Diagnostische necropsie en weefseloogst
Bron: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universiteit van Notre Dame, IN
Veel dierexperimenten zijn afhankelijk van eind…
Alle hier beschreven dierprocedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen voor dierethiek en goedgekeurd door IACUC. Alle procedures moeten de principes van de 3R's volgen—Vervanging, Vermindering en Verfijning—en moeten worden uitgevoerd door getraind personeel.
1. Uitwendig onderzoek
Een grof uitwendig onderzoek van het lichaam, dat een visuele inspectie van het lichaam omvat op letsels en massa's, moet worden uitgevoerd als de eerste stap in een necropsie. De vacht moet worden onderzocht op gebieden met haarverlies. De tanden en nagels worden geëvalueerd op overmatige groei of slijtage. Eventuele vlekken van de vacht bij de mond, neusgaten, ogen, anale en genitale openingen moeten worden genoteerd. Tape-tests, huidskrabben en bontonderzoek moeten worden uitgevoerd om externe parasieten te detecteren (zie procedures hieronder).
- Tape-test
- De vereiste uitrusting voor een tape-test omvat handschoenen, een strook doorzichtig cellofaantap, een glazen microscoopglasplaat en een schaar.
- Handschoenen worden altijd gedragen bij het hanteren van de tape, omdat het kleefmiddel oliën en huidcellen van de vingers zal verplaatsen, waardoor bevindingen worden verduisterd of verwarring ontstaat bij het evalueren van de plaat.
- Snij een stuk tape dat iets smaller is dan de breedte, en korter dan de lengte, van de microscoopglasplaat.
- Druk de plakkerige kant van de tape voorzichtig op de anus en het omringende gebied, en verwijder deze snel.
- Gebruik het andere uiteinde van de tape en druk deze tussen de schouderbladen en verwijder deze snel.
- Breng de tape aan op de microscoopglasplaat.
- De tape-test is klaar voor microscopisch onderzoek. Parasieteneieren zijn zichtbaar bij 4X vergroting, maar moeten vervolgens worden onderzocht bij 10X vergroting om de soort correct te identificeren.
- Het is belangrijk om de plakkerige kant van de tape niet aan te raken. De tape zal vuil van de aangeklede handen verplaatsen en het lezen van de plaat moeilijk maken.
- Huidkrabben
- De huidkrabb-test wordt uitgevoerd op alle gebieden van alopecia, huidlaesies of excoriatie.
- De vereiste uitrusting voor huidkrabben is een schone glazen microscoopglasplaat, minerale olie en een metalen spatel of scalpelblad.
- Plaats een paar druppels minerale olie op de microscoopglasplaat.
- Pinch de huid in een vouw aan de rand van de laesie of het gebied van belang.
- Plaats een kleine hoeveelheid minerale olie op de huid.
- Plaats de rand van de spatel of het scalpelblad op de huid en krab tegen de richting van de haargroei in.
- Blijf krabben totdat een kleine hoeveelheid roodheid zichtbaar is op de huid.
- Plaats het haar en weefsel dat van het huidoppervlak is geschraapt in de olie op de microscoopglasplaat. Indien nodig, verspreid het materiaal zodat het gelijkmatig in de olie wordt verdeeld.
- De plaat is nu klaar om onder de microscoop te worden onderzocht. Indien gewenst kan een dekglas worden aangebracht op de oliedruppel op de plaat. Onderzoek de plaat bij 4X en 10X vergroting.
- Bontonderzoek
- Het bontonderzoek is het laatste uitwendige onderzoek dat wordt uitgevoerd; het wordt echter daadwerkelijk uitgevoerd nadat het interne onderzoek is voltooid.
- Het dier wordt in een glazen of plastic Petri-schaal geplaatst nadat alle interne orgaanmonsters zijn verzameld.
- De schaal wordt 15 minuten in de koelkast geplaatst.
- Na 15 minuten wordt de schaal onder een dissectiemicroscoop geplaatst en wordt het bont onderzocht op externe parasieten. De meeste vlooien zullen zich naar de uiteinden van de haren verplaatsen en zijn gemakkelijk te observeren.
2. Intern grof onderzoek van de buikholte
- Excisie van de huid
- Een kleine snede wordt gemaakt net voor de bekkenholte bij vrouwtjes en boven het voorhuid bij mannetjes.
- De huidschelp wordt uitgebreid tot aan de kin.
- Bloedloze dissectie wordt gebruikt om de huid los te maken van de fascia en spier.
- Transversale sneden worden gemaakt voor de achterpoten en achter de voorpoten. Er moet op worden gelet dat de bloedvaten in het okselgebied niet worden doorgesneden.
- Gebruik bloedloze dissectie om het cervicale gebied en de borst te onthullen. Extra zorg moet worden besteed aan het voorkomen van scheuring van de halsslagader en halsslagader in de nek.
- Borstklieren
- Bij vrouwtjes wordt het borstweefsel onderzocht op massa's, verkleuring of afwijkingen.
- Lacterende of zwangere vrouwtjes zullen een verhoogd volume aan borstweefsel hebben, en melk kan aanwezig zijn.
- Borstweefsel wordt gevonden vanaf de bovenkant van het borstbeen bij het manubrium tot aan de genitale opening op het ventrale oppervlak, en strekt zich lateraal uit tot aan beide zijden tot bijna aanraking op het dorsale oppervlak bij de heupen en schouders.
- Excisie van de borstklieren vereist het grijpen van de rand van de klier met duimtang en het gebruik van bloedloze dissectie om de aanhechtingen aan de huid los te maken. Nadat de klier van de huid is gescheiden, kunnen irisscharen worden gebruikt om eventuele resterende aanhechtingen door te snijden voordat de klier in een fixeervloeistof wordt geplaatst.
- Subcutane
Nekropsie en weefseloogst zijn essentiële technieken die worden gebruikt in laboratoriumexperimenten om postmortem weefsels te verzamelen en analyseren.
Deze video schetst dissectie- en extractiemethoden voor abdominale, reproductieve en thoracale organen van knaagdieren.
Nekropsie wordt gebruikt wanneer NAM's, zoals organ-on-a-chip systemen, organoïdes en in silico-modellen, geen effecten op het hele lichaam kunnen vastleggen, zoals metastase, langdurige toxiciteit of oorzaken van onverwachte dood.
Documenteer eerst een volledige geschiedenis van het dier, inclusief zijn identificatienummer, geslacht, huisvestingsomstandigheden, geboortedatum, sterfdatum, studie-/protocolnummer en de naam van de hoofdonderzoeker.
Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming. Bereid vervolgens het dissectiegebied voor door een lade te rangschikken met essentiële instrumenten, waaronder schaar, pincetten, een scalpel, bottenknippers, een stompe sonde, een spatel en hechtmateriaal.
Voor histologisch onderzoek moeten verzamelde weefsels worden bewaard in een geschikte fixeervloeistof.
Tenzij anders gespecificeerd, is de meest gebruikte fixeervloeistof 10% neutraal gebufferd formaline. Merk op dat de weefselmonsters ongeveer 0,5-1 cm dik moeten zijn om voldoende penetratie van de fixeervloeistof mogelijk te maken. Formaline moet worden behandeld in een goed geventileerde ruimte, zoals onder geschikte afzuigsystemen, om de veiligheid van de operator te garanderen.
Fixatie voorkomt verval, autolyse en putrefactie; stopt alle lopende biochemische reacties; en kan de mechanische sterkte en stabiliteit van de behandelde weefsels verhogen.
Voorafgaand aan de necropsie moet het dier worden geëuthanaseerd. Merk op dat euthanasie moet worden uitgevoerd op vooraf gedefinieerde humane eindpunten, zoals significant gewichtsverlies, verminderde mobiliteit of ernstige klinische symptomen, om pijn en stress te minimaliseren in overeenstemming met goedgekeurde protocollen.
De methode van euthanasie kan van invloed zijn op de kwaliteit van de monsters. Koolstofdioxide wordt vaak gebruikt, met geleidelijke verdringing om stress te minimaliseren.
Dit zorgt ervoor dat de dieren bewusteloos worden vóór de perceptie van pijn geassocieerd met activering van nociceptoren door koolzuur. De stroom wordt onderhouden totdat respiratoire arrest optreedt, aangegeven door het volledige ontbreken van zichtbare borstbeweging.
Bevestig de dood door de afwezigheid van reflexen zoals de pedaalintrekkingsreflex.
Pas vervolgens een secundaire methode toe, zoals cervicale dislocatie of bilaterale thoracotomie, en bevestig de dood door ervoor te zorgen dat er geen ademhaling en geen hartslag is.
Plaats vervolgens een geëuthanaseerd dier op het dissectieoppervlak voor onderzoek.
Voer een initieel extern onderzoek uit door de karkas visueel te inspecteren op laesies en massa's, overmatige tandgroei of enige verkleuring van de vacht bij de mond, neusgaten, oren, ogen en de anale en genitale openingen, aangezien deze onderliggende ziekte, infectie of abnormale fysiologische omstandigheden kunnen aangeven.
Voer indien nodig een tapetest, een huidkrabbing en een vachtonderzoek uit om externe parasieten te detecteren, die ziekte kunnen veroorzaken of de studieresultaten kunnen beïnvloeden.
Zodra het externe onderzoek is voltooid, plaats het geëuthanaseerd dier in een rugligging en stabiliseer het lichaam tijdens de dissectie met behulp van pinnen.
Als aseptische weefselverzameling vereist is, voer alle dissectie en weefselverwerking uit binnen een bioveiligheidskabinet of geschikte kap om de steriliteit te behouden.
Om de huid te verwijderen, maak een kleine snede net voor het bekken bij vrouwtjes en boven het voorhuid bij mannetjes. Gebruik vervolgens met stompe dissectie de huid los te maken van de fascia en spier.
Stomp dissectief is een techniek in anatomische dissectie waarbij weefsels worden gescheiden en onderliggende structuren worden blootgelegd zonder te snijden. In deze techniek worden de schaar gebruikt om weefsels te spreiden in plaats van ze te snijden.
De gesloten uiteinden worden in het weefsel geduwd en vervolgens geopend om het weefsel langs natuurlijke vlakken te splitsen. Dit proces vereist geduld en een delicate aanraking, aangezien het strekken van het weefsel naburige organen en bloedvaten kan beschadigen. Verleng vervolgens de snede tot aan de kin.
Maak vervolgens dwarssneden voor de achterpoten en achter de voorpoten en gebruik stompe dissectie om het cervicale gebied en de borstkas bloot te leggen. Wees extra voorzichtig om ruptuur van de jugulaire en carotidale bloedvaten in de nek te voorkomen.
Merk op dat het belangrijk is om het orgaan in situ te observeren voordat u weefselmonsters verwijdert om eventuele abnormale vochtophopingen of verplaatsingen te identificeren.
Bij vrouwtjes, met de huid verwijderd, observeer het borstweefsel vanaf de bovenkant van het borstbeen bij het manubrium tot de genitale opening op de ventrale oppervlakte, zich lateraal uitstrekkend aan beide kanten.
Lacterende of zwangere vrouwtjes zullen een verhoogd volume aan borstweefsel hebben en melk kan aanwezig zijn. Om de borstklieren te verwijderen, grijpt u de weefseldop met pincetten en gebruikt u stompe dissectie om de hechtingen aan de huid los te maken. Zodra de klier is gescheiden, kan deze in een fixeervloeistof worden geplaatst voor latere histologische analyse.
In dit stadium kunt u submandibulaire speekselklieren observeren, die gepaard zijn en zich aan de onderkaak bevinden, zich uitstrekkend langs de nek tot het manubrium sternum.
Verwijdering van deze klieren vereist stompe dissectie en extra zorg bij het werken in het cervicale gebied om ruptuur van bloedvaten te voorkomen. Eenmaal bevrijd van de onderliggende spieren, til de klieren op en doorknipt u eventuele resterende hechtingen. De klieren kunnen minstens één snede vereisen om de fixeervloeistof te laten penetreren, vooral bij grotere exemplaren zoals die van ratten.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is necropsy necessary when alternative research methods are available?
Necropsy is essential when new approach methodologies like organ-on-chip systems, organoids, and in silico models cannot capture whole-body effects such as metastasis, long-term toxicity, or causes of unexpected death. These alternatives lack the complexity to replicate systemic interactions, making necropsy critical for comprehensive postmortem analysis and understanding disease progression in living organisms.
Q2: What is the purpose of using 10% neutral buffered formalin in tissue preservation?
Neutral buffered formalin is the standard fixative used to preserve collected tissues for histological examination. It prevents tissue decay, autolysis, and putrefaction while stopping ongoing biochemical reactions and increasing mechanical strength and stability. Proper fixation is critical because tissue samples must be approximately 0.5-1 cm thick to allow sufficient penetration of the fixative solution.
Q3: How does the euthanasia method impact tissue quality in necropsy procedures?
The euthanasia method significantly affects sample quality. Carbon dioxide is commonly used because it causes animals to lose consciousness before pain perception, minimizing distress. However, CO2 euthanasia can cause fluid accumulation in lungs and trachea, appearing as frothy clear fluid, and may result in pulmonary hemorrhages visible as dark red splotches on lung surfaces, affecting histological interpretation.
Q4: What is blunt dissection and why is it important during necropsy?
Blunt dissection is a technique where scissors are used to spread tissues rather than cut them, with closed tips pushed into tissue and then opened to split along natural planes. This method requires patience and a delicate touch because it separates structures without cutting, preventing damage to adjacent organs and blood vessels that could compromise sample integrity and obscure pathological findings.
Q5: What organs should be examined in the abdominal cavity during necropsy?
Key abdominal organs include the spleen, stomach, small intestines (duodenum, jejunum, ileum), large intestine, cecum, pancreas, kidneys, and liver. Each organ requires careful observation for abnormalities in size, color, texture, or contents. The mesentery anchoring intestines should be examined for enlarged lymph nodes and masses. Changes in these organs may indicate inflammation, obstruction, infection, or other pathology affecting study results.
Q6: How are reproductive organs harvested differently in male and female rodents?
In females, the Y-shaped uterus with extending horns and ovaries located below kidneys are removed by cutting arterial attachments and the fallopian tube. In males, the seminal vesicles, prostate gland, and testes are harvested by grasping abdominal fat pads to expose testes, then cutting scrotal attachments and the vas deferens. Both require careful examination for changes in size, symmetry, color, or texture indicating disease.
Q7: What special technique is required when removing and preserving lungs during necropsy?
After lung excision, a loose ligature is placed around the trachea. A needle attached to a syringe containing fixative is threaded into the trachea lumen, the ligature is tightened, and fixative is slowly injected until lungs are gently inflated without overdistension. This crucial step prevents alveolar collapse and allows accurate histological assessment of lung tissue structure and pathology.