Kalibratiecurves

1. Making the Standards: Serial Dilutions

1. Maak een geconcentreerde stockoplossing van de standaard. Meestal wordt de verbinding nauwkeurig gewogen en vervolgens kwantitatief overgebracht in een maatkolf. Voeg wat oplosmiddel toe, meng zodat het monster oplost en vul vervolgens tot de lijn met het juiste oplosmiddel.
2. Voer seriële verdunningen uit. Neem een andere maatkolf en pipet de hoeveelheid standaard die nodig is voor de verdunning, vul vervolgens tot de lijn met oplosmiddel en meng. Een tienvoudige verdunning wordt meestal gemaakt, dus voor een maatkolf van 10 ml, voeg 1 ml van de vorige verdunning toe.
3. Ga zo nodig verder met meer verdunning, door te pipetteren van de vorige oplossing om deze te verdunnen en het volgende monster te maken. Voor een goede calibratiecurve zijn ten minste 5 concentraties nodig.

2. Uitvoeren van de monsters voor de calibratiecurve en het onbekende

1. Voer de monsters uit met de UV-Vis spectrofotometer om de instrumentele respons te bepalen die nodig is voor de calibratiecurve.
2. Neem de meting met het eerste monster. Het is een goed idee om de monsters in willekeurige volgorde uit te voeren (d.w.z. niet van hoog naar laag of van laag naar hoog) voor het geval er systematische fouten zijn. Om een schatting van de ruis te krijgen, herhaalt u de meting van elk gegeven monster 3-5x.
3. Voer de aanvullende standaardmonsters uit, herhaal de metingen voor elk monster om een schatting van de ruis te krijgen. Noteer de gegevens om later een plot te maken.
4. Voer het onbekende monster(s) uit. Gebruik zoveel mogelijk dezelfde omstandigheden als bij het uitvoeren van de standaarden. Dus de monstermatrix of buffer moet hetzelfde zijn, de pH moet hetzelfde zijn en de concentratie moet in het bereik van de uitgevoerde standaarden vallen.

3. Maken van de calibratiecurve

1. Noteer de gegevens in een spreadsheet en gebruik een computerprogramma om de gegevens tegen concentratie te plotten. Als er voor elk punt ten minste drievoudige metingen zijn genomen, kunnen er foutbalken worden geplot van de standaarddeviatie van die metingen om de fout van elk punt in te schatten. Voor sommige curven moeten de gegevens mogelijk worden geplot met een as als log om een lijn te krijgen. De vergelijking die de calibratiecurve bestuurt is meestal van tevoren bekend, dus een log-plot wordt gebruikt wanneer er een log in de vergelijking is.
2. Bekijk de calibratiecurve. Ziet het er lineair uit? Heeft het een gedeelte dat er niet-lineair uitziet (d.w.z. het bereik van de instrumentele respons bereikt)? Om dit te controleren, past u alle gegevens aan een lineaire regressie aan met behulp van de software. Als de correlatiecoëfficiënt (R²) niet hoog is, verwijdert u enkele van de punten aan het begin of einde van de curve die niet in de lijn lijken te passen en voert u de lineaire regressie opnieuw uit. Het is niet acceptabel om punten in het midden te verwijderen alleen omdat ze een grote foutbalk hebben. Bepaal op basis van deze analyse welk deel van de curve lineair is.
3. De uitvoer van de lineaire zou een vergelijking moeten zijn van het formaat y=mx+b, waarbij m de helling is en b het y-snijpunt is. De eenheden voor de helling zijn de eenheid van de y-as/concentratie, in dit voorbeeld (Figuur 1) absorbantie/μM. De eenheden voor het y-snijpunt zijn de eenheden van de y-as. Er wordt een correlatiecoëfficiënt (R²) verkregen. Hoe hoger de R² hoe beter de pas; een perfecte pas geeft een R² van 1. Het programma kan ook een schatting geven van de fout op de helling en het snijpunt.

4. Resultaten: calibratiecurve van de absorbantie van blauwe kleurstof #1

1. De calibratiecurve voor de absorbantie van blauwe kleurstof #1 (bij 631 nm) is hieronder weergegeven (Figuur 1). De respons is lineair van 0 tot 10 µM. Boven die concentratie begint het signaal af te vlakken omdat de respons buiten het lineaire bereik van de UV-Vis spectrofotometer ligt.
2. Bereken de LOD. Vanuit de helling van de calibratiecurve is de LOD 3*S.D. (ruis)/m. Voor deze calibratiecurve werd de ruis verkregen door een standaarddeviatie van herhaalde metingen te nemen en was 0,021. De LOD zou 3*0,021/.109=0,58 µM zijn.
3. Bereken de LOQ. De LOQ is 10*S.D.(ruis)/m. Voor deze calibratiecurve is LOQ 10*0,021/.109 =1,93 µM.
4. Bereken de concentratie van het onbekende. Gebruik de lijnvergelijking om de concentratie van het onbekende monster te berekenen. De calibratiecurve is alleen geldig als het onbekende in het lineaire bereik van de standaardmonsters valt. Als de metingen te hoog zijn, kan verdunning nodig zijn. In dit voorbeeld werd de onbekende sportdrank 1:1 verdund. De absorbantie was 0,243 en dit kwam overeen met een concentratie van 2,02 µM. Dus was de uiteindelijke concentratie van blauwe kleurstof #1 in de sportdrank 4,04 µM.

Figuur 1. Calibratiecurven voor UV-Vis absorbantie van blauwe kleurstof. Links: De absorbantie werd gemeten van verschillende concentraties blauwe kleurstof #1. De reacties vlakken af na 10 µM, wanneer de absorbantie meer dan 1 is. De foutbalken zijn afkomstig van herhaalde met