ELISPOT-assay: detectie van IFN-γ secreterende splenocyten

1. Set-up

Buffers en reagentia

1. Steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium
2. Coatbuffer - hetzij steriele PBS of carbonaatbuffer
3. Assay verdunningsvloeistof - 10% foetaal runderserum (FBS) in PBS
4. Celkweekmedium - RPMI 1640 met 10% FBS, penicilline/streptomycine en L-glutamine
5. Wasbuffer - PBS met 0,05% Tween20
6. Dubbel gedistilleerd water (ddH₂O)
7. Detectie substraat - 100 mg AEC (3-amino-9-ethyl-carbazol) in 10 mL DMF (N,N, Dimethylformamide).

Uitrusting

8. Laminaire werkbank
9. Bevochtigde incubator ( ingesteld op 37°C, 5% CO₂)
10. Geautomatiseerde ELISPOT-lezer of dissectiemicroscoop

Materialen

11. ELISPOT-platen
12. Steriele en niet-steriele reservoirs
13. Pipetten en tips
14. Steriele serologische pipetten
15. Steriele, conische polypropyleenbuisjes
16. Twee knijpflesjes voor het wassen van platen

Assay-specifieke reagentia

17. Cellen - primaire cellen of cellijnen (hier werden splenocyten van C57BL/6 muizen gebruikt)
18. Stimulantia - mitogeen of antigeen (hier werden phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA, 50 ng/mL) en ionomycine (1 µM) gebruikt)
19. Primaire antilichaam - biotinyleren anti-cytokinewaarnemend antilichaam (verdund tot 2 µg/mL in assay verdunningsvloeistof)
20. Secundair antilichaam - streptavidin-paardenradenkruidperoxidase (SAv-HRP)

2. Procedure

Coating

1. De voorwaarden sterieel houden en binnen een laminaire werkbank, verdunt u het gezuiverde anti-cytokinewaarnemend antilichaam tot een eindconcentratie van 0,5-4,0 µg/mL in steriele coatingbuffer. (Opmerking: voor IFN- γ en IL-6 gebruikt u 5 µg/mL).
2. Breng de oplossing van het waarnemend antilichaam, 100 µL/well, over naar de ELISPOT-plaat.
3. Dek de plaat af met een plaatdeksel en verzegel het om verdamping te voorkomen.
4. Incubeer de plaat een nacht bij 4°C.

Blokking

5. De volgende dag ontdekt u de ELISPOT-plaat in de laminaire werkbank. Draai de plaat snel om op steriele doekjes om de oplossing van het waarnemend antilichaam uit elke put te verwijderen.
6. Voeg vervolgens 200 µL celkweekmedium toe aan elke put. Deze stap zal niet-specifieke binding tijdens de assay blokkeren.
7. Vervang het plaatdeksel en incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37°C.

Plaatsen en activeren van cellen

8. Terwijl de plaat incubeert, bereidt u een 2X mitogeenoplossing voor die 50 ng/mL PMA en 1 µM ionomycine bevat in celkweekmedium.
9. Bereid vervolgens doelcelsuspensies voor tot een stockconcentratie van 2 x 10⁶ cellen/mL.
10. Nadat de incubatie voltooid is, verwijdert u het celkweekmedium uit elke put door de plaat snel om te draaien op steriele doekjes in de laminaire werkbank.
11. Genereer vervolgens een 2X seriële verdunning van de stockoplossing van de celsuspensie. Om dit te doen, voegt u eerst 200 µL van de bereide stockoplossing van de celsuspensie toe aan de putten in de bovenste rij van de ELISPOT-plaat.
12. Voeg vervolgens 100 µL gewoon celkweekmedium toe aan de volgende vijf rijen van de plaat onder de rijen met celstockoplossing.
13. Voer vervolgens een 2X seriële verdunning uit door 100 µL van de celsuspensie van de bovenste rij in de rij direct eronder te pipetten. Zorg voor goede menging door deze oplossing voorzichtig op en neer te pipetten om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen.
14. Herhaal dit proces voor de resterende vier rijen.
15. Laat de zesde rij met alleen het kweekmedium. Het zal dienen als experimentele controle.
16. Voeg vervolgens 100 µL van de bereide mitogeenoplossing toe aan de experimentele putten van de eerste vijf rijen van de plaat. In de controleputten en de zesde rij, voegt u 100 µL van het celkweekmedium zonder mitogeen toe.
17. Vervang het plaatdeksel en incubeer de plaat bij 37°C, 5% CO₂ in een incubator gedurende 20-48 uur. (Opmerking: 20-24 uur is meestal voldoende voor het detecteren van IL-2 en TNF- α, terwijl 48 uur optimaal is voor IL-4 en IFN-γ).

Detectie

Primair antilichaam

18. Bereid het biotinyleren anti-cytokinewaarnemend antilichaam voor op een concentratie van 2 µg/mL in assay ver