Deze studie onderzocht de expressieniveaus van serum miR-3619-5p bij patiënten met diabetes type 2 en bestudeerde de regulerende rol van dit molecuul in de functie van de pancreatische β-cel. miR-3619-5p is downgereguleerd bij T2DM en kan betrokken zijn bij de regulatie van de pancreatische β-cel functie door MTA3 te targeten.
Onderzoeksartikel
Klinische significantie van de expressie van miR-3619-5p bij patiënten met diabetes type 2 en de regulatie ervan van de proliferatie van pancreas-β-cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het kernpathologische kenmerk van diabetes mellitus type 2 (T2DM) is het falen van de pancreatische β-cellen; daarom is de identificatie van effectieve circulerende biomarkers en moleculaire targets die de homeostase van pancreatische β-cellen reguleren van aanzienlijk praktisch belang. Als belangrijke regulerende moleculen van genexpressie spelen miRNA's een belangrijke rol bij de proliferatie, apoptose en insulinesecretie van pancreatische β-cellen. Het doel van deze studie is om de expressiepatronen en klinische waarde van miR-3619-5p in het serum van T2DM-patiënten te onderzoeken en de regulerende rol ervan bij de proliferatie van pancreatische β-cellen te verduidelijken. RT-qPCR werd gebruikt om de expressie van miR-3619-5p en MTA3 aan te tonen. ROC-curves werden gebruikt om de diagnostische prestaties te evalueren. Bio-informatica en dual-luciferase-assays werden gebruikt om de target-ligandrelatie te valideren. Celproliferatie werd gemeten met een CCK-8-assay, terwijl apoptose werd onderzocht via flowcytometrie. Insulinesecretieniveaus werden gemeten met behulp van ELISA. De resultaten toonden aan dat miR-3619-5p en MTA3 downgereguleerd waren in T2DM-patiënten en pancreatische β-cellen. miR-3619-5p zou een biomarker kunnen zijn voor de diagnose van T2DM; overexpressie ervan bevordert de celproliferatie, remt apoptose en verhoogt de insulinesecretie. miR-3619-5p target en reguleert MTA3, en de twee zijn significant positief gecorreleerd. Een miR-3619-5p-mimic kan de schade veroorzaakt door si-MTA3 aan de functie van pancreatische β-cellen omkeren. Kortom, miR-3619-5p is downgereguleerd bij T2DM en heeft diagnostische waarde. miR-3619-5p kan deelnemen aan de regulatie van de functie van pancreatische β-cellen door MTA3 te targeten.
Inleiding
De chronische metabole stoornis diabetes mellitus type 2 (T2DM) manifesteert zich voornamelijk als insulineresistentie gepaard gaand met een progressief verlies van de insulinesecretorische functie, en is verantwoordelijk voor meer dan 80% van alle diabetesgevallen1. De pathogenese ervan is complex en omvat een combinatie van genetische en omgevingsfactoren, evenals abnormaliteiten in de cellulaire en moleculaire regulatie2,3. Aangezien pancreatische β-cellen de primaire cellen zijn die verantwoordelijk zijn voor de insulinesecretie, is een abnormale afname van hun proliferatieve capaciteit een belangrijke oorzaak van onvoldoende insulinesecretie bij T2DM4. Momenteel steunt de klinische diagnose van T2DM hoofdzakelijk op traditionele indicatoren zoals de bloedglucosespiegel en het geglyceerde hemoglobine (HbA1c); echter is hun sensitiviteit voor vroege screening en het voorspellen van de ziekteprogressie beperkt5. Er is een dringende behoefte aan het identificeren van sensitieve, specifieke biomarkers en cruciale regulatoire doelwitten om nieuwe strategieën te bieden voor de precieze diagnose en behandeling van T2DM.
Onder invloed van glucotoxiciteit veroorzaakt door langdurige hyperglykemie wordt de proliferatie van pancreatische β-cellen beperkt en neemt apoptose toe, wat leidt tot een geleidelijk verlies van glucose-afhankelijke insulinesecretie; dit proces is een sleutelfactor die de voortdurende progressie van de ziekte stimuleert6,7. MicroRNA's (miRNA's) zijn betrokken bij diverse fysiologische processen in cellen8 en oefenen een cruciale regulerende werking uit op fysiologische processen, waaronder de proliferatie, apoptose en insulinesecretie van pancreatische eilandjescellen9,10. Meerdere studies hebben aangetoond dat diverse miRNA's abnormaal tot expressie komen bij T2DM en nauw betrokken zijn bij de pathogenese van de ziekte11,12,13. miR-3619-5p neemt deel aan biologische processen, waaronder celproliferatie en apoptose, en het huidige onderzoek hiernaar heeft zich primair gericht op het veld van de oncologie14,15. Abnormale expressie van miR-3619-5p is waargenomen in maligne tumoren, waaronder plaveiselcelcarcinoom van de huid, longkanker, colorectaal carcinoom en maagkanker, waarbij het doelgenen reguleert om de proliferatie, metastase en apoptose van tumorcellen te beïnvloeden16,17,18,19. Er blijft echter een duidelijk gat in het onderzoek naar de klinische expressiekenmerken, de klinische relevantie en de mechanismen van regulatie van de pancreasfunctie door miR-3619-5p bij T2DM.
Als een belangrijk lid van de MTA-familie medieert MTA3 eiwit-eiwitinteracties en gen-transcriptieregulatie, en is het uitgebreid betrokken bij cruciale fysiologische processen, waaronder celproliferatie, apoptose en metabolisme20. Huidig onderzoek naar MTA3 heeft zich voornamelijk gericht op de oncologie21,22,23, met slechts beperkte studies die de rol ervan bij metabole ziekten, in het bijzonder T2DM, onderzoeken. Enkele studies hebben aangetoond dat MTA3, als een diabetes-geassocieerd gen, deelneemt aan de regulatie van hyperglykemie-geïnduceerde leverfibrose24. Dit suggereert dat MTA3 betrokken kan zijn bij de progressie van T2DM; echter moet nog worden bevestigd of het in de context van T2DM wordt gereguleerd door miR-3619-5p.
Samenvattend is het bestaande onderzoek naar miR-3619-5p grotendeels beperkt gebleven tot tumormodellen en ontstekingsmodellen; het klinische expressieprofiel bij T2DM en de rol ervan bij de homeostase van pancreatische β-cellen en glucosemetabolisme-stoornissen moeten nog worden onderzocht. Daarom beoogt deze studie de doelrelatie tussen miR-3619-5p en MTA3 te verifiëren door de expressie en klinische significantie van miR-3619-5p in het serum van patiënten met T2DM te beoordelen, en de regulerende rol ervan bij de proliferatie van pancreatische β-cellen te onderzoeken, om zo een nieuwe theoretische basis te bieden voor onderzoek naar de pathogenese van T2DM en voor klinische diagnose en behandeling.
Protocol
Deze studie is goedgekeurd door de medisch-ethische commissie van het TongzhouBay People's Hospital (Goedkeuringsnummer 2024122001). De in deze studie gebruikte procedures zijn in overeenstemming met de beginselen van de Verklaring van Helsinki. Geïnformeerde toestemming is verkregen van alle individuele deelnemers die aan de studie hebben deelgenomen. Toestemming voor publicatie is verkregen voor de gegevens van iedere individuele persoon die in de studie is opgenomen.
Onderzoekssubjecten
In deze studie werden retrospectief 102 patiënten met T2DM geselecteerd die tussen januari 2022 en juni 2023 in ons ziekenhuis waren gediagnosticeerd. In aanmerking komende deelnemers voldeden aan de diagnostische criteria voor T2DM, waaronder een nuchtere bloedglucose ≥7,0 mmol/L en een postprandiale bloedglucose na 2 uur ≥11,1 mmol/L; zij hadden in de voorafgaande 3 maanden geen behandeling met insuline of antidiabetica van de nieuwe generatie ontvangen, hadden geen ernstige complicaties aan het hart, de lever, de nieren of andere organen, geen voorgeschiedenis van maligne tumoren, auto-immuunziekten of infectieziekten, en beschikten over volledige klinische dossiers. Patiënten met diabetes type 1 of andere specifieke typen diabetes, personen in een stresssituatie als gevolg van ernstige infectie, trauma, chirurgie of andere oorzaken, personen die in de voorafgaande 3 maanden glucocorticoïden, immunosuppressiva of soortgelijke medicatie hadden gebruikt, en zwangere vrouwen of vrouwen die borstvoeding gaven, werden uitgesloten. Er werd ook een controlegroep opgenomen, bestaande uit 80 personen die in dezelfde periode in ons ziekenhuis een routinematig gezondheidsonderzoek ondergingen.
Monstername
Alle studieparticipants hadden minstens 8–12 u vastgehouden; vroeg in de ochtend werd 5 mL veneus bloed afgenomen en verdeeld over RNase-vrije EP-buisjes, gecentrifugeerd (3000 × g, 10 min) om het serum te scheiden, en bewaard bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
Celkweek en behandeling
De rat pancreatic islet β-cellijn INS-1 werd gekweekt in RPMI 1640-medium bevattend 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. INS-1-cellen werden gekweekt in medium bevattend 25 mM glucose om een model van door hoog glucose (HG) geïnduceerde cellulaire schade te vestigen25. In de onbehandelde groep werden INS-1-cellen gekweekt in RPMI 1640-medium (bevattend 11.1 mM glucose).
De transfectie werd uitgevoerd met behulp van de transfectiekit met miR-3619-5p mimics, miRNA-blank controle (miR-NC), si-MTA3 en een blank controle (si-NC). De miR-3619-5p mimic, miR-3619-5p inhibitor, siRNA en de bijbehorende negatieve controles werden allemaal gekocht bij RiboBio. miRNA mimic concentratie: 50 nM; miRNA inhibitor concentratie: 100 nM; siRNA concentratie: 50 nM. Vervolgexperimenten werden uitgevoerd 48 h na transfectie. De relevante sequenties staan vermeld in Aanvullende Tabel 1.
Kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettereactie (RT-qPCR)
TRIzol-reagens werd gebruikt om totaal RNA uit serum te extraheren, terwijl de miRNeasy Mini Kit werd gebruikt om totaal RNA uit cellen te extraheren. Voor de detectie van miR-3619-5p werd reverse transcriptie uitgevoerd met een reverse transcriptiekit; na de cDNA-synthese werd een miRNA-kwantificatiekit gebruikt, met U6 als interne controle. Voor de detectie van MTA3 werd reverse transcriptie naar cDNA uitgevoerd met een mRNA-reverse transcriptiekit, en werd RT-qPCR uitgevoerd met een mRNA-kwantificatiekit, met GAPDH als interne controle. De veranderingen in de expressie van miR-3619-5p en MTA3 werden geanalyseerd met de 2-ΔΔCt-methode. De primersequenties staan in Aanvullende Tabel 1.
Dual luciferase reporter (DLR) assay
Wild-type (WT) en mutante (MUT) 3'-UTR's van MTA3 die de miR-3619-5p bindingsplaats bevatten, werden gekloond in de pmirGLO-vector. De vector werd samen met de miR-3619-5p mimic en miR-3619-5p inhibitor in 293T-cellen getransfecteerd met behulp van transfectiereagentia. De transfectiecontrolegroepen bestonden uit: de groep met het lege reporterplasmide (Controle) en de miRNA negatieve controletransfectiegroep (miR-NC). Na 48 u werd de relatieve luciferase-activiteit gemeten met een dual-luciferase reporter-systeem, waarbij de Renilla luciferase-activiteit diende als interne controle. Elke groep bestaat uit drie onafhankelijke biologische replica's, waarbij elke biologische replica bestaat uit drie technische replica's.
Celproliferatie-assay
Zaai de getransfecteerde cellen uit in een 96-wellplaat. Na respectievelijk 0 h, 24 h, 48 h en 72 h kweeken, wordt aan elke well 10 μL CCK-8-reagens toegevoegd. Incubeer dit gedurende 2 h bij 37 °C en meet de absorbentie bij 450 nm met een microplate reader.
Apoptose-assay
Was de cellen drie keer met PBS en resuspendeer ze vervolgens in 200 μL bindingsbuffer met 10 μL Annexin V-FITC en 5 μL PI. Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 300 μL bindingsbuffer toe en analyseer de cellen onmiddellijk met een flowcytometer om de apoptosegraad te berekenen.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Getransfecteerde cellen werden gezaaid in een 96-well plaat en gedurende de nacht uitgehongerd bij 37 °C. Het cultuurmedium werd vervangen door een oplossing met 25 mM glucose en de cellen werden 1 h gekweekt; vervolgens werd het cultuurmedium van de behandelde INS-1 cellen verzameld om de insulinesecretie te meten. De INS-1 cellen werden resuspendeerd in zuur methanol, gesoniceerd, en het supernatant werd verzameld om het totale insulinegehalte te bepalen. Er werd gebruikgemaakt van de Rat Insulin ELISA Kit, waarbij de assay werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De assay maakt gebruik van de meegeleverde referentiestandaarden uit de testkit om een kalibratiecurve op te stellen; de absolute concentratie insuline wordt berekend op basis van de absorbentiewaarden van de monsters, waarbij de eenheid van de absolute concentratie μIU/mL is. Ten slotte werd de secretiecapaciteit van insuline beoordeeld door de in het cultuurmedium gemeten insulinewaarden te normaliseren ten opzichte van het totale intracellulaire insulinegehalte. De gegevens in de statistische grafieken worden weergegeven als fold changes, berekend relatief aan de controlegroep.
Western blot
Getransfecteerde cellen van elke groep werden geoogst en waarna RIPA-lysisbuffer werd toegevoegd. De totale proteïneconcentratie werd bepaald met de BCA-methode. 50 μg van het totale proteïne werd gemengd met 5× loadingbuffer en gedurende 10 min gekookt. Na 10% SDS-polyacrylamidegelelektroforese werden de proteïnen overgebracht naar een polyvinylidefluoride-membraan. Blokkeer het membraan gedurende 1 u met 5% magere melk; voeg de primaire antilichamen MTA3 (1:1000) en GAPDH (1:1000) toe en incubeer dit overnacht bij 4 °C; was het membraan met TBST, voeg vervolgens het HRP-gelabelde geit anti-konijn IgG secundaire antilichaam (1:1000) toe en incubeer dit gedurende 1 u bij kamertemperatuur; visualiseer de resultaten met de ECL-chemiluminescentiemethode.
Statistische analyse
Kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Voordat de statistische analyse werd uitgevoerd, is de Shapiro–Wilk-test gebruikt om de normaliteit van de gegevens te verifiëren en de Levene-test om de homogeniteit van de varianties te beoordelen, om zo de geschiktheid van parametrische tests te bepalen. De resultaten van deze tests gaven aan dat alle kwantitatieve gegevens in deze studie een normale verdeling volgden en voldeden aan de aanname van homogeniteit van de varianties; daarom werden parametrische tests gebruikt voor de statistische analyse. Een t-test voor onafhankelijke steekproeven werd gebruikt om gegevens van twee groepen te analyseren, terwijl eenweg-variantieanalyse (ANOVA) met de post-hoc test van Tukey werd toegepast voor vergelijkingen tussen meerdere groepen. Spreidingsdiagrammen werden gebruikt om lineaire relaties tussen variabelen te beoordelen. Pearson-correlatieanalyse werd toegepast wanneer werd voldaan aan de aannames van normaliteit en lineariteit. De Pearson-correlatieanalyse omvatte alle 102 deelnemers; er werden geen uitschieters uitgesloten. De clustering van punten die in het spreidingsdiagram werd waargenomen, is het gevolg van de overlap van waarnemingen in de steekproef. Alle experimenten bevatten drie replica-monsters en elk experiment werd drie keer herhaald. Een p-waarde van <0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Vergelijking van demografische kenmerken en klinische metabole parameters tussen de studieparticipants
De vergelijkingsresultaten lieten zien dat de FBG- en HbA1c-waarden significant verhoogd waren bij patiënten met T2DM (P < 0,001), terwijl er geen significante verschillen waren in andere parameters (P > 0,05) (Tabel 1).
Expressie en klinische significantie van miR-3619-5p
RT-qPCR-analyse wees uit dat de expressie van miR-3619-5p in het serum van T2DM-patiënten significant verlaagd was (P < 0.001; Figuur 1A). ROC-curve-analyse toonde aan dat de AUC voor miR-3619-5p bij het diagnosticeren van T2DM 0,871 was (95% CI: 0,820–0,922) (Figuur 1B). Bovendien toonden de resultaten van een Pearson-correlatieanalyse uitgevoerd bij 102 patiënten met T2DM aan dat de expressie van miR‑3619‑5p duidelijk en omgekeerd gerelateerd was aan de FBG (Figuur 1C) en HbA1c (Figuur 1D).
Figuur 1: Expressie en klinische significantie van miR-3619-5p. (A) RT-qPCR-analyse van de miR-3619-5p-expressie in het serum van patiënten met T2DM. (B) ROC-curve voor de diagnose van T2DM met behulp van miR-3619-5p. (C) Pearson-correlatieanalyse tussen de relatieve expressie van miR-3619-5p en de nuchtere bloedglucosewaarde (FBG). (D) Pearson-correlatieanalyse tussen de relatieve expressie van miR-3619-5p en HbA1c. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD); Controle, n = 80; T2DM, n = 102. ***P < 0.001 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het effect van miR-3619-5p op de functie van pancreatische β-cellen
We hebben cellulaire functionele assays uitgevoerd op INS-1 pancreatische β-cellen behandeld met HG om de progressie van T2DM na te bootsen. De resultaten onthulden dat de expressie van miR-3619-5p significant was afgenomen na HG-behandeling (P < 0,001), terwijl transfectie met een miR-3619-5p mimic de expressie ervan sterk verhoogde (P < 0,01; Figuur 2A). Wat betreft celproliferatie en apoptose remde HG-behandeling de celproliferatie aanzienlijk en bevorderde het apoptose (P < 0,001), terwijl de miR-3619-5p mimic proliferatie bevorderde en apoptose remde na HG-behandeling (P < 0,01; Figuur 2B,C). ELISA-resultaten toonden aan dat de insulinesecretie significant was afgenomen na HG-behandeling (P < 0,001), terwijl de miR-3619-5p mimic de insulinesecretie verhoogde na HG-behandeling (P < 0,01; Figuur 2D).
Figuur 2: Effect van miR-3619-5p op de functie van pancreatische β-cellen. INS-1 pancreatische β-cellen werden behandeld met HG om de progressie van T2DM te simuleren. (A) RT-qPCR werd gebruikt om de expressie van miR-3619-5p in de cellen te detecteren. (B) Celproliferatie werd beoordeeld met behulp van de CCK-8 assay. (C) Flowcytometrie werd gebruikt om celapoptose te beoordelen. (D) ELISA werd gebruikt om de insulinsecretieniveaus te meten (genormaliseerd naar het totale intracellulaire insulinegehalte). De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD), n = 3. ***P < 0.001; **P < 0.01 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Validatie van miR-3619-5p-doelwitten
Bioinformatica-voorspellingen onthulden in totaal 174 doelgenen over vier databases (Figuur 3A), en de bindingsplaats van MTA3 vertoont een hoge graad van conservering (Context++ score: -0,31; Context++ score percentiel: 98). Er werd een complementaire bindingsplaats geïdentificeerd tussen miR-3619-5p en de 3'-UTR-regio van MTA3 (Figuur 3B). DLR-resultaten toonden aan dat de relatieve luciferase-activiteit van MTA3 WT significant was toegenomen in de miR-3619-5p mimic-groep, wat aangeeft dat miR-3619-5p kan binden aan MTA3 (Figuur 3C).
De expressie van MTA3 was duidelijk verminderd in het serum van patiënten met T2DM (Figuur 3D); de expressie was ook significant verminderd in met HG behandelde INS-1 cellen, terwijl de miR-3619-5p mimic de expressie van MTA3 verhoogde (Figuur 3E). Western blot-resultaten toonden aan dat de miR-3619-5p mimic de eiwitniveaus van MTA3 verhoogde, terwijl de miR-3619-5p inhibitor de expressie ervan significant verlaagde (Aanvullende Figuur 1). Pearson-correlatieanalyse onthulde een significante positieve correlatie tussen de miR-3619-5p en MTA3-niveaus in het serum van 102 patiënten met T2DM (Figuur 3F). Deze resultaten valideren verder de positieve regulerende rol van miR-3619-5p op MTA3.
Figuur 3: Validatie van miR-3619-5p-doelen. (A) Gemeenschappelijke doelgenen van miR-3619-5p geïdentificeerd in de vier databases: TargetScan, miRWalk, StarBase en miRDB. (B) Bindingsplaats van miR-3619-5p aan de 3’-UTR van MTA3. (C) DLR-assay (n = 3). (D) RT-qPCR-analyse van de MTA3-expressie in het serum van patiënten met T2DM (Controle, n = 80; T2DM, n = 102). (E) RT-qPCR-analyse van de MTA3-expressie in cellen (n = 3). (F) Pearson-correlatieanalyse van de expressie van miR-3619-5p en MTA3 in het serum van patiënten met T2DM (Controle, n = 80; T2DM, n = 102). De foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD). ***P < 0.001; **P < 0.01 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De effecten van MTA3 op de functie van pancreatische β-cellen
De resultaten toonden aan dat si-MTA3 de expressie van MTA3 na HG-behandeling verder verminderde, terwijl co-transfectie met een miR-3619-5p mimic dit effect terugdraaide (Figuur 4A). si-MTA3 remde de proliferatie van HG-behandelde cellen verder, bevorderde apoptose en verergerde de verstoring van de insulinesecretie; terwijl co-transfectie met de miR-3619-5p mimic de bovengenoemde cellulaire fenotypes die door si-MTA3 werden gemedieerd, terugdraaide, waardoor de celproliferatie werd hersteld, apoptose werd verminderd en de remming van de insulinesecretie werd verlicht (Figuur 4B–D).
Figuur 4: Effect van MTA3 op de functie van pancreatische β-cellen. si-MTA3 en miR-3619-5p mimic werden in cellen getransfecteerd om het effect van MTA3 op de functie van pancreatische β-cellen verder te onderzoeken. (A) RT-qPCR-analyse van MTA3-expressie in cellen. (B) Celproliferatie werd beoordeeld met behulp van de CCK-8 assay. (C) De apoptoseratio werd bepaald via flowcytometrie. (D) ELISA mat de insulinesecretieniveaus (genormaliseerd naar het totale intracellulaire insulinegehalte). De foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD), n = 3. ***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Samenvattend tonen de resultaten van klinische monsters aan dat de expressie van serum miR-3619-5p significant is verlaagd bij patiënten met T2DM, en dat miR-3619-5p significant correleert met FBG en HbA1c; celgebaseerde experimenten bevestigden dat miR-3619-5p specifiek MTA3 kan reguleren, waardoor de levensvatbaarheid en insulinesecretie-functie van INS-1 rattenpancreas-β-cellen worden beïnvloed. Gezamenlijk suggereren deze resultaten dat miR-3619-5p betrokken is bij de regulatie van de functie van pancreas-β-cellen, waardoor het onderzoeksdoel van deze studie om de rol van miR-3619-5p bij type 2 diabetes en de potentiële reguleringsmechanismen ervan te onderzoeken, in eerste instantie is behaald.
DATABESCHIKBAARHEID:
Alle ruwe en verwerkte datasets ter ondersteuning van de conclusies van deze studie zijn geüpload als Aanvullend bestand 1.
| Indicatoren | Controlegroep (n = 80) | T2DM-groep (n = 102) | p-waarde |
| Leeftijd (jaar) | 51.41 ± 9.70 | 52.29 ± 7.03 | 0.478 |
| Geslacht (mannelijk/vrouwelijk) | 43/37 | 54/48 | 0.914 |
| BMI (kg/m²)2) | 24.04 ± 3.10 | 24.81 ± 3.04 | 0.093 |
| TC (mmol/L) | 4.60 ± 0.64 | 4.78 ± 0.65 | 0.068 |
| TG (mmol/L) | 1.61 ± 0.18 | 1.67 ± 0.26 | 0.093 |
| HDL-C (mmol/L) | 1.43 ± 0.13 | 1.38 ± 0.18 | 0.085 |
| LDL-C (mmol/L) | 2.55 ± 0.29 | 2.63 ± 0.31 | 0.067 |
| nuchtere bloedglucose (mmol/L) | 4.96 ± 0.97 | 7.16 ± 1.64 | <0.001 |
| HbA1c (%) | 4.42 ± 0.49 | 6.77 ± 1.16 | <0.001 |
Tabel 1: Vergelijking van klinische parameters tussen proefpersonen. T2DM, diabetes mellitus type 2; BMI, body mass index; TC, totaal cholesterol; TG, triglyceriden; HDL, high-density lipoproteins; LDL, low-density lipoproteins; FBG, nuchtere bloedglucose; HbA1c, geglycosyleerd hemoglobine.
Aanvullende Tabel 1: Primer- en reagenssequenties gebruikt in deze studie.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Proteinexpressie van MTA3. Western blot-analyse van MTA3-proteineniveaus. (A) MTA3-proteineniveaus. (B) Ruwe Western blot-afbeeldingen van MTA3. (C) Ruwe Western blot-afbeeldingen van GAPDH. De foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD), n = 3. ***P < 0.001; **P < 0.01Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Ruwe data.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De kernpathologische kenmerken van T2DM zijn insulineresistentie en dysfunctie van de pancreatische β-cellen, waarbij een verminderde proliferatiecapaciteit en een afgenomen aantal pancreatische β-cellen de belangrijkste drijvers zijn van abnormale insulinesecretie en de primaire drijvers van de ziekteprogressie26. Het identificeren van sleutelmoleculen die de proliferatie van pancreatische β-cellen kunnen reguleren en hun functie kunnen verbeteren, is van groot belang voor de precisiediagnostiek en behandeling van T2DM.
Als belangrijke regulerende moleculen van genexpressie vervullen miRNA's een kritieke functie bij de proliferatie, apoptose en insulinesecretie van pancreatische β-cellen. Talrijke miRNA's zijn nauw geassocieerd met de pathogenese van T2DM27,28,29. Song et al. stelden vast dat knockdown van miR-3619-5p de celmigratie bij colorectale kanker remt30. Andere studies hebben aangetoond dat miR-3619-5p downgereguleerd is bij diabetespatiënten die peritoneale dialyse ondergaan31. Echter, de rol en mechanismen van miR-3619-5p bij T2DM zijn nog niet gerapporteerd. Deze studie wees uit dat de serumexpressie van miR-3619-5p bij patiënten met T2DM significant lager was dan in de gezonde controlegroep, in overeenstemming met de bevindingen van Costa et al.31, wat erop wijst dat een verminderde expressie van miR‑3619‑5p nauw verbonden kan zijn met het ontstaan en de ontwikkeling van T2DM. Correlatieanalyse gaf aan dat de expressie van miR-3619-5p negatief correleerde met FBG en HbA1c, wat aantoont dat een lagere expressie van miR-3619-5p geassocieerd is met een slechtere glykemische controle bij patiënten. Dit bevestigt verder dat miR-3619-5p betrokken kan zijn bij het proces van metabole dysregulatie bij T2DM, en dat het expressieniveau de ernst van de ziekte kan weerspiegelen; dit is consistent met de bevindingen van Chen et al., die rapporteerden dat differentieel tot expressie gebrachte RNA's betrokken kunnen zijn bij het lipidenmetabolisme, de insulinesecretie en de glucose-regulatie32. De resultaten van de ROC-curve-analyse suggereren dat het een biomarker kan zijn voor de diagnose van T2DM, ter compensatie van het gebrek aan sensitiviteit bij vroege diagnose in verband met traditionele bloedglucose-indicatoren.
Een abnormale afname van het proliferatievermogen van pancreatische β-cellen is een centraal onderdeel van het falen van de pancreatische eilandjes bij T2DM; het bevorderen van de proliferatie van pancreatische β-cellen en het verhogen van het aantal cellen is essentieel voor het verbeteren van de insulinesecretie-functie33,34. Deze studie toonde via cellulaire experimenten aan dat miR-3619-5p de proliferatie van INS-1-cellen aanzienlijk bevordert en apoptose remt, waardoor de insulinesecretie toeneemt. Dit suggereert dat miR-3619-5p de insulinesecretie-functie kan verbeteren door de proliferatie van pancreatische β-cellen te bevorderen en apoptose te remmen, waardoor het een rol speelt in de pathogenese van T2DM. Dit is consistent met de reguleringsmechanismen van miRNA's bij de proliferatie van pancreatische β-cellen die in eerdere studies zijn beschreven, zoals miR-26a-5p en miR-765, die de proliferatie en differentiatie van pancreatische β-cellen bevorderen door de expressie van doelgenen te reguleren35,36.
In deze studie werden bio-informatische voorspellingen en DLR-assays gebruikt om te bevestigen dat MTA3 een doelgen is van miR-3619-5p. Als metastase-geassocieerd eiwit is MTA3 uitgebreid betrokken bij belangrijke fysiologische processen zoals celproliferatie, apoptose en metabolisme20. Onderzoek heeft aangetoond dat MTA3 deelneemt aan de regulatie van door hoge glucoseconcentraties geïnduceerde leverfibrose24. T2DM-gemedieerde onderdrukking van MTA3 is gekoppeld aan verhoogde oxidatieve stress in de testes37. In deze studie was MTA3 downgereguleerd in HG-behandelde cellen. Samen met de resultaten van de celproliferatie-assays wordt verondersteld dat si-MTA3 kan bijdragen aan de pathogenese van T2DM door de proliferatie van pancreatische β-cellen te remmen, terwijl miR-3619-5p deze remming kan verlichten door de expressie van MTA3 te reguleren, waardoor de functie van de pancreatische β-cellen verbetert. De verduidelijking van dit mechanisme verfijnt het moleculaire netwerk van miRNA-regulatie van de proliferatie van pancreatische β-cellen en biedt een nieuw perspectief voor onderzoek naar de pathogenese van T2DM.
De bevindingen van deze studie hebben potentieel klinische en translationele waarde. Serum miR-3619-5p kan worden gedetecteerd in perifeer veneus bloed; indien gevalideerd in daaropvolgende grootschalige cohortstudies, is het veelbelovend als aanvullende biologische marker om clinici te helpen bij het identificeren van personen met een risico op pancreatische β-celdisfunctie, waardoor een eerdere risicostratificatie mogelijk wordt. miR-3619-5p kan hyperglykemie-geïnduceerde schade aan pancreatische β-cellen verminderen door de MTA3-pathway te targeten en te reguleren om de overleving van β-cellen en de insulinesecretie te behouden. Dit suggereert dat de miR-3619-5p/MTA3-as het potentieel heeft om te dienen als een nieuw doelwit voor eilandjesbescherming bij diabetes, wat fundamentele experimentele inzichten biedt voor de verdere ontwikkeling van geneesmiddelen op basis van nucleïnezuren of kleine-molecuulremmers om de eilandjesfunctie te beschermen.
Er moeten enkele beperkingen in de huidige studie worden opgemerkt: Ten eerste is ons onderzoek uitgevoerd in één enkel centrum; er kan sprake zijn van selectiebias en de interindividuele variabiliteit tussen de deelnemers is relatief beperkt. Toekomstige onderzoeken zouden de steekproefomvang moeten vergroten en multicentrische studies moeten uitvoeren om het expressieprofiel en de klinische waarde van miR‑3619‑5p te verifiëren. Ten tweede heeft deze studie de regulerende functie van miR-3619-5p bij de proliferatie van pancreatische β-cellen alleen op cellulair niveau gevalideerd en is er geen verdere validatie via dierproeven uitgevoerd. Toekomstige studies zouden een T2DM-diermodel moeten opzetten om de in vivo werkingsmechanismen verder te onderzoeken. Ten derde vertonen miRNA's over het algemeen multifunctionele kenmerken, en miR-3619-5p kan mogelijk ook een verscheidenheid aan gerelateerde genen reguleren. Tegelijkertijd zijn in vitro transfectiesystemen met gebruik van miRNA-mimics of inhibitoren onderhevig aan potentiële off-target effecten; kunstmatige interventie bij hoge doses kan aspecifiek meerdere signaleringspaden activeren of inhiberen, waardoor het moeilijk is om de onder fysiologische omstandigheden waargenomen werkingswijze volledig te reproduceren. Toekomstig onderzoek vereist een uitgebreidere screening van targets in het volledige transcriptoom om onderscheid te maken tussen specifieke targeted regulatie en de aspecifieke biologische effecten als gevolg van off-target effecten. Ten vierde, hoewel deze studie in het in vitro hoog-glucosemodel een interventie met 25 mM glucose gebruikte, is er geen mannitol-osmotische controlegroep opgezet; bijgevolg was het niet mogelijk om glucose-specifieke metabole effecten volledig te onderscheiden van effecten die voortvloeien uit osmotische stress. Toekomstige experimenten zouden osmotische controle moeten bevatten om het mechanisme waarlangbij hoge glucosewaarden INS-1-cellen beïnvloeden verder te verduidelijken. Ten slotte is er een mismatch in soorten tussen de klinische monsters en de in vitro celmodellen; hoewel INS-1-cellen een klassiek in vitro model zijn voor het bestuderen van de functionele rijping van pancreatische β-cellen, kunnen de in ratcellen waargenomen regulatiemechanismen niet direct worden gelijkgesteld aan werkelijke biologische processen bij mensen. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het interpreteren van de in deze studie op in vitro cellulair niveau geïdentificeerde miR-3619-5p/MTA3-regulatierelatie voor klinische toepassingen. Toekomstige studies zullen menselijke pancreatische β-celmodellen of primaire menselijke eilandjes moeten gebruiken om de soortconservatie van deze route verder te valideren.
miR-3619-5p is verlaagd in het serum en de pancreatische β-cellen van patiënten met T2DM; door MTA3 te targeten, kan miR-3619-5p hyperglykemie-geïnduceerde pancreatische β-celdysfunctie verlichten, de proliferatie van pancreatische β-cellen bevorderen, apoptose remmen en de insulinesecretie verbeteren. Deze studie suggereert dat miR-3619-5p nuttig kan zijn bij het ondersteunen van de stratificatie van het diabetesrisico, en dat de miR-3619-5p/MTA3-as een potentieel doelwit is voor eilandjesbescherming. In de toekomst zullen we een grootschalige cohortstudie uitvoeren om de klinische waarde ervan te valideren en in vivo functionele validatie uitvoeren met behulp van diermodellen voor diabetes; tegelijkertijd zullen we een diepgaande analyse uitvoeren van de signaleringspaden stroomafwaarts van MTA3 die veranderingen in de eilandjesfunctie mediëren en het translationele potentieel van dit doelwit voor eilandjesbeschermende therapie verder evalueren.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante financiële of niet-financiële belangen om te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door Prevention Strategies for Patients with Diabetes and Urinary Tract Infections (No. MSZ2025119).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Roche, Switzerland | 11684795910 | Kleuring met Annexin V-FITC (10 µL) en PI (5 µL); 15 min incubatie in het donker |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo, Japan | CK04 | Colorimetrische assay voor celviabiliteit; 10 µL per well, 2 u incubatie, OD450-meting |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Toegevoegd aan het kweekmedium op 25 mM om een model voor door hoge glucose (HG) geïnduceerde cellulaire schade te vestigen |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega, USA | E1910 | Sequentiële meting van vuurvlieg- en Renilla-luciferase-activiteiten |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10437028 | Supplement bij een uiteindelijke concentratie van 10% |
| Flowcytometer | Beckman Coulter, USA | CytoFLEX | Flowcytometrische analyse voor de berekening van de apoptosesnelheid |
| GAPDH-antilichaam | Abcam, UK | ab181602 | Western blot |
| GAPDH-primers | Sangon Biotech, China | Custom synthesis | Housekeeping-gen voor mRNA-normalisatie |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam, UK | ab6721 | Western blot |
| HEK293T-cellijn | ATCC, USA | CRL-3216 | Menselijke embryonale niercellen; hoge transfectie-efficiëntie voor luciferase-assays |
| INS-1-cellijn | Sunncell, China | SNL-332 | Rat insulinoma-cellijn; gekweekt in RPMI 1640 met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine |
| LightCycler 480 II Real-Time PCR System | Roche, Switzerland | 5015278001 | Real-time PCR-amplificatie; 96-well of 384-well plaatformaat |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, USA | L3000001 | Lipide-gebaseerd transfectiereagens |
| Microplate reader | BioTek, Agilent | Synergy H1 | Absorbantiemeting; monsterconcentraties geïnterpoleerd uit standaardcurven |
| miR-3619-5p inhibitors | RiboBio, China | miR20017999-1-5 | Chemisch gesynthetiseerd enkelstrengs RNA om de functie van miR-3619-5p te remmen |
| miR-3619-5p mimics | RiboBio, China | miR10017999-1-5 | Chemisch gesynthetiseerd dubbelstrengs RNA voor overexpressie van miR-3619-5p |
| miR-3619-5p primers | Sangon Biotech, China | Custom synthesis | Specifieke primers voor de detectie van miR-3619-5p |
| miR-NC (miRNA blanco controle) | RiboBio, China | miR2N0000001-1-5 | Niet-targeterende negatieve controle voor experimenten met miRNA mimic/inhibitor |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen, Germany | 217004 | Extractie van totaal RNA uit celmonsters |
| miScript II RT Kit | Qiagen, Germany | 218160 | Reverse transcriptie voor miRNA; maakt gebruik van poly(A)-tailing en oligo-dT priming |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen, Germany | 218073 | SYBR Green-gebaseerde qPCR voor miRNA-detectie |
| MTA3-antilichaam | Invitrogen, USA | PA5-100022 | Western blot |
| MTA3-primers | Sangon Biotech, China | Custom synthesis | Specifieke primers voor MTA3 mRNA-detectie |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ND-2000 | Beoordeling van RNA-concentratie en zuiverheid |
| Penicilline-Streptomycine | Gibco, USA | 15140122 | Antibioticumoplossing op 1% om bacteriële contaminatie te voorkomen |
| pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector | Promega, USA | E1330 | Dual-luciferase reportervector voor miRNA-targetvalidatie; bevat vuurvlieg- en Renilla-luciferasegenen |
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa, Japan | RR047A | Reverse transcriptie met een stap voor eliminatie van genomisch DNA |
| Rat Insulin ELISA Kit | Invitrogen, USA | ERINS | Kwantitatieve detectie van insuline uitgescheiden door INS-1-cellen in het kweekmedium |
| RPMI 1640 medium | Gibco, USA | 11875093 | Basaal kweekmedium; aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine |
| si-MTA3 | RiboBio, China | siB170209084646-1-5 | Small interfering RNA gericht op MTA3 voor gene knockdown |
| si-NC (blanco controle voor siRNA) | RiboBio, China | siB06525141922-1-5 | Niet-targeterende siRNA-controle |
| SYBR Green Master PCR Mix | TaKaRa, Japan | RR820A | SYBR Green-gebaseerde qPCR-amplificatie |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | Extractie van totaal RNA uit serummonsters |
| U6-primers | Sangon Biotech, China | Custom synthesis | Endogene referentie voor miRNA-normalisatie |
Referenties
- Wang L, et al. Associated factors and principal pathophysiological mechanisms of type 2 diabetes mellitus. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1499565.
- Wan Z, et al. The role of systemic inflammation in the association between serum 25-hydroxyvitamin D and type 2 diabetes mellitus. Clin Nutr. 2021;40(6):3661–7.
- Okamoto A, et al. Efficacy and safety of semaglutide in glycemic control, body weight management, lipid profiles and other biomarkers among obese type 2 diabetes patients initiated or switched to semaglutide from other GLP-1 receptor agonists. J Diabetes Metab Disord. 2021;20(2):2121–8.
- Aguayo-Mazzucato C, et al. β Cell Aging Markers Have Heterogeneous Distribution and Are Induced by Insulin Resistance. Cell Metab. 2017;25(4):898–910.e5.
- Goshrani A, Lin R, O'Neal D, Ekinci EI. Time in range-A new gold standard in type 2 diabetes research Diabetes Obes Metab. 2025;27(5):2342–62.
- Niu F, et al. β-cell neogenesis: A rising star to rescue diabetes mellitus. J Adv Res. 2024;62:71–89.
- Zhang Y, et al. THADA inhibition in mice protects against type 2 diabetes mellitus by improving pancreatic β-cell function and preserving β-cell mass. Nat Commun. 2023;14(1):1020.
- Ho PTB, Clark IM, Le LTT. MicroRNA-Based Diagnosis and Therapy. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
- Poy MN, et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 2004;432(7014):226–30.
- Karagiannopoulos A, Cowan E, Eliasson L. miRNAs in the Beta Cell-Friends or Foes Endocrinology. 2023;164(5).
- Hu H, et al. Plasma miR-193b-3p Is Elevated in Type 2 Diabetes and Could Impair Glucose Metabolism. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:814347.
- Benko J, et al. MiR-126 and miR-146a as markers of type 2 diabetes mellitus: a pilot study. Bratisl Lek Listy. 2023;124(7):527–33.
- Liu C, Gao Y, Wu J, Zou J. Exosomal miR-23a and miR-192, Potential Diagnostic Biomarkers for Type 2 Diabetes. Clin Lab. 2021;67(2).
- Liu Y, Li J, Wang S, Song H, Yu T. STAT4-mediated down-regulation of miR-3619-5p facilitates stomach adenocarcinoma by modulating TBC1D10B. Cancer Biol Ther. 2020;21(7):656–64.
- Ma J, et al. M2 macrophage facilitated angiogenesis in cutaneous squamous cell carcinoma via circ_TNFRSF21/miR-3619-5p/ROCK axis. Kaohsiung J Med Sci. 2022;38(8):761–71.
- Zhang M, Luo H, Hui L. MiR-3619-5p hampers proliferation and cisplatin resistance in cutaneous squamous-cell carcinoma via KPNA4. Biochem Biophys Res Commun. 2019;513(2):419–25.
- Ge L, Tan W, Li G, Gong N, Zhou L. Circ_0026134 promotes NSCLC progression by the miR-3619-5p/CHAF1B axis. Thorac Cancer. 2022;13(4):582–92.
- Sun Z, Li X, Shi Y, Yao Y. LncRNA PVT1 facilitates the growth and metastasis of colorectal cancer by sponging with miR-3619-5p to regulate TRIM29 expression. Cancer Rep (Hoboken). 2024;7(6):e2085.
- Wu C, et al. Long Noncoding RNA Plasmacytoma Variant Translocation 1 Regulates Cisplatin Resistance via miR-3619-5p/TBL1XR1 Axis in Gastric Cancer. Cancer Biother Radiopharm. 2020;35(10):741–52.
- Tang Y, et al. Mechanisms of MTA3 in cancer and related diseases and its clinical applications. Front Oncol. 2025;15:1731799.
- Lau P, et al. Sphingosine kinase 1 promotes tumor immune evasion by regulating the MTA3-PD-L1 axis. Cell Mol Immunol. 2022;19(10):1153–67.
- Du L, et al. MTA3 Represses Cancer Stemness by Targeting the SOX2OT/SOX2 Axis. iScience. 2019;22:353–68.
- Liu Y, et al. Discovery of Jaspamycin from marine-derived natural product based on MTA3 to inhibit hepatocellular carcinoma progression. Sci Rep. 2024;14(1):25294.
- Li Q, et al. High glucose promotes hepatic fibrosis via miR‑32/MTA3‑mediated epithelial‑to‑mesenchymal transition. Mol Med Rep. 2019;19(4):3190–200.
- Pu M, Kong L, Li J, Su L, Chen Y. LncRNA NBR2 affects pancreatic β-cell function in type 2 diabetes mellitus by targeting miR-646. Diabetol Metab Syndr. 2025;17(1):454.
- Galicia-Garcia U, et al. Pathophysiology of Type 2 Diabetes Mellitus. Int J Mol Sci. 2020;21(17).
- Wang J, et al. Extracellular vesicles mediate the communication of adipose tissue with brain and promote cognitive impairment associated with insulin resistance. Cell Metab. 2022;34(9):1264–79.e8.
- Rosado JA, Diez-Bello R, Salido GM, Jardin I. Fine-tuning of microRNAs in Type 2 Diabetes Mellitus. Curr Med Chem. 2019;26(22):4102–18.
- Taheri M, Eghtedarian R, Ghafouri-Fard S, Omrani MD. Non-coding RNAs and type 2 diabetes mellitus. Arch Physiol Biochem. 2023;129(2):526–35.
- Song B, et al. LINC00882 Plays a Tumor-promoter Role in Colorectal Cancer by Targeting miR-3619-5p to Up-regulate CTNNB1. Arch Med Res. 2022;53(1):29–36.
- Costa NA, et al. Peritoneal dialysis influences microRNA expression and pro-inflammatory response: results from a cross-sectional study. J Bras Nefrol. 2026;48(1):e20240218.
- Chen J, et al. Identification of the LncRNA PRNCR1/miR-642a-5p/SSTR3 CeRNA network and its diagnostic value in type 2 diabetes mellitus. Diabetol Metab Syndr. 2025;18(1):39.
- Elizabeth MM, et al. Pancreatic β-Cells and Type 2 Diabetes Development. Curr Diabetes Rev. 2017;13(2):108–21.
- Kerper N, Ashe S, Hebrok M. Pancreatic β-Cell Development and Regeneration. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2022;14(5).
- Yang F, Zhao S, Zhang X, Ding S, Xu Y. RNF6 Targeted by miR-26a-5p Protects Pancreatic β-Cell Function Against Type 2 Diabetes. Diabetes Metab Syndr Obes. 2022;15:93–102.
- Zheng L, et al. miR-765 targeting PDX1 impairs pancreatic β-cell function to induce type 2 diabetes. Arch Physiol Biochem. 2023;129(6):1279–88.
- Liu F, et al. T2DM-elicited oxidative stress represses MTA3 expression in mouse Leydig cells. Reproduction. 2022;163(5):267–80.