Kristallen kweken voor röntgendiffractie-analyse
Bron: Laboratorium van Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Röntgenkristallografie is een methode die vaak wordt gebruikt om de ruimtelijke arrangemen…
1. Voorbereiding van de kristalbuis en filter
- Plaats een NMR-buis in een Erlenmeyerkolf.
- Maak een pipetfilter.
- Bouw het filter door een stuk pluisvrij doek (1 inch bij 1 inch) in het pipet te plaatsen en vervolgens een staaf te gebruiken om het doek stevig in de vernauwing van het pipet te klemmen (Figuur 1).
- Maak twee pipetfilters voor elke benodigde kristalbuis.
2. Het toevoegen van de monster aan de kristalbuis
- Los het compound (tetrafenylporfyrine, 10 mg) op in 0,75 mL oplosmiddel (dichloormethaen).
- Voeg met een pipet voorzichtig het mengsel toe aan de bovenkant van de buis, door het door het filter te laten gaan.
- De deeltjes worden gefilterd om de vorming van nucleatieplaatsen te voorkomen, wat kan leiden tot kleine meerdere kristallen in plaats van de gewenste grotere enkele kristallen.
- Zodra het monster in de kristalbuis is geplaatst, voeg je heel langzaam en voorzichtig het anti-oplosmiddel (1,5 mL methanol) toe aan de buis door een nieuwe filterpipet. Laat het anti-oplosmiddel langzaam op de eerder toegevoegde oplossing lagen (Figuur 2). Gebruik geen bulb om het oplosmiddel door het pipet te duwen, laat het oplosmiddel in plaats daarvan door de filter zelf stromen.
- Zorg ervoor dat het oplosmiddel met de hoogste dichtheid eerst in de kristalbuis wordt toegevoegd.
- Controleer of de twee oplosmiddelen met elkaar mengbaar zijn. Dit wordt gedaan voorafgaand aan het toevoegen van het oplosmiddel.
- Verzegel de buis met een NMR-dop.
3. Kristalgroei
- Zonder de twee oplosmiddelen te laten mengen, plaats de kristalbuis(en) in een kast waar ze niet gestoord zullen worden.
- De kristallisatietijd varieert per compound - meestal moeten de kristalbuizen een week ongestoord blijven.
- Na een week inspecteer de buizen op kristalgroei.
- Kristalgroei gebeurt meestal op het grensvlak van de twee oplosmiddelen.
- Inspecteer de buizen visueel op bewijs van kristalgroei. Wees voorzichtig om het mengen van de oplosmiddelen niet te bevorderen, voor het geval de compound extra tijd nodig heeft voor kristalvorming.
- Als het lijkt dat er kristalgroei heeft plaatsgevonden, inspecteer de buizen verder met een microscoop.
4. Kristalselectie
- X-ray diffractiekristallen moeten goed gedefinieerde vlakken hebben.
- Kristallen die samengeklont hebben, moeten worden vermeden indien mogelijk.
- Laat de kristallen in de kristalbuis tot ze klaar zijn om te worden geoogst, onmiddellijk voordat de kristal op de diffractometer wordt geplaatst.
- Door de kristallen in de buis te houden, blijven de kristallen gesolvateerd. Ontsolvatie kan ervoor zorgen dat de kristallen barsten en de diffractie van de kristal belemmeren.
Figuur 1. Een afbeelding van het pipetfilter. Een klein stuk pluisvrij doek is stevig vastgeklemd bij de vernauwing van het pipet. De oplossingen worden door deze pipetfilters geleid voordat ze in de kristalbuis worden geïntroduceerd.
Figuur 2. Zodra de oplossing met het doelcompound in de kristalbuis is geplaatst, wordt het anti-oplosmiddel langzaam bovenop gelaagd door het door een nieuwe pipetfilter te laten lopen.
Een enkel kristal is vereist voor de bepaling van zijn structuur. De kwaliteit van het kristal heeft een grote invloed op de kwaliteit en nauwkeurigheid van de structurele bepaling.
Een enkel kristal is een vaste stof waarin de molecuulrangschikking zich in alle drie de dimensies herhaalt. De ruimtelijke rangschikking van de atomen binnen het kristallijne vaste stof kan worden bepaald met behulp van röntgenkristallografie. In deze techniek wordt een zuiver kristallijn monster omhuld door een straal röntgenstralen. Het kristal diffracteert de röntgenstralen in een karakteristiek patroon dat gerelateerd is aan de kristalstructuur en moleculaire samenstelling. Als een kristal te snel wordt gevormd, kunnen de moleculen ongeordend zijn, kunnen onzuiverheden in het kristal worden opgenomen of kunnen twee of meer gefuseerde kristallen worden gevormd in plaats van een enkel kristal. Daarom zijn gespecialiseerde methoden met nadruk op langzame groei nodig om kristallen van voldoende kwaliteit voor röntgenkristallografie te produceren.
Deze video zal de gewenste kenmerken van röntgenkwaliteitskristallen illustreren, een procedure voor het laten groeien ervan demonstreren en enkele toepassingen van deze techniek in de chemie introduceren.
Elektronen verstrooien röntgenstralen door een sferische röntgengolf uit te zenden wanneer ze worden geraakt. Als de atomen zich in een ordelijke rangschikking bevinden, produceert de constructieve interferentie tussen de golven een karakteristiek diffractiepatroon op een röntgendetector. Het kristal wordt in de straal geroteerd om diffractiepatronen vanuit meerdere hoeken te verzamelen. Met voldoende diffractiepatronen kan de moleculaire structuur worden afgeleid.
Kristallen van röntgenkwaliteit vormen over het algemeen symmetrische vormen en hebben gladde, lichtreflecterende vlakken. Wanneer ze onder een polariserende microscoop worden bekeken, zullen ze transparant zijn, maar de meeste moeten donker worden wanneer ze 90° worden geroteerd. Dit geeft een zeer geordende structuur aan. Om deze kristallen te laten groeien, wordt vaak vloeistof-vloeistof-diffusie gebruikt. Dit gebruikt twee mengbare oplosmiddelen: een oplosmiddel met lage dichtheid, of precipitant, waarin de verbinding die moet worden herkristalliseerd onoplosbaar is; en een oplosmiddel met hoge dichtheid waarin de verbinding oplosbaar is. Typisch is de volumeverhouding van precipitant tot oplosmiddel 2:1.
Het precipitant met lage dichtheid wordt gelaagd op een geconcentreerde oplossing van de verbinding in het oplosmiddel met hoge dichtheid. Na verloop van tijd wordt de verbinding minder oplosbaar naarmate het precipitant zich met de oplossing mengt. Een kleiner oplosmiddel-interfaceresulteert in een langzamere diffusiesnelheid, waardoor grotere, zuivere kristallen worden verkregen. Nu je de principes van het laten groeien van röntgenkwaliteitskristallen begrijpt, laten we een procedure doorlopen voor het laten groeien ervan door vloeistof-vloeistof-diffusie.
Om te beginnen, verkrijg de benodigde apparatuur die in het tekstprotocol staat. Verkrijg een oplosmiddel voor de verbinding en een minder dicht precipitant.
Om een pipetfilter voor te bereiden, plaats een klein stukje Kimwipe in de bovenkant van een glazen pipet en druk het papier voorzichtig naar de bodem van het pipetlijf met behulp van een staaf of de steel van een andere pipet, zorg ervoor dat het papier niet wordt doorboord. Bereid twee pipetfilters voor. Plaats er een in de NMR-buis. Bevestig indien nodig de constructie met een laboratoriumklem en ringstatief. Los ongeveer 10 mg van de verbinding die moet worden herkristalliseerd op in 0,75 mL oplosmiddel.
Voeg nu voorzichtig de monsteroplossing toe aan het pipetfilter. Bevestig een bulb aan de bovenkant en knijp langzaam om de oplossing in de NMR-buis te laten lopen om vaste onzuiverheden te verwijderen. Laat de bulb niet weer uitzetten terwijl deze is bevestigd, omdat de zuiging het filterpapier zal losmaken.
Verwijder vervolgens het gebruikte pipetfilter en plaats het tweede filter in de NMR-buis. Pipet ongeveer 1,5 mL precipitant in de buis. Laat het oplosmiddel door de filter door de zwaartekracht passeren. Zorg er voortaan voor dat u het filter niet verstoort tijdens enige manipulatie. Zodra al het precipitant in de buis is gefilterd, verwijder het filter en sluit de buis af. Plaats deze in een kast of andere gemakkelijk te controleren locatie waar deze niet zal worden geschud.
Na ten minste één dag inspecteert u de buizen op kristalgroei.?Als er geen kristallen aanwezig zijn of de kristallen erg klein zijn, laat dan de monsterbuis ongestoord. Als er kristallen zichtbaar zijn, controleert u hun grootte en vorm zonder de oplosmiddellagen te verstoren.
Als de kristallen groot, goed gedefinieerd zijn en niet geclusterd zijn, inspecteer dan de kristallen onder een microscoop om hun potentieel om van röntgenkwaliteit te zijn te verifiëren. Verwijder de kristallen niet uit de buis totdat de diffractometer klaar is om met het scannen te beginnen. Als oplosmiddelmoleculen in de kristalstructuur worden opgenomen, zal het laten drogen van het kristal het kristal afbreken. Met behulp van röntgenkristallografie werd de moleculaire structuur van deze donker roodachtig-paarse kristallen geverifieerd als tetrafenylporfyrine.
Röntgenkristallografie is een essentieel analytisch hulpmiddel in de chemie en biochemie.
Rekristallisatiemethoden omvatten verwarmen en afkoelen, vloeistof-vloeistof-diffusie, dampdiffusie en langzame verdamping. Bij langzame verdamping van een enkel oplosmiddelsysteem wordt de verbinding opgelost in een kleine hoeveelheid oplosmiddel en in een container met een klein gaatje in de dop geplaatst. Terwijl het oplosmiddel verdampt, neemt de concentratie toe totdat de verbinding begint te kristalliseren.
De functionaliteit van eiwitten is vaak gerelateerd aan hun structuur. Echter, eiwitten kunnen erg moeilijk te kristalliseren zijn. Gespecialiseerde technieken moeten worden ontwikkeld om röntgenkwaliteitskristallen van eiwitten te laten groeien. Hier wordt een druppel eiwitoplossing gemengd met een druppel precipitant en dit mengsel wordt afgesloten in een kamer met zuivere precipitant. Terwijl het oplosmiddeldamp uit de druppel diffundeert, neem
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What makes a crystal suitable for X-ray diffraction analysis?
X-ray-quality crystals form symmetric shapes with smooth, light-reflecting faces. Under a polarizing microscope, they appear transparent but turn dark when rotated 90 degrees, indicating highly ordered molecular arrangement. This ordered structure is essential because crystal quality directly influences the accuracy of structural determination in X-ray crystallography.
Q2: Why does slow crystal growth produce better results for X-ray analysis?
Rapid crystal formation causes molecular disorder, incorporates impurities, or creates fused crystals instead of single crystals. Slow growth allows molecules to arrange orderly and prevents contamination. A smaller solvent interface during liquid-liquid diffusion reduces the diffusion rate, yielding larger, purer crystals suitable for X-ray crystallography.
Q3: How does liquid-liquid diffusion work in crystal growth?
Liquid-liquid diffusion uses two miscible solvents: a low-density precipitant where the compound is insoluble, and a high-density solvent where it dissolves. The precipitant is layered onto the concentrated compound solution. As the precipitant gradually mixes with the solution, the compound becomes less soluble, causing slow, controlled crystallization that produces high-quality crystals.
Q4: What is the role of the pipette filter in the crystal growth procedure?
The pipette filter removes solid impurities from the compound solution before crystallization begins. A small piece of Kimwipe is placed in the glass pipette and pressed to the bottom. The sample solution passes through the filter by gentle bulb pressure, ensuring only pure dissolved compound enters the NMR tube for clean crystal formation.
Q5: How does X-ray crystallography determine molecular structure?
When X-rays hit a crystal with ordered atoms, electrons scatter the rays, producing constructive interference and a characteristic diffraction pattern. The crystal is rotated to collect patterns from multiple angles. With sufficient diffraction data, the three-dimensional spatial arrangement of atoms can be derived, revealing the molecule's complete structure and composition.
Q6: What alternative methods can be used to grow X-ray-quality crystals?
Besides liquid-liquid diffusion, recrystallization methods include vapor diffusion, slow evaporation, and heating-cooling cycles. In slow evaporation, the compound dissolves in solvent in a container with a small hole; as solvent evaporates, concentration increases until crystallization occurs. Protein crystallization often requires specialized techniques like purifying compounds by recrystallization under mineral oil.
Q7: Why is single-crystal X-ray diffraction preferred over powder diffraction?
Single-crystal X-ray diffraction preserves three-dimensional structural information because each crystal orientation is distinct. Powder diffraction loses this spatial data since all possible orientations exist simultaneously in the sample. While powder diffraction excels at analyzing crystalline mixtures and assessing amorphous structure crystallinity, single-crystal methods provide superior structural detail for determining molecular shape.