Single Molecule methoden voor monitoring van veranderingen in bilaag elastische eigenschappen

Hallo, ik ben Dr. Ola Anderson van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan het Weill Cornell Medical College in New York City. Mijn naam is Olson. Ik ben een student computationele biomedicus in het laboratorium van Olive Anderson.

En ik ben Shail Collingwood, ook onderzoekstechnicus in het Anderson-lab. Vandaag laten we u zien hoe u een vlakke biolayer vormt, hoe u een klein membraan isoleert met behulp van de Biolayer Punch-elektrode, hoe u single-channel-activiteit registreert en hoe u de resultaten analyseert om zo Gramicidine-kanalen te gebruiken als probes voor de eigenschappen van de lipide-dubbellaag. In een eerdere video hebben we u laten zien hoe u zich kunt voorbereiden op deze experimenten.

We hebben laten zien hoe u de kamer voorbereidt die wij hebben gebruikt, en we hebben laten zien hoe u de Bilayer-stans elektrode voorbereidt die wij gebruiken om de kleine membraanlaag te isoleren waar we de kanaalactiviteit registreren. Laten we nu enkele bilayers stansen. Om de voorbereiding voor bilayer-experimenten te starten, voegt u 2,5 ml van de temperatuur-geëquilibreerde elektrolytoplossing toe aan elk compartiment van de vooraf geverfde kamer. De oplossing die we gewoonlijk gebruiken, is 1 M natriumchloride plus 10 mM.

Buffer het stuk naar pH zeven, stel de microscoop en de lichtbron zo in dat het gat in het Teflon gecentreerd in uw gezichtsveld staat en helder wordt verlicht. Plaats de glazen micropipet in een micro-elektrodehouder. Verbind een spuit met de houder met een stuk Tygon-slang.

Vul de pipet in de elektrodehouder door middel van zuiging. Voorkom zorgvuldig de vorming van bellen, aangezien deze de elektrische verbinding tussen het zilverpellet in de elektrodehouder en de pipetpunt kunnen onderbreken. Breng een kleine hoeveelheid vaseline aan op de schroef en plaats deze vervolgens in de micro-elektrodehouder.

De vaseline helpt bij het creëren van een luchtdichte afsluiting. Steek de elektrodehouder in de patchclamp-headstage in de Faraday-kooi. Positioneer de micropipetpunt gecentreerd en direct achter het gat in de Teflon-scheidingswand.

Plaats de opgerolde zilverelektrode in de voorste kamer. Fixeer deze met boetseerklei en sluit hem aan op het spanningsregelcircuit. Balanceer tot slot de elektroden.

Dit is cruciaal omdat de twee elektroden, de elektrode aan de voorzijde en die in de micro-elektrodehouder, mogelijk licht verschillende halfcelepotentialen hebben. De halfcelepotentiaal is het verschil tussen het zilvermetaal en de elektrode en de elektrolytoplossing direct naast de zilverchloridecoating. Balanceer de elektroden door de handmatige offset aan te passen, zodat de stroom die tussen de twee compartimenten vloeit op de patchclamp schommelt tussen negatief 200 en positief 200 picoamps.

Het offsetpotentiaal zal in de loop van de tijd veranderen, dus u balanceert de elektroden met regelmatige tussenpozen gedurende het experiment om de lipide dubbellaagsmembraan te vormen. Reinig een vuurgepolijste glaspipet met fch-oplossing zoals beschreven in de bijbehorende video. Dip de gereinigde pipet in de lipidendekoplossing en laat deze ongeveer één millimeter in de pipet stijgen.

Plaats de pipetpunt net voor het gat in de Teflon-scheidingswand en breng voorzichtig een druppel van de lipide-oplossing aan op het gat. Bij een geslaagde poging vormt zich een felgekleurde lipidebel over het gat, waarbij een torus- of donutvorm van lipiden deze met de Teflon-scheidingswand verbindt. Laat het membraan dunner worden, wat kan worden gefaciliteerd door een potentiaal van 100 tot 200 millivolt over het membraan aan te leggen.

Plaats de glazen micropipetpunt in de Taurus en laat deze enkele minuten rusten voor een betere afdichting tussen de pipet en de dubbellaag. Op dit punt bent u klaar om een membraanpatch te isoleren met een glazen micropipet. Doseer nu de membraan met gramine.

Deze gramin-oplossing werd bereid vanuit een voorraadoplossing van 1 µM, die werd verdund tot 1 tot 10 nM. In dimethylsulfoxide wordt gewoonlijk 1 tot 10 µL van de verdunning aan elke zijde van het membraan toegevoegd, zodat de uiteindelijke concentratie in het picaMolaire bereik ligt. Gebruik de magnetische roerstaafjes om de oplossing ongeveer twee minuten te roeren en wacht nog eens 10 minuten voordat er een nieuw klein membraan wordt gevormd om de single-channel activiteit te registreren.

Deze wachttijd maakt het mogelijk dat gramicidine in het membraan wordt ingebouwd. Controleer de kanaalactiviteit door spanning aan te leggen. Over het algemeen streven we naar ongeveer één kanaalgebeurtenis per seconde.

De kanalen zijn zichtbaar als discrete stijgingen en dalingen in de membraanstroom. U kunt nu beginnen met het eigenlijke experiment. Neem eerst de controlesporen van de stroom op.

Balanceer de elektrode zoals eerder gedemonstreerd en vorm een klein membraan of patch zoals beschreven in de bijbehorende video. Breng een positieve spanning van 200 millivolt aan en registreer de single-channel activiteit. U dient 100 tot 200 single-channel stroomovergangen te verzamelen.

Herhaal deze stap met -200 millivolt. Verbreek de patch door elektrolyt via de pipetpunt uit te stoten. Gebruik de nylon schroef om de elektroden opnieuw in balans te brengen, trek de pipet terug naar de achterkamer, blaas overtollige lipiden weg en vorm een nieuwe patch.

U kunt deze stappen ook herhalen om opnames bij andere potentialen uit te voeren. U bent nu klaar om de experimentele stroomsporen op te nemen bij de modifier van de dubbellaag. In dit geval wordt het antidepressivum fluoxetine aan beide zijden van het membraan toegevoegd.

De fluoxetine-stamonlossing moet worden verdund tot 25 millimolar in DMSO. Voeg vijf microliters van deze oplossing toe om een concentratie van 50 micromolar in de kamer te bereiken. DMSO kan de eigenschappen van de dubbellaag beïnvloeden. Daarom is het belangrijk om de hoeveelheid DMSO in de oplossing te beperken tot 25 microliters 1% of 150 millimolar.

Roer vijf minuten en wacht 10 minuten zodat de modifier kan equilibreren tussen de waterige oplossing en het membraan. Registreer vervolgens de kanaalactiviteit in aanwezigheid van de modifier, zoals eerder beschreven. Herhaal deze stappen om de kanaalactiviteit bij toenemende concentraties van de modifier te registreren.

We leren veel over veranderingen in de dubbellaag door de levensduur en verschijningssnelheid van kanalen te kwantificeren. Om een dergelijke analyse uit te voeren, moeten we de vorming en het verdwijnen van kanalen detecteren. Hiervoor gebruiken we een algoritme op basis van overgangen, waarbij de computer de eerste afgeleide berekent om snelle veranderingen in de stroom vast te stellen en deze markeert als kanaalgebeurtenissen.

De gebeurtenissen worden opgeslagen als een tijdserie om ons te helpen de kanaallevensduren vóór en na de transitie te bepalen. Ook de stroomniveaus worden opgeslagen, wat ons helpt de kanaalamplitudes te bepalen terwijl het experiment vordert. De computer stelt een histogram van de stroomtransitie-amplitude op, waardoor u de acquisitie van stroomtransities kunt volgen.

Het stelt u daarnaast in staat om de kwaliteit van het experiment te evalueren. Als de huidige transitieamplitudes sterk uiteenlopen, zijn er problemen. Als het histogram compact is, verloopt het proces goed.

Wanneer u meer dan 200 transitiegebeurtenissen heeft verzameld, berekent u de gemiddelde stroom en standaarddeviatie voor de transities in de hoofdpiek. U kunt de verschijningssnelheid van het kanaal eenvoudig schatten door het aantal transities in het huidige histogram van de transitieamplitude te delen door de observatietijd. Vergeet niet ook door twee te delen, omdat een kanaal twee keer in het histogram wordt geteld: eenmaal wanneer het verschijnt en eenmaal wanneer het verdwijnt.

Analyseer de tijdreeks van transitiegebeurtenissen om de levensduurverdelingen van de kanalen te verkrijgen. Het bepalen van de levensduur is eenvoudig bij stroomsporen waarin op geen enkel moment meer dan één geleidend kanaal aanwezig is. In dat geval detecteert de computer of elke transitie een verschijning of verdwijning van een kanaal is, waarbij een verdwijningsgebeurtenis alleen kan toebehoren aan de voorafgaande verschijningsgebeurtenis.

De tijd tussen de twee overgangen is de kanaallevensduur. In gevallen waarin de kanaalovergangen te dicht bij elkaar plaatsvinden om onderscheiden te worden, moeten verschijningen en verdwijningen handmatig worden toegewezen. De toewijzing is complexer wanneer er twee of meer gelijktijdig geleidende kanalen aanwezig zijn, omdat u nu niet weet welke verdwijning van een kanaal bij welke verschijning van een kanaal hoort.

Om deze reden is het wenselijk om een lage kanaalactiviteit te hebben. Het toewijzingsprobleem kan worden opgelost door een willekeurige getalgenerator te gebruiken om verschijningen aan verdwijningen te koppelen. Zo verkrijgt u een reeks kanaallevensduuren.

Dit wordt omgezet in een levensduurhistogram, dat op zijn beurt wordt omgezet in een overlevingsplot. Bepaal de gemiddelde levensduur door een enkelvoudige exponentiële verdeling op de overlevingsplot te fitten met behulp van niet-lineaire kleinste-kwadratenmethode curve fitting en experimenten waarbij het grote membraan niet breekt. Wanneer de bilayer-modifier wordt toegevoegd, kan men het effect op de verschijningssnelheden van de kanalen vergelijken. Een dergelijke vergelijking is niet gerechtvaardigd als het grote membraan breekt; de functie van membraaneiwitten wordt gereguleerd door de lipidensamenstelling van het celmembraan.

Deze regulatie is het gevolg van een combinatie van specifieke lipide-eiwitinteracties en meer algemene interacties tussen de lipide dubbellaag en de membraaneiwitten. Deze interacties zijn bijzonder belangrijk in farmaceutisch onderzoek. Aangezien veel huidige farmaceutica op de markt amfifiel zijn, kunnen zij de eigenschappen van de lipide dubbellaag veranderen, wat op zijn beurt kan leiden tot een gewijzigde functie van membraaneiwitten.

Gramine-kanalen kunnen worden gebruikt als moleculaire krachttransducers om aan te tonen of amfifielen de eigenschappen van lipide dubbellagen kunnen veranderen. Het uitzetten van de veranderingen in levensduur en verschijningssnelheid als functie van de concentratie van de modifier geeft inzicht in veranderingen in de eigenschappen van de dubbellaag.

Een verhoogde frequentie betekent dat de dubbellaag gemakkelijker vervormt om de Gram-plaats en dimerisatie te accommoderen. Een verhoogde levensduur betekent dat de vervorming van de dubbellaag die gepaard gaat met kanaalvorming energetisch minder kostbaar is. Een modifier kan de frequentie en levensduur verhogen door de elasticiteit van het membraan te vergroten of de kromming te beïnvloeden.

We hebben nu aangetoond hoe chromo-kanalen kunnen worden gebruikt om te controleren of kleine moleculen de elastische eigenschappen van de dubbellaag beïnvloeden. Dat was alles. Bedankt voor het kijken.

Veel succes met uw experimenten.