Ionenuitwisselingschromatografie

1. Voorbereiden van het monster en de kolom

1. In deze demonstratie wordt een mengsel van 2 eiwitten gescheiden op een kationenwisselaarkolom: hemoglobine en cytochroom C. Voeg 0,2 mL evenwichtsbuffer (pH 8,1) toe aan het eiwitmonster en vortex om grondig te mengen. Centrifugeer gedurende 2 min om eventueel schuim te verwijderen.
2. Plaats de kationenwisselaarkolom gedurende 5 min in een testbuisje om de hars te laten bezinken. Klem de testbuis met de kolom op een ringstandaard om ervoor te zorgen dat deze rechtop staat.
3. Open de bovenste dop van de kolom en vervolgens de onderste dop. Laat de buffer in de kolom onder invloed van de zwaartekracht in de testbuis druppelen.
4. Was de kolom twee keer met een kolomvolume (in dit geval is het kolomvolume 0,3 mL) evenwichtsbuffer. Laat het eerste kolomvolume (0,3 mL) evenwichtsbuffer in de afvalfles druppelen voordat u het tweede kolomvolume toevoegt. Deze stap laat de kolom evenwichtsbuffer opnemen. Voeg in deze stap de evenwichtsbuffer langzaam toe om de hars niet te verstoren.

2. Een Eiwitmonster Door een Kationenwisselaarkolom Laten Lopen

1. Plaats de kolom in een 2 mL centrifugeerbuisje gelabeld "Unbound 1". Laad voorzichtig 0,1 mL van het eiwitmonster op de bovenkant van de kolom.
2. Zodra het monster op de bovenkant van de kolom is geladen, was het met 0,3 mL evenwichtsbuffer door de buffer bovenop de kolom toe te voegen en deze volledig te laten druppelen. Herhaal deze stap 4x (voor een totaal van 5 wasbeurten) en verzamel elke was in een aparte 2-mL centrifugeerbuis. Label de buisjes als "Unbound 1-5".
3. Voor de laatste 2 wasbeurten centrifugeer gedurende 10 s bij 1.000 x g om ervoor te zorgen dat alle ongebonden soorten van de kolom komen. Elk monster dat zich aan de kolom bindt, mag niet in deze wasbeurten zitten, maar monster dat zich niet bindt, zal ongebonden worden gewassen. Centrifugeren biedt meer kracht om ongebonden materialen van de kolom te wassen.
4. Plaats de kolom in een nieuw 2-mL centrifugeerbuisje gelabeld "Bound 1". Doe 0,3 mL elutiebuffer (hoge zoutconcentratie, pH 5,5) op de kolom. Centrifugeer het resulterende eluaat gedurende 10 s bij 1.000 x g.
5. Herhaal de elutiestap nog 2 keer door de kolom in een nieuw centrifugeerbuisje te plaatsen, 0,3 mL toe te voegen en 10 s te centrifugeren. Label deze "Bound 2 en 3".
6. Noteer eventuele kleurveranderingen of waarnemingen over de fracties. Hemoglobine is een gekleurd eiwit dat er roodbruin uitziet, terwijl cytochroom C roodachtig is.

3. Resultaten: Kationenwisselaar van Hemoglobine en Cytochroom C

1. Cytochroom C heeft een pI van 10,5 en hemoglobine een pI van 6,8. Dus wanneer een evenwichtsbuffer met een pH van 8,1 wordt gebruikt, bindt hemoglobine zich niet aan de kolom omdat het negatief geladen is. Cytochroom C is bij deze pH positief geladen en bindt zich wel aan de kolom omdat de pH < pI is.
2. Hemoglobine wordt waargenomen in de ongebonden fracties omdat het zich niet aan de kolom bindt.
3. Cytochroom C wordt waargenomen in gebonden fracties, omdat het zich aan de kationenwisselaarkolom heeft gebonden.

Figuur 1. Afbeelding van ongebonden fractie (hemoglobine) en gebonden fractie (cytochroom C).