Name: Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer de voorbereiding van planaire lipidebilaagjes voor elektrofysiologische experimenten met ionkanalen. Dit protocol toont stapsgewijs hoe u de kamer en elektroden correct instelt voor betrouwbare metingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ga naar <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">Springer Protocols</a> voor meer informatie over het voorbereiden van kunstmatige dubbellagen en het gebruik van gramicidine kanalen voor het sonderen van membraan elasticiteit.

De auteurs hebben niets te melden.

voorbereiding van de kunstmatige dubbellagen voor elektrofysiologie experimenten

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipidendubbellagen, ook wel kunstmatige lipidendubbellagen, kunt u om te studeren ionengeleidende kanalen in een goed gedefinieerde omgeving. Deze bilagen kunnen worden gebruikt voor veel verschillende studies, zoals de karakterisering van membraan-actieve peptiden, de reconstructie van ionkanalen of onderzoek over hoe veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen te veranderen van de functie van bilaag-spanning kanalen. Hier laten we zien hoe een vlakke bilaag vormen en hoe je kleine stukjes te isoleren van de bilaag, en in een tweede video zal een procedure ook laten zien voor het gebruik van gramicidine kanalen op veranderingen in de lipide bilaag elastische eigenschappen te bepalen. We tonen ook aan de individuele stappen die nodig zijn om de bilaag kamer voor te bereiden, de elektroden en hoe om te testen dat de bilaag is geschikt voor single-channel metingen.

Planar lipidendubbellagen, ook wel kunstmatige lipidendubbellagen, kunt u om te studeren ionengeleidende kanalen in een goed gedefinieerde omgeving. Hier tonen we de individuele stappen die nodig zijn om de bilaag kamer voor te bereiden, de elektroden en hoe om te testen dat de bilaag is geschikt voor single-channel metingen.

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

Planaire lipide dubbellagen, ook wel kunstmatige lipide dubbellagen genoemd, maken het mogelijk om iongeleidende kanalen in een nauwkeurig gedefinieerde omgeving te bestuderen. Deze dubbellagen kunnen ...

Hallo, ik ben Dr. Olaf Anderson van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan het Weill Cornell Medical College in New York City. Hallo, ik ben Ruchi Kaur, een MD PhD-student in het laboratorium van Dr. Olaf Anderson. Hallo, mijn naam is John Kim.Ik ben een onderzoekstechnicus. Vandaag laten we u zien hoe u zich voorbereidt op single-channel experimenten in zuivere lipide dubbellagen. We laten u zien hoe u de kamer voorbereidt en hoe u de Bilayer Punch-elektroden klaarmaakt.We hebben kleine gebieden van het membraan geïsoleerd waar we de metingen uitvoeren. Laten we beginnen. Onze elektrofysiologische opstelling bestaat uit het volgende: een luchtdraagbare antivibratietafel om mechanische trillingen te minimaliseren, een kooi van Faraday om elektrische ruis, geluid en trillingen af te schermen, en een statief.Voor de dubbellaagse kamer gebruiken we een circulerende watermantel voor temperatuurregeling waarin de dubbellaagse kamer is geplaatst en een micromanipulator om de headstage van de patchclamp-versterker te monteren. Een elektronische filtereenheid wordt gebruikt om de output van de patchclamp-versterker verder te filteren op 500 hertz. Om de stroomtransities te visualiseren, wordt een oscilloscoop gebruikt voor het weergeven van het stroomsignaal, zowel de output van de patchclamp-versterker als die van het elektronische filter.Ten slotte heeft u een computer nodig met een gegevensacquisitiesysteem dat het patchclamp-signaal digitaliseert. Bij 20 kilohertz maken wij gebruik van intern ontwikkelde software voor gegevensregistratie en -analyse. Alle apparatuur wordt 20 minuten voor aanvang ingeschakeld.Vervolgens bereiden we de kamer voor waarin de experimenten worden uitgevoerd. De kamer is via een septum in twee helften verdeeld; dit septum is gemaakt van een dun Teflon-vel, ongeveer 100 micron dik, en is gevuld met een elektrolytoplossing. We vormen de dubbellaag over het gat in het septum, wat zorgt voor de verbinding tussen de elektrolytoplossingen.Het gat moet een diameter van 1 tot 1,5 millimeter hebben. Breng met vaseline als afdichtingsmiddel een glazen venster aan in de voorste helft van de Teflonkamer. Draai roestvrijstalen schroeven door één metalen beugel en de vier gaten in de achterste helft van de kamer. Plaats met vaseline als afdichtingsmiddel een cirkelvormige Teflon-tussenschot zodanig dat het tussen de twee helften van de geassembleerde kamer wordt geklemd.Zorg ervoor dat het gat in de scheidingswand gecentreerd is. Breng vaseline aan op beide zijden van de scheidingswand om te garanderen dat de elektrolytcompartimenten waterdicht en elektrisch geïsoleerd zijn. Draai de schroeven vervolgens door het voorste gedeelte van de kamer en de voorste metalen steun.Draai de montage aan om er zeker van te zijn dat alle componenten stevig op hun plaats worden gehouden, maar niet te strak, zodat de kamer kan worden gereinigd en de vaseline kan worden verwijderd. Een pasteurpipet is gevlamd, gepolijst en in een rechte hoek gebogen. Het vlammen en polijsten van de pipet tot een gladde punt helpt om krassen in het glas of Teflon te voorkomen.Reinig vervolgens de kamer met een mengsel van chloroform en methanol in een verhouding van twee op één of een fch-oplossing. Gebruik de pipet om de overtollige vaseline met de fch-oplossing te verwijderen, zonder deze over het Teflon en glas uit te smeren. Gebruik minstens 10 volumes fch.Zodra dit is voltooid, worden magnetische roerknoppen aan de kamers toegevoegd. Reinig de kamer vervolgens met 95% ethanol. En tot slot met water van hoge zuiverheid, zoals gedestilleerd water, UE-water of een equivalent daarvan.Zoals voorheen gebruikt u een vuurgepolijste pipet om de vloeistof op te zuigen. Herhaal vervolgens de reiniging met ethanol en water. Daarna volgt water, ethanol en fol.Nu maken we de glazen elektrode-micropipet, die zal dienen als de elektrische verbinding met het achtercompartiment van de kamer. Met een P 97 flaming brown micropipet-puller van Sutter Instruments hebben we de glazen capillair getrokken om twee micropipetten te maken die elk een scherpe en korte taps toelopen. We gebruiken capillaren van borosilicaatglas met een buitendiameter van 0,8 millimeter en een binnendiameter van 0,5 millimeter. Een glazen capillair wordt in de puller geplaatst en vastgezet ter voorbereiding op het intrekken van de filament.De pool moet van platina worden gemaakt, aangezien we geen succes hebben gehad met het trekken van pipetten in elektrodepolen met wolfraamfilamenten; de volgende stappen worden uitgevoerd in een microforge met een platinafilament. Voordat u de microforge gebruikt, moet u er zeker van zijn dat het filament goed met glas is gecoat.U kunt gebruikmaken van zacht sodakalkglas of hard borosilicaatglas. U dient de warmte van uw microforge zodanig af te stellen dat het glas soepel vloeit en de filament gelijkmatig met een dunne laag bedekt. Monteer nu de micropipet in de microforge en breek de tip af.Dit doen we door de glazen coating van de filament voorzichtig te verzachten bij een relatief lage temperatuur. Beweeg vervolgens de tip van de micropipet voorzichtig naar de glazen coating op de filament zodat ze aan elkaar smelten; schakel daarna de verhitting van de filament uit, waardoor deze terugtrekt en de pipet breekt. Nu houden we een scherpe en gelijkmatige opening over van ongeveer 30 micron in diameter.Maak opnieuw met de micro-smeedoven een knik van 90 graden in de micropipet op drie tot vier millimeter van de punt, plaats de pipet enkele honderden microns boven de filament en schakel vervolgens de verwarming in zodat de filament roodgloeiend wordt. De filament zal bewegen door thermische uitzetting. Laat de pipet vervolgens voorzichtig op de filament zakken, waardoor de filament zal buigen.U regelt de mate van buiging door de warmte van de filament. Wanneer de buiging ongeveer 80 graden bedraagt, beweegt u de pipette snel omhoog en naar voren. Dit vereist enige coördinatie.U wilt een knik van 90 graden verkrijgen met behulp van dezelfde instellingen. Vlampolijst de micropipetpunt en zorg dat het filament met glas bedekt blijft. Vervolgens hebben we de pipetpunt gesilaniseerd met een 10%-oplossing van trioctylsilaan in benzeen.Dit maakt het pipetoppervlak hydrofoob, zodat het goed interacteert met het membraan. Laat de oplossing door capillaire werking enkele millimeters in het pipet stijgen. Laat dit verdampen met de micro forge op lage temperatuur en dan bent u klaar.Nu laten we u zien hoe u de zilverelektrode voorbereidt. Neem een stuk zilverdraad van vijf centimeter met een diameter van ongeveer één millimeter. Rol dit drie tot vier keer op tot een spoel met een binnendiameter van twee tot drie millimeter.Laat de rest als een staart over die zo wordt gebogen dat deze in een rechte hoek op de helix staat. Bedek de staart en de aangrenzende vijf tot 10 millimeter van de zilverdraad met gesmolten zilverchloride. Bereid nu de oplossing voor de vorming van de dubbellaag.In ons geval is het lipide dial phosphatidylcholine in decaan. Het lipide wordt bewaard in glazen buisjes bij -40 °C als aliquoten van 150 µL lipide en chloroform. Neem een glazen buisje uit de vriezer, laat het op kamertemperatuur komen en laat het chloroform verdampen onder een stroom droge stikstof.Voeg in een zuurkast 50 µL end decaan toe en vortex. Om een goed contact te verkrijgen tussen de bilayer-vormende oplossing en het Teflon rondom het gat waarover we de bilayer vormen, schilderen we de Teflon-scheidingswand rond het gat opnieuw. Reinig eerst een vuurgepolijste Pasteur-pipet met fch.Dompel de gereinigde pipet vervolgens in 2,5% fosfolipiden in n-decaan, waarbij het lipide ongeveer één millimeter in de pipet omhoog mag stijgen. Breng een druppel lipide aan als film over het gat in de Teflon-scheidingswand. Laat het lipide ongeveer 10 tot 15 minuten drogen en herhaal dit. Hallo.Vandaag hebben we u laten zien hoe u lipide dubbellagen voor enkelkanaal-experimenten kunt voorbereiden. In de bijbehorende video laten we u zien hoe u kleine stukjes membraan kunt isoleren, hoe u enkelkanaalactiviteit kunt registreren, hoe u de activiteit met kleine moleculen kunt beïnvloeden en hoe u de resultaten kunt analyseren. Dat is alles.Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ondersteund vlakke bilagen zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om de moleculaire interacties in een immunologische synaps model. Hier tonen we methoden voor het verankeren van celadhesie eiwitten waarvan bekend is dat moduleren synapsvorming naar de bovenste folder van de lipide bilyer en synapsvorming met behulp van TIRF microscopie visualiseren.

Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

Membraaneiwit functie wordt geregeld door de celmembraan lipide samenstelling. Deze video-artikel wordt beschreven hoe u een patch met bilaag pleister elektroden, evenals het gebruik van gramicidine kanalen als verslaggevers van veranderde membraan eigenschappen te vormen.

Single Molecule methoden voor monitoring van veranderingen in bilaag elastische eigenschappen

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.

Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Zacht, low-power, biomoleculaire memristors hefboomwerking dezelfde samenstelling, structuur en omschakeling van de mechanismen van de bio-synapsen. Hier gepresenteerd is een protocol te monteren en karakteriseren van biomoleculaire memristors verkregen isolerende lipide bilayers gevormd tussen waterdruppeltjes in olie. De opneming van spanning-geactiveerde alamethicin peptiden resultaten in de Ionische huidgeleiding memristive over het membraan.

Vergadering en karakterisering van biomoleculaire Memristors bestaande uit ionkanaal-doped lipide membranen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een feedback temperatuurgestuurd verwarmingssysteem om lipide monolayer assemblage en druppel interface bilayer vorming voor lipiden met verhoogde smelttemperaturen te bevorderen, en capaciteitsmetingen om temperatuurgestuurde veranderingen in het membraan te karakteriseren.

Temperatuurgecontroleerde montage en karakterisering van een druppelinterface-bilayer

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Leer de voorbereiding van planaire lipidebilaagjes voor elektrofysiologische experimenten met ionkanalen. Dit protocol toont stapsgewijs hoe u de kamer en elektroden correct instelt voor betrouwbare metingen.

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

Meer video's verkennen