Extractie van biomarkers uit sedimenten - Versnelde oplosmiddelextractie
Bron: Laboratorium van Jeff Salacup - Universiteit van Massachusetts Amherst
De verdeling van een groep organische biomarkers, glycerol-dialkyl glycer…
1. Verzamelen van de noodzakelijke materialen
- Extract monsters. Voordat ze worden geëxtraheerd, worden monsters (in dit geval sediment) bevroren, gevriesdroogd, vermalen en gehomogeniseerd en worden ze in groepen geëxtraheerd om de efficiëntie te maximaliseren.
- Gebruik, afhankelijk van de grootte van het monster, verzamelbuisjes met volumes van 40 of 60 mL. Voor dit experiment worden buisjes van borosilicaatglas (40 mL) en solvoombakken gebruikt. Verbrand buisjes, borosilicaatglaspipetten en weegtins bij 550 °C gedurende 6 uur om verwijdering van mogelijke organische verontreinigingen te garanderen.
- Dichloormethanol (DCM) en methanol zijn gebruikelijk in de meeste laboratoria voor organische geochemie. Gebruik ze afzonderlijk, (methanol eerst, gevolgd door DCM) om laboratoriumgereedschappen en glaswerk te spoelen voor gebruik. Een mengsel van dichloormethanol en methanol (MeOH; 9:1) wordt in veel laboratoria gebruikt om biomarkers met een breed scala aan polariteiten efficiënt te extraheren. Oplosmiddelen moeten vrij zijn van organische verontreinigingen.
- Verkrijg een versnelde solvext voor gebruik bij dit experiment.
2. Voorbereiding van monstercellen
- Assembleer een monstercel voor elk monster dat moet worden geëxtraheerd, plus één blanco.
- Schroef voor elke cel een eindkappen op een uiteinde van de cellichaam.
- Plaats een verbrande glasvezelfilter op de top van elke cel met solvent-gespoelde pincetten. Druk vervolgens voorzichtig en langzaam de filter in de cel met behulp van de filterplunger.
- Label de cellichamen per nummer (bijv. 1 - 22) voor elk monster en schrijf 'blank' op de lege cel.
- Vul de blanco met diatomeeënaarde (of zand) en sluit af met een tweede eindkappen. Draai met de hand vast.
3. Voorbereiding van monsters
- Plaats een verbrand weegtin op de laboratoriumweegschaal en nul.
- Spuit de laboratoriumspatel met oplosmiddel en gebruik het vervolgens om een geschikte massa monster over te brengen naar de weegtin en noteer de massa.
- De massa van het monster varieert afhankelijk van het gehalte aan organisch materiaal. Relatief materiaal met een laag organische stofgehalte (mariene modder) kan enkele grammen vereisen, terwijl materiaal rijk aan organisch materiaal (bladweefsel) veel minder kan vereisen.
- Breng al het materiaal in de weegtin over naar een voorbereide ASE-cel.
- Plaats nog een glasvezelfilter op de bovenkant van de cel, druk vervolgens langzaam en voorzichtig naar beneden totdat deze de bovenkant van het monster bereikt met behulp van de filterplunger.
- Voeg diatomeeënaarde (of zand) toe aan de cel tot het bijna vol is. Wees voorzichtig om eventueel puin van de draad van het cellichaam te verwijderen.
- Bedek de bovenkant van de cel met een andere eindkappen.
- Herhaal stappen 3.1 - 3.6 voor elk monster.
4. Voorbereiding van verzamelbuisjes
- Label elk buisje met het nummer van een overeenkomstig cel (bijv. 1 - 22 of blanco) en sluit af met ASE-verzamelbuisjekap.
5. Extractie
- Plaats elke monstercel in een genummerde sleuf op de bovenste ASE-lade.
- Plaats het overeenkomstige verzamelbuisje in dezelfde nummersleuf op de onderste ASE-lade.
- Maak de extractiemethode aan met behulp van de toetsen op de ASE. Extraheer bij 100 °C en 1.200 psi. Extraheer elk monster 3x met een statische houdtijd van 10 min en spoel het cellichaam met 50% van het totale volume tussen statische houdtijden.
- Zorg ervoor dat de oplosmiddelfles voldoende oplosmiddel bevat om alle monsters te extraheren.
- Spuit de ASE 3x door de knop 'spoelen' op het bedieningspaneel van de ASE in te drukken.
- Druk op start.
Accelerated solvent extractie is een snelle, efficiënte en hoogwaardige techniek die wordt gebruikt om organische biomarkers te scheiden van grote aantallen geologische sedimentmonsters.
Traditioneel worden extractiemethoden zoals sonicatie of Soxhlet gebruikt, maar het nadeel van deze protocollen is dat ze te langzaam zijn om voldoende materiaal te verwerken voor gedetailleerde paleoklimaatreconstructie. Een nieuwere techniek, de Accelerated Solvent Extractie, of ASE-methode, is ontwikkeld met efficiëntie en hoge doorvoer in gedachten.
De ASE-methode gebruikt een combinatie van hoge temperaturen en hoge druk om monsters te extraheren en kan meerdere monsters in één relatief snelle voorbereidingsrun verwerken.
Deze video is de derde in een serie die beschrijft hoe biomarkers uit sediment kunnen worden geëxtraheerd. Het zal de procedure behandelen en inzicht geven in de voordelen van ASE ten opzichte van sonicatie of Soxhlet-extractie.
Bij versnelde oplosmiddelextractie worden monsters geladen in stalen cellen die vervolgens op een carrousel worden geplaatst. Collectiebuisjes voor elke monstercel worden ook op een aparte carrousel geladen. Het instrument laadt een monstercel in een interne oven. Oplosmiddel wordt gepompt vanuit een oplosmiddelfles door een reeks kleppen totdat een voldoende druk is bereikt.
Deze druk wordt vastgehouden gedurende een tijdsduur die wordt bepaald door het monster en het analyt. Vervolgens wordt het oplosmiddel uit de monstercel gespoeld door een stalen leiding in het bijbehorende collectiebuisje. Het proces kan een aantal keer worden herhaald. De temperatuur, druk en duur kunnen allemaal worden aangepast aan het monster.
De hoge temperatuur die wordt gebruikt, verhoogt de kinetica van de extractie, terwijl de hoge druk voorkomt dat het oplosmiddel verdampt. Het collectiebuisje bevat nu een totaal lipide-extract, en wat er in de monstercel achterblijft, wordt een residu genoemd. Het bestaat uit niet-organisch materiaal en organisch materiaal dat niet oplosmiddel-extracteerbaar is, kerogen genaamd.
Nu we bekend zijn met de principes achter versnelde oplosmiddelextractie, laten we eens kijken hoe dit in het laboratorium wordt uitgevoerd.
Na het verzamelen van de interessante monsters; invriezen, homogeniseren en ontsmetten zoals gedemonstreerd in een andere video in deze serie.
Zodra alle monsters zijn voorbereid, monteer een cel voor elk monster dat moet worden geëxtraheerd, en één extra voor een blanco. Om dit te doen, schroeven we een eindkappen op het cellichaam. Gebruik oplosmiddel-gespoelde pincetten om een gecombusteerde glasvezelfilter bovenop elke cel te plaatsen. Druk de filter langzaam en voorzichtig naar beneden?met de plunjer.
Label de cellichamen per monster en label de blanco apart. Plaats een gecombusteerde weegschaal op een laboratoriumschaal en nulleer. Spoel een spatel met oplosmiddel, gebruik het vervolgens om 5 tot 10 g monster naar de weegschaal over te brengen en noteer de massa.
Breng al het materiaal in de weegschaal over naar de bijbehorende cel. Plaats nog een glasvezelfilter erop en kneed het voorzichtig tot het de bovenkant van het monster bereikt.
Voeg een dispersiemiddel toe, zoals diatomeeënaarde of zand, tot het bijna vol is, en zorg ervoor dat er geen puin in de draad van het cellichaam terechtkomt. Bedek de bovenkant van de cel met een andere eindkappen. Herhaal deze stappen voor elk monster en de blanco.
Label elk collectiebuisje met het nummer van een bijbehorende monstercel of blanco en sluit af met een flesdop. Plaats elke cel in een genummerde sleuf op de bovenste ASE-lade. Stel de parameters voor de extractiemethode in met behulp van het toetsenblok op de ASE om bij 100 °C en 1.200 psi te extraheren. Extraheer elk monster 3 keer met een statische houdtijd van 10 min en spoel de cellichaam met 50% van het totale volume ertussen door.
Zorg er vervolgens voor dat de oplosmiddelfles genoeg bevat om alle monsters te extraheren. Spoel de instrumentleidingen?3 keer voordat u de run start. Druk tenslotte op start.
Verwijder het buisje uit de ASE. Nu de biomarkers zijn geëxtraheerd, moeten ze worden gezuiverd voor analyse.
Accelerated Solvent Extractie is een veelzijdige techniek die voor verschillende toepassingen kan worden gebruikt, waarvan enkele hier worden verkend.
Accelerated solvent extractie kan ook worden gebruikt op andere soorten monsters, inclusief voedsel. Residuanalyse om te testen op pesticidenverontreiniging wordt vaak uitgevoerd in regelgevende en industriële faciliteiten om de veiligheid en kwaliteit van voedingsproducten zoals fruit of groenten te controleren. ASE kan worden gebruikt om organochloorpesticiden uit voedselmonsters te extraheren en de soorten of niveaus van residuen in de producten te bepalen. Deze informatie kan vervolgens worden gebruikt om vast te stellen of producten geschikt zijn voor menselijke of dierlijke consumptie. Zo zou dieldrine binnen 0 tot 0,1 delen per miljoen in voedsel moeten worden gevonden, afhankelijk van het product.
Voedingscomponenten kunnen ook worden geëxtraheerd met behulp van ASE. Bijvoorbeeld producten zoals chocolade, die een hoog zwaartekrachtvetgehalte kunnen hebben, kunnen worden geëxtraheerd. Met behulp van ASE met petroleumether als oplosmiddel kan vet worden gescheiden van chocolademonsters en onderworpen aan kwantitatieve analyse om een nauwkeurig percentage vetgehalte per bekende hoeveelheid chocolade te bepalen. Met behulp van deze informatie kunnen regelgevende instanties claims van chocoladefabrikanten verifiëren, of fabrikanten kunnen informatie verkrijgen om nauwkeurige voedsellabels te maken.
U hebt zojuist JoVE's introductie bekeken over de extractie van lipide biomarkers met behulp van versnelde oplosmiddelextractie, of ASE. Methoden voor verdere verwerking en analyse zijn te vinden in volgende video's.
Bedankt voor het bekijken!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.