Hoogprestatie vloeistofchromatografie (HPLC)

1. Making the Mobile Phase

1. Bereidt de mobiele fase voor door 400 mL acetonitril toe te voegen aan ongeveer 1,5 L gezuiverd DI-water.
2. Voeg voorzichtig 2,4 mL glazuurzuur toe aan deze oplossing.
3. Verdun de oplossing tot een totaal volume van 2,0 L in een volumetrische kolf met gezuiverd DI-water. De resulterende oplossing moet een pH hebben tussen 2,8 en 3,2.
4. Stel de pH in op 4,2 door 40% natriumhydroxide toe te voegen, druppelsgewijs met behulp van een gekalibreerd digitaal pH-meter. Voeg heel langzaam toe zodra de pH 4,0 bereikt. Dit zou ongeveer 50 druppels moeten kosten.
5. Filter de mobiele fase door een 0,47-µm Nylon 66-membraanfilter onder vacuüm om de oplossing te ontgassen en vaste stoffen te verwijderen die de chromatografische kolom zouden kunnen verstoppen. Het is belangrijk om de mobiele fase te ontgassen om te voorkomen dat er een bubbel ontstaat, die ofwel een lege ruimte in de stationaire fase bij de inlaat van de kolom kan veroorzaken ofwel in de detectorcel terecht kan komen, wat onstabielheid met de UV-absorptie kan veroorzaken.

2. Het maken van de componentenoplossingen

De drie componenten die gemaakt moeten worden zijn cafeïne (0,8 mg/mL), kaliumbenzoaat (1,4 mg/mL) en aspartaam (L-aspartyl-L-fenylalanine methylester) (6,0 mg/mL). Deze concentraties, eenmaal op dezelfde manier verdund, brengen de standaarden op de niveaus die in de soda-monsters worden gevonden.

1. Voeg 0,40 g cafeïne toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
2. Voeg 0,70 g benzoaat toe aan een 500-mL volumetrische kolf en verdun tot de 500-mL markering met DI-water.
3. Voeg 0,60 g aspartaam toe aan een 100-mL volumetrische kolf en verdun tot de 100-mL markering met DI-water. Plaats deze oplossing in een koelkast om ontbinding tijdens opslag te voorkomen.

3. Het maken van de 7 standaardoplossingen

De drie componenten hebben allemaal verschillende verdelingscoëfficiënten, wat van invloed is op hoe elk met beide fasen interacteert. Hoe groter de verdelingscoëfficiënt, hoe meer tijd het component in de stationaire fase doorbrengt, wat resulteert in langere retentietijd bij het bereiken van de detector.

1. Volg de tabel in Tabel 1 en pipet de juiste hoeveelheid van elke component in een 50-mL volumetrische kolf.
2. Verdun elke voorraadoplossing tot de 50-mL markering op de volumetrische kolven met mobiele fase.
3. Giet elke standaardoplossing in gelabelde kleine flesjes in een monsterrek.
4. Bewaar de rekken met monsters in een koelkast, samen met de resterende oplossingen in de 50-mL volumetrische kolven.

4. Controle van de initiële instellingen van het HPLC-systeem

1. Bevestig dat de afvoerlijn in een afvalcontainer staat en niet terugrecycleert in de mobiele fase.
2. Controleer of de stromingssnelheid van de mobiele fase is ingesteld op 0,5 mL/min. Dit is hoog genoeg om alle pieken binnen 5 min te laten elueren en langzaam genoeg om een mooie resolutie mogelijk te maken.
3. Controleer of de minimale en maximale druk en de stromingssnelheid zijn ingesteld op de juiste waarden op het voorpaneel van het systeem voor het leveren van oplosmiddelen (de pomp).
   1. Minimale drukinstelling: 250 psi (dit is om de pomp uit te schakelen, als er een lek optreedt).
   2. Maximale drukinstelling: 4.000 psi (dit is om de pomp te beschermen tegen breken, als er een verstopping ontstaat).
4. Druk op "nul" op het voorpaneel van de detector om de blanco (de blanco is de pure mobiele fase) in te stellen.
5. Spoel een 100-µL-spuit met gedeïoniseerd water en vervolgens met verschillende volumes van een van de te analyseren werkstandaarden en vul de spuit met die oplossing. Begin met de 3 enkele componenten-monsters, waardoor de piek van elke component van belang kan worden geïdentificeerd.

5. Handmatig injecteren van het monster en gegevensverzameling

1. Met de injectorhendel in de laadpositie, injecteer langzaam 100 µL oplossing door de septumpoort.
2. Controleer of het gegevensverzamelingprogramma is ingesteld om gegevens te verzamelen gedurende 300 s, wat voldoende tijd geeft voor alle 3 pieken om door de detector te elueren.
3. Wanneer u klaar bent om de proef te starten, draai de injectorhendel naar de injectiepositie (die het monster in de mobiele fase injecteert) en klik onmiddellijk op "Start Trial" op het computergegevensverzamelingprogramma. Voor standaarden 1-3 verschijnt slechts een van de drie opeenvolgende pieken op het scherm gedurende de run (Figuur 1).
4. Zodra 300 s is verstreken, stuurt de gegevensverzameling een prompt om het gegevensbestand op te slaan. Sla de gegevens op onder een geschikte bestandsnaam (bijv. STD#1).
5. Noteer de tijd in seconden voor de piek van elke proef, wat wordt gebruikt bij het identificeren van die component.
6. Verwijder de spuit uit het septum en herhaal het proces voor elk van de overige werkstandaarden, met dezelfde tijd per chromatogram zoals bepaald uit de eerste run.