Methodenartikel

Ex Vivo model voor myocardinfarct in het crystalloïde-geperfuseerde muizenhart

0 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/73840

⸱

27 oktober 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The People's Hospital of Danyang, Affiliated Danyang Hospital of Nantong University, 2Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 3Department of Cardiac Surgery, Heinrich Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een ex vivo myocardinfarctmodel in het geïsoleerde, met crystalloiden geperfuseerde muizenhart. Deze benadering omzeilt systemische variabelen, waardoor onderzoekers cardiac effecten direct kunnen evalueren in afwezigheid van extrinsieke factoren die de overleving van cardiomyocyten kunnen beïnvloeden, en lokale farmaceutische interventies kunnen testen.

Samenvatting

Experimenteel myocardinfarct (MI) wordt bij dieren doorgaans gemodelleerd via tijdelijke occlusie van de linker anterior descending (LAD) kransslagader of, op cellulair niveau, door hypoxie-reoxygenatieprotocollen. Als alternatief model voor ischemie op organniveau is het Langendorff-geperfundeerde hart een hoeksteen gebleven voor het onderzoeken van de effecten van fysiologische verstoringen en farmacologische interventies op cardioprotectie. Hier presenteren we de basismethodiek en de fundamentele regels die vereist zijn voor het opzetten van een regionaal myocardiaal ischemie/reperfusiemodel in het geïsoleerde muizenhart. Kort samengevat werd, na cardioplegische arrestatie, de LAD afgebonden na een korte spoeling met ijskoud PBS. Het hart werd vervolgens gemonteerd op een Langendorff-apparaat en geperfundeerd met een nutriëntenrijke, gezuurstofde buffer bij 37°C onder een constante perfusiedruk van 110 cmH₂O. Myocardiale ischemie werd geïnduceerd voor 30, 45, 60, 90 en 120 min, gevolgd door 90 min reperfusie. De viabiliteit van cardiomyocyten en de infarctgrootte werden beoordeeld met behulp van een microscopische 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuringsmethode. We hebben aangetoond dat het ex vivo MI-model betrouwbaar reproduceerbare myocardiale schade opleverde, gekenmerkt door een progressief verlies van viabele cardiomyocyten binnen de infarctregio naarmate de ischemieduur toenam. Daarnaast was ten minste 30 min reperfusie nodig om een duidelijke TTC-gebaseerde afbakening van het geïnfarceerde myocard te verkrijgen. Deze benadering omzeilt systemische variabelen, waardoor onderzoekers direct de cardiale effecten kunnen evalueren in afwezigheid van extrinsieke regulerende invloeden, zoals circulerende humorale factoren en infiltratie van immuuncellen, die de progressie van het MI kunnen beïnvloeden, en lokale farmaceutische interventies kunnen testen. Hiermee vormt het ex vivo MI-model een nuttig platform voor het onderzoeken van cardioprotectieve mechanismen die direct inwerken op cardiomyocyten.

Inleiding

Een myocardinfarct (MI) treedt op wanneer de bloedstroom in de kransslagaders stopt, wat leidt tot weefselsterfte en ernstige functionele beperkingen. Hoewel dit doorgaans in hele organismen wordt bestudeerd, kan de term verwijzen naar regionaal MI beperkt tot specifieke hartstructuren, of naar ex vivo, geïsoleerde hartlaboratoriummodellen (bijv. Langendorff-perfusie) die worden gebruikt om infarcten te bestuderen zonder systemische invloed1. Als zodanig dient het Langendorff-geperfuseerde hart al meer dan 50 jaar als een robuust en goed gevestigd experimenteel model voor het bestuderen van myocardiale ischemische schade2.

Het ex vivo MI-model in het geïsoleerde hart biedt verschillende voordelen, waaronder een precieze controle over de experimentele omgeving en de mogelijkheid om de directe effecten van interventies, zoals farmacologische middelen, op het myocard te evalueren onafhankelijk van systemische invloeden, waaronder circulerende humorale factoren, bloedcomponenten en neurohumorale regulatie3. Door deze verstorende factoren te minimaliseren, biedt het ex vivo model een meer voorspelbare en reproduceerbare benadering dan in vivo modellen en faciliteert het daarmee een rigoureus onderzoek naar de ziekteprocessen en moleculaire pathways die betrokken zijn bij MI4.

In geïsoleerde harten kan myocardiale ischemie zowel globaal als regionaal worden geïnduceerd5. In het globale MI-model wordt de perfusiestroom door de gehele coronaire circulatie volledig onderbroken, terwijl in het regionale MI-model alleen de linker anterior descendent coronaire arterie (LAD) tijdelijk wordt afgesloten door ligatie, wat resulteert in ischemische schade beperkt tot het myocard distaal van de ligatieplaats. Hoewel het globale MI-model technisch eenvoudig uit te voeren is, kent het verschillende beperkingen die de toepassing ervan in studies naar cardioprotectie beperken6. Een belangrijke beperking is dat de duur van de ischemie wordt bepaald door de duurzame tolerantie van het gehele hart, waardoor langdurige ischemie moeilijk te induceren is, met een kans op transmuraal infarct vergelijkbaar met in vivo situaties7. Bovendien, hoewel ex vivo modellen over het algemeen een uitstekende reproduceerbaarheid bieden wanneer de duur van ischemie en reperfusie zorgvuldig worden gecontroleerd, variëren deze protocollen aanzienlijk tussen laboratoria. Dergelijke variabiliteit benadrukt de noodzaak voor een betere standaardisatie en karakterisering van het geïsoleerde muizenhart, vooral omdat veel kritische methodologische details onvoldoende worden beschreven in de literatuur8.

Aan de andere kant is het regionale MI-model technisch uitdagender om op te zetten. Hier presenteren we verschillende modificaties en praktische strategieën om de inductie van betrouwbare ex vivo MI in het geïsoleerde muizenhart te optimaliseren, in het bijzonder voor het evalueren van farmacologische interventies gericht op cardioprotectie9,10. Hiermee biedt dit gemodificeerde ex vivo MI-protocol met gebruik van het Langendorff-geperfundeerde muizenhart een effectief platform voor het direct beoordelen van de myocardiale overleving na therapeutische interventies.

Protocol

Het hier beschreven model van het geïsoleerde geperfuseerde hart is een acuut experiment zonder overleving en is goedgekeurd door de lokale autoriteiten (O1019/25, LANUV van Nordrhein-Westfalen, Duitsland). Alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen en de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De apparatuur en chemicaliën die nodig zijn voor de experimenten staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Het opzetten van een Langendorff retro-perfusiesysteem voor het geïsoleerde muizenhart

OPMERKING: Er werd een niet-recirculerend, door zwaartekracht aangedreven systeem ontworpen om zuurstofrijk crystalloïde perfusaat (Krebs-Henseleit-buffer, KHB) aan het geïsoleerde muizenhart toe te dienen bij een constante druk van 110 cmH2O (Figuur 1A).

  1. Reinig het Langendorff-glaswerk met 0.1 M/L HCl en 100% ethanol, en spoel dit vervolgens na met gedestilleerd water voordat het systeem wordt gemonteerd.
  2. Weeg alle chemicaliën af die nodig zijn voor de bereiding van 2 L gemodificeerde KHB volgens de volgende eindconcentraties (mM): 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4·7H2O, 1.21 KH2PO4, 2.52 CaCl2·2H2O, 24.88 NaHCO3, 8.30 D-glucose, 2.0 natiumpyruvaat.
  3. Los alle chemicaliën, behalve CaCl₂, op in dubbel gedestilleerd water in een kolf van 2 L, terwijl er gedurende ten minste 10 min continu Carbogen (95% O₂/5% CO₂) doorheen wordt geleid om de pH te equilibreren op 7.4.
  4. Voeg CaCl₂ vervolgens toe aan de oplossing om precipitatie te voorkomen.
  5. Zet het doorblazen van de oplossing met Carbogen nog 10 min voort.
  6. Filtreer de KHB-oplossing onder vacuüm door een membraanfilter van 0.2 µm om kleine deeltjes te verwijderen die de coronaire microvasculatuur kunnen blokkeren.
  7. Overbreng de gefiltreerde KHB-oplossing naar een glazen reservoir van 2 L dat in een voorverwarmd waterbad bij 37 °C is geplaatst.
  8. Verbind het KHB-reservoir met de glazen drukkolom, zodat zuurstofrijke KHB de kolom continu vult door de druk die wordt gegenereerd door het Carbogen-gas in het reservoir.
  9. Zorg ervoor dat het uitstroombuizensysteem vrij is van luchtbellen.
  10. Equilibreer de KHB-oplossing nog 30 min met Carbogen voordat het experiment begint.

2. Isolatie en canulatie van het hart

OPMERKING: In de huidige experimenten werden mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 20–25 g gebruikt. Alle experimentele procedures moeten correct worden gedocumenteerd in overeenstemming met de lokale regelgeving, inclusief de rationale, de datum en de methode van euthanasie.

  1. Plaats de muis voorzichtig in een inductiekamer met 5% isofluraan (v/v) voor de inductie van de anesthesie.
  2. Bevestig de diepte van de anesthesie door de volledige afwezigheid van een reactie op een stevige knijp in de teen, en verplaats de muis vervolgens naar de operatietafel. Euthanaseer de muis onmiddellijk door middel van cervicale dislocatie, wat wordt bevestigd door de afwezigheid van ademhaling en verlies van spiertonus in het onderlichaam.
  3. Snijd de ribbenkast aan beide zijden richting het borstbeen door om het hart en de aorta ascendens volledig bloot te leggen.
  4. Pak het extracardiale weefsel vast met een pincet en exciseer het hart.
  5. Plaats het hart gedurende ten minste 30 s in een klein, vooraf gekoeld bekerglas met 50 mL ijskoud KHB-bufferoplossing om een cardioplegische arrestatie op te wekken.
    OPMERKING: Omdat de cardiale activiteit zeer temperatuurgevoelig is, wordt het hart volledig gestopt door onderdompeling in ijskoude KHB-bufferoplossing.
  6. Verplaats het hart naar een vooraf gekoeld, met KHB-buffer bevochtigd wattenstaafje in een metalen schaaltje, waar een canulesysteem is opgezet dat is verbonden met een driewegkraan. (Figuur 1B).
    OPMERKING: Het perfusiesysteem moet vrij zijn van luchtbellen.
  7. Positioneer vooraf een losse halve vierkante knoop met een 5-0 zijden draad op het distale uiteinde van de canule.
  8. Disseceer voorzichtig de thymus, het bindweefsel en resterende extracardiale weefsels (inclusief de longen en slokdarm) weg om de aortawortel bloot te leggen en bij te trimmen.
    OPMERKING: Zorg voor een adequate lengte van de aorta ascendens voor een succesvolle canulatie.
  9. Bevestig het hart op de canule en zet het vast met een vooraf geplaatste hechting.
  10. Spoel het hart met 5 mL ijskoud PBS om resterend bloed uit de coronaire circulatie te verwijderen.

3 Ex vivo myocardiale ischemie en reperfusie

OPMERKING: Globale myocardiale ischemie werd geïnduceerd door simpelweg de perfusie van het hart te stoppen, terwijl regionale myocardiale ischemie werd gecreëerd door tijdelijke ligatie van de LAD onder een stereomicroscoop.

  1. Positioneer de LAD in het centrum van het gezichtsveld door het hart voorzichtig te roteren via aanpassing van het onderliggende wattenkussentje. De LAD werd transparant en duidelijk te onderscheiden van het omringende myocardium tijdens perfusie met PBS.
  2. Haal een taps toelopende naald met een 8–0 polypropyleen hechtdraad onder de LAD door, 1 mm onder de onderrand van het linkeratrium.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de LAD zich precies in het midden tussen de twee punctieplaatsen bevindt om vasculair letsel als gevolg van de ligatie te voorkomen.
  3. Plaats een stukje zachte pledget over de LAD.
  4. Trek de hechtdraad stevig aan om de perfusie distaal van de ligatieplaats te stoppen.
  5. Verplaats het gecannuleerde hart naar het Langendorff-apparaat en start een retrograde perfusie.
  6. Dompel het hart onder in het met wateromhulsel voorziene organenbad om gedurende de gehele experimentele periode een constante temperatuur (37 °C) te handhaven.
  7. Monitor de piek- en steady-state coronaire flow (Tabel 1).
  8. Op de aangewezen tijdstippen van myocardiale ischemie (zie resultatensectie) wordt de perfusie stopgezet en het gecannuleerde hart uit het perfusieapparaat verwijderd.
  9. Dompel het hart onmiddellijk onder in ijskoude KHB (4 °C) om de cardiale contractie volledig te stoppen.
  10. Plaats het hart terug op het wattenkussentje in de vooraf gekoelde metalen schaal en maak de LAD-ligatie los.
  11. Voor farmacologische interventiestudies wordt in deze fase 5 µL Interleukine-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) in de geïnfarceerde voorwand geïnjecteerd met behulp van een 30 G insulinespuit.
  12. Bevestig het gecannuleerde hart opnieuw aan het perfusieapparaat en hervat de cardiale perfusie (reperfusie).

4. Beoordeling van myocardiale schade en overleving

OPMERKING: Kleuring met 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) markeert levensvatig myocardium dieprood, terwijl geïnfarceerd/necrotisch weefsel beige verschijnt na fixatie met Zamboni-oplossing.

WAARSCHUWING: TTC wordt over het algemeen als gevaarlijk beschouwd en vereist een zorgvuldige hantering, aangezien het milde huidirritatie en ernstige oogirritatie kan veroorzaken en schadelijk is bij inademing. Voer afval en residuen af in overeenstemming met de vereisten van de lokale autoriteiten.

  1. Stop de perfusie 90 min na reperfusie en dompel het hart onmiddellijk onder in ijskoud KHB om de cardiale contractie te stoppen.
  2. Verbind de canule met een 3 mL spuit die is gevuld met TTC-kleuringsoplossing (1% TTC opgelost in PBS) via een driewegkraan.
  3. Infuseer 1 mL TTC-oplossing in het hart, herhaal de infusie drie keer en breng een totaalvolume van 3 mL toe gedurende 15 min.
  4. Bedek het hart met vochtig weefselpapier om uitdroging van het oppervlak te voorkomen.
  5. Plaats het hart in een centrifugebuis met 3 mL TTC-oplossing bij 4 °C gedurende de nacht
  6. Maak een weefselblok met Optimal Cutting Temperature (OCT)-compound.
    OPMERKING: Het weefselblok kan worden bewaard bij −80 °C gedurende enkele maanden tot verdere analyse.
  7. Bevestig het weefselblok op een cryostaathouder met behulp van OCT-compound.
  8. Maak opeenvolgende cryosneden van het hart met een dikte van 50 µm en verzamel elke 10th sectie; over het algemeen worden ongeveer 8 weefselsneden per hart verkregen.
  9. Lijn alle 8 coupes uit op één microscopiepreparaat en droog deze 2–3 min. met een föhn.
  10. Dompel de coupes gedurende één nacht in een kleurkamer met Zamboni-oplossing (een fixeermiddel bestaande uit 2% paraformaldehyde en 0,4% picrinezuur, w/v) bij 4 °C.
    WAARSCHUWING: Het fixeermiddel van Zamboni kan een allergische huidreactie veroorzaken en wordt vermoed genetische defecten en carcinogenese te veroorzaken. Voer afval en residuen af in overeenstemming met de lokale regelgeving.
  11. Was de coupes 3 keer met PBS en bedek de coupes met monteermedium.
    OPMERKING: Met TTC gekleurde hartmonsters kunnen enkele maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.
  12. Leg beelden van het hart vast met een lichtmicroscoop met een 1,25x objectief met behulp van CellSens-software.
  13. Importeer de afbeeldingsbestanden in het ImageJ-platform voor de kwantificering van de infarctgrootte.
  14. Selecteer in het ImageJ-menu Afbeelding -> Aanpassen -> Kleurdrempelwaarde om het venster Color Threshold te openen (Figuur 2B).
  15. Selecteer een klein interessegebied (ROI) binnen de hartsectie en gebruik het dieprode levensvatbare myocardium en het beige geïnfarceerde/necrotische weefsel als kleurreferenties.
  16. Klik op Monster in de Kleurdrempelwaarde pas het venster en het verzadigingsbereik aan totdat het geselecteerde gebied precies overeenkomt met het doelgekleurde gebied.
  17. Klik op Selectie om het gebied af te bakenen dat overeenkomt met de geselecteerde kleur.
  18. Selecteer in het ImageJ-menu Analyseer -> MetenDe oppervlakte van het geselecteerde gebied, weergegeven in pixels, wordt getoond in het Resultatenvenster.
  19. Exporteer de meetgegevens naar een Excel-spreadsheet voor de berekening van de planimetrische infarctgrootte.
  20. Om het levensvatbare myocard binnen het infarctgebied te kwantificeren, dient het interessegebied (ROI) te worden afgebakend, primair op de geïnfarceerde voorwand van de ventrikel, waar IL-6 is geïnjecteerd.
  21. Open de ROI-manager via het ImageJ-menu en klik op Toevoegen om de geselecteerde ROI op te slaan in de ROI-lijst (Figuur 2C).
  22. Gebruik de functies "Sample" en "Selection", zoals hierboven beschreven, om het levensvatbare myocardium (dieprood) af te bakenen.
  23. Voeg het geselecteerde levensvatbare gebied toe aan de lijst van de "ROI Manager" en selecteer vervolgens EN om de overlap tussen de ROI en het levensvatbare myocardium te verkrijgen.
  24. Meet het oppervlak van het levensvatbare myocard en bereken de overlevingskans van de cardiomyocyten binnen de geselecteerde ROI.
    OPMERKING: De methodologische details voor TTC-kleuring en kwantificering van de infarctgrootte zijn eerder gerapporteerd11.

Resultaten

In het ex vivo MI-platform werden twee ischemische protocollen geëvalueerd in het geïsoleerde muizenhart. Globale ischemie, die veelvuldig is gebruikt in ex vivo MI-studies, resulteerde in heterogene ischemische schade in het gehele hart. Met behulp van een betrouwbare microscopische TTC-gebaseerde detectiemethode met hoge resolutie12 werd aangetoond dat het atriale myocardium en de apicale regio relatief resistent waren voor ischemie en levensvatbaar bleven na 45 min globale no-flow ischemie (Figuur 2A, bovenste paneel). In contrast hiermee veroorzaakte regionale MI gelokaliseerde ischemische schade in het myocardium distaal van de LAD-ligatieplaats. Onder deze omstandigheden bleven delen van het subepicardiale myocardium TTC-positief, wat duidt op het behoud van levensvatbaar weefsel (Figuur 2A, onderste paneel). Deze bevindingen onthullen verschillende patronen van myocardiaal overleven tussen de twee ischemische protocollen.

De minimale duur van ischemie en reperfusie die nodig is om op betrouwbare en reproduceerbare wijze een myocardinfarct op te wekken, werd verder onderzocht in het geïsoleerde muizenhart. Myocardiale schade nam progressief toe naarmate de duur van de ischemie werd verlengd van 30 min naar 120 min (Figuur 3A). Opmerkelijk genoeg werd de infarctgrootte meer dan verdubbeld tussen 30 min (n = 3) en 45 min (n = 5) ischemie en leek deze een plateau te bereiken toen de ischemische duur werd verlengd naar 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) en 120 min (n = 3) (Figuur 3B). Deze bevindingen geven aan dat de myocardiale levensvatbaarheid zeer gevoelig is voor de ischemische duur voorbij de 30 min. Vergeleken met het in vivo MI-model (ivMI, n = 5), produceerde het ex vivo MI-model (evMI, n = 8) vrijwel identieke infarctgroottes bij vergelijkbare ischemie- en reperfusieduren (36,88% ± 3,91% vs. 37,8% ± 2,17%, p = 0,27), wat suggereert dat de myocardiale schade niet substantieel werd beïnvloed door crystalloïde perfusie. Desalniettemin vertoonden evMI-harten dikkere ventrikelwanden en een gereduceerd ventrikellumen, waarschijnlijk als gevolg van myocardiaal oedeem geassocieerd met crystalloïde perfusie (Figuur 3C).

Door gebruik te maken van de relatief gecontroleerde omgeving, vrij van extracardiacaire invloeden, werden de cardioprotectieve effecten van intramyocardiale IL-6-toediening geëvalueerd. In controleharten behandeld met PBS bleven verspreide maar meetbare levensvatbare cardiomyocyten (levensvatbare CM's; dieprood) detecteerbaar binnen de geïnfarceerde/necrotische regio (beige), zelfs na 45 min ischemie (Figuur 4; 1,05% ± 0,44%, SEM, n = 4). Opmerkelijk genoeg verhoogde intramyocardiale toediening van IL-6 (i.m.; pijlen) de hoeveelheid levensvatbare CM's significant, welke hoofdzakelijk gelokaliseerd waren rond de injectieplaats binnen de regio van belang (ROI; 4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, Student's t-test). Deze bevindingen suggereren dat IL-6 de overleving van cardiomyocyten na ischemische schade kan verbeteren.

Ten slotte heeft het huidige ex vivo MI-model verschillende potentiële valkuilen die de reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Zoals aangetoond in Figuur 5, kan het wegglijden van de ligatuur leiden tot een onvoldoende occlusie van de LAD en uitgebreid myocardiaal overleven (4/168), terwijl er ondertussen incomplete reperfusie kan optreden wanneer takken van de LAD beschadigd raken (12/168). Daarnaast kan luchtembolisatie tijdens de aortacannulatie ook myocardiale schade veroorzaken (pijlen, 7/168), waardoor het moeilijk is om ischemische schade te onderscheiden van embolische schade voor kwantificering. Tot slot kan er onvoldoende TTC-kleuring optreden wanneer het hart overmatig wordt geperfuseerd (11/168), wat de afbakening van het infarctgebied aanzienlijk belemmert.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de experimentele opstelling. Het niet-recirculerende, door zwaartekracht aangedreven Langendorff-systeem met constante druk was ontworpen om voedingsstofrijke, zuurstofhoudende Krebs–Henseleit-buffer (KHB) te leveren bij een constante hydrostatische druk van 110 cmH₂O. KHB werd eerst voorverwarmd tot 37 °C in een reservoir en gevoed aan een watergekoelde drukkolom, waar een constante hydrostatische druk van 110 cmH2O werd gehandhaafd via een drukregelaar. Het geperfuseerde hart was ondergedompeld in een in hoogte verstelbaar, watergekoeld organenbad om gedurende de experimentele periode een constante temperatuur van 37 °C te behouden (A). Myocardinfarct werd geïnduceerd door tijdelijke ligatie van de linker anterior descending (LAD) coronaire arterie na cardioplegische stopzetting op een wattenplukje in een vooraf gekoelde metalen schaal (B). De procedure werd uitgevoerd onder een stereomicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Regionaal versus globaal myocardinfarct (MI) en bepaling van de infarctgrootte. Globaal MI induceert ischemische schade in het gehele hart, zoals aangegeven door de gele kleuring in de microscopische TTC-beelden. Het atriale myocardium en de apicale regio leken resistenter tegen ischemie en bleven levensvatbaar na 45 min globale no-flow ischemie (bovenpaneel in A). Regionaal MI induceert ischemische schade in het myocardium distaal van de LAD-ligatieplaats. In deze setting zijn delen van het subepicardiale myocardium rood gekleurd, wat wijst op behoud van levensvatbaar weefsel (onderpaneel in A). De infarctgrootte werd gekwantificeerd met ImageJ, waarbij het geïnfarceerde/necrotische gebied en het levensvatbare myocardium werden afgebakend op basis van hun verschillende kleuringskleuren (B). De overleving van cardiomyocyten binnen het interessegebied (ROI) werd berekend door het percentage van de donkerrode kleuring in de geselecteerde ROI te bepalen (C). Schaalbalken: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Impact van de ischemieduur op de infarctgrootte. Myocardiale beschadiging verergerde progressief naarmate de duur van de ischemie werd verlengd van 30 min naar 120 min (A). De infarctgrootte verdubbelde meer dan tussen 30 min (n = 3) en 45 min (n = 5) ischemie en leek een plateau te bereiken naarmate de ischemieduur werd verlengd naar 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) en 120 min (n = 3) (B). Vergeleken met het in vivo MI (ivMI, n = 5) model, produceerde het ex vivo MI (evMI, n = 8) bijna identieke infarctgroottes bij vergelijkbare ischemieduren (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27, Student’s t-test). De evMI-harten vertoonden een dikkere ventriculaire wand en een gereduceerd ventriculair lumen, waarschijnlijk als gevolg van myocardiaal oedeem geassocieerd met crystalloïde perfusie (C). Foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde (SDM). Schaalbalken: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: IL-6 verbeterde de overleving van cardiomyocyten na ischemische schade. Intramyocardiale (i.m.) toediening van IL-6 in het evMI-model resulteerde in een meetbaar aantal levensvatbare cardiomyocyten (levensvatbare CM's; donkerrood) binnen de geïnfarcteerde/necrotische regio (beige), hoofdzakelijk gelokaliseerd rond de IL-6 injectieplaats (pijlen, linkerpaneel). Kwantificering van levensvatbare CM's binnen het interessegebied (ROI, aangegeven door stippellijnen) onthulde dat PBS-injectie slechts resulteerde in een klein fractie levensvatbaar myocardium (1,05% ± 0,44%, SEM, n = 4), terwijl injectie van IL-6 de hoeveelheid levensvatbare CM's binnen de ROI significant verhoogde (4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, Student's t-test). Foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde (SDM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Onbevredigende of mislukte resultaten veroorzaakt door technisch falen. Zoals geïllustreerd door de representatieve myocardiale beschadiging in het ex vivo MI-model (links), kunnen levensvatbaar en necrotisch myocardium over het algemeen duidelijk worden onderscheiden bij een typische TTC-kleuring. Er zijn echter verschillende technische fouten die kunnen leiden tot onbevredigende of oninterpreteerbare resultaten. Onvoldoende LAD-ligatie door het wegglijden van de hechting kan leiden tot uitgebreid overleven van het myocardium ondanks langdurige ischemie. Onvolledige reperfusie kan optreden wanneer takken van de LAD tijdens de ligatie beschadigd raken en vervolgens slecht worden geperfuseerd, waardoor een patroon ontstaat dat lijkt op het klinisch geobserveerde "no-reflow"-fenomeen. Dergelijke regio's kunnen een roze kleur vertonen (pijlen). Microvasculaire embolisatie door luchtbellen die tijdens de canulatieprocedure de coronaire circulatie binnendringen, kan ook myocardiale beschadiging veroorzaken (pijlen), waardoor het moeilijk is om ischemische schade van embolische schade te onderscheiden voor kwantificatie. Ten slotte kan onvoldoende TTC-kleuring optreden wanneer het hart overmatig wordt geperfuseerd, wat naast ischemie ook myocardiale beschadiging kan veroorzaken. Schaalbalken: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

F-piek (n = 19)F-steady (n = 19)RF-piek (n = 19)RF-steady (n = 19)
Gemiddelden (mL/min)2.540.7820.99
SD0.590.290.560.53

Tabel 1: Coronaire flow bij de maximale (F-peak) en steady-state (F-steady) niveaus tijdens ischemie en reperfusie (RF-peak en RF-steady).

Discussie

Het huidige ex vivo MI-model is primair gebaseerd op geavanceerde Langendorff-geperfuseerde hartsystemen2. Een veelvoorkomende valkuil tijdens de preparatie is de introductie van luchtbellen in de coronaire circulatie, wat embolische schade kan veroorzaken en de beoordeling van ischemische schade kan bemoeilijken. Om dit probleem te voorkomen, is een nauwkeurige inspectie van het perfusiesysteem vlak voor elk experiment essentieel. Als er kleine luchtbellen in het slangensysteem vast komen te zitten, kan retrograden spoelen met KHB om de bellen terug in de drukkolom te verplaatsen helpen het probleem op te lossen.

De cruciale stap in dit protocol is de ligatie van de LAD-kransslagader. Daarom is allereerst een nauwkeurige visuele identificatie van de LAD essentieel. In de meeste gevallen worden de coronaire vaten transparant nadat het hart is gespoeld met ijskoud PBS, waardoor de LAD duidelijk te onderscheiden is van het omringende myocardium. Daarnaast is een correcte en vaardige ligatietechniek even belangrijk, aangezien overmatige spanning op de 8-0 polypropyleenhechting door de LAD kan snijden, waardoor een daaropvolgende reperfusie onmogelijk wordt. Om dit risico te minimaliseren, moet een passend formaat zacht pledget tussen de hechting en het vat worden geplaatst om de ligatiekracht te verdelen en de kransslagader tegen mechanisch letsel te beschermen. Niettemin is gering myocardiaal letsel door de ligatie onvermijdelijk, maar dit beïnvloedt over het algemeen de coronaire perfusie of de uitkomst van het experiment niet. Ten slotte is, omdat myocardiaal letsel zeer temperatuurgevoelig is13, een constante temperatuur gedurende het hele experiment van kritiek belang. Vooral onder condities van perfusie bij constante druk kan er waarschijnlijk warmteverlies optreden tussen de perfusiekolom en het hart, wat dynamisch varieert afhankelijk van de coronaire stroomsnelheid14. Fluctuaties kunnen dus potentieel leiden tot veranderingen in de myocardiale temperatuur. In deze setting is een watergekoeld organenbad zeer wenselijk om stabiele thermische condities te handhaven (Figuur 1A).

Zodra deze technische uitdagingen zijn overwonnen, biedt het ex vivo MI-model een betrouwbaar en reproduceerbaar platform voor het induceren van myocardiale schade in het geïsoleerde muizenhart (Figuur 3A). Daarom vormt het een waardevol experimenteel systeem voor het onderzoeken van myocardiale overleving na een MI, het evalueren van lokaal toegediende therapeutische interventies en het uitvoeren van hoge-resolutie beeldvorming zonder interferentie van respiratoire of cardiale bewegingen. Hoewel het globale MI-protocol technisch eenvoudig is en veelvuldig is gebruikt in eerdere studies4, is de belangrijkste beperking dat de duur van de globale ischemie over het algemeen beperkt is tot minder dan 45 min3. Bijgevolg produceert het, in tegenstelling tot het regionale MI-model, zelden een transmuraal infarct (Figuur 2).

Een uniek kenmerk van het ex vivo MI-model is de afwezigheid van systemische invloeden, waaronder neurale regulatie en circulerende bloedcomponenten, waardoor onderzoekers de directe lokale effecten van therapeutische interventies op het myocard kunnen evalueren8. Dit is bijzonder relevant voor cytokinen zoals IL-6 en de downstream PI3K/AKT-signalering, waarvan is aangetoond dat ze cardioprotectief zijn in geïsoleerde cardiomyocyten15. In vivo zijn de cardiale effecten van IL-6 echter vaak inconsistent of zelfs tegenstrijdig, omdat IL-6 gelijktijdig immuuncellen activeert en inflammatoire responsen bevordert die de directe cardioprotectieve werking kunnen tenietdoen16. In overeenstemming met dit concept heeft ons ex vivo model overtuigend aangetoond dat lokale intramyocardiale toediening van IL-6 de myocardiale levensvatbaarheid na ischemische schade significant behield17,18, wat een direct cardioprotectief effect van IL-6 op cardiomyocyten ondersteunt (Figuur 4).

Wij erkennen verschillende beperkingen van het huidige ex vivo MI-model. In de huidige opzet is de contractiele hartfunctie in het huidige protocol niet geëvalueerd3. Dit komt omdat het hoofddoel was om de myocardiale overleving in een regionaal MI-model te karakteriseren, en omdat contractiele dysfunctie wijst op functionele beperking na ischemische schade, maar niet noodzakelijkerwijs duidt op de dood van cardiomyocyten8. Bovendien sluit het ex vivo MI-model inherent circulerende bloedcomponenten, immuuncellen en neurohumorale invloeden uit die substantieel kunnen bijdragen aan de progressie van MI en cardiale remodellering in vivo. Hoewel deze vermindering van systemische complexiteit een groot voordeel is van het ex vivo MI-model, beperkt het ook het brede gebruik ervan bij het nabootsen van de inflammatoire, vasculaire, neurale en endocriene reacties die in vivo kunnen optreden. Ten slotte bleek crystalloïde perfusie geassocieerd te zijn met myocardiaal oedeem, zoals blijkt uit een toegenomen ventriculaire wanddikte en een verminderd ventriculair lumen in vergelijking met in vivo MI-harten. Het bekende voorkomen van oedeem kan de myocardiale architectuur, weefseldiffusie en potentieel de cellulaire viabiliteit beïnvloeden. Daarom moet het huidige model worden beschouwd als een gecontroleerd platform voor het onderzoek naar myocardiale schade en cardiomyocyten-specifieke mechanismen.

Niettemin is het hier beschreven ex vivo MI-model een eenvoudig, kosteneffectief platform voor het evalueren van myocardiale overleving in afwezigheid van extrinsieke regulerende invloeden. Gezien het toenemende gebruik van genetisch gemodificeerde muismodellen kan deze aanpak bijzonder waardevol zijn voor het onderzoeken van cardioprotectieve mechanismen met behulp van geavanceerde beeldvorming, elektrofysiologische registraties en moleculaire analyses. Daarnaast zou het model kunnen worden aangepast om gelokaliseerde farmacologische of gen-gebaseerde interventies systematisch te testen en om cardiomyocyt-specifieke mechanismen te ontleden zonder systemische storende factoren. Zo biedt het ex vivo MI-model een complementair experimenteel platform om de identificatie en mechanistische studie van hartbeschermende pathways te faciliteren.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenverstrengelingen hebben. De auteurs verklaren dat er geen kunstmatige intelligentie-instrumenten (AI) of generatieve AI-ondersteunende technologieën zijn gebruikt bij het opstellen, de data-analyse, het genereren van figuren of de validatie van dit werk.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het General Project of the Jiangsu Geriatrics Society (JGS2026MS019 aan WO), de Social Development Foundation of the Science and Technology Department of Zhenjiang City (subsidienummers SH2023023 aan H.Z. en SH2023057 aan X.L.), het FoKo-programma (subsidienummer 23/2013 aan ZD) en het Cardiovascular Research Institute Düsseldorf (CARID).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorideMillipore1.08380.0100Chemicaliën
AortacannuleBD305895 (20 G)Retroperfusie
AquamountBDH362262HCryosectie
WeegschaalOhaus-Wegen van chemicaliën
Grote pincetAESCULAP-Chirurgische instrumenten
BloedgasanalyzersRadiometerABL90 FLEX PLUSGasanalysator
Calciumchloride-dihydraatFluka21097Chemicaliën
CarbogenLinde4040152Langendorff-apparaat
CellSensOlympusVersie 3.1.1Beeldverwerkingssoftware
WattenpadsBEESanaPZN-1330900Chirurgische instrumenten
DekglasjesEprediaBB02400500A113MN20Cryosectie
CryostaatLeicaM850Cryosectie
Watervrije D(+)-glucoseMerck8337.1000Chemicaliën
Dubbel gedestilleerd waterMillipore-Chemicaliën oplossen
Ethanol (100%)Merck64-17-5Het reinigen van slangetjes
Ethanol (70%)VWRUN1170Schoonmaken van slangetjes
Filtermembraan (0.2 µm)Thermo Scientific8-000-230511Langendorff-apparaat
FlowmeterTransoonT4S410Langendorff-apparaat
Glazen microscoopglaasjesEngelbrecht11102Cryosectie
Glazen waterkolomZelfgemaakt-Langendorff-apparaat
ZoutzuurRothP074.1Chemicaliën
ImageJNIHversie 1.54gSoftware
Interleukine-6Biolegend570804Chemicaliën
IsofluraanPiramal14150097146754Chemicaliën
LichtmicroscoopOlympusBX61Beeldvorming
MagnesiumsulfaatheptahydraatMerck5886.1000Chemicaliën
Medische flowprobeTransoon3PXNLangendorff-apparaat
Metalen schaalZelfgemaakt-Chirurgische instrumenten
Micro-Fine spuitBD30G / 0,3 mLLangendorff-apparaat
MuisJanuariC57BL/6JDieren
Doel (x 1,25)OlympusPlanApo 1,25X/0,04Beeldvorming
OCT-verbindingSakura4583Chemicaliën
PetrischaalThermo Scientific172931Langendorff-apparaat
Fosfaatgebufferde zoutoplossingRoth9143.1Chemicaliën
KaliumchlorideMerck4936.1000Chemicaliën
KaliumdihydrogenfosfaatMerck4873.1000Chemicaliën
Zijden hechtmateriaalF.S.T18020-60Chirurgische instrumenten
NatriumchlorideSigmaAldrichSZBD0810VChemicaliën
NatriumwaterstofcarbonaatRoth6885.2Chemicaliën
NatriumpyruvaatSigmaAldrich113-24-6Chemicaliën
Zacht pledgetDeknatelL-705Chirurgische instrumenten
Roestvrijstalen pincet (8 mm)F.S.T11052-10Chirurgische instrumenten
Roestvrijstalen schaarAESCULAPBC702RChirurgische instrumenten
Roestvrijstalen schaarAESCULAPBC257RChirurgische instrumenten
StereomicroscoopLeicaMZ6Chirurgische instrumenten
Hechtmateriaal (8-0)EthiconTG-108Chirurgische instrumenten
Spuit (3 mL)B. Braun4617100VRetroperfusie
DriekleppenkraanB. Braun16494CRetroperfusie
BuisjesTygonT3304-23Langendorff-apparaat
WaterbadHAAKEDC1/B3Langendorff-apparaat
Zamboni-oplossingMorphisto12773.0050Chemicaliën

Referenties

  1. Pendexter CA, et al. Modified Langendorff perfusion method for extended perfusion times of rodent cardiac grafts. J Vis Exp. 2024;(208):66815.
  2. Bell RM, Mocanu MM, Yellon DM. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(6):940-950.
  3. Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
  4. Yang T, et al. Isolated perfused hearts for cardiovascular research: an old dog with new tricks. J Cardiovasc Transl Res. 2024;17(5):1207-1217.
  5. Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
  6. Hurt CM, et al. Transient receptor potential vanilloid 1 regulates mitochondrial membrane potential and myocardial reperfusion injury. J Am Heart Assoc. 2016;5(9):3774.
  7. Herr DJ, Aune SE, Menick DR. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. 2015;(101):52908.
  8. Lindsey ML, et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H812-H838.
  9. Zhu H, et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 2023;12(12):137-150.
  10. Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
  11. Ding Z, Zhang H, Bouvain P, Ding Z, Flögel U. A microscopic 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride assay for accurate and reliable analysis of myocardial injury. J Vis Exp. 2025;(225):68596.
  12. Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
  13. El Farissi M, et al. Hypothermia for reduction of myocardial reperfusion injury in acute myocardial infarction: closing the translational gap. Circ Cardiovasc Interv. 2021;14(8):010326.
  14. Ding Z, Gödecke A, Schrader J. Contribution of cytochrome P450 metabolites to bradykinin-induced vasodilation in endothelial NO synthase deficient mouse hearts. Br J Pharmacol. 2002;135(3):631-638.
  15. Smart N, et al. IL-6 induces PI 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2006;69(1):164-177.
  16. Broch K, et al. Randomized trial of interleukin-6 receptor inhibition in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2021;77(15):1845-1855.
  17. Fontes JA, Rose NR, Čiháková D. The varying faces of IL-6: from cardiac protection to cardiac failure. Cytokine. 2015;74(1):62-68.
  18. Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Ex vivo hartLangendorff-perfusiemuizenhartmodelligatie van de kransslagaderischemie-reperfusielevensvatbaarheid van cardiomyocytenTTC-kleuringinfarctgroottecardioprotectie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.