De MODS methode voor de diagnose van tuberculose en multidrug-resistente tuberculose

Samenvatting

De microscopische observatie-drug-gevoeligheid (MODS) test is een low-cost, low-tech tool voor high-performance detectie van tuberculose (TB) en multiresistente tuberculose (MDRTB). Deze video beschrijft de MODS vloeistof mediacultuur methode.

Samenvatting

Patiënten met actieve longtuberculose (tbc) te infecteren 10-15 andere personen per jaar, waardoor de diagnose van actieve tuberculose essentieel voor zowel het genezen van de patiënt en het voorkomen van nieuwe infecties. Bovendien is de opkomst van multidrug-resistente tuberculose (MDRTB) betekent dat de detectie van resistentie tegen geneesmiddelen noodzakelijk is voor het stoppen van de verspreiding van resistente stammen. De microscopische observatie-drug-gevoeligheid (MODS) test is een low-cost, low-tech tool voor high-performance detectie van TB en MDRTB. De MODS test is gebaseerd op drie principes: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) groeit sneller in vloeibare media dan op vaste media 2) microscopische MTB groei kan eerder in vloeibare media worden gedetecteerd dan te wachten tot de macroscopische verschijnen van kolonies op vaste media, en dat de groei is kenmerkend voor MTB, waardoor het kan worden onderscheiden van atypische mycobacteriën of schimmel of bacteriële besmetting 3) de drugs isoniazide en rifampicine kunnen worden opgenomen in de MODS test te laten voor gelijktijdige directe detectie van MDRTB, het wegnemen van de noodzaak voor subcultuur uit te voeren een indirecte drug gevoeligheid te testen. Concurrerende huidige diagnostiek wordt gehinderd door een lage gevoeligheid met sputum uitstrijkje, lange vertragingen tot diagnose met stevige mediacultuur, onbetaalbaar hoge kosten met bestaande vloeibare media cultuur methoden, en de noodzaak om subcultuur doen voor indirecte drug gevoeligheid testen om MDRTB op te sporen. In tegenstelling tot de niet-merkgebonden MODS methode heeft een hoge gevoeligheid voor TBC en MDRTB, is een relatief snelle cultuur-methode, biedt gelijktijdige medicijn testen van de gevoeligheid voor MDRTB, en is toegankelijk voor gebieden met beperkte middelen op slechts minder dan $ 3 voor het testen op TBC en MDRTB.

Protocol

1. Bereid voorraadoplossingen
   1. Fosfaatbuffer voorraad
      1. Mix capaciteit van 950 van natrium dibasisch oplossing (9.47g van dibasisch opgelost in gedestilleerd water 1000ml) met een capaciteit van 950 kalium monobase oplossing (9.07g van kalium monobase opgelost in gedestilleerd water 1000ml) en roer; houden achterkant 50 ml van elke oplossing aan te passen pH, indien nodig
      2. Pas de pH op 6,8 ± 0,2: voeg dibasisch oplossing om de pH te verhogen; toe te voegen kalium monobasisch oplossing voor een lagere pH
      3. Autoclaaf bij 121-124 ° C gedurende 15 minuten om te steriliseren
      4. Plaat een 100μl hoeveelheid van de fosfaatbuffer op voedingsagar medium in een petrischaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur tot steriliteit te bevestigen
      5. Bewaren in de koelkast bij 2-8 ° C gedurende een maand
         
         Opmerking: Elke sputummonster vraagt ​​10 ml van de fosfaatbufferoplossing
         
   2. Decontaminatie voorraad
      1. Combineer gelijke volumes van natriumhydroxide-oplossing (8.0g van natriumhydroxide opgelost in 200 ml steriel gedistilleerd water) en natriumcitraat oplossing (5,8 g natrium citraat gedistilleerd in 200 ml steriel gedistilleerd water)
      2. Mix en autoclaaf bij 121-124 ° C gedurende 15 minuten
      3. Bewaren in de koelkast bij 2-8 ° C gedurende een maand
         
         Opmerking: Elke sputummonster vereist 2 ml van decontaminatie voorraad
         
   3. Cultuurmedia voorraad
      1. In 900 ml van steriel gedestilleerd water toe te voegen 3.1ml van glycerol en 1.25g van casitone en 5.9g van 7H9 medium poeder, meng met een constante agitatie tot het volledig is opgelost
      2. Autoclaaf bij 121-124 ° C gedurende 15 minuten
      3. Koel en verdeel de steriele medium in 4.5ml porties in een steriele 16x 100 mm glazen buizen voor monstervoorbereiding, en 10.8ml porties voor de voorbereiding van antibiotica en de interne controles
      4. Incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur om de steriliteit (gebrek aan troebelheid) te controleren
      5. Bewaren bij 2-8 ° C met dop goed afgesloten, voor maximaal een maand
         
         Opmerking: Elke sputummonster vereist een buisje met 4.5ml van 7H9 medium
         
   4. Antibiotica stockoplossingen
      1. A. Isoniazide voorraad (8 mg / ml)
         1. Los 20 mg isoniazide volledig in 2,5 ml steriel gedistilleerd water
         2. Filter met 0.2μm spuitfilter voor waterige oplosmiddel
         3. Bewaren in 20μl aliquots in steriele micro centrifugeren buisjes bij -20 ° C tot 6 maanden
            
            Opmerking: Elke opgeslagen 20μl hoeveelheid is voldoende voor maximaal 100 monsters (met inbegrip afval)
            
      2. B. Rifampicine voorraad (8 mg / ml)
      1. Volledig oplossen 20 mg rifampicine in 1,25 ml DMSO
      2. Voeg 1,25 ml steriel gedestilleerd water toe en meng
      3. Filter met 0.2μm spuit filter voor organische oplosmiddelen
      4. Bewaren in 20μl aliquots in steriele microcentrifugebuizen bij -20 ° C tot 6 maanden
         
         Opmerking: Elke opgeslagen 20μl hoeveelheid is voldoende voor maximaal 100 monsters (met inbegrip afval)
         
2. Bereid te werken oplossingen
   1. Decontaminatie werkende oplossing
      1. Los van 0.1g NALC kristallen in elk 20 ml van de benodigde decontaminatie-oplossing
         
         Let op: Elk monster heeft 2 ml van de decontaminatie-oplossing
         
         Opmerking: Gooi NaOH-NALC decontaminatie-oplossing die ongebruikt blijft na 24 uur als NALC verliest zijn mucolytische activiteit loop van de tijd
         
   2. Cultuur media werkende oplossing
      1. Uiteengezet:
         1. 1 tube met 7H9 medium voor elke sputum monster worden verwerkt, plus een extra buis voor elke plaat (voor de negatieve controle kolom)
         2. 2 buizen van 7H9 medium voor de positieve controles (3 indien monoresistant stammen worden gebruikt)
         3. 1-2 buizen met 10.8ml 7H9 voor antibiotica oplossing voorbereiding
      2. Voeg 0,5 ml OADC aan de 4.5ml van 7H9 in elk monster buis
      3. Voeg 1,2 ml OADC aan buizen met 10.8ml 7H9
      4. Zet opzij twee buizen met 5ml 7H9-OADC voor positieve controles, en buis (s) met 12ml 7H9-OADC te worden gebruikt voor antibiotica-oplossing voorbereiding (deze hoeven niet PANTA)
      5. Reconstrueren PANTA en voeg 0,1 ml aan elk monster buis en met de negatieve controle buizen (7H9-OADC-PANTA: totaal volume = 5.1ml)
         
         Let op: Compleet medium met PANTA (7H9-OADC-PANTA) wordt gebruikt voor sputum monsters en negatieve controles, gebruik 7H9-OADC zonder PANTA voor positieve controles en voor antibiotica oplossing voorbereiding
         
   3. Antibiotica werken oplossingen
      1. 1. Zie figuur 1 voor stappen om het maken van het antibioticum werkende oplossing in een ongebruikte 24-well plaat
         
         Opmerking: Voor een nauwkeurige gevoeligheid resultaten, de laatste antibiotica concentraties zijn van cruciaal belang. De volgende procedure is geschikt voor laboratories uitgerust met micropipetten. Als micropipetten niet beschikbaar zijn, kunnen tuberculine injectiespuiten worden gebruikt met een andere reeks van verdunningen wordt beschreven in de Gebruikershandleiding Bijlage 3 bij modsperu.org
         
         Let op: niet opnieuw invriezen of hergebruik antibiotica werken of stock-oplossingen als drug activiteit kan worden verloren Gooi alle ongebruikte antibiotica aan het einde van de verwerking dag Figuur 1.. Het maken van de antibiotische werking oplossingen (van User Guide op modsperu.org)
         
3. Sputummonster en plaat voorbereiding
   1. Decontaminatie
      1. Plaats 2 ml sputum monster in een 15ml centrifugebuis (indien minder, vul aan tot 2 ml met fosfaat buffer, als er meer, gebruik 2 ml)
      2. Voeg 2 ml NaOH-oplossing NALC
      3. Cap buis strak en vortex gedurende 20 seconden; omkeren buis om ervoor te zorgen NaOH-oplossing in contact NALC de gehele binnenkant van de buis en deksel
      4. Laat staan ​​voor een minimum van 15 minuten - kan verlengen door een paar minuten als het monster is bijzonder viskeus. Om te voorkomen dat over de behandeling, mag niet meer dan 20 minuten
      5. De buis wordt tot 14ml met fosfaatbuffer (pH 6,8) te neutraliseren alkali en beëindiging van de decontaminatie-proces, en goed door het buisje mix 4 keer
      6. Centrifugeer bij 3000 g gedurende 15 minuten (zie bijlage 2 in de User Guide op modsperu.org voor de vergelijking van rotaties per minuut nodig is om 3000 g te bereiken)
      7. Giet af bovendrijvende in een vloeibare afvalstoffen container met 10% natriumhypochloriet of een ander geschikt ontsmettingsmiddel en behouden van de pellet
   2. De voorbereiding van de uiteindelijke monster schorsing en back-up
      1. Met behulp van 7H9-OADC-PANTA (van de buis met 5.1ml), resuspendeer de sample pellet in een totaal volume van 2 ml in de centrifugebuis met een Pasteur pipet; meng goed
      2. Verwijder 1 ml van het monster schorsing en op te slaan in een microcentrifugebuis bij 2-8 ° C als een back-up
      3. Voeg de seconde 1 ml van het monster schorsing op de buis met de rest van 7H9-OADC-PANTA, meng goed. Dit is de uiteindelijke steekproef oplossing klaar voor plating
   3. Het plaatsen van monster suspensies in 24-well plaat
      1. Plaats 900μl van het eindmonster schorsing in elk van de vier putten van een kolom in de 24-well plaat
      2. Herhaal dit met extra monsters totdat alle kolommen van de plaat, met uitzondering van kolom 3, worden gevuld (of totdat alle monsters zijn verguld)
      3. Plaats 900μl van 7H9-OADC medium zonder monster in de vier putten van Kolom 3 van elk monster plaat (negatieve interne controles)
   4. Het toevoegen van antibiotica om monsters te
      1. Met behulp van een multi-channel pipet voorzichtig vullen 4 tips met 100μl uit de putten met 7H9-OADC en antibiotica werken oplossingen (kolom 2 in antibiotica verdunning plaat-zie figuur 1)
      2. Voeg de 100μl monsters om de kolom te putten met een 900μl sample oplossingen zonder te raken plaat of monster
      3. Herhaal dit totdat alle kolommen hebben ontvangen van de extra 100μl van medium (drugsvrije putten) of antibiotica oplossingen (inclusief negatieve controle kolom 3)
      4. Sluit de plaat met het deksel en plaats het in een afsluitbare plastic (Ziplock) zak en seal (tas is niet meer geopend vanaf dit punt)
      5. Incubeer bij 37 ° C (CO ₂ verrijking is niet nodig)
4. Kwaliteitscontrole
   1. Negatieve controles worden uitgevoerd op elk bord. De aanwezigheid van een groei in een van de putten in de negatieve controle kolom geeft kruisbesmetting, dus de hele plaat moet worden weggegooid en de monsters opnieuw verguld.
   2. Positieve controles worden uitgevoerd op een aparte plaat aan het eind van de dag. Een volledig drugs-gevoelige stam is uitgevoerd in een kolom en een stam resistent tegen INH en RIF is uitgevoerd in een andere kolom. Als er bezorgdheid over het uitvoeren van een MDR stam, zowel een INH monoresistant stam en een RIF monoresistant stam kan worden uitgevoerd in de plaats van de gevoelige en MDR stammen. Alle positieve controles moeten de groei in de drugsvrije putten dat de media ondersteunen de groei aan te tonen. Om aan te tonen dat het medicijn concentraties juist zijn, dient de kwetsbare stam groeien niet in de INH of RIF putten, maar de MDR stam moet groeien ook groeien in de INH en RIF putten.
      
5. Plaat te lezen
   1. Met de dag in de platen als "Dag 0," plaat lezen begint op dag 5, en als negatief op dag 5 te lezen is gedaan om de dag (of andere dagen afhankelijk van de werkbelasting) tot en met dag 14 en daarna om de 2-3 dagen vanaf dag 15 -21. Platen zijn onderzocht op eenomgekeerde lichtmicroscoop met het 10x objectief
   2. Een positieve cultuur is er een waarin er twee of meer kolonievormende eenheden (> 2 CFU) in zowel drugsvrije putten. Vroege mycobacteriële groei ziet eruit als kleine gebogen komma's of spiralen (dag 5-9). Kolonie de vorming vordert meestal om "snoeren" of "knopen" (zie afbeelding bibliotheek op modsperu.org)
   3. Op de dag dat een cultuur is positief in de twee drugsvrije putten, het geneesmiddel-bevattende putten moeten worden gelezen. Eventuele groei in de aanwezigheid van een geneesmiddel geeft weerstand tegen deze drug.
      
      Opmerking: Als het lezen van het geneesmiddel-bevattende putten gebeurt> 1 week na een positieve cultuur wordt opgemerkt in de drug-free putten, kan dit niet verzet vertegenwoordigen als break-through groei is af en toe gezien
      
   4. Monsters die niet positief op dag 21 worden beschouwd als negatief culturen
   5. Vertroebeling van de putten is een gevolg van besmetting overmatige groei, terwijl mycobacteriële de groei niet leidt tot troebelheid
   6. Aan het einde van 21 dagen culturen kunnen worden weggegooid. Culturen blijven in de verzegelde tassen en worden geplaatst in autoclaafzakken en geautoclaveerd bij 121-124 ° C voor 45-60 minuten

Discussie

De MODS test is gericht op gebieden met beperkte middelen. Voor de eerste keer, MODS brengt de mogelijkheid voor een snelle detectie van vloeibare cultuur tuberculose en multidrug-resistente tuberculose voor gebieden met beperkte middelen iets minder dan drie dollar per test. MODS is een non-proprietary, iteratieve methode, en de MODS gemeenschap is altijd geïnteresseerd in verbeteringen die andere laboratoria hebben weten te maken.

Een terugkerend zorg is de bioveiligheid van vloeibare media cultuur van tuberculose, want vloeistoff...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Koelkast/vriezer	Apparatuur			om voorbereide bouillon en antibioticumvoorraden op te slaan
Vortex	Apparatuur			om sputumontsmetting te bevorderen
Centrifuge	Apparatuur			voor sputumconcentratie; in staat om 3000 g te bereiken; hoeft niet gekoeld te zijn, maar MOET bioveilig zijn (emmers kunnen worden afgesloten)
Incubator (37 graden C)	Apparatuur			voor cultuur; hoeft niet CO2 verrijkt te zijn
Omgekeerde lichtmicroscoop	Microscoop			om MODS-platen te lezen
Autoclaaf	Apparatuur			om media, PBS en gebruikte platen te steriliseren
Balans	Apparatuur			om isoniazide, rifampicine en NALC te wegen
Middlebrook 7H9 bouillon (Difco)	Reagens	Fisher Scientific	DF0713-17-9	500gr/fles; basis voor kweekmedia
Casitone (pancreatische caseïnedigest)	Reagens	Fisher Scientific	DF0259‐17‐9	500gr/fles; basis voor kweekmedia
Gelyofiliseerd glycerol (glycerine)	Reagens	Sigma-Aldrich	G‐33‐500	500ml/fles; basis voor kweekmedia
PANTA (lyofilisaat met antibioticummix BD)	Reagens	Fisher Scientific	B4345114	6 flessen/pak; aanvulling op antibioticummedia
OADC (Middlebrook OADC-verrijking BD)	Reagens	Fisher Scientific	B11886	10 x 20ml/pak; voedingsmedia-aanvulling
Dimethylsulfoxide (Hibri-Max)	Reagens	Sigma-Aldrich	D-2650	100ml/fles; voor het bereiden van rifampicinevoorraad
Antibioticumvoorraad: isoniazide	Reagens	Sigma-Aldrich	I-3377	50gr/fles; directe gevoeligheidstest
Antibioticumvoorraad: rifampicine	Reagens	Sigma-Aldrich	R-3501	1gr/fles; directe gevoeligheidstest
Natriumhydroxide (pellets)	Reagens	Sigma-Aldrich	221465	500gr/fles; sputumontsmetting
Natriumcitraat (trinatriumzout dihydraat)	Reagens	Sigma-Aldrich	S-4641	500gr/fles; sputumontsmetting
N-acetyl-L-cysteïne	Reagens	Sigma-Aldrich	A-7250	50gr/fles; sputumontsmetting
Kaliumfosfaatmonobasisch kristal. KH2PO4	Reagens	Sigma-Aldrich	P0662	500gr/fles; sputumontsmetting
Natriumfosfaatdibasisch, watervrij. Na2HPO4	Reagens	Sigma-Aldrich	S0876	500gr/fles; sputumontsmetting
Natriumhypochloriet	Reagens	huishoudelijke bleekvloeistof		om besmet afval te verwijderen
15ml centrifugeerbuisjes (polypropyleen 15ml Falcon 35‐2096)	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	14‐959‐49B	500st/doos; voor sputumontsmetting en -concentratie
24-welplaten (Plates Tissue 24 wels BD Falcon 35‐3047)	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	08-772-1	50 platen/doos; voor cultuur en lezen
Afsluitbare polyethyleenzakken 6 X 6 “ (ziplock)	Verbruiksartikel			voor bioveiligheid om 24-welplaat te bevatten
Glasbuisjes met deksel (16 x 100mm en 18 x 145mm)	Verbruiksartikel	VWR international	47729-583	500 buisjes/doos; om aliquoten van bereide bouillon op te slaan
Microcentrifugebuisjes met schroefdop (1,5ml)	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	05‐669‐22	1000st/doos; om aliquoten van antibioticumvoorraden op te slaan
0,22µm-filters (waterige oplosmiddelen) Spuitfilter Millex blauw	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	SLGL 025 OS	50 eenheden/doos; om antibioticumvoorraden te filteren
0,22µm-filters (organische oplosmiddelen) Spuitfilter Millex geel	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	SLGV 033 RS	50 eenheden/doos; om antibioticumvoorraden te filteren
Weggeef Pasteur-pipetten borosilicaatglas 9″	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	13‐678‐20C	720st/doos; om PANTA te mengen met mediamix
Aerosolbarrièretips 1000‐1300µl	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	02‐707‐51	1000st/pk; om media in plaat te doseren
USA Scientific Tips One 1‐200µl gele tips	Verbruiksartikel	Fisher Scientific	1111‐0006	1000 tips/zak; om antibioticumvoorraden te verdunnen