Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een geoptimaliseerd protocol voor de generatie van vasculaire organoïden uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen

231 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/73561

⸱

3 september 2026

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van vasculaire organoïden met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Samenvatting

Vasculaire organoïden afgeleid van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn ontstaan als krachtige driedimensionale modellen voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling, ziekte mechanismen en medicijnresponsen. Huidige protocollen voor vasculaire organoïden maken de generatie van zelforganiserende endotheel-pericytennetwerken mogelijk; echter, variabiliteit tussen batches, inconsistente organoïdevorming en onvoldoende pericytbedekking kunnen de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid belemmeren. Deze studie presenteert een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van vasculaire organoïden uit humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) met verbeterde reproduceerbaarheid en structurele consistentie. Belangrijke aanpassingen omvatten verfijnde condities voor de vorming van embryoïde lichaampjes, geoptimaliseerde concentraties en timing van groeifactoren tijdens mesoderminductie en vasculaire specificatie, en verbeterde driedimensionale kweekcondities die een robuuste rekrutering van pericyten en endotheel-pericyteninteracties bevorderen. De geoptimaliseerde organoïden vertonen sterk vertakte CD31-positieve endotheelnetwerken die consistent zijn omsloten door PDGFR-β-positieve pericyten, met een significant verminderde variabiliteit tussen batches vergeleken met het oorspronkelijke protocol. Gedetailleerde stap-voor-stap procedures worden verstrekt voor de generatie van organoïden, whole-mount immunofluorescentie karakterisering en kwaliteitscontrolebeoordeling. Deze geoptimaliseerde methode maakt de schaalbare productie van hoogwaardige vasculaire organoïden mogelijk die geschikt zijn voor het bestuderen van vasculaire celinteracties, het modelleren van ziekten en het screenen van verbindingen, waardoor de technische drempel wordt verlaagd voor laboratoria die dit modelsysteem willen adopteren.

Inleiding

Driedimensionale (3D) organoïden zijn krachtige instrumenten geworden voor het modelleren van de menselijke orgaanontwikkeling en ziekten in vitro, waarbij ze een superieure structurele biomimetica en pathofysiologische relevantie bieden in vergelijking met conventionele tweedimensionale celcultuurmodellen1,2. In recente jaren zijn organoïden afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) succesvol gevestigd voor meerdere weefseltypen, waaronder de darm3, hersenen4,5, nieren6, lever7,8 en retina9. Een grote uitdaging bij onderzoek op basis van organoïden is echter onvoldoende vascularisatie tijdens langdurige cultuur, wat kan leiden tot hypoxie en necrose, waardoor de expansie en differentiatie van de organoïden worden belemmerd10,11. Om deze beperking aan te pakken, zijn verschillende co-cultuurstrategieën geïntroduceerd, waaronder de integratie van endotheelcellen of mesenchymale stamcellen om de vorming van vasculaire netwerken te bevorderen12,13. Conventionele tweedimensionale culturen en diermodellen bootsen de menselijke vasculaire biologie echter niet volledig na, terwijl co-cultuurbenaderingen extra experimentele complexiteit introduceren14. Vasculaire organoïden die in staat zijn tot autonome vascularisatie bieden daarom een veelbelovend, mens-relevant alternatief15.

De vorming van het vasculaire netwerk omvat zowel vasculogenese als angiogenese, die worden aangestuurd door interacties tussen endotheelcellen en murale cellen, zoals pericyten en vasculaire gladde spiercellen, en die strak gereguleerd worden door meerdere signaleringsmoleculen, waaronder VEGF (vascular endothelial growth factor), TGF-β (transforming growth factor-β), PDGF (platelet-derived growth factor) en angiopoïetinen16. In 2019 ontwikkelden Wimmer en collega's een methode voor het genereren van zelfassemblerende 3D-bloedvat-organoïden direct vanuit hPSC's17,18. Dit systeem genereert gelijktijdig endotheelcellen en pericyten, wat resulteert in microvasculaire netwerken met lumenvorming en bedekking door een basale membraan. Op basis van dit platform zijn vasculaire organoïden gebruikt om diabetische vasculopathie te modelleren onder stimulatie met hoge glucoseconcentraties en pro-inflammatoire cytokinen (TNF-α en IL-6); deze organoïden recapituleren de verdikking van de basale membraan, een kenmerk van diabetische microvasculaire pathologie17. Daarnaast is dit model gebruikt om erfelijke vasculaire aandoeningen te bestuderen en om te dienen als platform voor screening op vasculaire toxiciteit19. Recentelijk hebben verschillende methodegeoriënteerde studies gepoogd de generatie van vasculaire organoïden te optimaliseren. Zo hebben vorderingen in single-cell RNA-sequencing belangrijke regulerende factoren geïdentificeerd, zoals MECOM en LEF1, waardoor een moleculair kader is ontstaan voor het karakteriseren en optimaliseren van de vorming van menselijke vasculaire organoïden. Bovendien introduceerden Xu et al. microwells om homogene vorming van embryoid bodies te faciliteren en voegden zij de CEPT-cocktail toe om de celviabiliteit te verbeteren, waardoor de batch-to-batch variabiliteit effectief werd verminderd20.

Om de homogeniteit, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid van de generatie van vasculaire organoïden te verbeteren, is het oorspronkelijke protocol beschreven door Wimmer et al.17,18 systematisch geoptimaliseerd om verschillende belangrijke beperkingen aan te pakken. Ten eerste maakt het oorspronkelijke protocol gebruik van natuurlijke aggregatie in low-attachment plates voor de vorming van embryoid bodies, wat kan leiden tot aanzienlijke variabiliteit tussen batches in aggregaatgrootte en bijgevolg een heterogene differentiatie-efficiëntie. In het geoptimaliseerde protocol wordt polyvinylalcohol (PVA) gecombineerd met orbitale schudding tijdens de aggregaatvorming om uniforme celaggregatie te bevorderen en de consistentie van de grootte van de embryoid bodies te verbeteren. Ten tweede maakt het oorspronkelijke protocol gebruik van volledige vervanging van het medium tijdens de fase van vasculaire netwerkvorming, wat kan leiden tot aanzienlijke schommelingen in de concentraties van groeifactoren en het aanhoudende vasculaire uitloping en de rekrutering van pericyten kan belemmeren. In tegenstelling hiermee behoudt het geoptimaliseerde protocol één derde van het geconditioneerde medium bij elke mediumwissel om endogene pro-angiogene factoren te behouden en de cultuuromgeving te stabiliseren. Ten derde vereist het oorspronkelijke protocol meerdere plaattransfers tijdens de isolatie en rijping van organoïden, wat de handlingsvereisten en het risico op verlies van organoïden verhoogt. Het geoptimaliseerde protocol omzeilt deze stappen door geïsoleerde organoïden individueel over te brengen naar wells van 96-well low-attachment plates, waardoor de procedure wordt vereenvoudigd en de doorvoersnelheid toeneemt. Collectief biedt dit geoptimaliseerde protocol gedetailleerde stapsgewijze procedures en kritische kwaliteitscontrolepunten om de technische drempel voor de adoptie van dit modelsysteem te verlagen en de bredere toepassing van vasculaire organoïden in studies naar vasculaire ontwikkeling, ziekte-mechanismen en high-throughput drug screening te faciliteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van hPSCs in deze studie is goedgekeurd door de Biomedische Ethiekcommissie van de Anhui Universiteit (BECAHU_2026-010).

1. Onderhoud van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen

OPMERKING: Houd menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) onder feeder-vrije omstandigheden. Voer alle procedures uit in een biologische veiligheidskabinet klasse II met gebruik van aseptische technieken.

  1. Preparatie van met basement membraanmatrix gecoate kweekplaten
    1. Haal een vial basement membraanmatrix uit −20 °C en ontdooi deze gedurende de nacht bij 4 °C gedurende ongeveer 12–16 h. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli.
    2. Meng de ontdooide basement membraanmatrix grondig onder steriele omstandigheden en verdeel deze in aliquots voor eenmalig gebruik (bijv. 1 mL per buis). Bewaar de aliquots bij −20 °C tot 2 jaar.
      OPMERKING: Houd de basement membraanmatrix, pipetten, tips en buizen koud tijdens de verwerking om voortijdige stolling te voorkomen. Vermijd het ontstaan van luchtbellen.
    3. Ontdooi de benodigde aliquot basement membraanmatrix op ijs. Verdun de basement membraanmatrix 1:200 in voorkoelde DMEM (5 µL basement membraanmatrix per 1 mL DMEM; uiteindelijke concentratie, ongeveer 5 µg/mL).
    4. Meng de oplossing voorzichtig door te pipetteren totdat er geen zichtbare deeltjes meer aanwezig zijn.
    5. Voeg 0,5 mL van de verdunde basement membraanmatrix toe aan elke well van een 12-wells plaat. Kantel en roteer de plaat voorzichtig om het gehele bodemoppervlak te coaten.
    6. Incubeer de gecoate plaat bij 37 °C in een 5% CO₂-incubator gedurende ten minste 2 h of bij 4 °C gedurende de nacht.
      OPMERKING: Bewaar afgesloten gecoate platen bij 4 °C gedurende 1–2 weken. Laat de plaat acclimatiseren naar kamertemperatuur en aspireer de coatingoplossing vlak voor gebruik.
  2. Ontdooien van hiPSCs
    1. Haal een cryovial met bevroren hiPSCs uit vloeibare stikstof en plaats deze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C. Agiteer de vial voorzichtig en haal deze binnen 1 min uit het bad, wanneer er slechts enkele kleine ijskristallen over zijn.
      OPMERKING: Vermijd langdurige blootstelling aan dimethylsulfoxide (DMSO) bij 37 °C en onvolledig ontdooien, aangezien beide de celviabiliteit kunnen verminderen.
    2. Desinfecteer de buitenkant van de cryovial met 70% ethanol en open deze in de biologische veiligheidskabinet.
    3. Overbreng de celsuspensie langzaam druppelsgewijs naar een 15 mL conische buis met 3 mL voorverwarmd chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium, of een equivalent chemisch gedefinieerd onderhoudsmedium. Meng voorzichtig tijdens de overdracht om de DMSO geleidelijk te verdunnen en osmotische stress te minimaliseren.
    4. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 3 min bij kamertemperatuur (22–24 °C) met behulp van een swing-bucket rotor.
    5. Aspireer voorzichtig het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 1 mL voorverwarmd chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium.
      OPMERKING: Gebruik een P1000-pipet en pipetteer voorzichtig 2–3 keer om mechanische schuifspanning en belvorming te minimaliseren.
  3. Uitplaten en kweek van hiPSCs
    1. Haal de vooraf gecoate 12-wells plaat uit de incubator en aspireer de coatingoplossing. Was de wells niet.
    2. Zaai ongeveer 1 × 105–2 × 105 viabele cellen per well voor routinematig herstel na het ontdooien. Pas de dichtheid aan op basis van de hiPSC-lijn en de experimentele vereisten.
    3. Dispenseer de celsuspensie langzaam langs de wand van elke well zonder met de pipetpunt het gecoate oppervlak te raken.
    4. Voeg Y-27632 toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 µM om de celoverleving en aanhechting na het ontdooien te bevorderen.
      OPMERKING: Gebruik Y-27632 alleen in het initiële platingmedium. Vervang dit de volgende dag door Y-27632-vrij chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium.
    5. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ en verzadigde vochtigheid.
    6. Controleer de celaanhechting en morfologie na ongeveer 16–24 h. Aspireer het medium en vervang het door vers, voorverwarmd chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium zonder Y-27632.
    7. Vervang het medium dagelijks of om de dag totdat de cellen ongeveer 70%–80% confluentie bereiken voor passaging of differentiatie.
      OPMERKING: Controleer de culturen dagelijks. Gebruik kolonies met compacte, scherp gedefinieerde randen, een hoge kern-cytoplasma-ratio en minimale spontane differentiatie.

2. Generatie en differentiatie van hiPSC-aggregaten

OPMERKING: Houd hiPSCs onder feeder-vrije condities in chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium op platen gecoat met basementmembraanmatrix. Passageer de cellen elke 4–5 dagen met 0,02% EDTA. Gebruik culturen met een passende zaaidichtheid en koloniegrootte en minimale spontane differentiatie om de efficiëntie van de vasculaire differentiatie te maximaliseren.

  1. Bereiding van een enkelcellesuspensie
    1. Zuig het chemisch gedefinieerde hPSC-onderhoudsmedium af en was de hiPSCs met 0,5 mL DMEM per putje van een 6-wells plaat.
    2. Zuig het DMEM af en voeg 0,5 mL 0,02% EDTA per putje toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2–4 min en monitor de cellen totdat ze beginnen af te ronden.
    3. Los de cellen los met een P1000-pipet. Pipetteer voorzichtig 2–3 keer om de aggregaten te dissociëren tot een enkelcellesuspensie.
    4. Resuspendeer de cellen in 5 mL chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium en overbreng de suspensie naar een conische buis van 15 mL.
    5. Meng 10 µL van de cellsuspensie met 10 µL 0,1% Trypaanblauw-oplossing. Breng 10 µL van het mengsel aan op een telkamer en bepaal het aantal levensvatbare cellen.
    6. Bereken het volume cellsuspensie dat nodig is om 5 × 105 levensvatbare cellen per putje te verkrijgen.
    7. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 min bij kamertemperatuur (22–23 °C). Zuig het supernatant af.
    8. Resuspendeer de cellen in vers chemisch gedefinieerd hPSC-onderhoudsmedium met 50 µM Y-27632 in een volume van 3 mL per putje.
  2. Aggregaatvorming
    1. Voeg 3 mL van de cellsuspensie toe aan elk putje van een low-attachment 6-wells plaat. Voeg PVA toe tot een eindconcentratie van 0,25%.
    2. Plaats de plaat op een orbitale schudder bij 50 rpm en incubeer bij 37 °C gedurende 1 dag.
    3. Bevestig de vorming van aggregaten met gladde randen en een diameter van ongeveer 50–100 µm of groter voordat u verdergaat.
    4. OPMERKING: Optimaliseer de aggregatieperiode voor individuele hiPSC-lijnen. Verleng de incubatie naar 2–3 dagen indien nodig om aggregaten van de gewenste grootte te verkrijgen.
  3. Mesoderm-inductie
    1. Overbreng op Dag 0 de aggregaten naar een conische buis van 15 mL met een steriele wegwerppipet van 10 mL. Bewaar de oorspronkelijke low-attachment plaat voor het opnieuw uitplaten.
    2. Laat de aggregaten ongeveer 15–20 min bezinken door zwaartekracht.
    3. OPMERKING: Behandel de aggregaten voorzichtig en gebruik zwaartekrachtsedimentatie in plaats van centrifugatie om mechanische schade te minimaliseren.
    4. Zuig het supernatant voorzichtig af nadat de aggregaten zijn bezonken.
    5. Resuspendeer de aggregaten in 3 mL per putje N2B27-medium aangevuld met 12 µM CHIR99021 en 30 ng/mL BMP-4.
    6. Overbreng de aggregaten terug naar de low-attachment plaat en incubeer bij 37 °C.
    7. Pipetteer de aggregaten eenmaal per dag voorzichtig met een P1000-pipet om overmatige aggregaatfusie te minimaliseren. Zet de mesoderm-inductie voort gedurende 3 dagen.
  4. Inductie van de vasculaire lijn
    1. Overbreng op Dag 3 de aggregaten naar een conische buis van 15 mL en laat ze bezinken door zwaartekracht. Bewaar de oorspronkelijke 6-wells plaat.
    2. Zuig het supernatant voorzichtig af nadat de aggregaten zijn bezonken.
    3. Resuspendeer de aggregaten in 3 mL per putje N2B27-medium aangevuld met 100 ng/mL VEGF-A en 2 µM forskoline.
    4. Overbreng de aggregaten terug naar de low-attachment 6-wells plaat en incubeer nog eens 2 dagen.

3. Generatie van vasculaire netwerken en organoïden

  1. Bereiding van de collageen I–basaalmembraanmatrix
    1. Verzamel de aggregaten die zijn gegenereerd in één 6-well plaat voor inbedding in één 12-well plaat. Gebruik ongeveer 40–60 aggregaten per well.
    2. Bereid voldoende collageen I–basaalmembraanmatrixmengsel om twee lagen van 0,5 mL aan elke well van de 12-well plaat toe te voegen.
    3. Bereid 12 mL matrix voor één 12-well plaat. Houd alle componenten op ijs, bereid het mengsel vlak voor gebruik en voorkom de vorming van luchtbellen.
    4. Voeg 0,5 mL matrix toe aan elke well van de 12-well plaat. Draai de plaat voorzichtig rond om de matrix gelijkmatig te verdelen.
    5. Incubeer de plaat gedurende 2 u bij 37 °C om de eerste matrixlaag te laten stollen.
  2. Inbedding van aggregaten
    1. Overbreng de aggregaten naar een conische buis van 15 mL met een steriele wegwerppipet van 10 mL en laat ze door zwaartekracht bezinken.
    2. Aspireer het supernatant en was de aggregaten twee keer met 1 mL N2B27-medium. Verwijder na de laatste wasstap zoveel mogelijk residueel medium.
    3. Bereid een vers collageen I–basaalmembraanmatrixmengsel en houd dit op ijs.
    4. Resuspendeer de gewassen aggregaten voorzichtig in de vers bereide matrix.
    5. Haal de 12-well plaat met de gestolde eerste laag uit de incubator.
    6. Voeg 0,5 mL van de matrix met aggregaten toe aan elke well.
    7. Schud de plaat voorzichtig gedurende maximaal 1 min om de aggregaten gelijkmatig te verdelen.
    8. Incubeer de plaat onmiddellijk gedurende 2 u bij 37 °C om de tweede laag te laten stollen.
  3. Inductie van vasculaire sprouting
    1. Warm N2B27-medium, aangevuld met 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A en 100 ng/mL FGF-2, voor tot 37 °C.
    2. Voeg het voorverwarmde, aangevulde medium toe aan elke well om vasculaire differentiatie te induceren.
    3. Monitor de culturen gedurende de volgende 1–3 dagen op vasculaire sprouting.
    4. OPMERKING: Warm het medium voor tot 37 °C voordat het aan de culturen wordt toegevoegd om destabilisatie van de gelmatrix te minimaliseren.
  4. Mediumverversing en onderhoud van de culturen
    1. Voer de eerste mediumverversing 3 dagen na de inbedding uit.
    2. Vervang het medium daarna om de dag door vers N2B27-medium met 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A en 100 ng/mL FGF-2.
    3. Behoud bij elke mediumverversing één derde van het geconditioneerde medium en vervang de overige twee derde door vers aangevuld medium.
  5. Ga op dag 10 verder met de isolatie van vasculaire organoïden.

4. Vestiging van vasculaire organoïden en voorbereiding voor kleuring

  1. Isolatie van individuele vasculaire netwerken
    1. Steek het afgeronde uiteinde van een steriele spatel langs de rand van de put en laat de gelmatrix voorzichtig los van de bodem.
    2. Beweeg de spatel verder van de rand van de put naar het midden totdat de gehele gelmatrix vrij drijft.
    3. Gebruik twee steriele naalden om individuele vasculaire netwerken uit de gel te excideren. Verwijder zoveel mogelijk overtollige matrix zonder het vasculaire netwerk te beschadigen.
  2. Kweek van geïsoleerde organoïden
    1. Overbreng elke geïsoleerde organoïde direct naar een individuele put van een low-attachment 96-wells plaat met een steriele wegwerppipet.
    2. Voeg 100 µL N2B27-medium aan elke put toe, aangevuld met 15% FBS, 100 ng/mL VEGF-A en 100 ng/mL FGF-2.
    3. Incubeer de organoïden nog 5 dagen en vervang het aangevulde medium dagelijks.
    4. Bevestig dat de organoïden op dag 5 van de rijping een ronde en volledig ingekapselde morfologie vertonen.
  3. Fixatie van vasculaire organoïden
    1. Overbreng morfologisch rijpe organoïden naar 2 mL microcentrifugebuisjes. Verwerk niet meer dan ongeveer 60 organoïden per buisje.
    2. Aspireer voorzichtig het medium en voeg 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS toe.
    3. Fixeer de organoïden gedurende 1 h bij kamertemperatuur.
      WAARSCHUWING: PFA is toxisch en een vermoedelijk carcinogeen. Hanteer PFA in een chemische zuurkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
    4. Aspireer de PFA en vervang deze door PBS.
      PAUSEERPUNT: Bewaar gefixeerde vasculaire organoïden in PBS bij 4 °C voor maximaal 1 maand.

5. Kleuring en confocale beeldvorming van vasculaire organoïden

  1. Blocking en permeabilisatie
    1. Voeg 2 mL blockingbuffer toe aan elke buis met gefixeerde vasculaire organoïden.
    2. Plaats de buizen verticaal op een orbitale schudmachine en incubeer met agitatie bij kamertemperatuur gedurende 2 u om de organoïden te blocken en te permeabiliseren.
  2. Incubatie met primaire antilichamen
    1. Aspireer de blockingbuffer en voeg 50–100 µL primair antilichaam toe, verdund 1:100 in blockingbuffer.
    2. Plaats de buizen rechtop op een schudmachine en incubeer met agitatie bij 4 °C gedurende de nacht.
  3. Wassen en incubatie met secundaire antilichamen
    1. Was de monsters drie keer met PBST gedurende 10–15 min per wasbeurt. Agiteer de verticaal geplaatste buizen tijdens elke wasbeurt.
    2. Voeg fluorescent secundair antilichaam toe, verdund 1:300 in blockingbuffer.
    3. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 u.
  4. Nucleaire tegenkleuring en laatste wasbeurt
    1. Was de monsters twee keer met PBST gedurende 10–15 min per wasbeurt.
    2. Voeg Hoechst-oplossing toe, verdund 1:5.000 in PBS, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10–15 min.
    3. Was de monsters met PBS gedurende 10–15 min.
  5. Confocale beeldvorming
    1. Breng de gekleurde organoïden over naar schaaltjes voor confocale beeldvorming.
    2. Neem confocale beelden op met consistente beeldvormingsparameters over de experimentele groepen heen.
  6. Kwantitatieve beeldanalyse van vasculaire organoïden
    OPMERKING: Voer de kwantitatieve beeldanalyse uit met Fiji/ImageJ en AngioTool. Houd identieke acquisitie-instellingen van de microscoop aan voor alle experimentele groepen.
    1. Meting van de aggregaatdiameter
      1. Neem bright-field beelden op van hiPSC-aggregaten van dag 0 met een omgekeerde microscoop met een gekalibreerde schaal. Fotografeer goed gescheiden aggregaten en voeg een schaalbalk toe.
      2. Importeer elke afbeelding in Fiji/ImageJ. Trek met de Straight Line-tool een lijn langs de schaalbalk en selecteer Analyze > Set Scale.
      3. Voer de bekende afstand en eenheid in (bijv. 100 µm) en selecteer Global om de kalibratie toe te passen op alle afbeeldingen in de sessie.
      4. Trek met de Straight Line-tool een lijn over de breedste diameter van elk aggregaat. Selecteer Analyze > Measure of druk op Ctrl+M en noteer de diameter in µm.
      5. Meet ten minste 30 aggregaten per batch.
      6. Teken voor niet-sferische aggregaten de omtrek van elk aggregaat met de Oval- of Polygon Selection-tool. Selecteer Analyze > Set Measurements > Feret's diameter en noteer de meting.
      7. Exporteer de metingen uit de Resultaten-tabel en compileer de gegevens in een spreadsheet.
      8. Bereken het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD) en de variatiecoëfficiënt (CV) als CV = SD/gemiddelde × 100% voor elke batch.
    2. Meting van de organoïdediameter
      1. Neem bright-field beelden op van volwassen vasculaire organoïden op dag 15 met een omgekeerde microscoop met een gekalibreerde schaal. Voeg aan elke afbeelding een schaalbalk toe.
      2. Importeer elke afbeelding in Fiji/ImageJ en kalibreer de schaal zoals beschreven in stap 6.1.2
      3. Trek met de Straight Line-tool een lijn over de breedste diameter van elke organoïde. Selecteer Analyze > Measure of druk op Ctrl+M en noteer de diameter in µm.
      4. Meet ten minste 30 organoïden per batch.
      5. Meet bij onregelmatig gevormde organoïden de langste en kortste diameters en bereken het gemiddelde, of bepaal de Feret-diameter zoals beschreven in stap 6.1.6.
      6. Exporteer de metingen en bereken het gemiddelde, de SD en de CV voor elke batch.
    3. Kwantificering van het CD31-positieve vasculaire areaal
      1. Neem confocale z-stack beelden op van whole-mount organoïden van dag 15 die gekleurd zijn voor CD31. Gebruik identieke lasersterkte, gain, offset en pinhole-instellingen voor alle monsters.
      2. Genereer maximum-intensiteitsprojecties (MIPs) uit de z-stacks met de microscoopsoftware of Fiji/ImageJ.
      3. Pas een intensiteitsdrempel toe om het CD31-positieve vasculaire netwerk te segmenteren, waarbij het achtergrondsignaal wordt uitgesloten.
      4. Selecteer Process > Noise > Remove Outliers en gebruik een straal van 2–5 pixels om kleine artefacten te verwijderen. Selecteer Process > Binary > Fill Holes om kleine openingen binnen het vasculaire netwerk op te vullen.
      5. Selecteer Analyze > Set Measurements en activeer Area en Area fraction. Selecteer Analyze > Measure om het vasculaire areaal te bepalen.
      6. Bereken het CD31-positieve vasculaire areaal als percentage van het totale areaal van de organoïde.
      7. Analyseer ten minste drie organoïden per batch uit drie onafhankelijke batches. Exporteer de metingen voor statistische analyse.
    4. Kwantificering van de PDGFR-β-positieve pericytenbedekking
      1. Neem confocale z-stack beelden op van whole-mount organoïden van dag 15 die gekleurd zijn voor CD31 en PDGFR-β. Genereer MIPs uit de z-stacks.
      2. Importeer de CD31- en PDGFR-β-MIPs in Fiji/ImageJ en verifieer de uitlijning van de beelden.
      3. Pas een drempelwaarde toe op het CD31-kanaal om een binair masker te genereren dat het vasculaire netwerk definieert.
      4. Pas een drempelwaarde toe op het PDGFR-β-kanaal met dezelfde segmentatieaanpak om een binair masker van het pericytensignaal te genereren.
      5. Selecteer Process > Image Calculator en pas de AND-operatie toe op de CD31- en PDGFR-β-maskers om overlappende pixels te identificeren.
      6. Meet het areaal van het overlappende signaal.
      7. Bereken de pericytenbedekking als (PDGFR-β-positief areaal binnen CD31-positieve vaten/totaal CD31-positief vasculaire areaal) × 100%.
      8. Analyseer ten minste drie organoïden per batch uit drie onafhankelijke batches. Exporteer de metingen voor statistische analyse.
    5. Analyse van de vertakkingsindex met AngioTool
      1. Neem confocale z-stack beelden op van whole-mount organoïden van dag 15 die gekleurd zijn voor CD31. Genereer MIPs uit de z-stacks.
      2. Start AngioTool en laad de MIP-afbeelding.
      3. Stel de vatdiameter in op basis van de typische vatdiameter die in de beelden is waargenomen.
      4. Pas de intensiteitsdrempel aan om het vasculaire netwerk te segmenteren, terwijl het achtergrondsignaal wordt uitgesloten. Stel de minimale vatgrootte in om kleine artefacten uit te sluiten.
      5. Voer de analyse uit en noteer het vatareaal, de vatdichtheid, de totale vatlengte, het aantal juncties en de vertakkingsindex.
      6. Verifieer de output-afbeelding door te bevestigen dat de vasculatuur in geel is omlijnd, het vasculaire skelet in rood wordt weergegeven en de vertakkingspunten zijn gemarkeerd met blauwe stippen.
      7. Exporteer de kwantitatieve resultaten uit AngioTool.
      8. Analyseer ten minste drie gezichtsvelden per batch uit drie onafhankelijke batches en compileer de gegevens voor statistische analyse.

6. Kwantitatieve real-time PCR-analyse van vasculaire organoïden

OPMERKING: Voer alle RNA-isolatie en daaropvolgende procedures uit onder RNase-vrije omstandigheden.

  1. RNA-extractie
    1. Verzamel 5–10 mature vasculaire organoïden van dag 15 in een RNase-vrije microcentrifugebuis van 1,5 mL. Verwijder het resterende medium volledig.
      OPMERKING: Pool indien nodig meerdere organoïden om voldoende RNA te verkrijgen.
    2. Voeg 350 µL lysisbuffer toe, aangevuld met 1% β-mercaptoethanol.
    3. Pipetteer de monsters 10–15 keer totdat de organoïden volledig zijn gelyseerd.
    4. Breng het lysaat over naar een spincolumn voor de eliminatie van genomisch DNA die in een opvangbuis is geplaatst. Centrifugeer 30 s bij 11.000 × g bij kamertemperatuur.
    5. Gooi de column weg en behoud het doorstroomvolume (flow-through).
    6. Voeg een gelijk volume 70% ethanol, ongeveer 350 µL, toe aan het doorstroomvolume en meng dit grondig door te pipetteren.
    7. Breng maximaal 700 µL van het mengsel over naar een RNA-spincolumn die in een opvangbuis is geplaatst. Centrifugeer 30 s bij 11.000 × g en gooi het doorstroomvolume weg.
    8. Voeg 350 µL wasbuffer 1 toe aan de column. Centrifugeer 30 s bij 11.000 × g en gooi het doorstroomvolume weg.
    9. Bereid het DNase I-mengsel door per monster 10 µL DNase I te combineren met 70 µL DNase-digestiebuffer.
    10. Voeg 80 µL van het DNase I-mengsel rechtstreeks toe aan het columnmembraan en incubeer 15 min bij kamertemperatuur.
    11. Voeg 350 µL wasbuffer 1 toe aan de column. Centrifugeer 30 s bij 11.000 × g en gooi het doorstroomvolume weg.
    12. Voeg 500 µL wasbuffer 2 toe aan de column. Centrifugeer 30 s bij 11.000 × g en gooi het doorstroomvolume weg.
    13. Herhaal de wasstap met 500 µL wasbuffer 2.
    14. Centrifugeer de lege column 2 min bij 11.000 × g om het membraan te drogen.
    15. Breng de column over naar een schone RNase-vrije microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 30–50 µL RNase-vrij water rechtstreeks toe aan het membraan en incubeer 1 min bij kamertemperatuur.
    16. Centrifugeer 1 min bij 11.000 × g om het RNA te elueren. Bewaar het RNA bij −80 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Bepaal de RNA-concentratie en -zuiverheid via spectrofotometrie. Gebruik een A260/A280-ratio van 1,8–2,1 als acceptabel bereik.
  2. cDNA-synthese
    1. Bereid het reverse-transcriptie-reactiemengsel op ijs.
    2. Combineer 600 ng totaal RNA met 4 µL RT master mix bestaande uit reverse transcriptase, buffer, dNTP's en random primers. Voeg RNase-vrij water toe tot een eindvolume van 20 µL.
    3. Incubeer de reactie 15 min bij 37 °C, gevolgd door 5 s bij 85 °C.
    4. Bewaar het resulterende cDNA bij −20 °C tot gebruik.
  3. Kwantitatieve real-time PCR
    1. Bereid per reactie 9 µL qPCR master mix door 5 µL 2× SYBR Green master mix, 3 µL RNase-vrij water en 1 µL voorgemengde forward- en reverse-primers van elk 10 µM te combineren.
    2. Dispenseer 9 µL master mix in elke well van een 96-well qPCR-plaat.
    3. Voeg 1 µL cDNA toe aan elke well om een eindreactievolume van 10 µL te verkrijgen.
    4. Sluit de plaat af met optische kleefstrip en centrifugeer 1 min bij 1.000 × g.
    5. Voer de initiële denaturatie uit bij 95 °C gedurende 30 s.
    6. Voer 40 amplificatiecycli uit van 5 s bij 95 °C gevolgd door 30 s bij 60 °C.
    7. Voer een smeltcurve-analyse uit om de specificiteit van het amplicon te bevestigen.
      OPMERKING: Analyseer elk monster in dubbelto of triplikaat.
    8. Bereken de relatieve expressie van het targetgen met de 2−ΔΔCt-methode. Normaliseer de Ct-waarden ten opzichte van het housekeeping-gen (bijv. GAPDH) en kalibreer de expressie ten opzichte van niet-gedifferentieerde hiPSC-monsters.

7. Statistische analyse

  1. Presenteer kwantitatieve gegevens als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van ten minste drie onafhankelijke biologische replica's (n ≥ 3) per conditie.
  2. Behandel elke onafhankelijke batch als één biologische replica voor metingen van aggregaten en organoïdediameters, en bereken het gemiddelde van de 30 individuele structuren die binnen elke batch zijn gemeten om een enkel gemiddelde op batchniveau te verkrijgen.
  3. Bereken het gemiddelde van de metingen van het vasculaire oppervlak, de pericytbedekking en de vertakkingsindex van meerdere organoïden of velden binnen elke batch om een enkele waarde op batchniveau te verkrijgen, en gebruik deze waarden op batchniveau voor statistische vergelijkingen.
  4. Vergelijk het geoptimaliseerde protocol met het oorspronkelijke Wimmer-protocol met behulp van een ongepaarde tweezijdige Student's t-toets.
  5. Definieer statistische significantie als p < 0,05. Geef significantieniveaus aan als p < 0,05, p < 0,01 en p < 0,001, indien van toepassing.
  6. Voer alle statistische analyses uit met statistische analysesoftware versie 10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het hier beschreven geoptimaliseerde protocol maakt de generatie van mature vasculaire organoïden uit hiPSCs mogelijk binnen ongeveer 15 dagen met behulp van een stapsgewijze differentisatiestrategie (Figuur 1A). Kort samengevat werden hiPSC-aggregaten gegenereerd in low-attachment platen aangevuld met 0,25% PVA op een orbitale schudmachine (Dag −1). Mesoderm-inductie werd gestart op Dag 0 met CHIR99021 (12 µM) en BMP-4 (30 ng/mL) gedurende 3 dagen, gevolgd door specificatie van de vasculair...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hierin beschreven geoptimaliseerde protocol introduceert verschillende belangrijke verbeteringen aan het systeem voor vasculaire organoïde-differentiatie dat oorspronkelijk is vastgesteld door Wimmer et al.18, met als doel de homogeniteit, reproduceerbaarheid en structurele integriteit van de generatie van vasculaire organoïden te verbeteren. Vergeleken met het oorspronkelijke protocol biedt de geoptimaliseerde methode aanzienlijke verbeteringen op de volgende aspecten. Ten eerste verbetert he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC) via het Young Scientists Fund (C) (No. 32200655) en het General Program (No. 32270847). De auteurs danken tevens het Anhui University Public Service Platform voor de ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 μm flessenfilterNalgeneFPE204030Voor steriele filtratie van media en buffers
15 mL conische buisSparkJadeGD0001Steriel
2 mL microcentrifugebuisEppendorf22363204Steriel
2-Mercaptoethanol (1000×)Gibco21985023Gebruik in zuurkast
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 fragment ezel anti-konijn IgG (H+L)LableadY1104Secundair antilichaam; verdun 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 fragment ezel anti-geit IgG (H+L)LableadY1007Secundair antilichaam; verdun 1:300
Anti-CD31 antilichaamCell Signaling3528sPrimair antilichaam; verdun 1:100 in blokkeringsbuffer
Anti PDGFR β antilichaamZenbio347269Primair antilichaam; verdun 1:100 in blokkeringsbuffer
Automatische celtellerLife TechnologiesCountess™ IIInclusief telkamerdia's
B27 supplement (50×)Gibco17504044Voor N2B27-medium; ontdooi bij 4ºC, verdeel in aliquoten en bewaar bij −20ºC, voorkom vries-dooi cycli
Benchtop centrifugeZonkiaSC-3610Met swinging-bucket rotor
Biologische veiligheidskast (Klasse II)Thermo FisherNANA
BMP4ProteintechHZ-1045Reconstitueer in steriel ddH2O tot 100 ng/μL, verdeel in aliquoten en bewaar bij −20 °C
Boeve Serum Albumine (BSA)Biosharp9048-46-8Voor blokkeringsbuffer
CHIR99021MCEHY-10182Bereid 10 mM stock in DMSO, bewaar bij −20ºC gedurende maximaal 1 jaar
CO2 incubatorFisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5% CO2, bevochtigd
Confocale imaging schaalBiosharpBS-20-GJMVoor imaging na kleuring
Confocale microscoopLEICANAUitgerust met 10×, 20×, 63× objectieven en ZEN-software
DMEMVivacellC3113-0500Voor Matrigel-verdunning en collageen I-oplossing
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565018Voor Matrigel-verdunning en N2B27-medium
EDTA (0.5 M, pH 8.0)InvitrogenAM9260GVerdun met PBS tot 0,02% voor passaging
Foetaal kalfsserum (FBS)Gibco10270-106Voor volledig N2B27-differentiatiemedium (15% eindconcentratie)
FGF-2NovoproteinC046Bereid 1 mg/mL stock in steriel PBS, verdeel in aliquoten en bewaar bij −20ºC
ForskolinR&D Systems1099Bereid 10 mM stock in DMSO, bewaar bij −20ºC
HEPES (1M)Gibco15630080Voor collageen I-oplossing
HoechstBeyotimeC1071S-4Bereid 1 mg/mL stock in gedeïoniseerd water, verdeel in aliquoten en bewaar bij −20ºC
Inverteerde microscoopLEICADMIL LEDRoutine celobservatie
Matrigel (met verminderde groeifactoren)STEEMABM05Bewaar bij −20ºC na aliquotering, voorkom vries-dooi cycli; hanteer op ijs
MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (NEAA, 100×)Gibco11140035Voor N2B27-medium
N2 supplement (100×)Gibco17502048Voor N2B27-medium; bewaar bij −20ºC beschermd tegen licht
Neurobasal mediumGibco21103049Voor N2B27-medium
Nuclease-vrij water (DNase/RNase-vrij)LableadDoo55WJVoor RNA/cDNA-preparatie en qPCR
Orbital shakerJoan LabNAVoor wasstappen
Paraformaldehyde (4% oplossing)ServicebioG1101Verdun met PBS tot 4% voor fixatie; gebruik in zuurkast
Penicilline-streptomycine (100×)Gibco15140122Voor N2B27-medium
PGM1 mediumCellapyA1517001hiPSC-expansiemedium; bewaar bij 4ºC beschermd tegen licht, stabiel gedurende 2 weken
PGM1 supplement (25×)CellapyA1517101Voor gebruik met PGM1 basaal medium
Polyvinylalcohol (PVA)Sigma-AldrichP8136Los op in PGM1 op 0,25% (w/v) om aggregatie te bevorderen
PureCol (Bove Type I Collageen, 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5005Voor collageen I-Matrigel mengsel; test batch op polymerisatiecapaciteit
qPCR thermocyclerThermo FisherStepOnePlus™Met smeltcurve-mogelijkheid; voor real-time PCR detectie
Reverse Transcriptie KitAccurate BiologyAG11706Voor cDNA-synthese uit totaal RNA; bevat RT-mastermix met reverse transcriptase, buffer, dNTP's en random primers
RNA-extractiekitYeasen19221ES50Voor isolatie van totaal RNA uit vasculaire organoïden; bevat gDNA-eliminatiekolommen en RNase-vrije DNase I
Natriumbicarbonaat (7,5%)Gibco25080094Voor collageen I-oplossing
NatriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750Bereid 1% (w/v) oplossing in gedeïoniseerd water voor blokkeringsbuffer
Natriumhydroxide (1,0 N)Sigma-AldrichS2770Voor pH-aanpassing van collageen I-oplossing
Steriele wegwerppipetten (10 mL)Bkmamlab110205007Individueel verpakt, steriel
Steriele filterpipetpunten (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220Steriel, met filter
Steriele naald (30 G)NANAVoor dissectie van vasculaire netwerken
Steriele spatel (rond uiteinde)Fisher Scientific21-401-5Roestvrij staal
SYBR Green Master MixAccurate BiologyAG117332× concentratie voor qPCR; bevat hot-start DNA-polymerase, buffer, dNTP's en SYBR Green-kleurstof
Tissue Culture-behandelde 12-wells plaatBD Falcon353043Voor gel-embedding en vasculaire netwerkcultuur
Tissue Culture-behandelde 6-wells plaatEppendorf30720113Standaard TC-behandeld
Triton X-100Sigma-AldrichT9084Voor blokkeringsbuffer
Trypaanblauw (0,4%)Thermo Fisher15250061Voor celtelling
Tween 20Sigma-AldrichP7949Voor 0,05% PBS-T wasoplossing
Ultra-Low Attachment 6-wells plaatCorning3471Voor aggregaatvorming en differentiatie
Ultra-Low Attachment ronde bodem 96-wells plaatBeyotimeFULA962-6pcsVoor suspensiecultuur van vasculaire organoïden
VEGF-AProteintechHZ-1038Bereid 1 mg/mL stock in steriel PBS, verdeel in aliquoten en bewaar bij −20ºC
WaterbadBlue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071Bereid 10 mM stock in steriel PBS of DMSO, bewaar bij −20ºC; werkconcentraties: 5 μM (ontdooien), 50 μM (aggregaatvorming)

Referenties

  1. Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.
  2. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165:1586-1597.
  3. Spence JR, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 2011;470:105-109.
  4. Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501:373-379.
  5. Quadrato G, et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 2017;545:48-53.
  6. Takasato M, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015;526:564-568.
  7. Takebe T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499:481-484.
  8. Huch M, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015;160:299-312.
  9. Nakano T, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10:771-785.
  10. Mansour AA, et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 2018;36:432-441.
  11. Ham O, et al. Blood vessel formation in cerebral organoids formed from human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;521:84-90.
  12. Sun XY, et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 2022;11:e76707.
  13. Grebenyuk S, Ranga A. Engineering organoid vascularization. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:39.
  14. Parikh M, Pierce GN. Considerations for choosing an optimal animal model of cardiovascular disease. Can J Physiol Pharmacol. 2024;102:75-85.
  15. Krug A, et al. Three-dimensional spheroid models for cardiovascular biology and pathology. Mechanobiol Med. 2025;3:100144.
  16. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 2003;9:653-660.
  17. Wimmer RA, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565:505-510.
  18. Wimmer RA, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019;14:3082-3100.
  19. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14:292.
  20. Xu C, et al. Vascular organoid generation from human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 2024;214:e67125.
  21. Frenz-Wiessner S, et al. Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells. Nat Methods. 2024;21:868-881.
  22. Sun D, et al. Matrix viscoelasticity controls differentiation of human blood vessel organoids into arterioles and promotes neovascularization in myocardial infarction. Adv Mater. 2025;37:e2410802.
  23. Hoffmann A, et al. Animal-origin-free method for generating blood vessel organoids. Sci Rep. 2026;16:12096.
  24. Nikolova MT, et al. Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell. 2025;188:3329-3348.e31.
  25. Quintard C, et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 2024;15:1452.
  26. Sun L, Wang P, Lin X, Qiu Y. Microfluidic vascular organoids-on-chips: a promising platform for advancing plastic and reconstructive surgery. Chinese Journal of Plastic and Reconstructive Surgery. 2025.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Menselijke pluripotente stamcellengeneratie van organoïdenvorming van embryoïde lichamenmesoderminductievasculaire specificatierekrutering van pericytenendotheelnetwerkenimmunofluorescentiekarakterisering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.