Zuivering van een totaal lipidenextract met kolomchromatografie

1. Setup en voorbereiding van materialen

1. Verkrijg een totaal lipidenextract (TLE) met behulp van een oplosmiddel-extractiemethode (Sonicatie, Soxhlet of Accelerated Solvent Extraction (ASE)).
2. Verzamel de volgende: gecombusteerde borosilicaat glas pipetten en bulben, silicagel, hexaan, dichloromethaan (DCM) en methanol.
   1. Deze materialen kunnen bij elke chemische retailer worden gekocht. De reagentia moeten zuiver en vrij van koolwaterstoffen zijn.
3. Verkrijg ook gecombusteerde glaswol en 4-mL borosilicaat glas vials.
4. Zorg ervoor dat u een manier hebt om de kolom en de opvangvials tijdens de procedure te ondersteunen. Bijvoorbeeld, een standaard met klemmen en een vial rek. Veel labs hebben zelfgemaakte racks die meerdere kolommen en opvangvials kunnen vasthouden (Figuur 2). Dit stelt u in staat om meerdere kolommen tegelijk te laten lopen.

2. Methoden

1. Begin met het droge monster in een 4-mL glas vat. Als het monster meer weegt dan ~ 10 mg in droge toestand, moet het mogelijk worden gesplitst voordat de volgende stappen worden uitgevoerd, aangezien de silicagel slechts kan reageren met een eindige massa organische materie.
2. Suspendeer het monster in een kleine hoeveelheid hexaan. Dit is de eerste en minst polaire van de drie oplosmiddelen die in dit experiment worden gebruikt.
3. Als er monster aan de binnenkant van het vat zit, soniqueer de monsters gedurende 5 minuten.
4. Laad een kleine hoeveelheid glaswol in de bovenkant van een pipet met behulp van een set schone pincetten. Duw de glaswol voorzichtig naar de bodem van de pipet, met behulp van een andere pipet, om een plug te vormen.
5. Breng voorzichtig silicagel in de pipet totdat deze ongeveer halfvol is.
6. Plaats een 4-mL afvalinzamelvat onder de kolom.
7. Week de silicagel in de pipet met 3 volumes hexaan. Dit conditioneert de kolom, verwijdert luchtbellen en spoelt eventuele onzuiverheden van de silicagel.
8. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, verwijdert u het afvalinzamelvat en vervangt u het door een vat om de apolaire fractie te verzamelen.
9. Breng voorzichtig het hele monster in hexaan over op de kolom met behulp van een pipet. Spoel de monstervat twee keer meer met kleine volumes hexaan, en breng over naar de kolom. Laat het hexaan waarin het monster werd overgebracht volledig in de silicagel weken. Op geen enkel moment tijdens de procedure mag de silicagel uitdrogen.
10. Ga door met het toevoegen van hexaan aan de bovenkant van het monster totdat het opvangvat onder de kolom bijna vol is (~4 mL).
    1. Laat al het hexaan de silicagel binnengaan voordat u begint met het volgende oplosmiddel.
11. Plaats het opvangvat met middelhoge polariteit onder de kolom.
12. Voeg DCM toe aan de bovenkant van de kolom totdat het opvangvat bijna vol is. Laat opnieuw al het DCM het opvangvat binnengaan voordat u begint met het volgende oplosmiddel.
13. Plaats het polaire opvangvat onder de kolom.
14. Voeg methanol toe aan de bovenkant van de kolom totdat het opvangvat bijna vol is.