In dit artikel zullen we laten zien hoe het centrale zenuwstelsel ontleden uit derde instar Drosophila larven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het centrale zenuwstelsel (CZS) van Drosophila larven is complex en slecht begrepen. Een manier om het centraal zenuwstelsel te onderzoeken is om immunohistochemie gebruiken om de expressie van verschillende nieuwe en marker-eiwitten te onderzoeken. Kleuring van hele larven is niet praktisch, omdat de harde cuticula voorkomt dat antilichamen van binnendringen in het lichaam holte. Om vlekken deze weefsels is het noodzakelijk om het dier voorafgaand ontleden de vaststelling en vlekken. In dit artikel zullen we laten zien hoe je Drosophila larven ontleden zonder beschadiging van het centrale zenuwstelsel. Begin met het scheuren van de larve in de helft met een paar fijne tang, en draai vervolgens de nagelriem "inside-out" aan het centrale zenuwstelsel bloot te leggen. Als de dissectie wordt zorgvuldig uitgevoerde CNS zal gehecht blijven aan de nagelriem. We meestal houden het centraal zenuwstelsel aan de cuticula gedurende de fixatie en kleuring stappen, en alleen volledig verwijderen van het CZS van de cuticula net voor het monteren van de monsters op glasplaatjes. We tonen ook enkele representatieve afbeeldingen van een schaal voor het CNS bevlekt met Eva, een transcriptiefactor, uitgedrukt in een subset van neuronen in het CZS. Het artikel sluit af met een bespreking van enkele van de praktische toepassingen van deze techniek en de mogelijke problemen die zich kunnen voordoen.
Protocol
- Ontleden 3 e instar larven, waardoor CNS aan de cuticula. Plaats in een 1.5 ml buis.
- Fix in PBS (1x) met 2% formaldehyde gedurende 40 min met schommelen. ; Gebruik 250ul voor elke 5-10 ontleed CNS.
- Verwijder de formaldehyde en in het kort drie keer wassen met PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Gebruik een fijn getrokken Pasteur pipet om het verlies van weefsel te voorkomen.
- Blokkeer niet-specifieke eiwit binding sites en permeabilize celmembranen door het incuberen van weefsel 1-8 uur in PBST + 5% BSA, rocken bij 4 ° C.
- Incubeer in primair antilichaam verdund in PBST + 5% BSA rocken bij 4 ° C gedurende de nacht. Optimale antilichaamverdunning zal variëren voor verschillende antilichamen.
- Spoel 3x in PBST gevolgd door twee 30min wassen bij 4 ° C.
- Incubeer in secundair antilichaam verdund in PBST + 5% BSA gedurende 1-3 uur rocken bij 4 ° C. Spoel 3x in PBST gevolgd door twee 30min wassen bij 4 ° C. Als de secundaire is geconjugeerd aan een lichtgevoelige stof, wikkel de buis in aluminiumfolie.
- Ontleden weefsel verder (indien nodig) en op dia's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze video laat zien hoe ontleden de CNS uit derde instar Drosophila larven. Na de dissectie, kan het centrale zenuwstelsel worden gekleurd met behulp van een standaard protocol immunohistochemie. Op dit moment, veel is nog onbekend hoe de volwassen zenuwstelsel is en opgewekt als hoe het slaat en stuurt de gegevens. Studies van de zich ontwikkelende Drosophila larven CNS moeten versterken onze kennis van het zenuwstelsel bedrading en functie.
Drosophila larven vertonen een aantal stereotpyed gedrag, zoals een reactie op omgevingsfa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Pincet | fijn gepunt | |||
| Horlogeglas met 9 putjes | ||||
| Plastic Petri-schaal |
Referenties
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13, 507-523 (1994).
- Park, Y., Fujioka, M., Kobayashi, M., Jaynes, J., Datta, S. even skipped is required to produce a trans-acting signal for larval neuroblast proliferation that can be mimicked by ecdysone. Development 128. , 1899-1909 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
