Gaschromatografie (GC) met vlamionisatiedetector
1. Initialisatie van de GC
- Zet de helium dragergás en lucht aan en pas de drukmeters op het instrument aan.
- Zet de kolomoom op een hoge temperatuur (meestal 250 °C of hoger) om de kolom te bakken. Overschrijd niet de maximale temperatuur van de kolom. Dit zal eventuele verontreinigingen verwijderen. Laat het minstens 30 minuten bakken voordat u een monster uitvoert.
2. Een methodenbestand maken
- In de software die het instrument bestuurt, voer alle gewenste waarden voor een methodenbestand in. Stel eerst de instellingen van de autosampler in. Stel het aantal voorlopige spoelingen, naloopse spoelingen en spoelingen met monster in. Deze spoelingen maken de kolom schoon tussen verschillende monsters.
- De geïnjecteerde hoeveelheid is meestal 1 μL. Een splitsverhouding wordt meestal ingesteld omdat het injecteren van een volledig monster de kolom kan overbelasten. Als de splitsverhouding 100:1 is, betekent dit dat voor elke 1 deel dat in het instrument wordt geïnjecteerd, er 100 delen verloren gaan.
- Voer de parameters van de mobiele fase in. De stroomsnelheid wordt bepaald door de ingestelde druk. Snellere stroomsnelheden leiden tot snellere scheidingen, maar er is minder tijd voor de analyt om te interageren met de kolom.
- Voer de temperatuursprogrammering in. Voor een isotherme run, voer de temperatuur van de scheiding en vervolgens een tijd voor de scheiding in. Voor een gradiënteloutitie, voer de starttemperatuur en houdtijd, de eindtemperatuur en houdtijd, en de snelheid van de helling in °C/min in. Er wordt ook een evenwichtstijd ingesteld die de kolom toestaat om af te koelen naar de oorspronkelijke temperatuur tussen runs.
- Voer de detectorparameters in. Een detectortemperatuur en bemonsteringssnelheid worden ingevoerd. De detector moet altijd een hogere temperatuur hebben dan de kolomtemperatuur, zodat er geen analyt condenseert op de detector.
- Sla het methodenbestand op. De parameters moeten mogelijk ook worden gedownload, zodat ze door de GC worden gelezen.
3. Verzameling van GC-gegevens
- Zet de waterstofgas aan en zorg ervoor dat de drukmeter correct is ingesteld. Steek de vlam van de FID aan.
- Op de autosampler-standaard, vul de wasvial met wasoplosmiddel, zoals acetonitril of methanol. Zorg ervoor dat de afvalvial leeg is.
- Bereid het monster voor. Als er enige kans is op deeltjes in het monster, filter het monster. Omdat kunststofresiduen soms met GC kunnen worden gezien, gebruik alleen glazen spuiten en glazen vials om uw monster voor te bereiden.
- Vul de vijl minstens half met monster zodat de autosampler-spuiten ervoor gegarandeerd het monster opnemen. Autosampler-vials zijn doorgaans 2 mL, maar als het monstervolume beperkt is, zijn er vijl-inserts beschikbaar om het benodigde monstervolume te verminderen.
- Laad de monstervijl(en) in de autosampler-standaard. Houd bij welke positie elk monster zich bevindt.
- Voor de run, nul de baseline van de chartrecorder op de computersoftware.
- Bestanden kunnen worden verzameld als een enkele run of met behulp van een batchtabel voor meerdere runs. Zorg ervoor dat u het juiste vijlnummer voor het monster opgeeft. Druk op de "start" knop en maak een bestand.
- Gegevens worden doorgaans geanalyseerd met een softwareprogramma. Parameters die kunnen worden gemeten, omvatten retentietijd, piekhoogte, piekoppervlak en aantal theoretische platen.
4. Resultaten: GC-analyse van koffiemonsters
- In dit voorbeeld werd GC-FID-analyse uitgevoerd voor cafeïne en palmitinezuur, twee verbindingen die in koffie worden aangetroffen. De cafeïne is minder polair dan het palmitinezuur, dat een lange alkaneketen heeft. Daarom wordt de cafeïne minder vastgehouden en eluteert eerst op de nonpolaire kolom van 95% dimethylpolysiloxaan en 5% fenyl-aryleen (Figuur 1).
- Uit het chromatogram kunnen de piekoppervlakken worden berekend. De piekoppervlakken zijn evenredig aan de massa koolstof die door de detector gaat en ze kunnen worden gebruikt om een calibratiecurve van instrumentrespons versus concentratie te maken. Voor Figuur 1, is het piekoppervlak 27.315 voor cafeïne en 18.852 voor palmitinezuur.
- Een maatstaf voor de kolomefficiëntie is N, het aantal theoretische platen. N kan worden berekend uit het chromatogram voor elke piek. Voor Figuur 1, is N 283.000 voor cafeïne en 261.000 voor palmitinezuur.
- Figuur 2 toont het effect van temperatuur op isotherme scheidingen. Twee scheidingen zijn overelkaar gelegd van hetzelfde cafeïne en palmitinezuur monster. De eerste is bij 180 °C en de tweede bij 200 °C. De retentietijd is veel kleiner voor de hogere temperatuur run.
Figuur 1. GC-FID-analyse van cafeïne en palmitinezuur monsters. Het 5 mM cafeïne standaard eluteert eerst, gevolgd door het 1 mM palmitinezuur monster. De temperatuursnelheid was 0,1 min bij 150 °C, gevolgd door een snelheid van 10 °C/min naar 220 °C waar de temperatuur gedurende 5 min werd vastgehouden.
Bron: Laboratorium van Dr. B. Jill Venton - Universiteit van Virginia
Gaschromatografie (GC) wordt gebruikt om kleine verbindingen met een laag molecu…
1. Initialisatie van de GC
- Zet de helium dragergás en lucht aan en pas de drukmeters op het instrument aan.
- Zet de kolomoom op een hoge temperatuur (meestal 250 °C of hoger) om de kolom te bakken. Overschrijd niet de maximale temperatuur van de kolom. Dit zal eventuele verontreinigingen verwijderen. Laat het minstens 30 minuten bakken voordat u een monster uitvoert.
2. Een methodenbestand maken
- In de software die het instrument bestuurt, voer alle gewenste waarden voor een methodenbestand in. Stel eerst de instellingen van de autosampler in. Stel het aantal voorlopige spoelingen, naloopse spoelingen en spoelingen met monster in. Deze spoelingen maken de kolom schoon tussen verschillende monsters.
- De geïnjecteerde hoeveelheid is meestal 1 μL. Een splitsverhouding wordt meestal ingesteld omdat het injecteren van een volledig monster de kolom kan overbelasten. Als de splitsverhouding 100:1 is, betekent dit dat voor elke 1 deel dat in het instrument wordt geïnjecteerd, er 100 delen verloren gaan.
- Voer de parameters van de mobiele fase in. De stroomsnelheid wordt bepaald door de ingestelde druk. Snellere stroomsnelheden leiden tot snellere scheidingen, maar er is minder tijd voor de analyt om te interageren met de kolom.
- Voer de temperatuursprogrammering in. Voor een isotherme run, voer de temperatuur van de scheiding en vervolgens een tijd voor de scheiding in. Voor een gradiënteloutitie, voer de starttemperatuur en houdtijd, de eindtemperatuur en houdtijd, en de snelheid van de helling in °C/min in. Er wordt ook een evenwichtstijd ingesteld die de kolom toestaat om af te koelen naar de oorspronkelijke temperatuur tussen runs.
- Voer de detectorparameters in. Een detectortemperatuur en bemonsteringssnelheid worden ingevoerd. De detector moet altijd een hogere temperatuur hebben dan de kolomtemperatuur, zodat er geen analyt condenseert op de detector.
- Sla het methodenbestand op. De parameters moeten mogelijk ook worden gedownload, zodat ze door de GC worden gelezen.
3. Verzameling van GC-gegevens
- Zet de waterstofgas aan en zorg ervoor dat de drukmeter correct is ingesteld. Steek de vlam van de FID aan.
- Op de autosampler-standaard, vul de wasvial met wasoplosmiddel, zoals acetonitril of methanol. Zorg ervoor dat de afvalvial leeg is.
- Bereid het monster voor. Als er enige kans is op deeltjes in het monster, filter het monster. Omdat kunststofresiduen soms met GC kunnen worden gezien, gebruik alleen glazen spuiten en glazen vials om uw monster voor te bereiden.
- Vul de vijl minstens half met monster zodat de autosampler-spuiten ervoor gegarandeerd het monster opnemen. Autosampler-vials zijn doorgaans 2 mL, maar als het monstervolume beperkt is, zijn er vijl-inserts beschikbaar om het benodigde monstervolume te verminderen.
- Laad de monstervijl(en) in de autosampler-standaard. Houd bij welke positie elk monster zich bevindt.
- Voor de run, nul de baseline van de chartrecorder op de computersoftware.
- Bestanden kunnen worden verzameld als een enkele run of met behulp van een batchtabel voor meerdere runs. Zorg ervoor dat u het juiste vijlnummer voor het monster opgeeft. Druk op de "start" knop en maak een bestand.
- Gegevens worden doorgaans geanalyseerd met een softwareprogramma. Parameters die kunnen worden gemeten, omvatten retentietijd, piekhoogte, piekoppervlak en aantal theoretische platen.
4. Resultaten: GC-analyse van koffiemonsters
- In dit voorbeeld werd GC-FID-analyse uitgevoerd voor cafeïne en palmitinezuur, twee verbindingen die in koffie worden aangetroffen. De cafeïne is minder polair dan het palmitinezuur, dat een lange alkaneketen heeft. Daarom wordt de cafeïne minder vastgehouden en eluteert eerst op de nonpolaire kolom van 95% dimethylpolysiloxaan en 5% fenyl-aryleen (Figuur 1).
- Uit het chromatogram kunnen de piekoppervlakken worden berekend. De piekoppervlakken zijn evenredig aan de massa koolstof die door de detector gaat en ze kunnen worden gebruikt om een calibratiecurve van instrumentrespons versus concentratie te maken. Voor Figuur 1, is het piekoppervlak 27.315 voor cafeïne en 18.852 voor palmitinezuur.
- Een maatstaf voor de kolomefficiëntie is N, het aantal theoretische platen. N kan worden berekend uit het chromatogram voor elke piek. Voor Figuur 1, is N 283.000 voor cafeïne en 261.000 voor palmitinezuur.
- Figuur 2 toont het effect van temperatuur op isotherme scheidingen. Twee scheidingen zijn overelkaar gelegd van hetzelfde cafeïne en palmitinezuur monster. De eerste is bij 180 °C en de tweede bij 200 °C. De retentietijd is veel kleiner voor de hogere temperatuur run.
Figuur 1. GC-FID-analyse van cafeïne en palmitinezuur monsters. Het 5 mM cafeïne standaard eluteert eerst, gevolgd door het 1 mM palmitinezuur monster. De temperatuursnelheid was 0,1 min bij 150 °C, gevolgd door een snelheid van 10 °C/min naar 220 °C waar de temperatuur gedurende 5 min werd vastgehouden.
Gaschromatografie, of GC, is een techniek die wordt gebruikt om kleine vluchtige verbindingen in de gasfase te scheiden, detecteren en kwantificeren.
Bij GC worden vloeibare monsters verdampt en vervolgens door een inert gas door een lange, dunne kolom gevoerd. Analyten worden gescheiden op basis van hun chemische affiniteit met een coating aan de binnenkant van de kolom.
Omdat GC vereist dat analyten in de gasfase worden verdampt, is het instrument ideaal geschikt voor vluchtige, niet-polaire chemicaliën met een massa van minder dan 1.000 dalton. Voor grotere, waterige of polaire moleculen die moeilijk te verdampen zijn, is vloeistofchromatografie een nuttige alternatief. Deze video introduceert de basisprincipes van gaschromatografie en illustreert de stappen die nodig zijn om de chemische soorten in een niet-waterige monstersteekproef te analyseren met behulp van een gaschromatograaf.
Het GC-instrument heeft vijf essentiële componenten. Ten eerste wordt een injectiepoort gebruikt om het monster in het instrument te brengen. Vervolgens verdampt een verwarmingskamer het monster en mengt het met een inert gas. Het inerte gas, zoals helium of stikstof, voert het verdampte monster door het systeem. Samen vormen het draaggas en het monster de mobiele fase. Vervolgens komt de mobiele fase in de verwarmde kolom en scheidt de analyten terwijl ze er doorheen stromen. Ten slotte registreert een detector de gassen zodra ze de kolom verlaten, of elueren, en stuurt gegevens naar een computer voor analyse. Het meest cruciale onderdeel van het instrument is de kolom. De kolom is een capillair met een stationaire fase matrix die de binnenwanden bedekt. Alternatief kunnen kolommen worden gevuld met matrix-gecoate kralen. De stationaire fase is meestal gemodificeerd polydimetylsiloxaan, wat ideaal is voor het oplossen van niet-polaire moleculen. De scheidingseigenschappen worden verfijnd door 5-10% fenyl-, cyanopropyl- of trifluorpropylgroepen toe te voegen.
Analyten met een lage chemische affiniteit voor de stationaire fase bewegen zich snel door de kolom, terwijl moleculen met een hoge affiniteit worden vertraagd terwijl ze adsorberen aan de kolomwanden. De tijd die een verbinding in de kolom doorbrengt, wordt de retentieduur, of Rt, genoemd en maakt het mogelijk verbindingen te identificeren. De detector zit aan het einde van de kolom en registreert gassen terwijl ze elueren. Vlam-ionisatiedetectie, of FID, wordt veel gebruikt omdat het koolstofionen detecteert, waardoor het vrijwel elke organische verbinding kan detecteren. Bij FID verbranden analyten in een waterstof-luchtmengsel wanneer ze de kolom verlaten, waardoor koolstofionen worden geproduceerd die een stroom in nabijgelegen elektroden induceren. De stroom is recht evenredig met de koolstofmassa, dus de concentratie van de verbinding kan worden bepaald. Het eindresultaat is een chromatogram, een plot van FID-signaal versus tijd, dat elke eluerende component toont zodra ze de kolom verlaten. Idealiter zal elke piek een symmetrische, Gaussiaanse vorm hebben. Asymmetrische kenmerken, zoals piekverkleuring en piekfrontering, kunnen het gevolg zijn van overbelasting, injectieproblemen of de aanwezigheid van functionele groepen die aan de kolom hechten, zoals carbonzuren.
Nu de principes van gaschromatografie zijn besproken, laten we eens kijken hoe we een gaschromatografie-analyse in het laboratorium uitvoeren en analyseren.
Voordat u een experiment uitvoert, zet u de heliumgastank aan. Open de software op de computer en bak de kolom uit om eventuele potentiële verontreinigingen te verwijderen. Stel de oven op een hoge temperatuur, meestal 250 °C of hoger, en bak de kolom gedurende minimaal 30 minuten.
Pas vervolgens de instellingen van de autosampler aan. Stel het aantal pre- en post-run spoelingen in om de kolom tussen monsters schoon te maken.
Gebruik een monstervolume van 1 μL en stel de split ratio in om het instrument te programmeren om slechts een fractie van de invoer te accepteren. Pas de stroomsnelheid van het draaggas aan en gebruik gevestigde instellingen of proef en fout om de ideale druk te vinden.
Voer nu de temperatuurinstellingen voor het experiment in. Voer voor een isotherme run de temperatuur en de tijd voor de scheiding in. Alternatief, voor een temperatuurgradiënt, voer de starttemperatuur en houdtijd, de eindtemperatuur en houdtijd en de rampsnelheid in °C per minuut in.
Stel de tijd in voor het afkoelen van de kolom tussen runs voor zowel een gradiënt als een isotherme run.
Stel ten slotte de bemonsteringssnelheid en de detectortemperatuur in. De detector moet altijd heter zijn dan de kolom om condensatie te voorkomen. Nadat alle instellingen zijn geprogrammeerd, slaat u het methodebestand op.
Activeer de detector door de klep van de waterstoftank te openen en ontsteek de vlam van de FID. Het instrument is nu klaar voor monstersanalyse.
Om het monster op de GC te draaien, vult u eerst een flesje met een wasoplosmiddel, zoals azetonitril of methanol. Bereid het monster voor en zorg ervoor dat u glazen spuiten en glazen flesjes gebruikt, omdat plastic resten de GC kunnen verontreinigen.
Voeg nu het voorbereide monster toe aan een flesje met een pipet. Vul het minimaal voor de helft, zodat de spuit van de autosampler volledig ondergedompeld zal zijn. Laad vervolgens de was- en monsterspuitjes in de autosampler-rek. Voordat u het monster draait, nult u de basislijn van het chromatogram op de computersoftware. Gegevens kunnen worden verzameld als een enkele run of met behulp van een batchtabel voor meerdere runs. Druk op "start" om het monster te draaien.
In dit voorbeeld werden cafeïne- en palmitinezuurniveaus in koffie geanalyseerd met behulp van GC met FID. Cafeïne is kleiner en minder polair, dus het wordt minder aangetrokken door de kolom en elueert eerst. Palmitinezuur, dat een lange alkaanenketenstaart heeft, elueert later vanwege een hogere affiniteit met de stationaire fase.
Omdat de piekdimensies evenredig zijn aan de koolstofmassa, kan de concentratie van elk component worden bepaald uit zijn respectieve piekgebied op de chromatograaf en vergeleken met standaarden met een bekende concentratie.
Het effect van de kolomtemperatuur werd ook onderzocht. Bij 200 °C bewogen monsters
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What types of compounds are best analyzed using gas chromatography?
Gas chromatography is ideally suited for small volatile, nonpolar compounds less than 1,000 daltons in mass. GC requires analytes to vaporize into the gas phase, making it perfect for non-aqueous solutions. For larger, aqueous, or polar molecules that are difficult to vaporize, liquid chromatography is a more useful alternative.
Q2: How does the stationary phase in a GC column separate different compounds?
Analytes separate based on their chemical affinity with the stationary phase coating the column's inner walls. Compounds with low affinity move quickly through the column, while molecules with high affinity are slowed as they adsorb to the column walls. The time a compound spends in the column, called retention time, allows compounds to be identified and distinguished from one another.
Q3: What is flame-ionization detection and how does it quantify compounds?
Flame-ionization detection (FID) combusts analytes in a hydrogen-air flame as they exit the column, producing carbon ions that induce a current in nearby electrodes. The current is directly proportional to carbon mass, allowing compound concentration to be determined. FID is widely used because it detects virtually any organic compound and is unaffected by noncombustible gases and water.
Q4: What does a chromatogram show and what do peak shapes indicate?
A chromatogram is a plot of FID signal versus time, showing each eluted component as a peak. Ideally, each peak has a symmetrical, Gaussian shape. Asymmetrical features like peak tailing and peak fronting can indicate overloading, injection problems, or the presence of functional groups such as carboxylic acids that stick to the column.
Q5: How does temperature affect sample separation in gas chromatography?
Increasing column temperature accelerates sample movement through the column. At higher temperatures, samples move faster, reducing analysis time. However, peak heights may change while the area under the curve remains constant, preserving quantitative accuracy. Temperature can be held constant for isothermal runs or programmed as a gradient for more complex separations.
Q6: What are the key steps for preparing and running a GC sample?
Fill a vial with wash solvent like acetonitrile or methanol, then prepare your sample using glass syringes and vials to avoid plastic contamination. Add the sample to a vial with a pipette, filling at least halfway so the autosampler syringe is fully submerged. Load vials into the autosampler rack, zero the baseline on the computer, and press start to begin the analysis.
Q7: How is GC combined with other techniques for chemical identification?
GC is commonly used in tandem with mass spectrometry, called GC-MS, to unambiguously identify chemicals in samples. GC first separates complex mixtures into individual components, while mass spectrometry separates molecules based on their mass-to-charge ratio, providing precise mass information and chemical identity. This combination is a powerful tool for environmental monitoring and chemical analysis.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
1:06
Principles of Gas Chromatography
3:54
Instrument Initialization
5:37
Running the GC
6:32
Representative Results: Quantification of Caffeine and Palmitic Acid in Coffee
7:28
Applications
8:59
Summary