De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract?hd=author,Powers]">Current Protocols in Cell Biology</a> .

De auteurs hebben niets te melden.

het verkrijgen van eieren van xenopus laevis teven

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

De eieren van de Xenopus laevis intact, gelyseerd en / of gefractioneerde nuttig zijn voor een breed scala aan experimenten. Dit protocol laat zien hoe eieren leggen induceren, te verzamelen en dejelly de eieren, en sorteren van de eieren op een beschadigde eieren te verwijderen.

Het verkrijgen van Eieren van Xenopus laevis Teven

Intacte, gelyseerde en/of gefractioneerde eitjes van Xenopus laevis zijn nuttig voor een breed scala aan experimenten. Dit protocol laat zien hoe de eiafzetting kan worden geïnduceerd, ...

Eiextracten van Xip Labis zijn nuttig als bronnen van cytoplasmatisch en organelmateriaal voor in vitro reconstitutie van cellulaire processen, zoals kernassemblage en nucleair eiwitimport. Voordat u de eiextracten kunt gebruiken, moet u echter eerst de eieren verkrijgen van vrouwelijke kikkers. Hallo, mijn naam is Marie Cross en ik ben een promovendus in het lab van Dr. Maureen Power van de afdeling Cell Biology aan de Emory University in Atlanta, Georgia.Vandaag laten we u zien hoe u jelly-eieren verkrijgt en isoleert van volwassen vrouwtjes van de soort opus lavis. Deze procedure omvat de volgende stappen: het voorbereiden van de kikkers op de eiafzetting met zwanger marere, het induceren van de eiafzetting met menselijk choriongonadotrophine en het sorteren van ongeschikte eieren of oocyten. Laten we beginnen.Om eieren te produceren, worden volwassen vrouwelijke kikkers eerst geprimed met zwangerschapsserum-gonadotrofine van merries. Om de primingprocedure te starten, bereid een tank voor met honderd millimolaire natriumchloride om de kikkers in te huisvesten. Na injectie moeten geprimede kikkers worden gehouden met een dichtheid van ongeveer één kikker per liter.Optimale eiproductie wordt behouden door kikkers te huisvesten bij 18 °C. Injecteer de kikker subcutaan in de dorsale lymfzak met 0,5 µL van 200 units per µL pregnant mare serum gonadotropin, met behulp van een naald van 27 gauge bevestigd aan een spuit van 1 µL.Plaats de geprimede kikkers terug in het aquarium met 100 mM natriumchloride. Induceer na twee tot drie dagen de eiafzetting door de kikkers opnieuw subcutaan in de dorsale lymfzak te injecteren met 0,5 µL van 100 IU/mL menselijk choriongonadotrofine.Plaats elke kikker na injectie in vijf liter van honderd millimolaire natriumchloride. Het is aanbevolen om elke kikker in een eigen container te plaatsen, aangezien de kwaliteit van de eitjes per kikker verschilt. Ongeveer 16 tot 22 uur na de injectie van humaan choriongonadotropine wordt de kikker overgeplaatst naar een schoon watertankje en worden de eitjes in een bekerglas gegoten.Het is raadzaam om de kikkers één tot twee dagen lang te observeren op tekenen van infectie op de injectieplaats. In dit stadium is elk ei omgeven door een transparante gelei-laag, die voorkomt dat ze elkaar raken. Om de gelei van de eieren te verwijderen, worden de eieren eenmaal gespoeld met 2% L-cysteïne bij pH 8, waarna ze verder worden geïncubeerd in 100 µL L-cysteïneoplossing van 2% per kikker gedurende ongeveer vijf minuten. Draai de eieren bij kamertemperatuur na vijf minuten voorzichtig en periodiek rond.Giet de cysteïne-oplossing van de deje-eieren af en was ze drie keer in een 0,25 x gemodificeerde ringer-oplossing. Giet de eieren, terwijl u onder een dissectiemicroscoop werkt, in een glazen Petrischaal van honderd millimeter om debris te verwijderen. Verwijder de slechte eieren uit de Petrischaal met een Pasteur-pipet.Rijpe xip-eieren hebben een donker gepigmenteerde bovenhelft en een lichte onderhelft. Een wit stipje ter grootte van een speldenkop, dat duidt op de rijping van de oocyten, moet zichtbaar zijn in het midden van de donker gepigmenteerde hemisfeer van het rijpe ei. Een goed ei is een ei met een gelijkmatige pigmentatie.Alles zonder deze witte plek is een oocyten en dient te worden verwijderd. Eieren die wit en vergroot zijn of niet gelijkmatig gepigmenteerd zijn, moeten ook worden verwijderd. Een bijzonder slecht ei zal eruitzien als een witte, opgezwollen bol waarbij de grens tussen de hemisferen volledig is vervaagd. Was de gesorteerde eieren twee tot drie keer door er eilyse buffer over te gieten en de buffer vervolgens voorzichtig af te gieten, waarbij het aantal meegeschopte eieren tot een minimum wordt beperkt.Nu kunnen de eicellen worden gelyseerd en kunnen extracten worden bereid. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u eicellen verkrijgt en ontgeletteert uit volwassen xenopus lavis vrouwtjes. Bekijk zeker onze andere twee video's waarin wordt getoond hoe u ruwe eiextracten bereidt, alsof hoe u in vitro kernassemblage reconstitueert met behulp van gefractioneerde eiextracten.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

obtaining-eggs-from-xenopus-laevis-females

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Emory University.  De eieren van de Xenopus laevis intact, gelyseerd en / of gefractioneerde nuttig zijn voor een breed scala aan experimenten. Dit protocol laat zien hoe eieren leggen induceren, te verzamelen en dejelly de eieren, en sorteren van de eieren op een beschadigde eieren te verwijderen.

Het verkrijgen van Eieren van Xenopus laevis Teven

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Protocol

Openbaarmakingen

Herprints en machtigingen

Tags