Column Chromatografie
Bron: Laboratorium van Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Kolomchromatografie is een van de meest bruikbare technieken voor het zuiveren van verbind…
1. Silica Gel Slurry
- Pour de silicagel in een Erlenmeyerkolf. Het gewicht van het pakkingsmateriaal moet ongeveer 50x dat van het te scheiden monster zijn. Als de te scheiden verbindingen zeer vergelijkbare Rf waarden hebben, kan het nodig zijn om een grotere hoeveelheid silica per monster te gebruiken, zoals in dit voorbeeld.
- Plaats 10 g silica in de Erlenmeyerkolf, aangezien er 50 mg monster (45 mg fluorenon en 5 mg tetrafenylporfyrine) wordt geïsoleerd.
- Voeg het oplosmiddelsysteem (hexaan/dichlooromethaan, 70%: 30%) toe aan de Erlenmeyerkolf die de silicagel bevat. Voeg voldoende oplosmiddel toe om ervoor te zorgen dat alle silicagel goed is opgelost. De silica zal niet oplossen, maar het mengsel zal visueel opvallen wanneer het is opgelost. Zodra het oplosmiddel is toegevoegd, draai de Erlenmeyerkolf om ervoor te zorgen dat alle silica goed is opgelost.
2. Voorbereiding van de kolom
- Selecteer de geschikte kolom. Typisch moet de kolom ongeveer half gevuld zijn met silicagel slurry. Hoe groter het monster dat gezuiverd moet worden, hoe groter de kolom die nodig is.
- Versluit de bodem van de kolom met een stuk glaswol. Zorg met behulp van een lange staaf dat de wol stevig in de bodem van de kolom is ingeklemd, net boven de stopkraan.
- Zodra de wol stevig op zijn plaats zit, breng een dunne laag zand aan over de glaswol.
Opmerking: Als de kolom is uitgerust met een glazen frit boven de stopkraan, moet deze stap worden weggelaten. - Klem de kolom in verticale positie op een ringstandaard.
- Gebruik een trechter om voorzichtig de voorbereide slurry van silicagel in de kolom te gieten. Mogelijk moet u extra oplosmiddel toevoegen om de slurry van de Erlenmeyerkolf naar de kolom over te brengen. Gebruik een pipet om eventueel silicagel dat aan de zijkanten van de kolom kleeft weg te spoelen.
- Terwijl de silicagel zich in de kolom nestelt, tik zachtjes op de zijkanten van de kolom om ervoor te zorgen dat de silicagel strak inpakt en geen luchtbellen uitsluit.
- Open de stopkraan en laat het oplosmiddel in een schone Erlenmeyerkolf stromen tot net voordat de silicagel en de oplosmiddelfront elkaar ontmoeten. De silicagel mag nooit droog worden totdat de procedure is voltooid.
- Plaats een dunne laag zand op de silicagel (Figuur 1). Gebruik een pipet om eventueel zand dat aan de zijkanten van de kolom blijft plakken weg te spoelen.
- Laat eventueel extra oplosmiddel weglopen totdat het zand droog is, maar niet tot aan de silicagel laag.
Figuur 1. De juiste opstelling voor een kolommenchromatografie-experiment voorafgaand aan de toevoeging van het monster.
3. Toevoegen van het monster aan de kolom
- Los het monster op in de kleinste hoeveelheid oplosmiddel mogelijk (met behulp van hetzelfde oplosmiddel dat is gebruikt om de silicagel slurry te maken).
- Gebruik een pipet om voorzichtig het monster toe te voegen bovenaan de kolom.
- Zodra het monster op de bovenkant van de kolom is aangebracht, open de stopkraan en laat het oplosmiddel door de zandlaag stromen, maar niet door de silicagel laag. Gebruik een zeer kleine hoeveelheid oplosmiddel om eventueel monster dat aan de zijkanten van de kolom blijft plakken weg te spoelen. Laat dit extra oplosmiddel ook door de zandlaag stromen.
4. Elueren van het monster door de kolom
- Gebruik een pipet om zeer voorzichtig 4-5 mL oplosmiddel toe te voegen op een manier die de zandlaag niet verstoort.
- Plaats een trechter bovenaan de kolom en vul de rest van de kolom heel langzaam en voorzichtig met oplosmiddel.
- Open de stopkraan en laat het oplosmiddel door de kolom stromen.
- Begin het mobiele fase te verzamelen terwijl het uit de kolom in testbuisjes stroomt.
- Testbuisjes moeten in een testbuisjesstandaard op een rij worden geplaatst.
- Voeg extra oplosmiddel toe aan de bovenkant van de kolom zoals nodig is totdat alle gewenste verbindingen uit de kolom zijn elueerd.
5. Herstel van de bestanddelen
- Als de verbindingen gekleurd zijn, dan kunnen ze visueel worden geïdentificeerd. Als de verbindingen echter kleurloos zijn, zullen ze moeten worden geïdentificeerd met behulp van ultraviolet (UV) licht (indien de verbindingen conjugatie bevatten) of met de juiste kleurstof. De zuiverheid van de verbindingen kan worden geverifieerd met dunne-laagchromatografie.
- Identificeer de testbuisjes die het gewenste verbinding(en) bevatten.
- Breng alle fracties die het gewenste geïsoleerde verbinding(en) bevatten samen in een vooraf gewogen rondbodem (RB) kolf. Doe dit voor elke te isoleren verbinding.
- Verdampt het oplosmiddel door de RB kolf op de rotatie verdamper te plaatsen.
- Zodra al het oplosmiddel is verwijderd, weeg de RB met het gedroogde product en trek het oorspronkelijke gewicht van de RB af om een opbrengst te verkrijgen.
Kolomchromatografie is een veelzijdige zuiveringsmethode die wordt gebruikt om verbindingen in een oplossing te scheiden. Een oplossingsmengsel wordt door een oplosmiddel door een kolom gevoerd die een adsorberend vast lichaam bevat, de stationaire fase genoemd. De gecombineerde oplossing en monstersmengeling wordt de mobiele fase genoemd.
Moleculen in de mobiele fase reizen met verschillende snelheden door de kolom op basis van hun chemische eigenschappen en hun affiniteit voor de stationaire fase. Zo verlaat elke verbinding de kolom op een ander moment. Zodra de verbindingen zijn gescheiden en gezuiverd, kunnen ze verder worden verwerkt of zijn ze klaar voor distributie. Deze video introduceert de basisprincipes van kolomchromatografie en demonstreert vervolgens de techniek met de zuivering van organische verbindingen.
Bij kolomchromatografie adsorberen moleculen reversibel aan de stationaire fase terwijl ze door de kolom stromen, waardoor hun voortgang wordt vertraagd. Verbindingen die zwak interageren met de stationaire fase, komen sneller uit de kolom, of elueren. Verbindingen die sterk interageren met de stationaire fase, elueren langzamer. De stationaire fase is een adsorberend poeder of gel zoals silicagel of alumina. Silicagel en alumina zijn sterk polair, dus ze interageren sterk met polaire verbindingen en oplosmiddelen en zwak met niet-polaire moleculen. De stationaire fase wordt als een suspensie met het oplosmiddel in de kolom geladen en vervolgens gevuld door oplosmiddel door de stationaire fase te laten stromen. Wanneer deze correct is verpakt, is de stationaire fase van boven naar beneden homogeen en bevat geen luchtbellen of droge plekken, omdat ongelijkmatige stroming veroorzaakt door deze onregelmatigheden de scheiding van verbindingen verstoort. Het oplosmiddel, of eluent, is meestal een organisch oplosmiddel dat vanuit een reservoir wordt geleverd. Over het algemeen elueren niet-polaire oplosmiddelen alleen niet-polaire verbindingen, terwijl polaire oplosmiddelen zowel polaire als niet-polaire verbindingen elueren. Als een mengsel verbindingen met aanzienlijk verschillende polariteit bevat, kan een reeks steeds polairere oplosmiddelen worden gebruikt om alle verbindingen van belang te elueren. De stroomsnelheid van de mobiele fase wordt meestal geregeld door een stopkraan aan de onderkant van de kolom. Pauzes in de stroom worden tot een minimum beperkt om diffusie van de verbindingen te voorkomen. De mobiele fase die de kolom verlaat, het eluaat, wordt in fracties verzameld om de scheiding van verbindingen te behouden. Nu u de principes van kolomchromatografie begrijpt, laten we een procedure doornemen voor de zuivering van een mengsel van organische verbindingen.
Om de procedure te beginnen, haal het materiaal dat in de tekst wordt vermeld. Weeg een kolf met ronde bodem voor elke verbinding die moet worden geïsoleerd en noteer de massa. Weeg vervolgens het monster en los het op in het minimale volume oplosmiddel dat nodig is. Het juiste oplosmiddel moet worden bepaald met behulp van dunne-laagchromatografie. De Rf-waarde moet tussen 0,2 en 0,3 liggen. Bepaal vervolgens de hoeveelheid silicagel die nodig is voor de stationaire fase op basis van het droge gewicht van het monster en het verschil in migratieafstand van de verbindingen van belang op basis van de TLC-voorselectie. Giet de juiste hoeveelheid silicagel in een Erlenmeyer-kolf. Voeg het oplosmiddel toe aan de silicagel tot de suspensie doorschijnend is en vrij beweegt wanneer de kolf wordt geschud. Selecteer vervolgens een kolom die groot genoeg is zodat de silicagel deze voor de helft vult. Als de kolom geen glazen frit heeft, plaats dan glaswol in de kolom en druk deze stevig naar de bodem met een lange staaf. Bedek de glaswol met ongeveer 2 cm zand om te voorkomen dat silica door de glaswol passeert. In een afzuiging klemp de kolom op een ringstatief, waarbij voldoende ruimte onder het statief wordt gelaten om de testbuisjes te kunnen plaatsen.
Plaats een trechter in de kolom en zorg ervoor dat de stopkraan gesloten is. Giet de suspensie in de kolom en tik voorzichtig tegen de zijden terwijl de suspensie bezinkt om luchtbellen uit te sluiten. Spoel de trechter, de kolf en de wanden van de kolom met oplosmiddel om alle gel in de kolom over te brengen.
Plaats een Erlenmeyer-kolf onder de kolom. Open de stopkraan en laat het oplosmiddel in de kolf lopen tot het niveau net boven de silicagel ligt, en sluit vervolgens de stopkraan. Giet ongeveer 2 cm zand op het gel. Spoel voorzichtig alle zand dat aan de zijden van de kolom blijft plakken, met oplosmiddel weg. Laat het oplosmiddel weglopen zodat het zand grotendeels droog is, maar de silica volledig bedekt blijft.
Om de scheiding te starten, voegt u het monster toe aan de kolom zonder het zand te verstoren. Gebruik kleine porties oplosmiddel om eventueel aan de kolomwanden blijvend monster weg te spoelen en om de monstercontainer uit te spoelen. Laat het oplosmiddel voorzichtig weglopen tot het niveau net boven de silica ligt. Voeg vervolgens met een pipet voorzichtig 4-5 ml oplosmiddel toe zonder de zandlaag te verstoren. Plaats een trechter in de kolom en vul deze langzaam met oplosmiddel. Verwijder de kolf en vervang deze door een geëtiketteerde testbuis. Met de eerste testbuis op zijn plaats, open de stopkraan en verzamel het eluaat tot de testbuis bijna vol is.
Verzamel fracties doorgaans totdat alle gewenste verbindingen zijn elueren, door middel van de geëtiketeerd testbuisjes. Wanneer u klaar bent, sluit u de stopkraan.
Voor elke geïsoleerde verbinding, combineer de zuivere fracties in een vooraf gewogen kolf met ronde bodem. Verwijder het oplosmiddel uit de kolf op een rotatie-verdamper en weeg vervolgens de kolf met ronde bodem die de droge verbinding bevat. Voor meer informatie, zie de video van deze collectie over rotatieverdamping.
Dit monster bevatte een mengsel van tetrafenylporfyrine, of TPP, en fluorenon. De donkere rood-paarse TPP werd eerst elueren, gevolgd door het gele fluorenon. De zuiverheid van elke geïsoleerde verbinding werd bevestigd door NMR-spectroscopie.
Kolomchromatografie wordt gebruikt voor zuivering en analyse in een verscheidenheid van wetenschappelijke gebieden.
Hoged
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.