft dat LED-blootstelling onder deze instellingen de celgroei niet meetbaar beïnvloedde.

Om optogenetische controle over genexpressie te demonstreren, is het CcaSR v3.0-systeem gebruikt22, een door groen licht geactiveerd en door rood licht onderdrukt twee-componentensysteem dat de expressie van sfGFP reguleert (Figuur 3A). Onder groen licht autophosphoryleert CcaS en draagt de fosfaatgroep over aan de responsregulator CcaR, die dimeriseert om de PcpcG2-promotor-afhankelijke expressie van sfGFP te activeren. Onder rood licht defosforyleert CcaS, waardoor de activiteit van PcpcG2 afneemt en de expressie van sfGFP wordt onderdrukt. De CcaSR-plasmiden werden getransformeerd in E. coli MG1655 en gebruikt voor de experimenten die in dit protocol worden beschreven (Figuur 3B). Tijdens het experiment mat de microplaatlezer elke 10 min de OD600 en fluorescentie. Om te voorkomen dat de LED-verlichting de optische metingen zou storen, werden de LED's geprogrammeerd om uit te schakelen tijdens de meetvensters aan het begin en einde van elk interval van 10 min (Figuur 3C).

De crosstalk tussen de putjes werd eerst geëvalueerd door microwells onder donkere condities verticaal of horizontaal naast microwells onder constante groene lichtilluminatie te plaatsen (Figuur 3D). Donkere microwells naast microwells met constante groene lichtilluminatie vertoonden geen significante toename in expressie vergeleken met donkere microwells zonder verlichte naburige microwells, wat wijst op minimale lichtlekkage tussen de microwells. Op basis van deze resultaten werd voor volgende experimenten een pulse width modulation (PWM)-waarde van 1 uit 255 gebruikt om voldoende optische stimulatie te bieden terwijl de crosstalk tussen de putjes werd geminimaliseerd.

Open-loop stimulatie werd vervolgens gebruikt om de actueringsparameter voor LEMOS-gebaseerde optogenetische controle te definiëren. De actueringsparameter was de duty cycle van het groene licht, gedefinieerd als het fractiegedeelte van elk actief illuminatievenster dat aan groen licht werd toegewezen, waarbij de resterende illuminatietijd aan rood licht werd toegewezen. Elk controleinterval duurde 10 min, waarbij de LED's gedurende 8 min actief waren en gedurende de resterende 2 min uitstonden om interferentie met plate-reader metingen te voorkomen. Groen-licht duty cycles van 5% tot 80% produceerden een gegradeerde sfGFP-expressie, wat aantoont dat de duty cycle kan worden gebruikt als een instelbare input voor optogenetische regulatie (Figuur 3E). De expressiesnelheid nam toe naarmate de duty cycle steeg van 5% naar 40%, zonder significante verdere toename bij hogere duty cycles (Figuur 3F), wat suggereert dat het systeem verzadiging nadert bij langere stimulatie met groen licht.

Ten slotte werd een closed-loop feedbackregeling geïmplementeerd om te testen of LEMOS 2.0 de genexpressie dynamisch kon reguleren richting een gedefinieerd setpoint25 (Figuur 4A). De componenten van het regelsysteem waren als volgt toegewezen: actuator — LED's, controller — externe computer waarop het PID-script draaide, en gemeten output — sfGFP-fluorescentie genormaliseerd naar OD600. De controller vergeleek de gemeten FL/OD600-waarde met het toegewezen setpoint en actualiseerde de duty cycle van het groene licht voor het volgende interval van 10 min. Proportioneel-integraal-afgeleide (PID) regeling werd geïmplementeerd, waarbij de duur van de blootstelling aan groen licht in elke cyclus, tgreen, werd berekend als:
figure-results-1

Hier is e(t) de fout tussen het gemeten FL/OD600-signaal en het instelpunt op tijdstip t. K is de proportionele versterking, τI  is de integraal-tijdconstante en τD is de afgeleide-tijdconstante. De parameters voor de gesloten-lusregeling zijn geselecteerd met behulp van het model voor genexpressie over groeistadia (GEAGS), dat eerder is beschreven26. Met deze parameters benaderde en volgde het gemeten signaal het doelinstelpunt voor FL/OD600 (Figuur 4B).

De overeenkomstige opdrachten voor de duty-cycle worden weergegeven in Figuur 4C. De staafhoogte representeert de fractie groen licht die tijdens elk illuminatievenster van 8 min werd toegediend. De opdracht voor de duty-cycle veranderde in discrete stappen omdat de controller de invoer eenmaal per 10 min bijwerkte. Naarmate de sfGFP-expressie het instelpunt naderde, nam de blootstelling aan groen licht af en de blootstelling aan rood licht toe. Nadat het gemeten signaal het instelpunt had bereikt, werd nog steeds een laag niveau van groene lichtinvoer waargenomen. Deze residuele regelingsinvoer weerspiegelt waarschijnlijk de afgeleideterm die reageert op de scherpe verandering in de expressiesnelheid nabij het instelpunt. Deze resultaten tonen aan dat LEMOS 2.0 modelgestuurde PID-feedbackregeling van optogenetische genexpressie in batchcultuur kan implementeren.

figure-results-2
Figuur 1: Opstelling van de LEMOS 2.0-software tijdens een experiment. Voorbeeldschermopname waarop het Python-besturingsscript in VS Code te zien is (links), waarbij de LED-commando's in de terminal verschijnen zodra ze naar de Arduino-microcontroller worden verzonden. De projectmap met het hoofdscript en de bijbehorende functiemodules is zichtbaar in het bestandsverkennerpaneel. Aan de rechterkant toont de software van de platenlezer een lopende kinetische meetcyclus; aan het einde van elke cyclus triggert het Python-script automatisch de volgende run via de Gen5-interface en werkt het de commando's voor de LED-duty cycle dienovereenkomstig bij. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 2: Constructie van het LEMOS-apparaat en karakterisering van de celgroei. (A) Explosieschema van het LEMOS-apparaat met weergave van de PDMS-microwells, stimulatie-LED's, batterij, schakelaar, microcontroller, oplaadmodule, apparaatframe en buitenmantel. (B) Geassembleerd apparaat met PDMS-microwells gevuld met gedeïoniseerd water. (C) PDMS-microwell gegoten in het LEMOS-apparaat. Gereproduceerd uit Namboothiri et al. (2026)18, gelicentieerd onder CC BY 4.0. (D) 3D-geprinte mal voor het gieten van microwells (E) Groeicurves van E. coli in LEMOS bij 30 °C (N = 3 technische replica's voor wells die continu werden belicht met respectievelijk groen of rood licht, evenals wells die in het donker werden gehouden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 3: Karakterisering van het optogenetische systeem in LEMOS en open-loop regelingsdynamiek. (A) Plasmidkaart van het CcaSR twee-componenten optogenetische systeem: groen licht (522 nm) activeert CcaS/CcaR om de expressie van sfGFP op te reguleren, en rood licht (620 nm) reguleert de expressie naar beneden. (B) Protocol voor het uitvoeren van optogenetische experimenten met het CcaSR optogenetische systeem. (C) Schematische weergave van de werking van LEMOS. Gedurende de tijdsperiode van 12 u blijft het apparaat in de microplate-reader. De reader meet de sfGFP-fluorescentie en OD600, waarna de gegevens naar een computer worden gestreamd, die de tijdregistratie beheert en Arduino-schetsen aanstuurt. De Arduino-schetsen bevelen de ingebouwde microcontroller om de LED-verlichting tijdens elke meting tijdelijk uit te schakelen. Aangepast van Namboothiri et al. (2026)18, gelicentieerd onder CC BY 4.0. (D) Effect van interferentie door groen licht op niet-gestimuleerde cellen in donkere condities. In de plaatindeling geven groene vakjes microwells met groen licht aan (N = 9), grijze vakjes geven microwells in donkere condities aan zonder interferentie van licht in de omliggende microwells (N = 6), paarse vakjes geven donkere microwells aan (N = 3) die verticaal grenzen aan microwells met groen licht, gele vakjes geven donkere microwells aan (N = 3) die horizontaal grenzen aan microwells met groen licht, en blauwe vakjes geven microwells met groen licht aan (N = 2) met een controlestam om autofluorescentie te meten. (E) Open-loop responsen in LEMOS bij variërende duty cycles van groen licht (5–80%, N = 3) als actuatieparameter. Doorgetrokken lijnen geven gemiddelden aan; gearceerde banden geven standaarddeviaties aan. (F) Gemiddelde expressiesnelheid tijdens de exponentiële groeifase bij variërende duty cycles. N staat voor het aantal technische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 4: Gesloten-lus feedbackregeling in LEMOS 2.0. (A) Schema van de gesloten-lus werking: de microplaatlezer fungeert als de sensor die FL/OD600 meet, de computer fungeert als de regelaar en het LEMOS 2.0-apparaat activeert LED's om de genexpressie te reguleren. Het proces is de genexpressie in levende bacteriële cellen. Aangepast naar Namboothiri et al. (2026)18, gelicentieerd onder CC BY 4.0. (B) Proportional-integral-derivative (PID) regeling bij het volgen van het FL/OD600 instelpunt (SP = 18,5 × 105 a.u.). Referenties met constant licht zijn groen en rood (N = 3). De runs voor het volgen van het instelpunt worden beschreven door oranje lijnen (N = 3). Doorgetrokken lijnen geven het gemiddelde FL/OD600 aan; gearceerde banden geven standaarddeviaties aan. De stippellijn markeert het instelpunt. (C) Representatieve duty-cycle commando's gegenereerd door de PID-regelaar tijdens het volgen van het instelpunt in een gesloten lus. De balkhoogte geeft de fractie groen licht aan die tijdens elk illuminatie-interval is geleverd. N geeft het aantal technische replicaten aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PlatformKweekformaatUitlezingTerugkoppelingsregeling gedemonstreerdGroeivormBeperking aangepakt door LEMOS 2.0
LEMOS 2.032 PDMS-microwells in platenlezerCommerciële plaatlezerModelgestuurde PID-setpointtrackingGeschudde batchcultuurDeze studieDeze studie
LEMOS 1.016 PDMS-microwells in platenlezerCommerciële plaatlezerModelgestuurde PI- en PID-setpoint-trackingGeschudde batchcultuurLagere doorvoer; beperkte compatibiliteit met donkere omstandigheden18
Geautomatiseerde turbidostaat + robotische bemonsteringTurbidostaatFlowcytometrie + OD-sensorPI-, PID-, MPC-setpointtrackingContinue kweekVereist robotische bemonstering; vertraging tussen meting en actuatie2, 3
Mother-machine microscopieSingle-cell microfluidicaLive-cell microscopieSingle-cell feedback / MPCContinue perfusieVereist gespecialiseerde microfluidica en microscopie4, 6, 7
Chi.BioGeminimaliseerde turbidostaatIngebouwde OD/FL-sensorenPI-setpoint-trackingContinue cultuurHet ingebouwde dynamische bereik van de sensor beperkt de prestaties van de fluorescentie-feedback5
LichtbuisarrayKweekbuisjesExterne OD/flowcytometrieAlleen open-loopGeschudde batchcultuurHandmatige bemonstering; beperkte online uitlezing van de groei10
LAVA / LITOS / RainbowCap / DiyaMultiwell-verlichtingsapparatenCommerciële platenlezerAlleen open-loopBatchcultuurGescheiden stimulatie/uitlezing; beperkte automatisering12, 13, 14, 15
Lustroverlichting van 96-wells plaatCommerciële plaatlezerAlleen open-loopBatchcultuurVereist robotische overdracht tussen stimulatie en uitlezing8
RT-OGENEMultiwell/microfluïdisch-compatibele tafelCamera-gebaseerde OD/FLClosed-loop poging ondernomen; beperkt door uitlezingStatische batchcultuurCamera-gebaseerde uitlezing en statische kweek beperken de prestaties van de regeling16
optoPlateReaderAangepaste 96-wells reader/stimulatorIngebouwde fotodiodesBang-bang set-point trackingGeschudde batchcultuurAfhankelijkheid van reporter/filter en lagere fluorescentiegevoeligheid beperken de flexibiliteit van de uitlezing11,17

Tabel 1: Vergelijking van LEMOS 2.0 met bestaande optogenetische platforms2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Aanvullende figuur 1: Assemblagebeelden. (A) Gebogen LED-strip en gevormde strip in het apparaat. (B) Nano BLE Sense Rev 2 gesoldeerd aan de step-up converter, die op zijn beurt is gesoldeerd aan de batterijoplaadmodule. (C) Originele en gemodificeerde versies van de ‘JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100mm’. (D) Originele schakelaar, gemodificeerde schakelaar, gesoldeerde rode JST PH-kabel en een korte jumper gesoldeerd tussen twee pinnen aan weerszijden van de onderste rij. (E) Integratie van de schakelaar in de circuitassemblage en het van stroom voorzien van het circuit. (F) Zijaanzicht van LED's en LED-strips die met lijmpistool zijn gepositioneerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Schermafbeeldingen van de Arduino IDE-instellingen. (A) Schermafbeelding van de Boards Manager, waarop een zoekopdracht naar een van de vereiste boards wordt getoond. (B) Schermafbeelding van de Library Manager, waarop twee van de vereiste bibliotheken worden getoond. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1. LEMOS Bedradingsschema. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Protocol voor het instellen van een aangepaste plaatindeling voor LEMOS 2.0 in Gen5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Screenshots van de softwarestappen die worden beschreven in Aanvullend bestand 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Video 1: Assemblagevideo met de volgende stappen. Manipulatie van de LED-strip in het frame, het vastzetten van de LED-strip met lijmpistool, de indeling van de bedrading naar en tussen de LED-strips, en de uiteindelijke assemblage met de elektronische schakelingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschrijft de fabricage en bediening van LEMOS 2.0, een microplaat met 32 putjes waarin LED's zijn ingebed voor optogenetische stimulatie en feedback-controle-experimenten in een standaard microplaatlezer. Representatieve experimenten tonen aan dat LEMOS 2.0 microbiële groei ondersteunt (Figuur 2E) zonder dat er significante fototoxiciteit werd waargenomen onder belichting. Daarnaast vermindert LEMOS 2.0 lichtlekkage naar aangrenzende microwells onder donkere omstandigheden (Figuur 3D), waardoor de betrouwbaarheid van donkercontroles en ruimtelijk gepatroneerde stimulatie-experimenten wordt verbeterd. Bovendien maakt LEMOS 2.0 optogenetische actuatie op basis van de duty-cycle mogelijk (Figuur 3E) en implementeert het een closed-loop PID-regeling van genexpressie in batchculturen (Figuur 4B).

Fotobleken is een belangrijke overweging bij optogenetische experimenten, omdat dezelfde optische workflow wordt gebruikt voor zowel activering als fluorescentie-uitlezing27. LEMOS 2.0 maakt gebruik van commerciële RGB-leds die drie diodes bevatten met emissiepieken op 620–630 nm (rood), 515–525 nm (groen) en 465–475 nm (blauw)19. Daarom moeten de selectie van de reporter en de bedrijfsintensiteit van de led worden gekozen om de spectrale overlap tussen de activeringsgolflengten en het excitatiespectrum van de fluorescente reporter te minimaliseren, terwijl voldoende lichtinvoer voor optogenetische regulatie behouden blijft. In dit protocol werd het CcaSR-systeem gebruikt, waarvan de reacties op groen en rood licht binnen de brede activatie- en deactivatiebanden vallen die voor dit systeem zijn gerapporteerd22, en werd sfGFP-fluorescence gemeten met 485 nm excitatie. Aangezien de groene en rode activeringsgolflengten die worden gebruikt voor CcaSR-controle gescheiden zijn van de sfGFP-excitatiegolflengte, en omdat de led-output werd geminimaliseerd tot een PWM-intensiteit van 1 op 255 terwijl er nog steeds een robuuste optogenetische regulatie plaatsvond, wordt verwacht dat fotobleken door led-activering beperkt is. Tijdens langdurige tijdreeksexperimenten kan er nog steeds enige fotobleking optreden; onder de hier gebruikte omstandigheden was dit echter niet groot genoeg om de gemeten optogenetische inductie, duty-cycle-respons of closed-loop tracking-dynamiek te maskeren20.

Verschillende stappen zijn cruciaal voor betrouwbare prestaties. Tijdens de fabricage moet elke LED worden uitgelijnd met de overeenkomstige microwell om de uniformiteit van de stimulatie te behouden en optische overspraak te verminderen. Tijdens de montage van het circuit moet de step-up converter worden geconfigureerd op 5 V voordat de microcontroller en de LED-strips worden aangesloten. Het gieten van PDMS vereist tevens speciale zorg, omdat luchtbellen, stof, vuil of onvolledige uitharding de optische transmissie door de bodems van de microwells kunnen beïnvloeden en inconsistente OD600- of fluorescentiebaselines kunnen veroorzaken28. Daarom moet vóór biologische experimenten een nulmeting met steriel medium worden uitgevoerd. Als er grote verschillen in de OD600-metingen tussen wells worden waargenomen ten opzichte van de rest van de plaat, moeten de betreffende wells worden geïnspecteerd op de eerder genoemde fabricageproblemen. Afhankelijk van de ernst moeten deze microwells ofwel worden uitgesloten van de analyse, of moeten de microwells volledig opnieuw worden gegoten.

Softwareconfiguratie is een andere veelvoorkomende oorzaak van mislukte experimenten. De huidige workflow is afhankelijk van de gecoördineerde werking van de plate-reader-methode, de Gen5-data-export, het Python-aansturingsscript en de Bluetooth-communicatie tussen de centrale en perifere Arduino-boards. Het exportpad en het bestandsformaat moeten overeenkomen met de structuur die door het Python-script wordt verwacht, en het Gen5-venster moet tijdens de run zichtbaar blijven omdat de automatisering gebruikmaakt van schermgebaseerde interacties. Voordat een experiment wordt gestart, moet het LEMOS-apparaat worden aangesloten op de centrale Arduino en moet een testroutine worden uitgevoerd om te verifiëren of alle LED's correct oplichten; eventuele niet-reagerende LED's moeten worden geïdentificeerd en verholpen voordat de bacteriële culturen worden geladen, aangezien onopgemerkte defecten zouden leiden tot ongecontroleerde verlichtingsomstandigheden tijdens het experiment. Gebruikers die de workflow aanpassen aan een ander plate-reader-model of softwarepakket dienen dezelfde timing-, meet-, export- en parsing-logica te behouden, terwijl de automatiseringslaag naar behoefte wordt gewijzigd.

LEMOS sluit de cirkel door geautomatiseerde actuatie mogelijk te maken die is gesynchroniseerd met de meetintervallen18. Hier is het oorspronkelijke LEMOS-apparaat bijgewerkt door het aantal wells te verdubbelen om de doorvoer te verhogen. Daarnaast minimaliseert de herziene geometrie van de microwells lichtlekkage tussen de wells, waardoor optogenetische circuits in hetzelfde experiment onder zowel donkere als verlichte omstandigheden kunnen worden getest. LEMOS 2.0 ondersteunt momenteel batch-culturexperimenten. Aangezien de groeisnelheid, de beschikbaarheid van hulpbronnen en de dynamiek van genexpressie veranderen tijdens batchcultuur, moeten parameters zoals LED-intensiteit, duty-cyclebereik, bemonsteringsinterval en controllerparameters mogelijk opnieuw worden gekalibreerd voor andere stammen, reporters, optogenetische systemen of groeiomstandigheden20. Een gedetailleerde vergelijking van LEMOS 2.0 met eerder ontwikkelde platforms voor het uitvoeren van optogenetische studies wordt gegeven in Tabel 1. Toekomstige versies zouden in-plate kanalen of reservoirs kunnen bevatten voor gecontroleerde mediumuitwisseling en verdunning, waardoor langere experimenten mogelijk zijn terwijl consistentere groeiomstandigheden worden behouden. Aanvullende ontwerpen zouden ook alternatieve LED-golflengten kunnen ondersteunen of de afhankelijkheid van schermgebaseerde softwareautomatisering kunnen verminderen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te vermelden.

Dankbetuigingen

De auteurs B.J., T.S.B. en H.R.N. werden ondersteund door de Texas A&M Engineering Experiment Station

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
22 AWG gestrande aansluitdraad AmazonASIN: B089CQ2N69Goedkope draad om het elektrische circuit te verbinden. Massieve of gestrande draad is acceptabel.
8-pins 3-positie 2P3T DP3T schuifschakelaar met zijknopAmazonASIN: B007Q9Y8YCSchakelaar en pinnen moeten zich aan aangrenzende zijden bevinden, niet tegenover elkaar, zoals vaker voorkomt.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2ArduinoABX00071Microcontroller – Het platte profiel en de BLE-functionaliteit zijn geschikt voor de behoeften van het randapparaat.
Arduino Nano 33 IoTArduinoABX00027Microcontroller – Gebruikt als centraal apparaat.
BioTek Synergy H1 microplaatlezerAgilent (BioTek)—Of een compatibele plaatlezer met kinetische modus
Breathe-Easy afdichtingsfolieUSA Scientific9123-6100Medische afdichtingsfolie; gasdoorlatende microplaatafdichting
Chloramphenicol (25 mg/mL voorraad in ethanol)Diverse—Werkconcentratie 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200Mann Release TechnologiesLoslaatmiddel
Kapton-tapeAmazonASIN: B07F8TZZ4N
LB-agarplaten en geschikte antibioticaIn-house—Er wordt aangenomen dat deze reeds aanwezig zijn.
Li-ion 3,7 V batterij, 3000 mAh (11,1 Wh), maat 104060UfineUFX0391-03 Moet worden geleverd met JST PH 2-pins mannelijke kabel. Gefabriceerd door Liter Energy, verkocht door diverse detailhandelaren.
Li-ion batterij oplaad- en ontladingsmodule met Type-C USB (5V 1A)AmazonASIN: B0CTMJMRKZZoek op "Replaces TP4056" op Amazon. Scroll voorbij de standaard TP4056-modules. Stop bij een vermelding die de kleinere, zwarte modules toont met de tekst "Replaces TP4056" in de titel.
Li-ion JST PH 2-pins kabel – vrouwelijk connectorkop 100 mmDiverseASIN: B07NWNPB77Moet compatibel zijn met de JST-connector van de batterij’s.
Mini Boost Module 3,7 V naar 5 V/8 V/9 V/12 V Step Up Board met LED-indicatorAmazon (Teyleten Robot)ASIN: B0B4TB9QNY[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Nunc OmniTray plaat met één putjeThermo Scientific242811Buitenmantel
pNO286-3AddgenePlasmid #107746Codeert voor constitutieve CcaS-expressie
pSR58.6AddgenePlasmid #63176Codeert voor constitutieve CcaR-expressie en sfGFP onder de PcpcG2-promotor
Soldeerbout en soldeerDiverse—Aanbevelingen: fijne punt, vloeimiddel of soldeertin met harsenkern.
Spectinomycine (50 mg/mL voorraad)Diverse—Werkconcentratie 50 µg/mL
Steriele kweekbuisjes (14 mL rondbodem)Diverse—
SYLGARD 184 siliconen elastomeer (basis + uithardingsmiddel)SYLGARD 1841:10 uithardingsmiddel:basis op massa
USB-A naar Micro USB-kabelDiverse—Voor het aansluiten van Arduino-boards op de pc. Moet een kabel voor gegevensoverdracht zijn, niet enkel een oplaadkabel.
USB-A naar USB-C oplaadkabelDiverse—Sluit aan op de batterijoplaadmodule
Vacuümdesiccator en pompDiverse—Voor het ontgassen van PDMS
WS2812B IC SPI RGB Pixel LED-strip, 100LED/m, DC5V, IP30, zwartAmazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B088B8G8LD ; BTF-LIGHTING onderdeel nr.: WS2812B1M100LB30Individueel aanstuurbare LED-strip. 100 LED/m. Spanning: 5 V. IP30 verwijst naar waterbestendigheid. Zwart heeft de voorkeur boven wit om minder licht te reflecteren.

Referenties

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

Herprints en machtigingen

Tags

Optogenetische controleLED-microplaatgenexpressiedynamische lichtstimulatiemicroplaatlezerPDMS-microwellsschakelmontageArduino-programmeringfluorescentiemetingbacteriële culturen

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.