Ga naar <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Springer Protocols</a> voor meer informatie over de engineering baculovirus als een insecidical agent en de orale infectie technieken die gebruikt worden in deze test.

De auteurs hebben niets te melden.

protocollen voor orale infectie van lepidoptera larven met baculovirus

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculovirussen worden op grote schaal gebruikt als eiwit-expressievectoren en als insecten ongediertebestrijding agenten. Deze video laat zien hoe lepidoptera larven kunnen worden besmet met veelvlakken door druppeltjes voeding en dieet op basis van plug-bioassays. Dit begeleidende Springer Protocols gedeelte geeft een overzicht van de baculovirus levenscyclus en het gebruik van baculovirussen als insecticide middelen, waaronder discussie over de voors en tegens voor het gebruik van baculovirussen als insecticiden, en de vooruitgang in genetische verbetering van baculovirussen voor een betere insecticide werkzaamheid.

In deze video, tonen we aan orale infectie technieken van lepidoptera larven met baculovirus om insecten efficiency te bepalen.

Protocollen voor orale infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus

Baculovirussen worden op grote schaal gebruikt, zowel als vectoren voor eiwitexpressie als voor de bestrijding van insectenplagen. Deze video laat zien hoe lepidoptera-larven kunnen worden ...

Het Vao-virus wordt veelvuldig gebruikt als DNA-vector in combinatie met insecten-cellijnen voor eiwitexpressie. Het feit dat dit virus insecten echter efficiënt infecteert met dodelijke gevolgen, maakt het ook tot een effectief insecticide middel. In Brazilië wordt bijvoorbeeld jaarlijks het wildtype Balo-virus toegepast op meer dan 1 miljoen hectare sojabonen om de fluweelboonenrups te bestrijden. Om hun insecticide werking te verhogen, zijn Balo-virussen genetisch gemodificeerd met genen die coderen voor insectspecifieke toxinen die actief zijn binnen de HemosIL van het insect.In deze video demonstreren we methoden voor orale infectie van lepidopteralruiken met bacao virus om de insecticide werking te analyseren. Hallo, ik ben van het Blind Boning-laboratorium van de afdeling Oftalmologie aan de Iowa State University, en ik ben Wendy Sparks, eveneens van het Boning-lab. Vandaag laten we u twee procedures zien voor VA-virusinfectie van lepidopteralruiken.Eerst laat harran zien hoe neonatale larven kunnen worden geïnfecteerd met behulp van een bioassay via druppelvoeding. Daarna laat ik zien hoe larven in het midden tot late stadium kunnen worden geïnfecteerd met behulp van een bioassay via bloed in het dieet. Laten we beginnen.Bioassays met druppelvoeding kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de dodelijke dosis van abacavir en de overlevingstijd van met balo-virus geïnfecteerde larven. Voor deze assay worden over het algemeen vroege instars of neonatale larven gebruikt.Zorg ervoor dat u vóór aanvang bekers met het juiste dieet bij de hand heeft. Bereid daarnaast de juiste virusverdunningen voor, inclusief groene voedselkleurstof tot een concentratie van 4% volume. Om de letale virusconcentratie te bepalen, moet de verdunning een mortaliteitsbereik van 1 tot 99% opleveren. Voorlopige bio-assays kunnen nodig zijn om een geschikt bereik van virusconcentraties vast te stellen. Maak, nadat de buis is gevortexd om bezinking van de polyhedra te voorkomen, twee concentrische cirkels van kleine druppels van de virusoplossing in een Petri-schaal van 60 millimeter.Vergeet niet voor elke gebruikte virusconcentratie ook een negatieve controle met een schijninfectie (mock infection) in te richten. Zet vervolgens de behandeling op door 25 tot 30 neonatale larven met een steriel penseel naar het midden van de concentrische cirkels over te brengen. Plaats het deksel op de schaal en verzegel deze met parafilm om te voorkomen dat de larven ontsnappen.Gebruik idealiter verschillende penselen voor de overdracht naar elk virustype om contaminatie tussen de behandelingen te voorkomen. Laat de schaal 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur staan, gedurende welke tijd de larven drinken. De larven die zich hebben gevoed, kunnen worden geïdentificeerd aan de groene kleur van de voorste darm als gevolg van de groene voedselkleurstof; breng alleen de larven die zich hebben gevoed over naar plastic bekertjes van één ounce die dieet bevatten, waarbij één larve per bekertje wordt overgebracht.Dek na het overbrengen van de larven de bekers af met deksels en incubeer deze gedurende 24 uur na infectie bij 28 °C. Verwijder alle bekers met dode larven. Deze vroege sterfgevallen zijn waarschijnlijk het gevolg van letsel tijdens de hantering.Bij het gebruik van deze bioassay om de dodelijke dosis te bepalen, moeten de larven elke twee tot drie dagen worden gecontroleerd totdat de schijngeïnfecteerde larven en eventuele overlevende virusbehandelde larven zijn verpopt of zijn begonnen met het graven om te verpoppen; virusgeïnfecteerde larven blijven bovenop het voedsel en sterven na enkele dagen. Dode larven zullen soms rimpelen en zwart worden; larven die sterven door infectie worden in essentie zakken met polyhedra, die volledig zullen oplossen. Als ze op dat moment mechanisch worden verstoord, wordt de larvale mortaliteit in elke behandeling gescoord.Bioassays voor letale concentraties moeten drie of vier keer op verschillende momenten worden herhaald. Gebruik 30 individuen per dosis voor elk virus of controlebehandeling. Gebruik een geschikt programma voor probit-analyse, zoals polo of SAS, om de lc 50-waarden, 95% betrouwbaarheidsintervallen en de relevante statistieken te berekenen.Deze druppelvoedingsanalyse kan ook worden gebruikt om ST 50-overlevingstijden te bepalen. In dat geval wordt de mortaliteit van de larven elke vier tot acht uur gescoord, met frequentere observaties. Als de mortaliteitssnelheid hoog is, worden bioassays voor overlevingstijd uitgevoerd met een lc 99-dosis van het virus; mediane overlevingstijden en de 95% betrouwbaarheidsgrenzen worden berekend met de Kaplan-Meier-schatter met behulp van een s plus- of SAS-programma.Nu Harang u de bioassay voor druppelvoeding heeft laten zien, zal ik u de bioassay voor voedingspluggen laten zien. Bij de bioassay voor voedingspluggen worden larven in het midden tot late stadium gevoed met een voedingsplug die is behandeld met een bekende dosis virus om de letale dosis of LD 50 te bepalen. Verwijder de dag vóór het uitvoeren van deze assay het voeder uit de beker om de larven een nacht te laten vasten.Deze stap zal de snelheid verhogen waarmee de larven het virus consumeren. Bereid de volgende dag het geïnoculeerde dieet voor door het in kleine blokjes van ongeveer twee kubieke millimeter te snijden. Als de dieetblokjes te klein zijn, zullen ze uitdrogen.Als de voedingskubussen te groot zijn, zullen de larven niet in staat zijn om de volledige voedingskubus gedurende de nacht te consumeren. Voeg nu één tot twee µL polyhedra-suspensie toe aan elke voedingskubus. De suspensie bevat 4% volume aan voedingskleurstof.Laat de suspensie vijf tot 15 minuten in het dieet intrekken. Vergeet niet om ook een dieetkubus behandeld met een mock-virus voor te bereiden als negatieve controle. Breng vervolgens één dieetkubus over naar elke larve in het vierde stadium in elke beker.Plaats de bekertjes vervolgens gedurende de nacht in de incubator bij 28 °C. Verwijder de volgende dag alle larven die de dieetkubus niet volledig hebben opgegeten. Voeg daarna aan elk bekertje met resterende larven een groot stuk dieet toe. Houd de larven bij 28 °C en voeg naar behoefte extra dieet toe totdat de mock-geïnfecteerde larven en de overlevende virus-geïnfecteerde larven klaar zijn met eten of zijn begonnen met verpoppen.Note op dit moment het aantal dode en overlevende insecten op. We tonen u twee methoden voor het infecteren van insecten met het baculovirus: bloeden (feeding biopsy) en de dieet-plaquebiopsie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kadavers van door het virus gedode larven doorgaans fragiel zijn en gemakkelijk kunnen scheuren, waardoor het virus vrijkomt.Steriliseer dus de werkoppervlakken en voeg besmette handschoenen en wegwerpmaterialen op een passende manier toe aan het afval om contaminatie te voorkomen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

protocols-for-oral-infection-of-lepidopteran-larvae-with-baculovirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Iowa State University.  In deze video, tonen we aan orale infectie technieken van lepidoptera larven met baculovirus om insecten efficiency te bepalen.

Protocollen voor orale infectie van lepidoptera Larven met Baculovirus

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Protocol

Openbaarmakingen

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen