ELISA-tests: indirect, sandwich en competitief

1. Indirect ELISA

Een indirecte ELISA is er een waarbij het primaire antigeenspecifieke antilichaam wordt herkend door een secundair geconjugeerd antilichaam. Het volgende protocol is een voorbeeld van een indirecte ELISA-methode, waarbij de serummonsters van met influenza A-virus (IAV) geïnfecteerde muizen worden getest op de aanwezigheid van IAV-specifiek IgG-antilichaam. Een sterk punt van dit voorbeeld is dat er verschillende secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt die alle antilichaam-isotypen of specifieke isotypen herkennen (bijv. IgG).

Bekleding van antigeen op de microplaat

1. Bekleed de putjes van een 96-putjes ELISA-plaat met gezuiverd antigeen door 50 μL gezuiverd antigeen (2 mg/mL gezuiverd A/PR/8 Influenza A-virus in 0,05M Tris-HCl buffer (pH 9,5)) in elk putje van de plaat te pipetten.
2. Dek de plaat af met een kleefbare afdekking en incubeer deze een nacht bij 4°C om het antigeen aan de plaat te laten binden.
3. Na het einde van de incubatie, verwijder de coatingoplossing door de plaat over een gootsteen te slaan.

Blokking

4. Blokkeer de resterende eiwitbindende plaatsen in de beklede putjes door 200 μL blokkeringsbuffer toe te voegen, hierbij wordt 5% ezelsserum in 1X PBS gebruikt, per putje. Alternatieve blokkeringsreagentia omvatten 5% magere droge melk of BSA in PBS of normaal serum van een dier waarin het secundaire antilichaam werd gegenereerd.
5. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4°C.
6. Na de incubatie, verwijder de blokkeringsbuffer door de plaat te slaan en was de plaat vervolgens met PBS bevattend 1% Tween-20.

Incubatie met het primaire antilichaam

7. Maak een seriële verdunning van het serummonster, dat het primaire antilichaam bevat, om een verdunningsbereik van 1 tot 204.800 te verkrijgen, met behulp van 1X PBS. Om dit te doen, verdun het serum eerst 1:12,5 en voer vervolgens een 4X-verdunning uit (verdunningsbereik - 1:12,5 tot 1:204.800).
8. Voeg 100 μL van de sterieel verdunde serummonsters toe aan de putjes.
9. Dek de plaat af met een kleefbare afdekking en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.
10. Na de incubatie, sla de plaat over een gootsteen en was de plaat met PBS bevattend 1% Tween-20.

Incubatie met het secundaire antilichaam

11. Voeg 100 μL van een enzymgeconjugeerd secundair antilichaam, paardenradensperoxidase, HRP-geconjugeerd ezelsanti-muis secundair in dit experiment, toe aan elk putje.
12. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
13. Na de incubatie, sla de plaat over een gootsteen en was de plaat met PBS bevattend 1% Tween-20.

Detectie

14. Voeg 100 μL van de indicatorsubstraat (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) met een concentratie van 1 mg/mL toe aan elk putje.
15. Incubeer de plaat met het substraat gedurende 5-10 min bij kamertemperatuur.
16. Na 10 min, stop de enzymatische reactie door 100 μL 2N Zwavelzuur (H₂SO₄) toe te voegen. Binnen 30 min na het toevoegen van de stopoplossing, lees de plaat met een microplaatlezer bij 405 nm om de absorptie van de putjes te bepalen.

2. Sandwich ELISA

Bij deze ELISA-versie wordt het experimentele monster "gesandwiched" tussen een ongeconjugeerd vangantilichaam en een geconjugeerd detectieantilichaam, beide specifiek voor hetzelfde eiwit maar op verschillende epitopen. In het volgende voorbeeld van een sandwich ELISA, werd de concentratie van humaan TNFα bepaald in onbekend monster met behulp van een standaardcurve gegenereerd uit 2,5X seriële verdunning van een bekende standaard, recombinant humaan TNFα (startend bij een concentratie van 75 pg/mL).

Bekleding van vangantilichaam op de microplaat

1. Bekleed de putjes van een 96-putjes ELISA-plaat met gezuiverd vangantilichaam door 100 μL vangantilichaam (1-10 μg/mL bereik) toe te voegen aan elk putje van de plaat.
2. Dek de plaat af met een kleefbare plaatafdekking en incubeer deze een nacht bij 4°C.
3. Na de incubatie, verwijder de coatingoplossing van de plaat door de plaat over een gootsteen te slaan.

Blokking

4. Blokkeer de resterende eiwitbindende plaatsen in de met antilichaam beklede putjes door 200 μL blokkeringsoplossing, 5% magere droge melk bevattend PBS, toe te voegen aan de putjes.
5. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4°C.
6. Na de incubatie, verwijder de blokkeringsbuffer door de plaat te slaan en was de plaat vervolgens met PBS bevattend 1% Tween-20.

Antigeen bevattende testmonsters toevoegen

7. Voeg 100 μL van het testmonster toe aan de putjes. Sluit de plaat af met een kleefbare afdekking.
8. Incubeer ge