Stroomcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS): Isolatie van splenische B-lymfocyten

1. Voorbereiding

1. Voordat u begint, trekk uw laboratoriumhandschoenen en de juiste beschermende kleding aan.
2. Steriliseer alle dissectiegereedschappen, eerst met een detergent en vervolgens met 70% ethanol en droog vervolgens grondig.
3. Bereid 50mL van Hank's balanced salt solution (HBSS) bereid met 2% foetaal runderserum (FCS).

2. Dissectie

1. Gebruik een koolstofdioxide-afleversysteem om de muis te euthanaseren door middel van hypoxie. Zet de geëuthaniseerde muis op een dissectieplaat in rugligging en voer een longitudinale laparotomie uit met behulp van een schaar en pincetten.
2. Gebruik pincetten om de darmen en de maag aan de rechterkant van de buik te verplaatsen om de maag en de milt bloot te leggen. De milt is aan de maag bevestigd.
3. Gebruik pincetten om de milt voorzichtig los te maken van de maag en plaats deze in de petrischaal met 5mL van HBSS 2% FCS.

3. Immuuncelisolatie

1. Plaats de milt in een 40µm celstrainer over dezelfde petrischaal. Verpletter de milt met een plunjer om het in dezelfde schaal te dissociëren.
2. Breng de gedissocieerde milt en de vloeistof over in een 15mL centrifugebuis.
3. Centrifugeer de buis gedurende 7 min bij 370 x g bij 10°C en gooi het supernatant weg, vermijd het pellet.
4. Suspendeer het pellet opnieuw in 2mL kaliumacetaat om de erytrocyten te lyseren. Wacht 2 min en breng vervolgens het volume op tot 15mL met HBSS 2% FCS.
5. Centrifugeer de buis opnieuw gedurende 7 min bij 370 x g bij 10°C. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pellet opnieuw in 5mL HBSS 2% FCS.
6. Tel de cellen met behulp van een trypaanblauwkleuringstest en pas de uiteindelijke celconcentratie aan tot 10⁷ cellen/mL met behulp van een geschikt volume HBSS 2% FCS.

4. Celkleuring

1. Breng 200µL van de celsuspensie over in zes FACS-buisjes, gelabeld 1 tot en met 6.
2. Centrifugeer de buisjes gedurende 7 min bij 370 x g bij 10°C en gooi het supernatant weg, vermijd het pellet.
3. Bereid vervolgens zes nieuwe antilichaammixen door de geschikte hoeveelheid antilichaam toe te voegen aan 200µL HBSS 2% FCS volgens Tabel 1.
4. Breng vervolgens deze antilichaammixen over naar de bijbehorende genummerde FACS-buisjes.
5. Incubeer de celsuspensies gemengd met de antilichamen gedurende 20 minuten op ijs in het donker.
6. Voeg 1mL HBSS 2% FCS toe aan elke buis en centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende 3 min bij 370 x g bij 10°C.
7. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pellet opnieuw in 200µL HBSS 2% FCS.
8. Breng de gesuspendeerde pellets over in nieuwe FACS-buisjes.

Tabel 1: Samenstelling van antilichaammixen. Er werden zes mixen van 200µL HBSS + antilichaam voorbereid voor het experiment. Mix 1 is voor PMT-instelling, mixen 2 tot en met 5 zijn voor compensatie-instellingen en mix 6 is voor celsortering.

5. FACS-kalibratie

1. Schakel eerst de sorter in en voer "Fluidics Startup" uit.
2. Schakel de stroom in en wacht vervolgens 15 minuten totdat de stroom is gestabiliseerd.
3. Pas de amplitude van de stroom aan om een losgelaten druppelvorming te verkrijgen. Klik vervolgens op "Sweet Spot" om de amplitudeaanpassing te voltooien.
4. Plaats de neutrale dichtheids (N.D.) filter - 1.0 en open de "CST" interface, wat staat voor cytometerinstelling en tracking.
5. Voer dagelijkse kwaliteitscontrole uit door eerst de CST-kralen te verdunnen met FACS-medium volgens de instructies van de fabrikant en voer vervolgens de CST-controle uit.
6. Vervang na voltooiing van de CST-controle het N.D. 1.0-filter met het N.D. 2.0-filter op de cytometer.
7. Verdun vervolgens druppelvertragingskralen in FACS-medium volgens de instructies van de fabrikant en laad vervolgens in de FACS.
8. Om een correcte sortering te garanderen, voer Druppelvertraging uit-
   1. Klik eerst op "Voltage" en vervolgens op "Optical Filter". De rechter kwadrant moet gelijk zijn aan 100%. Indien nodig, pas de rode laserscrew op de cytometer links of rechts aan om 100% in de rechter kwadrant te verkrijgen.
   2. Voer vervolgens een testsortering uit om ervoor te zorgen dat de stroom in de verzamelbuis valt. Klik hiervoor op "Waste Drawer" en start "Test Sort". Controleer of de zijstromen in de verzamelbuizen vallen. Indien dit niet het geval is, pas de spanning aan totdat dit wel het geval is.
   3. Navigeer naar de experimentele sjabloon. Open vervolgens het "Accudrop Drop Delay" experiment en klik op de "Sorting Layout"
   4. Wijzig de stromingssnelheid om 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde te verkrij