Column Chromatografie

1. Silica Gel Slurry

1. Pour de silicagel in een Erlenmeyerkolf. Het gewicht van het pakkingsmateriaal moet ongeveer 50x dat van het te scheiden monster zijn. Als de te scheiden verbindingen zeer vergelijkbare R_f waarden hebben, kan het nodig zijn om een grotere hoeveelheid silica per monster te gebruiken, zoals in dit voorbeeld.
   1. Plaats 10 g silica in de Erlenmeyerkolf, aangezien er 50 mg monster (45 mg fluorenon en 5 mg tetrafenylporfyrine) wordt geïsoleerd.
2. Voeg het oplosmiddelsysteem (hexaan/dichlooromethaan, 70%: 30%) toe aan de Erlenmeyerkolf die de silicagel bevat. Voeg voldoende oplosmiddel toe om ervoor te zorgen dat alle silicagel goed is opgelost. De silica zal niet oplossen, maar het mengsel zal visueel opvallen wanneer het is opgelost. Zodra het oplosmiddel is toegevoegd, draai de Erlenmeyerkolf om ervoor te zorgen dat alle silica goed is opgelost.

2. Voorbereiding van de kolom

1. Selecteer de geschikte kolom. Typisch moet de kolom ongeveer half gevuld zijn met silicagel slurry. Hoe groter het monster dat gezuiverd moet worden, hoe groter de kolom die nodig is.
2. Versluit de bodem van de kolom met een stuk glaswol. Zorg met behulp van een lange staaf dat de wol stevig in de bodem van de kolom is ingeklemd, net boven de stopkraan.
3. Zodra de wol stevig op zijn plaats zit, breng een dunne laag zand aan over de glaswol.
   Opmerking: Als de kolom is uitgerust met een glazen frit boven de stopkraan, moet deze stap worden weggelaten.
4. Klem de kolom in verticale positie op een ringstandaard.
5. Gebruik een trechter om voorzichtig de voorbereide slurry van silicagel in de kolom te gieten. Mogelijk moet u extra oplosmiddel toevoegen om de slurry van de Erlenmeyerkolf naar de kolom over te brengen. Gebruik een pipet om eventueel silicagel dat aan de zijkanten van de kolom kleeft weg te spoelen.
   1. Terwijl de silicagel zich in de kolom nestelt, tik zachtjes op de zijkanten van de kolom om ervoor te zorgen dat de silicagel strak inpakt en geen luchtbellen uitsluit.
6. Open de stopkraan en laat het oplosmiddel in een schone Erlenmeyerkolf stromen tot net voordat de silicagel en de oplosmiddelfront elkaar ontmoeten. De silicagel mag nooit droog worden totdat de procedure is voltooid.
7. Plaats een dunne laag zand op de silicagel (Figuur 1). Gebruik een pipet om eventueel zand dat aan de zijkanten van de kolom blijft plakken weg te spoelen.
8. Laat eventueel extra oplosmiddel weglopen totdat het zand droog is, maar niet tot aan de silicagel laag.

Figuur 1. De juiste opstelling voor een kolommenchromatografie-experiment voorafgaand aan de toevoeging van het monster.

3. Toevoegen van het monster aan de kolom

1. Los het monster op in de kleinste hoeveelheid oplosmiddel mogelijk (met behulp van hetzelfde oplosmiddel dat is gebruikt om de silicagel slurry te maken).
2. Gebruik een pipet om voorzichtig het monster toe te voegen bovenaan de kolom.
3. Zodra het monster op de bovenkant van de kolom is aangebracht, open de stopkraan en laat het oplosmiddel door de zandlaag stromen, maar niet door de silicagel laag. Gebruik een zeer kleine hoeveelheid oplosmiddel om eventueel monster dat aan de zijkanten van de kolom blijft plakken weg te spoelen. Laat dit extra oplosmiddel ook door de zandlaag stromen.

4. Elueren van het monster door de kolom

1. Gebruik een pipet om zeer voorzichtig 4-5 mL oplosmiddel toe te voegen op een manier die de zandlaag niet verstoort.
2. Plaats een trechter bovenaan de kolom en vul de rest van de kolom heel langzaam en voorzichtig met oplosmiddel.
3. Open de stopkraan en laat het oplosmiddel door de kolom stromen.
4. Begin het mobiele fase te verzamelen terwijl het uit de kolom in testbuisjes stroomt.
   1. Testbuisjes moeten in een testbuisjesstandaard op een rij worden geplaatst.
5. Voeg extra oplosmiddel toe aan de bovenkant van de kolom zoals nodig is totdat alle gewenste verbindingen uit de kolom zijn elueerd.

5. Herstel van de bestanddelen

1. Als de verbindingen gekleurd zijn, dan kunnen ze visueel worden geïdentificeerd. Als de verbindingen echter kleurloos zijn, zullen ze moeten worden geïdentificeerd met behulp van ultraviolet (UV) licht (indien de verbindingen conjugatie bevatten) of met de juiste kleurstof. De zuiverheid van de verbindingen kan worden geverifieerd met dunne-laagchromatografie.
2. Identificeer de testbuisjes die het gewenste verbinding(en) bevatten.
3. Breng alle fracties die het gewenste geïsoleerde verbinding(en) bevatten samen in een vooraf gewogen rondbodem (RB) kolf. Doe dit voor elke te isoleren verbinding.
4. Verdampt het oplosmiddel door de RB kolf op de rotatie verdamper te plaatsen.
5. Zodra al het oplosmiddel is verwijderd, weeg de RB met het gedroogde product en trek het oorspronkelijke gewicht van de RB af om een opbrengst te verkrijgen.