Interne normen

1. Proper Sample Handling: Making a Solution

1. Neem een schone beker en weeg de juiste hoeveelheid monster erin. Noteer de werkelijke gebruikte massa. In dit voorbeeld wordt een oplossing van adenine gemaakt in een maatkolf voor gebruik als interne standaard voor de volgende analyse. De massa van adenine is 100 mg. Weeg niet direct in een maatkolf omdat deze een lange hals heeft en het adenine niet gemakkelijk kan worden toegevoegd of verwijderd.
2. Voeg ongeveer 25 mL oplosmiddel (in dit geval dimethylsulfoxide (DMSO)) toe aan de beker en laat roeren om op te lossen. In dit voorbeeld wordt de uiteindelijke oplossing gemaakt in een 50-mL maatkolf, dus voeg ongeveer 25 mL toe zodat de beker kan worden gespoeld en de oplossing kan worden aangevuld tot het eindvolume.
3. Zodra de vaste stof is opgelost, giet de oplossing in de maatkolf.
4. Spoel de beker en de roerbaar met kleine hoeveelheden oplosmiddel, ongeveer 10 mL, en giet het spoelwater in de maatkolf. Herhaal dit nog twee keer. Dit helpt bij het zorgen voor een goede oplossingsoverdracht.

2. Voorbereiding van een interne standaard kalibratiecurve

1. Bereid de gewenste standaardmonsters voor voor gaschromatografie-analyse. In dit voorbeeld wordt cafeïne uit koffie geëxtraheerd met acetonitril en vervolgens wordt adenine gebruikt als interne standaard voor meting.
2. Voor de cafeïnemonsters, weeg de hoeveelheid monster die nodig is om een 1 mg/mL monster te maken. Als je een 10-mL maatkolf gebruikt, is dat 10 mg.
3. Weeg de analyt in een beker, voeg een paar mL oplosmiddel (hier methanol) toe om op te lossen, en breng het vervolgens kwantitatief over naar de maatkolf met behulp van 3 spoelingen.
4. Maak 3 meer standaarden op een vergelijkbare manier met 0,2, 0,5 en 2 mg/mL cafeïne.
5. Doe 1 mL van elke cafeïnestandaard in een monsterstatief.
6. Voeg 0,2 mL van 2 mg/mL adenine interne standaard toe aan elk monsterstatief.
7. Voer het gaschromatografie-experiment uit met elke cafeïnestandaard. Bereken voor elk chromatogram de verhouding van piekgebieden voor de cafeïne ten opzichte van de standaard.
8. Maak een plot van de gebiedsverhouding versus de concentratieverhouding. De helling van die plot is de responsfactor.

3. Voorbereiding van een echt monster met interne standaard voor gaschromatografie

1. Bereid het gewenste monster voor voor gaschromatografie-analyse. In dit voorbeeld wordt cafeïne uit koffie geëxtraheerd met acetrontrile.
2. Voor het koffiemonster, weeg 2 g koffie af in een 100-mL beker. Noteer het exacte gewicht van de koffie.
3. Voeg 20 mL acetonitril toe aan de beker.
4. Laat het 20 min staan, regelmatig roeren.
5. Filter de koffiegrond uit met behulp van een filterpapier in een trechter.
6. Spoel het filterpapier 3x met kleine hoeveelheden acetonitril (5 mL).
7. Meet het eindvolume van het filtraat. Het zou ongeveer 35 mL moeten zijn.

4. Voer het monster uit en bereken de concentratie

1. Neem 1 mL van het koffie-extractmonster en voeg 0,2 mL van de interne standaard toe in een flesje. Plaats het flesje in de auto-sampler-rek.
2. Voer een GC-analyse van het monster uit. Zorg ervoor dat de GC-condities ervoor zorgen dat cafeïne en adenine gescheiden worden. In dit voorbeeld worden isotherme scheidingen uitgevoerd bij 200 °C.
3. Na de analyse bereken de piekgebieden voor zowel de interne standaardpiek als de analytpiek. Gebruik hun verhoudingen om de hoeveelheid cafeïne in het monster te berekenen.

5. Resultaten: GC-analyse van cafeïne met interne standaard

1. GC-analyse van cafeïne wordt getoond in Figuur 1. Adenine wordt gebruikt als interne standaard. De verhouding van piekgebieden kan worden gemeten en geplot versus de verhouding van de concentraties. De helling van de plot is de responsfactor (in dit geval 1,8).
2. Figuur 2 toont een chromatogram van een koffiemonster met adenine interne standaard. De verhouding van het piekgebied is 1,78. Met behulp van de responsfactor en de bekende concentratie van adenine (0,33 mg/mL), wordt de concentratie van cafeïne in het onbekende monster berekend op 0,33 mg/mL.

Figuur 1. Kalibratieplot met behulp van een interne standaard. Een plot van de gebiedsverhoudingen versus concentratieverhoudingen voor 3 standaardmonsters van cafeïne (1, 0,5 en 0,2 mg/mL) met 0,33 mg/mL adenine interne standaard toegevoegd aan elk. De helling van de lijn is 1,8, wat de responsfactor is.

Figuur 2. Chromatogram van koffie met adenine interne standaard. Een plot van de respons van de FID-detector op monsters. De drie belangrijkste pieken zijn adenine (IS), cafeïne en palmiti