Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Centrale mechanismen van elektroacupunctuur bij chronisch hartfalen: inzichten uit kwantitatieve proteomica van de nucleus tractus solitarius

172 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/73867

⸱

18 september 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chinese Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 2Anhui Province Key Laboratory of Meridian Viscera Correlationship, 3School of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Rehabilitation Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, 5School of Acupuncture and Tuina, Anhui University of Chinese Medicine, 6College of Integrated Chinese and Western Medicine (School of Life Science), Anhui University of Chinese Medicine, 7South China Research Center for Acupuncture and Moxibustion, Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Elektroacupunctuur vermindert chronisch hartfalen en pathologische cardiale remodellering door de neuronale activiteit in de nucleus tractus solitarius te herstellen. Deze therapeutische centrale neuromodulatie is geassocieerd met de upregulatie van de kandidaat-biologische doelwit-transcriptiefactor YY1.

Samenvatting

Chronisch hartfalen (CHF) is een belangrijke wereldwijde oorzaak van cardiovasculaire mortaliteit, gedreven door autonome dysregulatie en sympathische overactivatie. Hoewel elektroacupunctuur (EA) cardioprotectieve effecten uitoefent via centrale neuromodulatie, blijven de specifieke moleculaire doelwitten binnen de nucleus tractus solitarius (NTS), een belangrijk centrum voor autonome integratie, onduidelijk. Om dit te onderzoeken, werd een CHF-ratmodel tot stand gebracht via ligatie van de linker anterior descending kransslagader. De ratten ontvingen zeven opeenvolgende dagen EA op bilaterale HT7-acupunctuurpunten. De hartfunctie en myocardiale schade werden geëvalueerd met echocardiografie, enzyme-linked immunosorbent assays en histologische kleuring. De neurale activiteit in de NTS werd beoordeeld via c-Fos-immunofluorescentie en in vivo elektrofysiologie. Moleculaire mechanismen werden onderzocht met behulp van kwantitatieve proteomics en bio-informatica, waarbij kern-doelwitten werden geverifieerd via kwantitatieve PCR en Western blotting. EA verbeterde de ejectiefractie van de linker ventrikel, verminderde myocardiale fibrose en verlaagde serummarkers voor hartfalen. Tegelijkertijd herstelde EA de spontane neuronale vuursnelheden, lokale veldpotentiaalenergie en c-Fos-expressie binnen de NTS. Proteomische profilering identificeerde 85 kern-differentieel tot expressie gebrachte eiwitten die door EA werden gemoduleerd. Functionele stratificatie van de 58 downgereguleerde en 27 upgereguleerde eiwitten onthulde hun respectievelijke participatie in de organisatie van de extracellulaire matrix en ATP-afhankelijk chromatineremodellering. De stapsgewijze screeningsaanpak, waarin topologische netwerkmapping, pathway-verrijking en weefselexpressie-profilering werden geïntegreerd, identificeerde de transcriptiefactor YY1 als een zeer responsief kandidaat-doelwit. In vivo validatie bevestigde dat EA de expressie van YY1 upreguleerde. Over het algemeen verzachtte EA pathologische cardiale remodellering en herstelde het de neuronale activiteit in de NTS. YY1 werd geïdentificeerd als een kandidaat-doelwit geassocieerd met deze centrale neuromodulatie, wat moleculaire inzichten biedt in de mechanismen die ten grond liggen aan de effecten van EA bij CHF.

Inleiding

Chronisch hartfalen (CHF) wordt algemeen erkend als het eindstadium van diverse cardiovasculaire pathologieën en blijft wereldwijd een leidende oorzaak van cardiovasculaire mortaliteit, wat een enorme belasting vormt voor de wereldwijde gezondheidszorgsystemen1. De pathofysiologische progressie van CHF wordt primair gedreven door dysregulatie van het autonome zenuwstelsel, gekenmerkt door aanhoudende sympathische overactivatie en parasympathische terugtrekking2. Het herstellen van de autonome homeostase wordt daarom beschouwd als een cruciale therapeutische strategie voor het verminderen van pathologische cardiale remodellering en het verbeteren van de globale hartfunctie3.

Elektroacupunctuur (EA) vormt een moderne ontwikkeling van traditionele acupunctuur en heeft brede erkenning gekregen voor de klinische werkzaamheid bij de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen4. Uit uitgebreid onderzoek, waaronder onze eerdere studies, is gebleken dat deze therapie aanzienlijke cardioprotectieve effecten uitoefent, primair door het moduleren van het centrale autonome zenuwstelsel. Specifiek hebben we aangetoond dat EA op het Shenmen (HT7) acupunt de overmatige sympathische outflow effectief kan onderdrukken en de sympathovagale balans kan herstellen via gerichte centrale neurale mechanismen, waardoor de pathologische progressie van CHF wordt verlicht5,6,7,8.

De nucleus tractus solitarius (NTS), gelegen in de medulla oblongata, is een essentieel integratiecentrum voor het handhaven van de centrale autonome balans. Het fungeert als het primaire relaisstation voor cardiovasculaire reflexen en perifere sensorische input, waarbij het het dynamische evenwicht tussen de sympathische en vagale tonus reguleert9. Ondanks het anatomische en functionele belang blijven de specifieke moleculaire veranderingen binnen dit cruciale centrum van de hersenstam tijdens EA-behandeling voor CHF grotendeels onbekend. Geavanceerde high-throughput proteomics in combinatie met bioinformatica-analyse biedt een krachtig instrument om onbevooroordeeld de complexe eiwitnetwerken en signaleringscascades in kaart te brengen die betrokken zijn bij dit centrale neurobiologische proces10.

Daarom was deze studie erop gericht de effecten van EA op het HT7-acupunt op de hartfunctie en de neuronale activiteit van de NTS bij CHF te onderzoeken en de moleculaire veranderingen binnen de NTS die geassocieerd zijn met de EA-behandeling te karakteriseren. Door in vivo elektrofysiologie te integreren met kwantitatieve proteomica, bio-informatica-analyse en moleculaire validatie, poogde deze studie kandidaat-moleculaire targets te identificeren die geassocieerd zijn met EA-gemedieerde centrale neuromodulatie bij CHF.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden met gewervelde dieren zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care and Use Committee van de Anhui University of Chinese Medicine, onder goedkeuringsnummer AHUCM-rats-2024145. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

Voorbereiding en groepering van de dieren

Voor alle experimenten werden schone mannelijke Sprague-Dawley ratten gebruikt, in de leeftijd van 8 weken en met een gewicht van 20 tot 250 g. De dieren werden gehuisvest in een gecontroleerde omgeving bij een temperatuur van 24 ± 2 °C en een relatieve vochtigheid van 50%–60%, onder een standaard licht-donkercyclus van 12 u. Alle ratten hadden ad libitum toegang tot voedsel en water en ondergingen een acclimatisatieperiode van 1 week voorafgaand aan de experimentele procedures.

Voor Experiment I, waarin de functionele en centrale neurale activiteit werd geëvalueerd, werden 24 ratten willekeurig verdeeld over vier groepen van zes dieren per groep: de Sham-, CHF-, EA- en Sham EA-groepen (Figuur 1A). Voor Experiment II, waarin moleculaire targets en high-throughput proteomics werden geëvalueerd, werden 36 ratten willekeurig toegewezen aan drie groepen van 12 dieren elk: Sham, CHF en EA. De steekproefgroottes werden bepaald op basis van de Resource Equation Method om te voldoen aan de ethische richtlijnen voor dierenwelzijn en het reductieprincipe, terwijl de statistische validiteit werd gewaarborgd (E waarde = 20 voor Experiment I; E waarde = 3 voor Experiment II)1. Deze strategie voor de steekproefgrootte was consistent met de protocollen die werden gebruikt in eerdere studies naar EA bij cardiovasculaire aandoeningen8,12. Post hoc power-analyses gaven aan dat een statistische power van meer dan 0,90 de adequaatheid van deze toewijzing ondersteunde. De Sham EA-groep werd uitgesloten van Experiment II omdat voorlopige functionele evaluaties wezen op een gebrek aan therapeutische werkzaamheid.

Vestiging van het model voor chronisch hartfalen

De ratten werden 12 h vóór de operatie gevast en hadden vrije toegang tot water. De anesthesie werd geïnduceerd met 3% isofluraan en gedurende de procedure gehandhaafd op 1,5%–2% isofluraan. Aangezien isofluraan een vluchtig anestheticum is, werd gebruikgemaakt van een geschikt afzuigingssysteem en werd de procedure uitgevoerd in een goed geventileerde ruimte om beroepsmatige blootstelling te voorkomen.

Standaard ledemaat-elektrocardiogrammen (ECG) werden continu geregistreerd. Er werd een linker thoracotomie uitgevoerd om het hart bloot te leggen, waarna de linker anterior descenderende (LAD) kransslagader permanent werd afgebonden 2 tot 3 mm onder de linker aurikel met een 7-0 niet-resorbeerbare hechtdraad13. Succesvolle ischemie werd bevestigd door het identificeren van een ST-segmentelevatie van ten minste 0,2 mV op het ECG (Figuur 1B). Om infecties te voorkomen en pijn te verlichten, werden postoperatief gedurende drie opeenvolgende dagen dagelijks intraperitoneale injecties van penicilline (20.0 U/mL) en subcutane injecties van carprofen (5 mg/kg) toegediend.

Voor de sham-controlegroep werd een identieke thoracotomieprocedure uitgevoerd, gevolgd door oppervlakkige naaldinsertie op de overeenkomstige anatomische locatie zonder ligatie van de LAD-kransslagader. Er werd identieke postoperatieve zorg en monitoring geboden. De echocardiografische beoordeling werd uitgevoerd 4 weken na de operatie. Het model werd als succesvol gevestigd beschouwd wanneer de linkerventrikelejectiefractie (LVEF) ≤45% was8 (Figuur 1C). Dieren die niet aan deze criteria voldeden, preoperatieve baseline-ECG-afwijkingen vertoonden of vroegtijdig stierven, werden systematisch uitgesloten. Aanvullende ratten werden onderworpen aan identieke chirurgische protocollen om uitgesloten dieren onmiddellijk te vervangen en een uniforme steekproefgrootte te handhaven.

Electroacupunctuurinterventie

In overeenstemming met gevestigde vergelijkende anatomische protocollen14 werden de bilaterale HT7-acupunctuurpunten op de Hand-Shaoyin Hartmeridiaan gelokaliseerd aan de palmaire zijde van de transversale polsplooi nabij de ulnaire rand, direct in de radiale depressie van de flexor carpi ulnaris pees. Het lokale gebied werd routinematig gedesinfecteerd. Twee steriele wegwerpacupunctuurnaalden (0.25 x 25 mm) werden loodrecht in elk HT7-acupunctuurpuntgebied ingebracht tot een doeldiepte van 2 tot 3 mm en met een tussenruimte van ongeveer 1 mm geplaatst om strikt binnen hetzelfde acupunctuurpuntgebied te blijven. Voor de videodocumentatie werd de inbrengdiepte visueel geverifieerd door de naaldschacht vóór inbreng op de 3 mm positie te markeren.

Eén naald werd bevestigd aan de kathodische terminal van het EA-apparaat en de aangrenzende naald werd bevestigd aan de anodische terminal om een gelokaliseerd elektrisch circuit te vormen (Figuur 1D). Een continue elektrische golfvorm werd toegediend met een constante frequentie van 2 Hz en een intensiteit van 1 mA, gekalibreerd om waarneembare maar milde spiertrekkingen in de betreffende ledematen op te wekken, gedurende 30 min per dag over zeven opeenvolgende dagen onder isofluraan-anesthesie.

Een minimaal naaldprotocol werd toegepast bij de cohort met de sham-interventie om rekening te houden met aspecifieke somatosensorische reacties15,16. Steriele naalden werden oppervlakkig ingebracht tot een diepte van 0,5–1 mm op identieke HT7-locaties zonder elektrische leidingen aan te sluiten of stroom toe te dienen, overeenkomend met de anesthesieduur van 30 min. De baseline Sham- en CHF-controlegroepen werden blootgesteld aan een identieke dagelijkse isofluraanblootstelling (1,5%–2% isofluraan gedurende 30 min per dag over zeven opeenvolgende dagen) zonder naaldinsertie of elektrische stimulatie. Deze procedure standaardiseerde de anesthesie-baseline over alle experimentele cohorten en controleerde voor potentiële neurosuppressieve of cardioprotectieve artefacten geïnduceerd door repetitieve vluchtige anesthesie.

Echocardiografische beoordeling en euthanasie van dieren

Na de interventie werden de ratten geanestheseerd met 3% isofluraan voor de inductie en 1% voor het onderhoud, waarna ze in rugligging op het dierenplatform werden gefixeerd. De borstharen werden zorgvuldig verwijderd met een depilatoir middel, en een akoppelingsmiddel werd gelijkmatig aangebracht op de blootgestelde huid. De hartfunctie werd geëvalueerd met een digitaal echographiesysteem uitgerust met een 18 MHz echo-transducer. M-mode echocardiografie werd geregistreerd om de LVEF en de fractionele verkorting van de linker ventrikel (LVFS) te meten, waarbij de gemiddelde waarde van 3 technische replica's werd berekend voor de uiteindelijke analyse.

Bloed werd afgenomen uit de abdominale aorta terwijl de dieren onder anesthesie bleven om subsequent bloedverlies en coagulatie te voorkomen en om de monsterkwaliteit voor de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) te waarborgen. De ratten werden onmiddellijk geëuthanaseerd door continue inductie met 5% isofluraan tot aan het stoppen van de hartslag en ademhaling.

Weefselmonsters werden vervolgens toegewezen volgens het experimentele ontwerp. Voor Experiment I werden 3 ratten per groep gebruikt om het hart te oogsten voor hematoxyline en eosine (HE)/Masson-kleuring en de hersenen voor c-Fos-immunofluorescentie. De overige drie ratten werden toegewezen voor in vivo elektrofysiologie. Voor Experiment II werden bilaterale NTS-weefsels geëxtraheerd van zes ratten per groep voor proteomics. Weefsels van de resterende zes ratten werden geoogst voor moleculaire verificatie: drie werden gebruikt voor Western blotting en qPCR, en drie werden uitsluitend gebruikt voor qPCR.

Enzyme-linked immunosorbent assay

De verzamelde bloedmonsters kregen de tijd om natuurlijk te stollen bij 4 °C gedurende 10–20 min. De monsters werden gecentrifugeerd bij 1.0 x g gedurende 15 min bij 4 °C om het serum te scheiden, waarna de supernatanten werden verzameld. Wanneer de analyse niet onmiddellijk werd uitgevoerd, werden de serummonsters bewaard bij −80 °C tot gebruik. Serumconcentraties van N-terminaal pro-brain natriuretisch peptide (NT-proBNP) en cardiaal troponine T (cTnT) werden gekwantificeerd met specifieke ELISA-kits volgens de standaardinstructies. De absorbentiewaarden werden gemeten en de biomarkerniveaus werden berekend op basis van standaardcurves.

Histologische en immunofluorescentiekleuring

Oogsthartweefsels werden gespoeld in een vooraf gekoelde 0,9% natriumchlorideoplossing, gesneden op 5 mm boven de apex en ingebed in paraffine. De weefselcoupes werden gedeparaffineerd en gehydrateerd. HE-kleuring werd uitgevoerd door hematoxyline gedurende 10 min aan te brengen, gevolgd door tegenkleuring met eosine gedurende 2,5 min. Masson-kleuring werd uitgevoerd door hematoxyline gedurende 60 s en Masson's trichroom gedurende 30–60 s aan te brengen. De coupes werden gedifferentieerd in 6%–8% fosforzuur en tegengekleurd met lichtgroen gedurende 5 min. De collageenvolumefractie (CVF) werd gekwantificeerd om myocardiale fibrose te evalueren.

De geoogste hersenweefsels werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd in oplossingen met een toenemende sucroseconcentratie en gesneden met een dikte van 30 µm. Omdat paraformaldehyde toxisch is en wordt beschouwd als een vermoedelijk carcinogeen, werd hiermee gewerkt in een chemische zuurkast onder gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen. De coupes werden geblokkeerd met een buffer die 0,5% Triton X-10 en 3% runderseerumeiwit (BSA) bevatte, en vervolgens gedurende de nacht bij 4 °C geïncubeerd met een primair antilichaam tegen c-Fos. De coupes werden daarna gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gedurende 2 u bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd met de overeenkomstige secundaire antilichamen. De coupes werden gemonteerd met een fluorescentie-quenching-oplossing die 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bevat, waarna de c-Fos-positieve neuronen werden afgebeeld.

In vivo elektrofysiologie

Ratten werden geanestheseerd met isofluraan bij 3% voor inductie en 1% voor instandhouding en gefixeerd in een stereotaxisch hersenapparaat. De hoofdhuid werd geschoren en gedesinfecteerd. Er werd een midline-incisie gemaakt om het bregma bloot te leggen, waarna de dura mater werd verwijderd. Er werd nauwkeurig een schedelgat geboord boven de NTS-regio op basis van de volgende stereotaxische coördinaten ten opzichte van Bregma: anteroposterieur (AP) ±12,6 mm, mediolateraal (ML) ±0,9–2,1 mm en dorsoventraal (DV) ±7,6–8,1 mm.

Na voltooiing van de elektrofysiologische registraties werd de exacte stereotaxische lokalisatie van de elektrodepunt geverifieerd. Een gelijkstroom van 1 mA werd gedurende 10 s kortstondig aangelegd op de registratie-elektrode om een kleine electrolytische laesie te creëren. Na het experiment werd de hersenstam in coupes gesneden en werd histologisch bevestigd dat het laesietraject anatomisch gelokaliseerd was binnen de NTS.

Een microelektrodenmatrix met acht kanalen (2 x 4) werd geïmplanteerd en met een gemotoriseerde micromanipulator langzaam naar de doelregio in de hersenen bewogen met een snelheid van 5 µm/s. Zodra er een stabiele neurale activiteit was vastgesteld, werden er gedurende 40 s continu opnames gemaakt. Een multichannel acquisitiesysteem werd gebruikt om neuronale spike-ontladingen (gefilterd op 150–8.0 Hz, bemonsteringssnelheid 40 kHz) en lokale veldpotentialen (LFP; gefilterd op 0,7–400 Hz, bemonsteringssnelheid 1 kHz) vast te leggen.

Spike-sorting software werd gebruikt om typische interferentiesignalen met een hoge amplitude en artefacten te elimineren via waveform-kruiscorrelatie. De daaropvolgende analyse van neurale signalen werd uitgevoerd met neural-analysis software. Neuronen werden alleen als actief geclassificeerd wanneer ze een spontane gemiddelde vuursnelheid >2 Hz vertoonden en een stabiele signaal-ruisverhouding >3:1 behielden. De drempelwaarde van 2 Hz werd gekozen op basis van de vastgestelde fysiologische kenmerken van autonome NTS-neuronen; hiermee werden voornamelijk stille cellen en laagfrequente respiratoir-ritmische bursts effectief uitgesloten, waardoor werd gewaarborgd dat de analyse zich richtte op tonisch actieve neuronen die de basale cardiovasculaire regulatie mediëren17,18,19,20. Op basis van deze criteria werden de gemiddelde neurale vuurfrequentie en spike-discharge raster plots gegenereerd. Energiespectrogrammen van de 2D LFP en 3D power spectral density (PSD) topografieën werden opgesteld om de kenmerken van de neurale oscillerende energie te beoordelen.

Na de opname werd de incisie gehecht en werden de ratten gemonitord totdat ze volledig waren hersteld van de anesthesie. Penicilline werd toegediend via een intraperitoneale injectie, en carprofen (5 mg/kg, s.c.) werd gedurende drie opeenvolgende dagen dagelijks toegediend.

Kwantitatieve proteomics-analyse via data-onafhankelijke acquisitie

Totaal eiwit werd geëxtraheerd met een lysisbuffer en gekwantificeerd via de bicinchoninezuurmethode. De eiwitten werden gedenatureerd, onderworpen aan reductieve alkylering en gedigesteerd met trypsine bij 37 °C gedurende 2 h. De resulterende peptiden werden ontzout met behulp van een C18-kolom, geconcentreerd bij 45 °C en改めて opgelost voor daaropvolgende massaspectrometrie-analyse.

Peptiden werden geladen op een trapkolom (5 µm C18, 30 µm x 5 mm) die geëquilibreerd was met 96% buffer A (0,1% mierenzuur in water). De peptiden werden gescheiden over een high-throughput ultra-high-performance vloeistofchromatografie-analytische kolom met behulp van een strikt geoptimaliseerde gradiënt van buffer A en buffer B (0,1% mierenzuur in 80% acetonitril).

Massaspectrometrie werd uitgevoerd in de positieve ionen data-independent acquisition (DIA) modus met een electrospray-spanning van 1,9 kV. Volledige massaspectrometer-scans werden verkregen over een massa-bereik van 380 tot 980 m/z met een resolutie van 240.00, een automatic gain control (AGC) target van 500% en een maximale injectietijd van 3 ms. MS/MS-spectra werden verkregen met een resolutie van 80.0 (AGC target: 50%; maximale injectietijd: 3 ms; RF-lensamplitude: 40%). Precursor-ionen werden gefragmenteerd middels higher-energy collisional dissociation met een isolatievenster van 2 Th en een genormaliseerde botsingsenergie van 25% bij een gedefinieerde cyclustijd van 0,6 s.

Ruwe massaspectrometriegegevens werden verwerkt met DIA-NN-software. Er werd een spectrale bibliotheek gegenereerd met behulp van het interne deep learning-algoritme, en de match-between-runs-functie werd toegepast voor kwantificering tegen de referentieproteoomdatabase van Rattus norvegicus, met trypsinevertering en maximaal 2 gemiste klievingen. De uiteindelijke kwantitatieve proteïnematrix werd gefilterd met een strikte drempelwaarde voor de false discovery rate van 1% op zowel precursor-ion- als proteïneniveau.

Bioinformatische analyse en hub-gen mining

Bio-informatica-analyses en datavisualisaties werden hoofdzakelijk uitgevoerd met de R-programmeeromgeving in combinatie met gespecialiseerde software voor netwerkvisualisatie. Om methodologische transparantie en reproduceerbaarheid te waarborgen, zijn alle aangepaste R-scripts die tijdens deze analyseprocessen zijn gebruikt, opgenomen in Aanvullend Bestand 1. De initiële kwaliteitscontrole van de gegevens en beoordelingen van de algemene distributie werden uitgevoerd met het ropls-pakket. Er werden overzichtsstatistieken voor proteïne-identificatie/kwantificatie samengesteld; er werd een partial least squares discriminant analyse (PLS-DA) uitgevoerd over de drie groepen; er werd een orthogonal partial least squares discriminant analyse (OPLS-DA) uitgevoerd voor paarsgewijze vergelijkingen; en er werden correlatie-heatmaps van monsters gegenereerd met het pheatmap-pakket.

Centrale differentieel tot expressie gebrachte eiwitten werden gescreend met drempelwaarden bestaande uit een p-waarde <0,05, een fold change >1,2 en een variable importance in projection-score >1,0. Dubbele volcano-plots werden gegenereerd met het ggplot2-pakket, intersecties werden geïdentificeerd met het ggVennDiagram-pakket en hiërarchische clustering-heatmaps werden uitgezet met het pheatmap-pakket om de overlappende eiwitten te visualiseren. Gene Ontology (GO)- en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-verrijkingsanalyses werden afzonderlijk uitgevoerd voor de opgereguleerde en neergereguleerde eiwitten met het enrichR-pakket op basis van de Enrichr-database.

Alle differentieel tot expressie gebrachte eiwitten werden in kaart gebracht in de STRING-database met een betrouwheidsdrempel van 0,4 om het eiwit-eiwitinteractienetwerk te construeren. De interactiegegevens werden geïmporteerd in software voor netwerkvisualisatie. De cytoHubba-plugin werd toegepast om topologische scores te berekenen, en de top 18 genen met de hoogste score werden geëxtraheerd op basis van de kleurdiepte van de knooppunten. De 18 hub-kandidaten ondergingen een pathway-enrichmentanalyse, en de 10 meest prominente eiwitten werden geselecteerd om hun expressieniveaus in menselijke weefsels te beoordelen met behulp van de Genotype-Tissue Expression (GTEx)-database. Het meest kritische hub-gen werd geïdentificeerd op basis van expressieniveaus in de menselijke hersenen en netwerktopologische scores. De Cistrome Data Browser werd gebruikt om downstream transcriptiefactoren en histonmodificaties te voorspellen die geassocieerd zijn met het specifieke hub-gen.

Western blot en kwantitatieve polymeraseketenreactie

Totaaleiwitten werden geëxtraheerd uit NTS-weefsels met behulp van een lysaatmengsel bestaande uit phenylmethanesulfonylfluoride lysisbuffer, PMSF en fosfataseremmers. De monsters werden gehomogeniseerd met een ultrasone celdisruptor en gecentrifugeerd bij 13.80 x g gedurende 20 min bij 4 °C om de supernatanten te verzamelen. Eiwitconcentraties werden bepaald met een bicinchoninezuur-eiwitassaykit. In totaal werd 20 µg eiwit van elk monster gescheiden via 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en vervolgens overgebracht op polyvinylideenfluoride-membranen.

De membranen werden geblokkeerd met 5% vetarme melk in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween (TBST) gedurende 1 u bij kamertemperatuur en overnight geïncubeerd bij 4 °C met specifieke primaire antilichamen gericht tegen Yin Yang 1 (YY1) en β-actin als housekeeping-eiwit. De membranen werden drie keer gedurende 5 min gewassen met TBST en 1,5 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met een secundair antilichaam geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase. De doelbanden werden gevisualiseerd met behulp van een enhanced chemiluminescence-kit, vastgelegd met een imaging-systeem en gekwantificeerd ten opzichte van β-actin.

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit NTS-weefsels met behulp van een RNA-extractiereagens. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden gemeten met een spectrofotometer, en cDNA van de eerste streng werd gesynthetiseerd met een reverse transcriptiekit. Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (PCR) werd uitgevoerd met een SYBR Green PCR-kit op een real-time PCR-systeem. De specifieke primersequenties die voor amplificatie werden gebruikt, samen met hun respectievelijke NCBI Reference Sequence-toegangsnummers, waren als volgt: YY1 (NM_0010271.1), forward 5'-AGCGTTCGTTGAGAGCTCAA-3' en reverse 5'-AGCCTTCGAATGTGCACTGA-3'; DPF2 (NM_001014264.1), forward 5'-TGTGATGACTGTGACCGTGG-3' en reverse 5'-TCCAAACAGGTGGCAACT-3'; DMAP1 (NM_0100705.1), forward 5'-GGTGTGACATTACGGAGCCA-3' en reverse 5'-TCCAGCAGCATCTGTTCCAG-3'; en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) (NM_01708.4), forward 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3' en reverse 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'. Relatieve mRNA-expressieniveaus werden berekend met de 2-ΔΔCt methode en genormaliseerd ten opzichte van het interne referentiegen GAPDH.

Statistische analyse

Alle experimentele gegevens werden geanalyseerd met behulp van statistische software en gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De normaliteit werd beoordeeld met de Shapiro-Wilk-test en de homogeniteit van de variantie werd geëvalueerd met de Brown-Forsythe-test.

Voor vergelijkingen tussen twee onafhankelijke groepen werd de Student's t-test of de gepaarde t-test gebruikt voor gegevens die voldeden aan de normaliteitscriteria. Gegevens die niet voldeden aan de normaliteitsaannames werden geanalyseerd met behulp van de Mann-Whitney U-test of de Wilcoxon signed-rank test. Voor vergelijkingen tussen meerdere groepen werd een éénweg variantieanalyse, gevolgd door de Holm-Sidak post hoc-test, gebruikt wanneer aan de aannames van normaliteit en homogeniteit werd voldaan. De Kruskal-Wallis H-test, gevolgd door de Dunn post hoc-test, werd gebruikt wanneer aan deze aannames niet werd voldaan.

Correlaties werden beoordeeld met behulp van de Pearson-correlatiecoëfficiënt, berekend met het Hmisc-pakket in R. De bijbehorende p-waarden werden aangepast met de Benjamini-Hochberg-methode voor de false discovery rate via het stats-pakket om de verhoogde type I-foutmarge als gevolg van meervoudig testen te beheersen. De algemene statistische significantie werd vastgesteld op p <0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Electroacupunctuur verbetert de hartfunctie en vermindert myocardiale beschadiging bij ratten met chronisch hartfalen

Om de effecten van EA op CHF te beoordelen, werd het ratmodel tot stand gebracht via ligatie van de LAD-kransslagader, gevolgd door specifieke EA- of Sham EA-interventies. Er werden systematische evaluaties uitgevoerd, waaronder echocardiografie, biochemische analyses en histologische kleuringen (Figuur 2A). Functioneel vertoonde d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De huidige studie onderzocht de centrale mechanismen van EA op het HT7-acupunt in het ratmodel van CHF. Fysiologische en histologische gegevens gaven aan dat EA de LVEF verbeterde en myocardiale fibrose verminderde. Parallel aan deze perifere veranderingen ondersteunden in vivo elektrofysiologische registraties en neurale mapping dat EA de neurale vuursnelheden binnen de NTS herstelde. Via proteomics op basis van massaspectrometrie werd het moleculaire landschap van de NTS in kaart gebracht, waarbij 85 differentieel tot ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben. De auteurs verklaren daarnaast dat er geen kunstmatige intelligentietools zijn gebruikt bij enig onderdeel van het proces van manuscriptvoorbereiding.

Dankbetuigingen

Wij willen onze oprechte dank uitspreken aan alle onderzoekers die hebben bijgedragen aan deze studie en erkennen met respect het offer van de proefdieren. Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (beurzen nr. 202YFC350500 en 202YFC350502) en het Xu Nenggui University-Level Talent Support Program (beurs nr. DT24002). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of het opstellen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Volwassen mannelijke Sprague-Dawley rattenLiaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.Nr. SCXK (LIAO) 2025-001RGD_70508
AcupunctuurnaaldenSuzhou Tianxie Acupuncture Instrument Co., Ltd.——
Antifade monteermedium met DAPIAibixin Biotechnology Co., Ltd.abs9235-25ml—
Anti-YY1 primair antilichaamProteintech Group, Inc6281-1-IgAB_288164
Anti-beta-actine primair antilichaam609-1-IgAB_2687938
Runder serumalbumine (BSA)Sigma Odellie Trading Co., Ltd.V9093—
BCA-eiwitassaykitShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.P012S—
c-Fos (9F6) konijn mAbSai Xin Tong Biological Reagents Co., Ltd.250SAB_24721
CytoscapeHet Cytoscape Consortiumversie 3.2.1SCR_03032
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazyme Biotech Co., Ltd.Q71-02—
ElectroacupunctuurapparaatNanjing Jisheng Medical Technology Co., Ltd.HANS-20A—
Achtkanaals (2 × 4) micro-elektrodenarrayKewa Suzhou Medical Technology Co., Ltd.-—
ELISA-kit (NT-proBNP)Wuhan Enzyme Immuno-Biotechnology Co., Ltd.MM-0329R1—
ELISA-kit (cTnT)MM-0795R2—
Kit voor verbeterde chemiluminescentieProteintech Group, IncPK1001—
Geit anti-konijn IgGAimee Technology Co., Ltd.111-545-003AB_238046
HRP-geconjugeerd geit anti-muis IgG secundair antilichaamBeiJing Cowin Biotech Co.,Ltd.CW0102Het is niet mogelijk om een vertaling te genereren omdat er geen brontekst is verstrekt. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben.
HiScript III RT SuperMixVazyme Biotech Co., Ltd.R323-01—
ImageJ-softwareNational Institutes of Healthversie 4.0SCR_03070
BeeldvormingssysteemBio-Rad Laboratories, IncChemiDoc MP
Multi-kanaals anesthesieapparaat voor kleine dierenRWD Life Science Co., LtdR510-2-10—
MicroscoopOlympus Optical Co., Ltd.DP72—
NeuroExplorer-softwareBeijing Plexon Technology Co., Ltd.versie 5.0SCR_01818
Offline Sorter-softwareBeijing Plexon Technology Co., Ltd.versie 4.7.2SCR_0012
Orbitrap AstralThermo Fisher Scientific——
PowerLab standaard leding voor ledematen II
systeem		AD Instruments International Trading Co., Ltd.ML18—
PepMap Neo Trap-kolomThermo Fisher Scientific——
FosfataseremmersShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.P1081—
R-software—versie 4.5.2SCR_01905
RIPA-lysisbufferYeasen Biotechnology Co., Ltd.2015ES60—
RNAiso PlusTaKaRa Biotechnology Co., Ltd.9108—
Digitaal echographiesysteem voor kleine dierenFeiyino Technology Co., Ltd.VINNO6 Lab—
Statistische softwareGraphPad-software Versie 8.0SCR_02798
De multichannel-acquisitie van OmniPlex
systeem		Beijing Plexon Technology Co., Ltd.versie 1.20.0—
Triton X-10Beijing Solab Technology Co., Ltd.22298142—
Vanquish Neo UHPLC-systeemThermo Fisher Scientific——
µPAC Neo High Throughput-kolomThermo Fisher Scientific——

Referenties

  1. Valente V, et al. The global epidemiology of heart failure: a comprehensive and contemporary review. Eur J Heart Fail. 2026.
  2. Triposkiadis F, et al. The sympathetic nervous system in heart failure physiology, pathophysiology, and clinical implications. J Am Coll Cardiol. 2009;54(19):1747-62.
  3. Arshad MS, et al. Sympathetic nervous system in heart failure: targets for treatments. Curr Hypertens Rep. 2025;27(1):20.
  4. Fan H, et al. The hypotensive role of acupuncture in hypertension: clinical study and mechanistic study. Front Aging Neurosci. 2020;12:138.
  5. Zuo H, et al. Electroacupuncture alleviates acute myocardial ischemic injury in mice by regulating the β1 adrenergic receptor and post-receptor protein kinase A signaling pathway. Acupunct Med. 2024;42(6):342-55.
  6. Wu HS, et al. Neural mechanism of HT7 electroacupuncture in myocardial ischemia: critical role of the paraventricular nucleus oxytocin system. Front Neurosci. 2025;19:1678938.
  7. Kun W, et al. Electroacupuncture ameliorates cardiac dysfunction in myocardial ischemia model rats: a potential role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. J Tradit Chin Med. 2023;43(5):944-54.
  8. Xu W, et al. Electroacupuncture ameliorates chronic heart failure: the role of CRH neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Front Neurosci. 2026;20:1741523.
  9. Andresen MC, Kunze DL. Nucleus tractus solitarius--gateway to neural circulatory control. Annu Rev Physiol. 1994;56:93-116.
  10. Craft GE, et al. Recent advances in quantitative neuroproteomics. Methods. 2013;61(3):186-218.
  11. Charan J, Kantharia ND. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 2013;4(4):303-6.
  12. Zhou J, et al. Electroacupuncture pretreatment mediates sympathetic nerves to alleviate myocardial ischemia-reperfusion injury via CRH neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Chin Med. 2024;19(1):43.
  13. Litwin SE, et al. Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat. Circulation. 1994;89(1):345-54.
  14. Shu Q, et al. Electroacupuncture alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting hypothalamic paraventricular nucleus neurons projecting to the rostral ventrolateral medulla. Eur J Neurosci. 2024;60(5):4861-76.
  15. Wan F, et al. Electroacupuncture improves cerebral blood flow in vascular cognitive impairment mice by activating the locus coeruleus-prefrontal cortex circuit. Neuroscience. 2025;583:33-42.
  16. Xu R, et al. Electroacupuncture ameliorates incisional pain via suppressing IL-33 signaling-related macrophage infiltration and ROS overproduction in incised skin. Chin Med. 2026;21(1):26.
  17. Quiroga RQ, et al. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Comput. 2004;16(8):1661-87.
  18. Goldwyn JH, et al. Gain control with A-type potassium current: IA as a switch between divisive and subtractive inhibition. PLoS Comput Biol. 2018;14(7):e1006292.
  19. Buzsáki G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 2004;7(5):446-51.
  20. Zhang J, Mifflin SW. Responses of aortic depressor nerve-evoked neurones in rat nucleus of the solitary tract to changes in blood pressure. J Physiol. 2000;529(Pt 2):431-43.
  21. Benarroch EE. The central autonomic network: functional organization, dysfunction, and perspective. Mayo Clin Proc. 1993;68(10):988-1001.
  22. Scheitz JF, et al. Bidirectional brain-heart interactions in health and disease. Nat Rev Neurol. 2026;22(4):209-25.
  23. Floras JS. Sympathetic nervous system activation in human heart failure: clinical implications of an updated model. J Am Coll Cardiol. 2009;54(5):375-85.
  24. Iannetta D, et al. Dissecting the exercise pressor reflex in heart failure: a multi-step failure. Auton Neurosci. 2025;259:103269.
  25. Sved AF, et al. Baroreflex dependent and independent roles of the caudal ventrolateral medulla in cardiovascular regulation. Brain Res Bull. 2000;51(2):129-33.
  26. Liu Y, et al. Neurophysiological basis of electroacupuncture stimulation in the treatment of cardiovascular-related diseases: vagal interoceptive loops. Brain Behav. 2024;14(10):e70076.
  27. Zhou W, Benharash P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. J Acupunct Meridian Stud. 2014;7(4):190-3.
  28. Fawcett JW, et al. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nat Rev Neurosci. 2019;20(8):451-65.
  29. Moon S, Ito Y. Vasculature cells control neuroglial co-localization and synaptic connection in a central nervous system tissue mimic system. Hum Cell. 2023;36(6):1938-47.
  30. Ferrer-Ferrer M, Dityatev A. Shaping synapses by the neural extracellular matrix. Front Neuroanat. 2018;12:40.
  31. Rabinowitch I, et al. Understanding neural circuit function through synaptic engineering. Nat Rev Neurosci. 2024;25(2):131-9.
  32. McGeachie AB, et al. Stabilising influence: integrins in regulation of synaptic plasticity. Neurosci Res. 2011;70(1):24-9.
  33. Qiu L, et al. RNA modification: mechanisms and therapeutic targets. Mol Biomed. 2023;4(1):25.
  34. Clapier CR, et al. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(7):407-22.
  35. Du W, et al. Mechanisms of chromatin-based epigenetic inheritance. Sci China Life Sci. 2022;65(11):2162-90.
  36. Rashid F, et al. Mechanomemory of nucleoplasm and RNA polymerase II after chromatin stretching by a microinjected magnetic nanoparticle force. Cell Rep. 2024;43(7):114462.
  37. Weintraub AS, et al. YY1 is a structural regulator of enhancer-promoter loops. Cell. 2017;171(7):1573-88.e28.
  38. Zurkirchen L, et al. Yin Yang 1 sustains biosynthetic demands during brain development in a stage-specific manner. Nat Commun. 2019;10(1):2192.
  39. Cunningham JT, et al. mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1-PGC-1alpha transcriptional complex. Nature. 2007;450(7170):736-40.
  40. van Weperen VYH, Vaseghi M. The brain-heart axis: effects of cardiovascular disease on the CNS and opportunities for central neuromodulation. Nat Rev Neurosci. 2026;27(3):159-77.
  41. Lam JC, et al. YY1-controlled regulatory connectivity and transcription are influenced by the cell cycle. Nat Genet. 2024;56(9):1938-52.
  42. Montuoro S, et al. Neuroimmune cross-talk in heart failure. Cardiovasc Res. 2025;121(4):550-67.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Mechanismen van elektroacupunctuurcardiale remodelleringsympathische overactivatieechocardiografische beoordelingc-Fos-immunofluorescentieWestern blottingYY1-transcriptiefactor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.