Magnetisch geactiveerde celsortering (MACS): Isolatie van thymische T-lymfocyten

1. Voorbereiding

1. Voordat u begint, trek laboratoriumhandschoenen en passende beschermende kleding aan.
2. Was alle dissectiereedschappen, eerst met een wasmiddel en vervolgens met 70% ethanol en droog ze vervolgens met een schone papieren handdoek.
3. Bereid 200 ml Hank's gebalanceerde zout-oplossing (HBSS) met 2% foetaal runder serum (FCS) voor.

2. Dissectomie

1. Prik een geëuthanasieerde muis op een dissectieplaat in rugligging vast.
2. Maak met een schaar en pincetten een longitudinale laparotomie om toegang tot de borstholte te krijgen.
3. Verwijder het hart om toegang te krijgen tot de thymus, die zich boven het hart bevindt. Identificeer vervolgens de thymus, die bestaat uit twee witte lobben en zich in de borstholte boven het hart bevindt.
4. Gebruik pincetten om de thymus voorzichtig los te maken en plaats deze op het petrischaaltje met 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Immuuncelisolatie

1. Plaats de thymus op een 40 µm celzeef bovenop hetzelfde petrischaaltje. Verpletter de thymus met een plunjer om hem in hetzelfde schoteltje te dissociëren.
2. Breng de gedissocieerde thymus en de vloeistof over in een 15 ml centrifugeerbuisje.
3. Was het petrischaaltje met 5 ml HBSS 2% FCS en breng ook het gewassen medium over in hetzelfde centrifugeerbuisje.
4. Centrifugeer het buisje gedurende 7 min bij 370 x g en 20°C en gooi het supernatant weg, waarbij het pellet wordt vermeden.
5. Resuspendeer het pellet in 2 ml kaliumacetaat om de erytrocyten te lyse. Wacht 2 min en breng vervolgens het volume op tot 14 ml met HBSS 2% FCS.
6. Centrifugeer het buisje opnieuw gedurende 7 min bij 370 x g en 20°C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer het pellet in 5 ml HBSS 2% FCS.
7. Schat de celconcentratie met behulp van de trypanblauwkleuring en pas de uiteindelijke celconcentratie aan tot 10⁷ cellen/ml met behulp van een geschikt volume HBSS 2% FCS.

4. Magnetische labeling van immuuncellen

1. Neem twee FACS-buisjes. Label één buisje, 'niet-verrijkte T-cellen', en het andere buisje, 'verrijkte T-cellen' - die zullen worden gescheiden met behulp van magnetische labeling.
2. Verdeel de celoplossing in elk van de twee FACS-buisjes.
3. Centrifugeer het buisje 'verrijkte T-cellen' gedurende 3 min bij 370 x g en 20°C en gooi het supernatant weg, waarbij het pellet wordt vermeden.
4. Resuspendeer het pellet in 250 µL van een mix van gebiotinyleerde anti-CD3-antilichamen (Tabel 1, Mix 1).

Mix	Labeling reagentia	Verdunning
1	Gebiotinyleerd anti-CD3-antilichaam	1/400 (in HBSS 2% FCS)
2	Streptavidine-gekoppelde kralen	1/5 (in HBSS 2% FCS)
3	Anti-CD3 BV421	1/200 (in HBSS 2% FCS)

Tabel 1: Samenstelling van antilichamenmix. Mixen 1 en 2 worden gebruikt voor magnetische scheiding. Mix 3 wordt gebruikt voor het evalueren van de celaanrijking na magnetische scheiding.

5. Incubeer de celsuspensie-antilichaammix gedurende 15 minuten bij 4°C in het donker.
6. Voeg 3 ml HBSS 2% FCS toe aan beide buisjes en centrifugeer ze opnieuw gedurende 3 min bij 370 x g en 20°C.
7. Gooi het supernatant weg en resuspendeer het pellet in 250 µL streptavidine-gekoppelde kralen (Tabel 1, Mix 2).
8. Incubeer het celmengsel en de kralen gedurende 20 min op ijs.
9. Voeg vervolgens 3 ml HBSS 2% FCS toe en meng goed en centrifugeer opnieuw gedurende 3 min bij 370 x g en 20°C.
10. Resuspendeer het pellet in 2 ml HBSS 2% FCS.

5. Magnetische scheiding van CD3-positieve cellen

1. Plaats de kolom op de magneet en voeg 3 ml HBSS 2% FCS toe om het systeem te bevochtigen. Wacht 5 minuten.
2. Pipetteer de gelabelde cellen vervolgens in de kolom.
3. Nadat de celsuspensie door de kolom is gepasseerd, spoel de kolom 3 keer met 3 ml HBSS 2% FCS.
4. Verwijder vervolgens de kolom van de magneet en plaats deze in een 15 ml opvangbuisje.
5. Om de doelcellen te elueren, voeg 5 ml HBSS 2% FCS toe aan de kolom en spoel de kolom uit met de plunjer.
6. Herhaal de elutiestap met nog eens 5 ml HBSS 2% FCS.

6. Evaluatie van doelcelverrijking door middel van flowcytometrie

1. Breng 500 µL van de geëluteerde celsuspensie over naar een FACS-buisje gelabeld 'verrijkte T-cellen'. Breng 200 µL van de 'niet-verrijkte T-cellen' suspensie over naar een tweede FACS.
2. Centrifugeer vervolgens beide bu